<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen Proteinen (nachstehend meist als S. C. P. bezeichnet) und von Lipiden aus pflanzlichen Kohlenhydraten durch Kultur einer Mikrobe in einem solche Kohlenhydrate enthaltenden Kulturmedium.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Protein und Lipid aus pflanzlichen Kohlenhydraten, insbesondere Stärke, welches Verfahren gekennzeichnet ist durch einen zweistufigen Vorgang, der darin besteht, dass Stärke durch Einwirkung von dextrinogenen Enzymen zur Herstellung eines Kulturmediums für eine Mikrobe verflüssigt und das verflüssigte Kulturmedium durch asepti- schen Zusatz einer saccharogenen Amylase zu dem Kulturmedium verzuckert wird, während die Mikrobe kultiviert wird. In den letzten Jahren wurden einzellige Proteine künstlich aus pflanzlichen Kohlenhydraten oder Kohlenwasserstoffen mineralischen Ursprungs unter Kultivierung eines Mikroorganismus künstlich hergestellt.
Die so erhaltenen Proteine stammen aus den Zellen des kultivierten Mikroorganismus und unterscheiden sich im allgemeinen von denjenigen, die durch chemische Mittel aus pflanzlichen Quellen, z. B. Bohnen, extrahiert werden. Diese künstlich hergestellten Proteine sind als Fleischersatz verwendbar und finden verschiedene Anwendungen in der Nahrungsmittelindustrie als Fleisehersatz, Zusatz zu Nahrungs- und Futtermitteln und Viehfutter.
Seither wurde von vielen Untersuchungen betreffend die Herstellung von S. C. P. aus pflanzlichen Kohlenhydraten durch Züchtung einer Mikrobe in einem aus solchen Kohlenhydraten hergestellten Kulturmedium berichtet.
Als Ausgangsmaterial für die Fermentation oder Herstellung von S. C. P. und Lipiden dienen hiebei Koh-
EMI1.1
grossen Mengen erhältlich. Daher ist die Verwendung von Stärke als Ausgangsmaterial aus wirtschaftlichen Gründen erwünscht. Wenn jedoch eine für die Kultur verwendete Mikrobe nur Monosaccharide oder Oligosaccharide verwerten kann, muss die Stärke bzw. ein anderes hochmolekulares Material zunächst hydrolysiert werden, bevor sie bzw. es als Kulturmedium eingesetzt wird.
Herkömmliche, zur Lösung dieses Problems angewandte Verfahren sind das sogenannteAmyloverfahren, das zur Herstellung von Alkoholen aus Stärke verwendet wird, das Kojiverfahren und einAuswahlverfahren beruhend auf den Koji- und Amiloverfahren. Nach diesen Verfahren wird Koji (z. B. Aspergillus Oryzae) mehr als 10 h hindurch in einer Vorstufe kultiviert, u. zw. vor dem Hauptfermentationsverfahren, und dann zur Verzuckerung in dem nachfolgenden Verfahren verwertet.
Unter diesen Voraussetzungen sind die Kontrolle und der Betrieb der Kultivierung kompliziert, und der Vorgang erfordert eine beträchtliche Zeit. Daher sind diese Verfahren zur Herstellung von S. C. P. ungeeignet, weil bei einem solchen Verfahren eine grosse Menge Ausgangsmaterial mittels einer einfachen Verfahrensweise innerhalb kurzer Zeit behandelt werden soll.
Vor kurzer Zeit hat man demSymbaverfahren als einem Verfahren zur Herstellung von S. C. P. aus einem Abwasser der Stärkeaufbereitung viel Beachtung geschenkt. Dieses Verfahren verwendet eine Mischkultur (symbiotisch), wobei eine Verzuckerung von thermisch sterilisierter Stärke mit einer besonderen Amylase bildenden Mikrobanart (Endomycopsis fibligar) ausgeführt wird, welche in einem separaten Fermentationsbehälter kultiviert wird, wobei die Hauptmenge der Hefe, Candidautilis, in einem Hauptfermentationsbehälter kultiviert wird.
