DD205929A1 - Verfahren zur anzucht von impfmaterial fuer biotechnische prozesse - Google Patents

Abstract

DIE ERFINDUNG BETRIFFT EIN VERFAHREN ZUR ANZUCHT VON IMPFMATERIAL FUER BIOTECHNISCHE PROZESSE. ZIEL DER ERFINDUNG IST DIE EINFACHE, SCHNELLE UND MATERIALSPARENDE ANZUCHT VON INOCULUM FUER BIOTECHNISCHE PROZESSE. DER ERFINDUNG LIEGT DIE AUFGABE ZUGRUNDE, EIN GEEIGNETES VERFAHREN DER ANZUCHT VON INOCULUM MIT SOLCHE EIGENSCHAFTEN ZU ENTWICKELN, DIE SOFORT NACH DEM UEBERIMPFEN HOHE WACHSTUMSGESCHWINDIGKEITEN, NIEDRIGE STOFFVERBRAEUCHE UND EINE HOHE STABILITAETBIOTECHNISCHER PROZESSE GEWAERLEISTEN. ERFINDUNGSGEMAESS WIRD DAS IMPFMATERIAL BEI NIEDRIGEN BIOMASSEBILDUNGSGESCHWINDIGKEITENIM VERLAUF DES MIKROBIELLEN WACHSTUMSPROZESSES GEERNTET. DIE ANZUCHT KANN DISKONTINUIERLICH, SEMIKONTINUIERLICH ODER KONTINUIERLICH VORGENOMMEN WERDEN.

Description

- Ί-

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Titel der Erfindung

Verfahren zur Anzucht von Impfmaterial für biotechnische Prozesse

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die erfindungsgemäße Lösung betrifft ein Verfahren zur.Anzucht von Impfmaterial definierten Zustandes für biotechnische Prozesse und kann überall dort angewendet werden, wo Impfreaktoren parallel zum Produktionsfermentor betrieben werden» Die Erfindung ist in die IPK C 12 N einzuordnen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen auf den verschiedensten Kohlenstoff- und Energiequellen sind in großer Anzahl bekannt« Durch Anwendung dieser Verfahren ist die technische Gewinnung von Zellsubstanz und/oder anderen mikrobiellen Produkten möglich.

Die Bereitstellung von Inoculum ist für die zuverlässige technische Realisierung solcher mikrobieller Prozesse notwendig.

im

Das impfmaterial wird sowohl bei der Anfahrt des Produktionsfermentors als auch bei Störungen und Havarien im Verlaufe des biotechnischen Prozesses benotigt₀ Dabei kommt es vor allem darauf an, daß das Impfmaterial sofort nach Oberimpfen eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit, niedrige Stoffverbrauche_f niedrige Wärmebildungen sowie eine hohe Stabilität des mikrobiellen Prozesses gewährleiste t

Solche Verfahren zur Anzucht von Impfmaterial, die durch eine geeignete Prozeliführung der Fermentation diese Anforderungen erfüllen, sind aus der Hatentliteratur nicht bekannt. Bekannt sind lediglich solche Verfahren, die auf der bevorzugten Nutzung des Reaktorinhaltes oder des Ablaufes aus dem Produktionsfermentor und deren Lagerung in geeigneten tinrichtungen beruhen«

Ein bekanntes Verfahren zur Bereitstellung von Inoculum bei technologischen Störungen der Fermentation besteht in der Zugabe geeigneter bubstanzen zum i-ermentationsmedium im Produktionsfermentor» die zur Aufrahmung der Biomasse führen. Das Aufgerahmte wird in Behältern aufbewahrt und nach Beseitigung der Störung als Inoculum eingesetzt (GB 1 214 957) .

Der Zustand des Inoculums wird dabei nicht berücksichtigt. In einem weiteren Verfahren (Patentanmeldung DDR WP C 12 N/ 226 088) wird Abiauf des Produktionsfermentors in geeigneten Kreislaufeinrichtungen außerhalb des Produktionsfermentors unter definierten Bedingungen aufbewahrt. Diese Lösungen haben den Nachteil, daß in den Kreisiauteinrichtüngen lediglich Impfmaterial, das unter den Bedingungen der Züchtung von Zeilsubstanz im hroduktionsfermentor gewonnen wurde, gelagert wird.

Eine gezielte Beeinflussung des Impfmaterialzustandes ist danach nur über die Wahl der Aufbewahrungszeit, der Lagertemperatur und der Größe der Behälter der Kreislaufeinrichtung möglich.

