DD249039A1

DD249039A1 - Verfahren zum langzeitbetrieb von mikrobiellen produktsynthesen mit wachstumsassoziierten biokatalysatoren

Info

Publication number: DD249039A1
Application number: DD29008286A
Authority: DD
Inventors: Uwe Setzermann; Wolfgang Loettel; Dieter Eibel; Ursula Gergs; Ute Hempel; Dieter Sattler
Original assignee: Leipzig Chemieanlagen
Priority date: 1986-05-09
Filing date: 1986-05-09
Publication date: 1987-08-26
Also published as: DD249039B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Langzeitbetrieb biotechnologischer Prozesse mit wachstumsassoziierten Biokatalysatoren. Ziel der Erfindung ist es, der Desaktivierung des Biokatalysators entgegenzuwirken. Die Aufgabe besteht darin, den stationaeren Zustand in kontinuierlichen Verfahren bzw. die Vielfachwiederverwendung der Biomasse in diskontinuierlichen bzw. semikontinuierlichen Verfahren zu erwirken. Erfindungsgemaess wird dem Prozess eine geringe bilanzierte Menge aktiver Impfzellen kontinuierlich oder periodisch aus einer vorgeschalteten Reinzuchtanlage zugefuehrt. Bei kontinuierlichen Prozessen betraegt die Biomassekonzentration im Zulauf des Bioreaktors vorzugsweise X00,1 g/l, bei diskontinuierlichen Prozessen die je Charge eingesetzte Menge aktiver Impfzellen (mRZ) in Bezug auf die Biomasse (mXR) vorzugsweise mRZ0,01 mXR. Dabei ist die mittlere Verweilzeit des Prozesses wesentlich kleiner als die Desaktivierungszeit des Biokatalysators zu waehlen, so dass im Prozess durch Wachstum der Impfzellen staendig aktive Biokatalysatoren zur Verfuegung stehen. Durch das erfindungsgemaesse Verfahren werden gezielt Mischpopulationen und Abbausequenzen gesteuert.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zum Langzeitbetrieb von mikrobiellen Produktsynthesen mit wachstumsassoziierten Biokatalysatoren

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aktivierung der Biokatalysatormasse in kontinuierlichen und diskontinuierlichen biotechnologischen Anlagen zur Gewährleistung eines Langzeitbetriebes· Das Verfahren wird vorwiegend bei industriellen Prozessen zur mikrobiellen Produktsynthese (Primärmetabolite - z. B. Alkohol, SCP u, a.) mit wachsenden freien Zellen (z. B. Hefen, Bakterien) auf der Basis konventierbarer Bahrsubstrate (technische Substrate) angewandt.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zur mikrobiellen Stoffwandlung technischer Substrate sind Verfahren mit kontinuierlicher, semikontinuierlicher und diskontinuierlicher Prozeßführung bekannt, die zum Teil aus technisch-ökonomischen Gründen mit einem Recycling der sich im Prozeß vermehrenden Biomasse arbeiten.

In der Praxis überwiegen bei vielen Massenprozessen noch immer diskontinuierliche und semikontinuierliche Verfahren, obwohl sie im Vergleich zu kontinuierlichen Prozessen geringere Produktivität aufweisen. Demgegenüber gewährleisten die diskontinuierlichen Fahrweisen eine höhere Produktionsstabilität, da sie den Biokatalysator für jede Charge neu aus Reinzuchtstufen gevjinnen» Üblich ist die Biokatalysatormenge im Verhältnis

= "1 (Volumen der Reinzuchtanlage) "^p"* " Tu (Volumen d*er Produkt ions stufe)

einzusetzen. . '

Um diesen Koatenfaktor zu verringern, wurden kontinuierliche und diskontinuierliche Verfahren mit Biomassewiederverwendung entwikkelt. Trotz technischer Maßnahmen- zur Biokatalysatorregenerierung und -erhaltung wie:

. Hefe- und Säurewäsche

« partielle Belüftung

, dynamische Prozeßführung

, Sterilbetrieb

können die Hauptursachen der Biokatalysatoralterung

, Einfluß von toxischen Stoffen aus den technischen Substraten und dem Stoffwechsel