Wenn jedoch die Ausgangskonzentration der Stärke bei dem Symbaverfahren gross ist, muss das Auftreten einer Gelatinierung im Verlauf der thermischen Sterilisierungsbehandlung der Stärke erwartet werden. Daraus folgt, dass es eine obere Grenze für die in dem Verfahren eingesetzte Stärke gibt. Da zwei verschiedene Arten von Hefe zusammen im Hauptfermentationsgefäss kultiviert werden, stellt ein richtig ausgeglichenes Wachstum der beidenHefen ein schwieriges Problem dar. Hinzu kommt, dass die Aufrechterhaltung der Kultur und die Herstellung eines Produktes von gleichbleibender Qualität bei diesem Verfahren nicht einfach ist.
Auf Grund dieser Tatsachen ergibt sich ein grosses Verlangen zur Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von S. C. P. aus Stärke, bei welchem die Mikrobenzüchtung leicht und in wirkungsvoller Weise ohne Schwierigkeiten vorgenommen werden kann.
Erfindungsgemäss soll ein mikrobielles Protein, das als Fleischersatz und Zusatz zu Nahrungs- oder Futtermitteln verwendbar ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Protein und Lipid aus pflanzlichen Kohlenhydraten durch Züchtung von Mikroben vorgesehen werden.
Ferner soll erfindungsgemäss ein solches Verfahren eine Stufe der Verflüssigung von Stärke durch die Einwirkung eines dextrinogenen Enzyms auf dieselbe und eine Stufe der enzymatischen Verzuckerung der Mikroben-Kultur umfassen.
Des weiteren soll erfindungsgemäss ein einfaches, automatisch regelbares Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Protein und Lipid geschaffen werden, bei welchem Verfahren eine grosse Menge Ausgangsmaterial kontinuierlich in kurzer Zeit behandelt werden kann.
Schliesslich soll erfindungsgemäss ein kontinuierliches mehrstufiges Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Protein vorgesehen werden, bei welchem Verfahren ein unterschiedlicher Druck in einzelnen
<Desc/Clms Page number 2>
Kulturbehältern aufrecht erhalten wird, um die Menge einer zwischen den einzelnen Kulturbehältern strö- menden Fermentationsflüssigkeit regeln zu können.
Es wurde nunmehr festgestellt, dass die Nachteile der bekannten Verfahren überbrückt werden können, indem separat eine Verfahrensstufe der enzymatischen Stärkeverflüssigung und eine Verfahrensstufe der enzymatischen Verzuckerung und Kultivierung vorgesehen wird, um eine gleichzeitige enzymatische Ver- zuckerung und Mikrobenzüchtung zu bewirken.
Die Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Protein und Lipid aus pflanzlichen Kohlenhydraten, einschliesslich Stärke, durch Mikrobenzüchtung und-kultivierung, das darin be- steht, dass Stärke mit einem dextrinogenen Enzym in einem Behälter verflüssigt wird, um ein Kulturmedium für eine Mikrobe zu schaffen, eine gleichzeitige enzymatische Verzuckerung und Mikrobenkultivierung in einem Fermentationsbehälter oder mehreren Behältern durch aseptischen Zusatz einer saccharogenen Amylase zu dem Kulturmedium während der Kultivierung der Mikrobe in demselben vorgenommen wird und die kultivierten mikrobiellen Zellen und das Lipid aus dem Kulturmedium abgeschieden werden.
Das Verfahren gemäss der Erfindung beinhaltet eine enzymatische Verflüssigungsstufe zur Verflüssigung von Stärke mit einem dextrinogenen Enzym zwecks Bereitstellung eines Kulturmediums für eine Mikrobe, eine Sterilisierungsstufe betreffend das Kulturmedium, eine enzymatische Verzuckerung- und Kultivierungs- stufe zur gleichzeitigen enzymatischen Verzuckerung und Kultivierung der Mikrobe in einem oder mehreren
Fermentationsbehältern durch aseptischen Zusatz einer saccharogenenAmylase zu dem Kulturmedium während der Mikroben-Kultivierung in demselben, eine Trenn- und Konzentrierungsstufe für die kultivierten mikrobiellen Zellen und schliesslich eine Trocknungsstufe, um das gewünschte mikrobielle Protein zu erhalten.
Ein besonderes Kennzeichen des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass die enzymatische Verflüssigungsstufe unabhängig von der enzymatischen Verzuckerungs- und Kultivierungsstufe durchgeführt wird.