Ziel der Erfindung

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Ziel der Erfindung ist die einfache, schnelle und materialsparende Anzucht von Inoculum für biotechnische Prozesse,

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der erfindungsgemäßen Lösung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein geeignetes Verfahren der Anzucht von Inoculum einer solchen Beschaffenheit zu entwickeln, das sofort nach dem Überimpfen hohe Wachstumsgeschwindigkeiten, niedrige Stoffverbrauche, niedrige Wärmebildungen sowie Kühlkosten und eine hohe Stabilität biotechnischer Prozesse in Produktionsfermentoren gewährleistet

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß das Impfmaterial bei niedrigen Biomassebildungsgeschwindigkeiten im Verlaufe des mikrobiellen Wachstumsprozesses geerntet wird. Die Anzucht des Inoculums kann diskontinuierlich oder kontinuierlich vorgenommen werden. Bei der diskontinuierlichen Impfmaterialanzucht ist der mikrobielle Wachstumsprozeß beim Übergang in die stationäre Phase zu unterbrechen. Die Anfangsbiomassekonzentration ist möglichst hoch zu wählen und die Nährstoffe sollen für vorzugsweise 1 bis 2 Verdoppelungen der Zellsubstanz bilanziert werden. Dies garantiert schon bei der Anzucht des Inoculums hohe Biomasseausbeuten. Die beim Übergang zur stationären Phase geernteten Mikroorganismen sind sofort als Inoculum für biotechnische Prozesse zu verwenden.

Die semikontinuierliche Impfmaterialanzucht wird so geführt, daß nach Auszehrung der Kohlenstoff- und Energiequelle, die sich durch das Ansteigen der Gelöstsauerstoff konzentration, des pH-Wertes des Fermentationsmediums oder den Übergang der Zellen aus dem Doppelzell- zum Einzelzellzustand ankündigt, die Hälfte des Fer-

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mentationsmediums durch Nährmedium, das Nährstoffe für eine Verdoppelung der Zellmasse enthält, ausgetauscht wird.

Eine Begrenzung des Wachstumsprozesses über die Kohlenstoff- und Energiequelle mit niedrigem Oberschuß aller übrigen Nährstoffe, vorzugsweise des Phosphors und des Sauerstoffs garantiert eine hohe energetische und stoffliche Effektivität biotechnischer Prozesse. Uie in Intervallen dem Fermentor entnommenen Fermentationsmedien können sofort nach deren Austausch als Inoculum im Produktionsfermentor verwendet werden. Bei der kontinuierlichen Anzucht von Inoculum werden hohe Verweilzeiten, vorzugsweise das 3fache der minimalen Verweiizeit eingestellt. Bei der mikrobiellen Verwertung sauerstoff freier Substrate ist die Limit ierung des Prozesses über das Sauerstoffangebot mit geringfügigem Oberschuß der anderen Nährstoffe, vorzugsweise des Kohlenstoffsubstrates und der Phosphationen, zu empfehlen«

Bei der mikrobiellen Wandlung sauerstoff reicher Substrate ist eine Limitierung des Prozesses durch die Kohlenstoff- und Energiequelle vorzunehmen, wobei ein niedriger Überschuß der anderen Nährstoffe, vorzugsweise der Phosphationen und des Sauerstoffs zu empfehlen ist,, Das Impfmaterial kann indirekt dem Fermentor entnommen werden oder durch Sammeln des Fermentorablaufes in einem Zeitraum bis zu 10 Stunden gewonnen werden,. Diese gezielte Prozeßführung der Impfmaterialanzucht garantiert eine hohe energetische und stoffliche Effektivität sowie Stabilität biotechnischer Prozesse.

Die erfindungsgemäbe Lösung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1

Der Hefestamm Lodderomyces elongisporus wurde auf Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle in einem 10 1 Rührfermentor aerob und diskontinuierlich kultiviert .

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Das wäßrige Nährmedium enthielt außerdem noch

12 g (NH₄)J₂ S0₄/l

1,2 g K₂CO₃/1

0,8 g H₃HU₄ ((80

0.5 g MgSO₄ . 7 H₂O

und ausreichende Mengen von Spurensalzverbindungen. Das Hefewachstum wurde durch das Glucoseangebot begrenzt. Die anderen Nährstoffe wurden in geringem Überschuß bilanziert*

Der Wachstumsprozeß wurde diskontinuierlich bis zum Übergang in die stationäre Wachstumsphase geführt. Die Hefesuspension wurde dem Reaktor entnommen und sofort als Impfmaterial verwendet. Bei der Impfmaterialanzucht wurde ein mittlerer spezifischer Kohlenstoffsubstratverbrauch von 2,2 g/g, eine mittlere spezifische Wärmebildung von 4,0 kcal/y und eine aktuelle Biomassekonzentration von 20 g HTS/1 erreicht.

