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Herstellung von l-Isoleucin durch Fermentation 1-Isòleucin wird durch
Züchtung eines l-Isoleucin produ zierenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium
gewonnen, welches Leucin enthält. Mikroorganismen vom Genus Corynebacterium, Brevibacterium,
Achrombacter, Pseudomonas, Serratia, Micrococcus, Bacillus, Streptomyces, Aerobacter,
Escherichia, Microbacterium und dgl.sind zur Verwendung in dem Verfahren besonders
geeignet. l-Isoleucin ist eine -wichtige Aminosäure und-es-ist als Nährstoffzusatz
zu Lebensmitteln und Futtermitteln für Menschen und Tiere nützlich.
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Frühere Forscher haben berichtet, daß l-Isoleucin durch Fermentation
erhalten werden kann unter Verwendung von oC-Aminobuttersäure (japan. Patentanmeldung
18 511/1961, 5167/1962, 7091/1963 und 10 242/1964), α-Hydroxybuttersäure (japan.
Patentanmeldung 11 9i8,965) oder Threonin (japan. Patentanmeldung 1990/1965 und
2880/1965) in einem Kulturmedium.
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Wir haben nun gefunden, dat l-Isoleucin in großer Ausbeute durch Züchten
eines Mikroorganismus in einem Leucin enthaltenden Kulturmedium erhalten werden
kann.
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Mikroorganismen, die imstande sind, nach dem erfindungsgemaßen Verfahren
l-Isoleucin zu produzieren, sind in verschiedenen Gattungen gefunden worden, jedoch
besonders geeignete Mikroorganismen sind Glieder der Gattungen, Corynebacterium,
Brevibacteriwm, Achrombacter, Pseudomonas, Serratia, Micrococcus, Bacillus, Streptomyces,
Aerobactert Escherichia, Microbacterium und dergl.. Aus der Betrachtung von Mikroorganismen,
die in der zuvor beschriebenen-Fähigkeit zur l-Isoleucin-Gewinnung verwendet werden,
wird es offenbar werden, welche Mikroorganismen anderer Gattungen zur erfindungsgemäßen
Produktion von 1-Isoleucin
verwendbar sind. Besonders geeignete
Stämme der obigen Gattungen zur Verwendung in dein erfindungsgemäßen Verfahren stammen
von Corynebacterium glutamicum (syn. Micrococcus glutamicus, offenbart in dem deutschen
Patent 1 177 104), Brevibacterium ammoniagenes, Escherichia coli, Pseudomonas ovalis,
Achromobacter cycloclastes, Paracolobactrum coliforme, Streptomyces antibioticus
und Bacillus megatherium.
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Obgleich Wirkung und Funktion des Leucins nicht klar sind, hat es
den Anschein, daß Leucin nicht als Substrat wirkt.
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Dieses ist augenscheinlich, da die Menge des gebildeten 1-Isoleucins
größer ist als die des dem Kulturmedium zugesetzten Leucins und da fast das gesamte
dem Kultum zugesetzte Leucin in dem Medium unverändert bleibt, wenn mehr als 1 mg/ml
Leucin dem Kulturmedium zugesetzt ist.
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Zum Zweck der vorliegenden Erfindung können irgendein synthetisches
oder natürliches Medium, das Leucin enthält, und geeignete Mengen einer assimilierbaren
Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle, von anorganischen Substanzen und anderen
Nährstoffen, die zum Wachstum des verwendeten Mikroorganismus notwendig sind, verwendet
werden.
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Als C-Quelle können in dem Kulturmedium verschiedene assimilierbare
C-Quellen, wie Glukose, Stärkehydrolysat, Vielasse und andere Kohlenwasserstoffe
und dergl. verwendet werden.
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Als N-Quelle können sowohl organische als auch anorganische Stickstoffverbindungen,
wie Harnstoffe und Ammonsalze, z.B.
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Ammonsulfat, Ammonchlorid und dergl. verwendet werden.
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Als anorganische Substanzen, welche in dem Kulturmedium enthalten
sein können, sind zu erwähnen: Kaliumphdsphat, Magnesiumsulfat, Zinksulfat, Calciumcarbonat
und dergl'.
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Zusätzlich können Vitamine, Aminosäuren und Basen und dergl.
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als Nährstoffe für das Wachstum entsprechend den Charakteristiken
des eingesetzten Mikroorganismus verwendet werden.
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Ferner können bekannte Substanzen, die imstande sind, die Ausbeute
an l-Isoleucin zu beeinflussen oder auch ein Precursor, wie α-Aminobuttersäure,
Threonin und dergl. dem Kulturmedium zugesetzt werden.
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Der erfindungsgemäße Mikroorganismus kann unter Bedingungen gezüchtet
werden, die denen analog sind, die für die konventionelle Aminosäurefermentation
zutreffen. Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, wie z.B. mittels Belüftung,
Schütteln, Rühren und dergl. durchgeführt. Die Temperatur beim Züchten liegt vorzugsweise
zischen- 10- und 500 c. Das pH des Mediums kann schwanken, jedoch sollte man es
vorzugsweise au-f etwa neutral einstellen. Die Züchtung
wird vorzugsweise
über 30 bis 150 Stunden geführt, um eine befriedigende Menge an l-Isoleucin zu erhalten.