Verschiedene Arten von hochmolekularen Kohlenhydraten und Stärke können im erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsmaterial eingesetzt werden. Die Verwendung von Stärke wird vorgezogen, da diese in grossen Mengen bei geringen Kosten im Handel erhältlich ist. Es können verschiedene pflanzliche Stärken, wie Kartoffelstärke, und Abwässer aus Anlagen zur Stärkeherstellung als Ausgangsmaterial eingesetzt werden.
Wenn Stärke als Ausgangsmaterial für die Herstellung von S. C. P. eingesetzt wird, muss diese zunächst hydrolysiert werden, es sei denn, dass die verwendete Mikrobe Amylasewirkung besitzt. Die Stärkehydrolyse kann mittels eines im Handel erhältlichen dextrinogenen Enzyms bei der Verflüssigungsstufe kontinuierlich und schnell ausgeführt werden.
Der hydrolysierten Flüssigkeit werden dann anorganische Nährsalze zugesetzt, bis eine für die Mikrobenkultivierung optimale Salzkonzentration erreicht ist. Hierauf wird bei der Sterilisierungsstufe das so erhaltene Kulturmedium durch Erwärmen sterilisiert und einer Fermentationseinheit zugeführt, die gewöhnlich aus einer Serie von Fermentationsbehältern besteht.
Bei der nachfolgenden enzymatischen Verzuckerung- und Kultivierungsstufe wird eine im Handel erhältliche saccharogene Amylase dem Kulturmedium in den Fermentationsbehältern aseptisch zugesetzt, wo die enzymatische Verzuckerung und Mikrobenkultivierung gleichzeitig erfolgt.
In dieser Weise geht die Hydrolyse rasch und wirkungsvoll vor sich. Bekanntlich sind hydrolytische Enzymreaktionen, wie die Verzuckerung, im allgemeinen reversibel, und es geht eine Reaktionshemmung vor sich. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren, nach welchem die Verzuckerung und die Kultivierung gemeinsam ausgeführt werden, wird eine durch die Wirkung von saccharogener Amylase freigesetzte Glukose oder Maltose fortlaufend durch die vorliegende Mikrobe aufgebraucht und demnach aus der hydrolytischen Umsetzung schnell entfernt.
Auf diese Weise werden sowohl die Umkehrreaktionen als auch die Hemmung vernachlässigbar. Tatsache ist, dass 60 bis 90 h erforderlich sind, um eine verflüssigte Stärkelösung in einem Reaktionsbehälter unter Verwendung einer bestimmten Menge von saccharogener Amylase zu verzuckern, bis der Verzuckerungsgrad DE 97 erreicht. Hingegen betrug die Dauer der satzweisen Kultivierung einer Candida-Hefe 14 bis 24 h bei der erfindungsgemässen Verzuckerungs- und Kultivierungsstufe unter Verwendung einer verflüssigten Stärkelösung mit einem Gesamtzuckergehalt von 4%.
Bei der Trennstufe werden die kultivierten mirkobiellen Zellen z. B. durch Dekantieren oder Zentrifugieren erhalten. Die so isolierten Zellen werden dann schliesslich getrocknet, wonach das gewünschte mikrobielle Protein erhalten wird. Die Ausbeute an mikrobiellen Zellen beträgt 45 bis 52%, bezogen auf die Menge des insgesamt zugesetzten Zuckers, wobei die Menge an unverbraucht gebliebenem Zucker 0, 1 bis 0, 2% beträgt.
Die Erfindung soll an Hand von Zeichnungen näher erläutert werden. Fig. 1 zeigt schematisch die Stufen des erfindungsgemässen Verfahrens, Fig. 2 schematisch ein Beispiel für die Ausführung der enzymatischen Verzuckerungs- und Kultivierungsstufe und Fig. 3 ein weiteres Beispiel zur Ausführung dieser Stufe.
<Desc/Clms Page number 3>
In Fig. 1 ist mit --1-- eine Vorstufe zur Herstellung des Ausgangsmaterials, mit --2-- eine enzymatisehe Verflüssigungsstufe zur enzymatischen Hydrolyse von Stärke, mit --3-- eine Stufe zur Herstellung eines Kulturmediums, mit --4-- eine Sterilisierungsstufe durch Erhitzen, mit --5-- eine enzymatische Verzukkerungs-und Kultivierungsstufe, mit --6-- eine Trennstufe zur Isolierung der mikrobiellen Zellen, mit - eine Trocknungsstufe und mit --8-- das gewünschte Produkt bezeichnet.