Bei der Züchtung der Hefezellen aus dem diskontinuierliehen Wachstumsprozeß in einem Rührfermentor trat keine lag-Phase im Wachstumsprozeii auf, Uie spezifischen Stoffverbrauche und die Wärmeproduktion waren in der Übergangsphase zum exponentiellen Wachstum nur geringfügig im Vergleich zu den Werten der exponentiellen Wachstumsphase erhöht.

Der mittlere spezifische Glucoseverbrauch betrug ²·⁴. g/g und die mittlere spezifische Wärmebildung 4,4 kcal/g

In der exponentiellen Wachstumsphase wuchsen die Hefezellen mit einer spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit von 0,63 h" , einem spezifischen Substratverbrauch von 2»0 g/g und einer spezifischen Wärmebildung von 3,6 kcal/g.

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Beispiel 2

Der Hefestamm Lodderomyces elongisporus wurde auf Saccharose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle in einem 10 1 Rührfermentor aerob und semikontinuierlieh gezüchtet. Der Wachstumsprozeß wurde über die Kohlenstoff- und Energiequelle begrenzt. Das Nährmedium enthielt außerdem noch

12 g (NH₄)₂ S0₄/l 1,2 g K₂GÖ₃/1 0,8 g H₃P0₄/l

0,5 g MgSO₄ . 7 H₂O

und ausreichende Mengen von Spurensalzverbindungen« Der Wachstumsprozeß wurde stets diskontinuierlich bis zur Auszehrung der Kohlenstoff- und Energiequelle geführt, die sich durch ansteigenden pH-Wert und Gelöstsauerstoff konzent ration des Fermentationsmediums sowie im Absinken des Anteiles sprossender Hefezellen an der Mikroorganismenpopulation auf 20 % ankündigte. Die Hälfte des Fermentationsmediums wurde aus dem Reaktor entnommen und danach Nährmedium mit Nährstoffen für eine Verdoppelung der Zellmasse zugeführt. Der Wachstumsprozeß wurde bis zur Auszehrung der Saccharose im Fermentationsmedium geführt und erneut der Austausch des Fermentationsmediums gegen neues Nährmedium vorgenommen« Folgende Prozeßkennziffern wurden erreicht:

Biomasseendkonzentration 20 g/l

spezifischer Substratverbrauch 2,0 g/g spezifische Wärmebildung 3,5 kcal/g

spezifischer Sauerstoffverbrauch 1,1 g/g Zeitdauer zwischen zwei Austauschen

des Fermentationsmediums . 1,3 Stunden.

Das Impfmaterial kann in Abständen von 1,1 bis 1,3 h, kurz vor der Auszehrung der Kohlenstoff- und Energiequelle bei einem Anteil von sprossenden Zellen an der Population von ca« 35 % geerntet werden«

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Bei Einsatz der geernteten Hefesuspension als Impfmaterial, durch die der semikontinuierliche Prozeß der Impfmaterialanzucht nicht gestört wird, trat keine lag-Phase im Wachstumsprozeß der Hetezellen auf.

Beispiel 3

Der Hefestamm Lodderomyces elongisporus wurde auf Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle in einem 10 1 Rührfermentor aerob und kontinuierlich gezüchtet· Das wäßrige Nährmedium enthielt neben der Glucose noch 12 g (:nh₄)₂ scyi

1,2 g KH₂P0₄/l 0,8 g H₃P0₄/l 0,5 g MgSO₄ · 7 H₂0/l

und ausreichende Mengen an Spurensalzverbindungen. Wachstumsstimulierender Bestandteil der Nährlösung war die Glucose« Die Verweilzeit betrug 10 Stunden. Die Belüftungsrate betrug 40 1/1 h.