• Mangel an Wuchsstoffen und Spurenelementen in den technischen Substraten

. Einfluß von Kontaminationen

• Bildung von Mutanten

durch die bekannten Verfahren nicht verhindert v/erden. Dies ist auch die Ursache, warum kontinuierliche Verfahren nur kurzzeitig stationär (quasistationär) betrieben werden können· Kontinuierliche Prozesse v/erden nach dem Prinzip des Chemostaten betrieben, welches beinhaltet, daß bei wachsenden Biokatalysatoren nach der Anfahrphase im stationären Betrieb keine externe Biomassezufuhr notwendig ist. In der Praxis ist das unterstellte Gleichgewicht zwischen der Durchflußrate D und der spezifischen Wachstumsrate /u Cu = D) jedoch nicht gewährleistet. Auf Grund der Biokatalysatoralterung ( /α =/u(t)) kommt es nach einer prozeßsoezif ischen Zeit zu einer Verringerung der spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit (yu<"D), die Biomasse wird ausgespült und der Prozeß kommt zum Erliegen.

Einige bekannte technische Lösungen gehen deshalb von mehrstufigen Anlagen aus, deren erste Stufe als Vorfermentor zur Biomasseanzucht genutzt wird. Die Biomasse in den Vorfermentoren unterliegt ebenfalls der Prozeßalterung und muß im kontinuierlichen Betrieb periodisch erneuet werden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung liegt darin begründet, einen Langzeitbetrieb biotechnologischer Prozesse zu erreichen bei gleichzeitiger Verringerung der Zähl der Prozeßabbrüche, die bei Inaktivierung der Biomasse erforderlich sind.

Ein notwendiges Neuanzüchten der aktiven Biomasse und das Heuanfahren der Prozeßanlage soll vermieden werden«

Die Verringerung des Einsatzes von kohlehydrathaltigen Rohstoffen und von Nährstoffen, sowie die Einsparung von Energie soll erreicht werden«

Eine kostenaufwendige Sterilfahrweise beim Einsatz von leichtkonvertierbaren Substraten ( zuckerhaltige Rohstoffe), die in Masse^brozessen stark kontamina^tionsgefährdet sind, soll vermieden werden·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein 'Verfahren für eine mikrobielle Produktsynthese mit wachstumsassoziierten Biokatalysatoren zum Einsatz zu bringen, mit dem ein Langzeitbetrieb bei kontinuierlichen biotechnologischen Prozessen sowie bei Biomassewiederverwendung in diskontinuierlichen Prozessen gewährleistet wird.

Erfindungsgemäß' wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß dem Produktionsbioreaktor ständig oder periodisch eine bilanzierte Menge aktiven Bickatalysators (Reinzucht) zugegeben wird. Durch die Zugabe aktiver Impf zellen, die sich im Produktionsfermcrtor mit hoher spezifischer Wachstumsrate vermehren können, wird die Desaktivierung der Biokatalysatormasse ausgeglichen. Im Produktionsfermentor entsteht eine Population mit mittlerer Aktivität, für die das zeitinvariante Stationaritätsprinzip des Chemostaten ( /u = D) gilt. Die Erfindung berücksichtigt dabei die Erkenntnis, daß jede Einzelzelle einer Alterungsfunktion unterliegt. In der ersten Phase der Desaktivierung ist jedoch noch ein normales Wachstum der Zelle möglich, während es in einer zweiten Phase nach dem Verbrauch von Reservestoffen und Schädigung der Zellstruktur zu einer schnellen vollständigen Desaktivierung kommt.

Diese Erkenntnis nutzend, ist es möglich und ausreichend mit geringen Mengen von Impfzellen - deren mittlere Verweilzeit im System kleiner als die Desaktivierungszeit ist, den Prozeß zu stabilisieren«

Erfindungsgemäß wird die Prpzeßstabilisierung in .kontinuierlichen Prozessen durch die dem aseptisch arbeitenden Produktionsfermentor vorgeschalteten sterilen Reinzuchtfermentor (Impffermentoren) gelöst. Der Reinzuchtfermentor "wird mit optimiertem Nährsubstrat und vorzugsweise in Redundanzschaltung betrieben«

Als Volumenverhältnis des Reinzuchtfermentors (V-^₂) zum ersten Produktionsfermentor (Vp) wird