Die Menge des dem Kulturmedium zugesetzten Leucins wird schwanken und zwar in Abhängigkeit
von dem verwendeten Mikroorganismen-Stamm, jedoch ist es vorzuzichen, 50α
bis 20 mg Leucin pro ml Kulturmedium zu verwenden.
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Nach dem Züchten werden die mikrobiellen Zellen aus der Brühe durch
Filtration entfernt, und das Filtrat wird nach einer geeigneten Methode behandelt,
z.B. mit Hilfe eines Kationenaustauscher-Harzes, um. 1-Isoleucin zu erhalten. Das
adsorbierte l-Isoleucin kann eluiert, konzentriert und in üblicher Weise gekühlt
werden um rohe Kristalle von 1-Isoleucin zu erhalten.
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Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung,
aber sie sollen sie nicht einschränken.
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Beispiel 1 Die Fermentation wurde unter Verwendung eines Kulturmediums
durchgeführt, welches Glukose (5 g/dl), Ammonsulfat (2gZ KH2PO4 (0,05g/dl), K2HPO4
(0,025g/dl), MgSO4 7H2O (0,05g/ dl), CaCO3 (2g/dl), Biotin 30α/1), 1-Lysin
(10 mg/1), dl-α
Aminobuttersäure (10g/l) und leucin (1g/1)
enthält.
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Eine 2,0 ml-Portion dieses Mediums wurde in einen Erlenmeyerkolben
eingebracht und mit einer Saatkultur von Corynebacterium glutamicum M-14 (ATCC 21193)
beimpft. Die Fermentation wurde in 96 Stunden bei 300 C durchgeführt, um 4.3g/1
l-Isoleucin in dem Kulturmedium zu erhalten. Unter den gleichen Zuchtbedingungen,
jedoch in Abwesenheit von 1
leucin, wurden in dem Kulturmedium nur 1.9 g/1 1-Isoleucin erhalten.
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Das pH der Brühe wurde auf schwach sauer eingestellt. Die Brühe wurde
dann erhitzt und die mikrobiellen Körper und die anderen Niederschläge wurden durch
Filtration entfernt.
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Das Filtrat wurde durch eine Harzkolonne geschickt, die mit Diaion
SK No. 1 (schwach saures Ionenaustauscherharz vorn.
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Styroltyp, beziehbar durch die Mitsubishi Kasei Kogyo K.K., Japan)
in seiner H+-Form gepackt war, um l-Isoleucin zu adsorbieren. l-Isoleucin wurde
dann mit verdünnter Schwefelsäure eluiert. Die das eluierte 1-Isoleucin enthaltenden
Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt, unter reduziertem Druck konzentriert und
zum Schluß mit Alkohol versetztes um durch Fällung l-Isoleucin zu erhalten. Die
Ausbeute aus der Brühe betrug 2.8 g;l.
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Beispiel 2 Die Fermentation wurde unter Verwendung eines Kulturmediums
ausgeführt, welches Glukose (5g/dl), Ammonsulfat (2g/dl), KH2PO4 (0,05g/dl), K2HPO4
(0,05g/dl), MgSO4. 7H2O (0,025g/ dl), Biotin (30#/1), Hefeextrakt (0,5g/dl) und
dl- aC -Aminobuttersäure (1g/dl)enthielt. Das Kulturmndium wurde in getrennte Portionen
geteilt und jede Portion mit einem der Mikroorganismen, wie in der nachfolgenden
Tabelle erläutert, beimpft. Die Fermentation wurde mit jedem Medium in 96 Stunden
bei 300 C unter Schütteln ausgeführt, um die in der nachfolgenden Tabelle gezeigte
Ansammlung von l-Isoleucin zu erhalten.
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Tabelle Menge an produziertem 1-Isoleucin (mg/ml) @ Leucin, im Kultur-
Leucin im medium nicht vor- Kulturme-Mikroorganismen handen Mengen von lg/l vorhanden
Brevibacterium ammoniagenes 1.5 (ATCC 6872) Escherichia coli 1.0 2.2 (ATCC 3655)
Pseudomonas ovalis 1.0 (IAM - 3-2-1) Achromobacter cycloclastes 2.5 5.1 (IAM-1013)
Paracolobactrum
coliforme 1.1 4.1 (ATCC 21186) Streptomyces antibioticus 1.3 2.1 (ATCC 10382) Bacillus
megatherlum 1.1 2.1 (ATCC 15450)-Eine Kultur jedes Organismus, identifiziert durch
ATCC (American Type Culture Collection) oder IAM (Institute of, Applied Microbiology-Tokyo
University) sind ohne einschränkung hinterlegt worden, so daß sie der Öffentlichkeit
an der identifizierton Hinterlogungsstelle zugängig gemacht sind.
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Ansprüche :