Bei der kontinuierlichen Impfmaterialanzucht wurden folgende Prozeßkennziffern erreicht:

spezifischer Substratverbrauch 2,2 g/g

spezifischer Phosphatverbrauch 8,0 mg P/g

spezifische Wärmebildung 4,0 kcal/g

aktuelle Biomassekonzentration 20 g/l

Die Hefesuspension ist ständig als Impfmaterial verfügbar« Bei Erntung des Impfmaterials direkt aus dem Reaktor und sofortigem Einsatz der Hefesuspension trat keine lag-Phase im Wachstumsprozeß auf. Die Hefezellen wuchsen exponentiell nach Durchlaufen einer Übergangsphase zum exponentiellen Wachstum von 0,5 bis 1 Stunde. Ein Sammeln von Fermentationsablauf in einem Zeitraum bis zu 10 Stunden führte zu keiner drastischen Verlängerung dieser Übergangsphase im Wachstumsprozeß. Eine längere Lagerung des Impfmaterials im Kühlschrank ist wegen des Auftretens einer lag-Phase im Wachstumsprozeß nach Oberimpfen in ein neues Nährmedium, das mit

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einer erhöhten Wärmeentwicklung und einem erhöhten Substratverbrauch gekoppelt ist, nicht zu empfehlen.,

Beispiel 4

Der Hefestamm Lodderomyces elongisporus wurde auf Paraffinen als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle in einem 10 1 Kührfermentor aerob und kontinuierlich bei einer Verweilzeit von 10 h und einer Belüftungsrate von 60 l/kg h gezüchtet

Das wäßrige Nährmedium enthielt in 1 1 12g (NH₄)₂ S0₄/l 1,2 g K₂ü0₃/l 0.8 g H₃P0₄/l U.5 g MgSO₄ · 7 H₂0/l

und ausreichende Mengen an Spurensalzverbindungen. Der Wachstumsprozeß wurde über das Sauerstoffangebot in der Luft begrenzt.

Die übrigen NährstoTfe u. a„ Phosphor und Paraffine wurden in geringfügigem Überschuß bilanziert. Folgende Prozeßkennziffern wurden erreicht:

spezifischer Substratverbrauch 1,1 gZg

spezifischer Sauerstoffverbrauch 2,4 gZg

spezifische Wärmebildung 7,5 kcal/g

spezifischer Phosphorverbrauch ti „0 mg/g

Bei fcinsatz der Hefesuspension aus kontinuierlicher Fermentation als Impfmaterial trat keine lag-Phase auf und die Hefezellen wuchsen nach Durchlaufen einer Übergangsphase von 0,5 bis 1 h exponentiell mit einer spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit von 0,35 h , einem spezifischen Paraffxnverbrauch von 1,0 gZg und einer 3u spezifischen Wärmebildung von 7,0 kcalZg HJS.

Claims (6)

242052 7 Ertindungsanspruch

1* Verfanren zur Anzucht von Impfmaterial für biotechnische Prozesse, gekennzeichnet dadurch, daß das Inoculum bei niedrigen Biomassebildungsraten im Verlauf des mikrobiellen Wachstumsprozesses geerntet wird und sofort zur Anzucht im Produktionsfermentor verwendet werden kann,

2, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Anzucht von Impfmaterial diskontinuierlich erfolgt, wobei das Biomassewachstum über die Kohlenstoff- und Energiequelle begrenzt wird, die anderen Nährstoffe in geringem Überschuß bilanziert werden und das Inoculum beim Übergang zur stationären Wachstumsphase geerntet wird»

3« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Anzucht von Impfmaterial semikontinuierlich erfolgt, wobei das Biomassewachstum über die Kohlenstoff- und Energiequelle begrenzt wird, die anderen Nährstoffe in geringem Überschuß bilanziert werden und das Impfmaterial beim Austausch der Hälfte des Fermentationsmediums nach Auszehrung der Kohlenstoff- und Energiequelle geerntet wird,

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4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Anzucht von Impfmaterial kontinuierlich erfolgt, wobei hohe Verweilzeiten, vorzugsweise das 3fache der minimalen Verweilzeit gewählt werden und das Impfmaterial durch Leeren des Impffermentors oder Sammeln von Fermentorablauf im Zeitraum bis zu 10 Stunden gewonnen wird_e

5« Verfahren nach Punkt 1 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Impfmaterialanzucht auf sauerstoff-freien Substraten unter Sauerstofflimitation geführt wird und die anderen Nährstoffe in geringem Überschuß bilanziert werden.

6. Verfahren nach Punkt 1 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Anzucht des Inoculums auf sauerstoffreichen Substraten durch die Kohlenstoff- und Energiequelle begrenzt wird und die anderen Nährstoffe in geringem Überschuß bilanziert werden.