^RZ = 1 · 10 "¹ bis 1 ♦ 10 "⁴

angewandt. Dem entspricht ein Biomassekonzentrationsverhältnis von Impfzellen (Xq) im Zulauf zur Biomassekonzentration (X-) im Produktionsfermentor von

^ = 1 bis 10~⁴

Bei diskontinuierlichen und semikontinuierlichen Prozessen mit Biomassewiederverwendung wird erfindungsgemäß durch chargenmäßige Zugabe von aktiven Impfzellen zur wiederverwendeten Biomasse ein Ausgleich der Desaktivierung und damit ein Langzeiteinsatz des Biokatalysators gewährleistet.

Als Mengenverhältnis wird angegeben: - Rückführung der Biomasse nach der Charge ()

— = o,5 bis 0,95

Vges Zugabe von aktiven Impfzellen

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird an Hand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert. In der dazugehörigen Zeichnung zeigt die Figur das Prinzipschema des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Als Ausführungsbeispiel wird ein Verfahren' zur kontinuierlichen Vergärung von Melasse mit dem Biokatalysator Saccharomyces cerevisiae beschrieben·

Entsprechend des Prinzipschemas besteht die gesarate Fermentationsanlage aus einer Hefereinzucht- und einer Hauptgäranlage» Die Fermentoren 1 und 2 sind aerobe sterilisierbare Reinzuchtfermentoren. Fermentor 3 (aerob) und Fermentor 4 und 5 (mikroaerob) sind aseptische Produktionsfermentoren« Die verwendete Separator-Trennein- . heit, vorzugsweise Separator 6, dient zur Abtrennung der Biomasse von der alkoholhaltigen Schlempe. Erfindungsgemäß wird dem aeroben Produktionsfermentor 3 kontinuierlich eine" bilanzierte Menge (x =0,1 g HTS/1 im Zulauf) Reinzuchtbiomasse hoher Aktivität aus den Reinzuchtf ermentoaren 1 oder 2 zugespeist. Im Fermentor 1 vermehrt sich die zugeführte Reinzuchtbiomasse hoher Aktivität und vermischt sich mit der vorhandenen und der zurückgeführten Biomasse geringerer Aktivität« Die Biomasse hoher Aktivität .wächst schneller und gleicht dadurch den Aktivitätsverlust der vorhandenen Biomasse aus. In den Produktionsfermentoren 3» 4, 5 und der Rückführungsstrecke entsteht eine Hefepopulation, die trotz der Desaktivierung des Biokatalysators ein stabiles mittleres Wachstumsund Gärvermögen aufweist. Die Reinzu.chtf ermentoren werden mit sterilem Melasse 7 und optimierten Nähr- und Wuchsstoffen 8 sowie Sterilluft 9 betrieben. Entsprechend der Desaktivierungsfunktion des Biokatalysators arbeitet ein Reinzuchtfermentor mindestens 100 bis 120 h in einem quasistationären Zustand, Nach dieser Zeit kann eine starke Desaktivierung einsetzen, die nach ca« 150 bis 180 h auch im Reinzuchtfermentor zur völligen Desaktivierung führen würde.

Um den kontinuierlichen Zufluß an Reinzuchtbiomasse in die Produktionsf ermentoren zu gewährleisten, können die Fermentoren 1 und 2

in Redundanz geschaltet werden, d. h. sie werden nach folgendem technologischen Regime im Wechsel betrieben.' !fach 100 h Betriebszeit wird der Reinzuchtfermentor 1 leer gefahren, gereinigt und sterilisiert. Sioch bevor der Reinzuchtf ermentor -1 leer ist, wird der entsprechend dem Wachstumszyklus mit einer Stammkultur zuvor angefahrene Reinzuchtfermentor 2 dazu geschaltet und die nächsten 100 Produktionsstunden betrieben. In einer weiteren Variante kann der zweite Reinzuchtfermentor 2 eingespart werden. In der Reinigungsund Anzuchtphase des Permentors 1 wird hierbei die Zufuhr von. Impfmaterial zum Produktionsfermentor 3 periodisch unterbrochen. Mit einer geringen Schwingung der verfahrenstechnischen Parameter gleicht der Produktionsfermentor diese kurzzeitigen Unterbrechungen (ca. 20 h) aus.

In der nachfolgenden Tabelle sind entsprechend der Prinzipskizze für das Ausführungsbeispiel die Verfahrensparameter dargestellt.

Die Vorteile der erfinderischen Lösung sind:

- Einsatz effektiver, hochproduktiver kontinuierlicher Gärverfahren (Produktivitäten ^ 36 g Eth./l h) in stabiler Produktion

- Reduzierung des Arbeitsaufwandes für Anzucht, Reinigung und Betreiben von diskontinuierlichen großtechnischen Gärverfahren

- Verringerung des Energie- und Rohstoffeinsatzes für die Anzucht von neuer Biomasse

- Verringerung des apparate- und anlagentechnischen Aufwandes durch Vermeidung des Sterilbetriebes großtechnischer Produktionsanlagen.

Verfahrensparameter für das AusfUhrungsbeispiel bei	einem Biomasserezirkulationskoeffizient von 0,25	1	2	3 · ·,.	4	5
	f	0,8	0,8	70	60	60
Permentor	0,5	0,5	46	49	49
Fermentorvolumen (nr )	32	32 .	32	32	32
Fermentationsvolumen (nr*)	4,2	4*2	4,2	4,2	4,2
Temperator (⁰C) u	8	8	460	30	30 _s
pH-Wert	,0,068 ;	0,068	. _ · .	-	... - ,
Belüftung (N m³/h) _; ' ·	- ·.	·,-	0,7	3,6
Zulauf steriler Melasse mit 50 g Zucker/1 (nr/h)	- : ·	.- . - . .	5,5	0,5
Zulauf Melasse mit 450 g Zucker/1 (m^/h)	-	-	0,068	- :	- .
Zulauf Wasser (nrVh)	10	10	28	24	25
Zulauf Reinzuchthefesuspension (mr/h)	5	5	.5	26	1
Hefekonzentration (g HTS/1)	19	19	35	65	76
Zuckerkonzentration (g/l)
Ethanolkonzentratlon (g/l)

Claims

Erfindungsanspruch

=££ = 1 · 10"¹ bis 1 . 10"⁴ ^mXR

entspricht.

^ = 1 bis 1 · 10 "⁴

entspricht»

1. Verfahren zum Langzeitbetrieb von mikrobiellen Produktsynthesen mit wachstumsassoziierten Biokatalysatoren in kontinuierlicher oder diskontinuierlicher Verfahrensweise durch Mischen der Rohstoffe mit Prozeßwasser und Nährstoffen zur Herstellung einer fermentierbaren Lösung, Fermentieren dieser Lösung in einem oder mehreren Produktionsfermentoren mit Hilfe von Mikroorganismen, die als Biokatalysatoren wirken und in einem oder mehreren Reinzuchtfermentoren gezüchtet werden und sich im Produktiohsfermentor autokatalytisch vermehren, Abtrennen des Biokatalysators aus der fermentierten Lösung und Wiederverwendung der abgetrennten Mikroorganismen in der Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß aus den Reinzuchtfermentoren eine ständige Zugabe bilanzierter Mengen einer oder mehrerer Arten (Stämme) aktiver Impfzellen des Biokatalysators in die Produktionsfermentoren erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die .Zugabe der aktiven Impfzellen zum Produktionsfermentor kontinuierlich oder periodisch erfolgt,.
3« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei kontinuierlich betriebenen Produktionsfermentoren die Zugabe der aktiven Impfzellen (X_Q) im Volumenstrom des Zulaufes einem Konzentrationsverhältnis zur Biomasse im Produktionsfermentor

(X_n) von
4· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei diskontinuierlich betriebenen Produktionsfermentoren die Zugabe von aktiven Impfzellen ( ^τ>^) zu der wiederverwendeten Biomasse (m^-jJ einem Konzentrationsverhältnis von
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet» daß durch die Zugabe bilanzierter Mengen mehrerer aktiver Impfkulturen aus mehreren Reinsuchtfermentoren in den Produktionsfermentor eine erwünschte Mischpopulation aufrechterhalten und die Abbausequenzen von Mischsubstraten gesteuert werden·