Bei der Vorstufe zur Herstellung von Ausgangsmaterial werden verschiedene Materialien in Abhängigkeit von ihren Eigenschaften und Formen behandelt, um allfällige Schwierigkeiten bei den nachfolgenden Verfahrensstufen zu vermeiden.
EMI3.1
müssenschlämmung eingestellt. Bei Verwendung von Abwässern aus einer Anlage zur Stärkeherstellung als Ausgangsmaterial wird eine Behandlung zur Proteinentfernung ausgeführt, wenn erforderlich, zusätzlich zu den Behandlungen zur Einstellung des pH-Wertes und der Stärkekonzentration.
Bei der enzymatischen Verflüssigungsstufe wird das vorbehandelte Ausgangsmaterial durch Zusatz von einem dextrinogenen Enzym (0 !-Amylase) enzymatisch verflüssigt, kontinuierlich in zweistufige Verflüssigungsbehälter eingebracht, und auf eine Temperatur von 85 bis 880C erhitzt. Die Verweilzeit beträgt 60 bis 90 min.
Bei der Stufe zur Herstellung eines Kulturmediums wird das verflüssigte Material mit Wasser unter Bildung einer Lösung mit einer Gesamtzuckerkonzentration von 1 bis 8%, gewöhnlich von dz verdünnt. Hierauf werden die erforderlichen Mengen von anorganischen, Stickstoff, Phosphor, Magnesium und Kalium enthaltenden Nährsalzen dem Medium zugesetzt, wonach der pH-Wert desselben auf 4, 5 bis 6 eingestellt wird.
Das Vorhandensein von Stickstoff in dem Kulturmedium ist erforderlich. Es können eine oder mehrere anorganische, Stickstoff enthaltende Verbindungen oder in manchen Fällen organische Verbindungen, z. B.
Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und Ammoniumnitrat als Stickstoffquelle in den Kulturmedien verwendet werden. Zusätzlich werden auch anorganische Salze, wie Kalium-dihydrogenphosphat, Dina- triumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat und Eisen (n)-sulfat dem Medium als weitere erforderliche Nährmittelquelle zugesetzt.
Bei der Sterilisierungsstufe wird das so erhaltene Kulturmedium unter Druck bei 120 bis 1350C 10 bis 60 min lang sterilisiert. Diese Stufe wird im allgemeinen kontinuierlich nach Herstellung des Kulturmediums ausgeführt.
Bei der enzymatischen Verzuckerungs-und Kultivierungsstufe wird das sterilisierte Kulturmedium in die Fermentationsbehälter eingebracht, in denen Hefe, Bakterien oder andere Mikroorganismen gezüchtet werden. Bevorzugt eingesetzt werden erfindungsgemäss Hefen der Candida-Art und der lipidbildenden Rhodo- torula-Art, z. B. CandidautilisundRhodotorulaglutinis.
Gleichzeitig wird in die Behälter eine vorbestimmte Menge der saccharogenen Amylase (Gluko-Amylase) aseptisch zugesetzt, wodurch das Medium (die verflüssigte Lösung) verzuckert wird und zur gleichen Zeit die Mikroben unter Verwendung der gebildeten Glukose und Maltose als Kohlenstoffquelle wachsen.
Um die saccharogene Amylase aseptisch zuzusetzen, kann z. B. eine Lösung von sacoharogener Amylase sterilisiert werden, indem sie durch ein Mikrofilter mit einer Porengrösse von ungefähr 0,2 Mm (z. B. ein EX Mill pore-Filter, Millipore Corpor. U. S. A.) geleitet und dann dem Medium zugesetzt wird. Eine Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 4,0 bis 7,0 und eine Temperatur von 30 bis 520C unter Belüftung und Rühren ausgeführt. Obgleich diese Stufe auch ansatzweise vorgenommen werden kann, kann zwecks Erzielung bessere Resultate eine kontinuierliche mehrstufige Kultivierung verwendet werden.
Letztere wird im allgemeinen unter Verwendung einer Fermentationseinheit mit mehr als zwei in Serie angeordneten Fermentationsbehältern ausgeführt.
Fig. 2 zeigt ein Beispiel für die enzymatische Verzuckerungs- und Kultivierungsstufe mit drei in Serie angeordneten Fermentationsbehältern-11, 12 und 13--. Das Volumen des dritten Behälters Ist doppelt so gross wie jenes des ersten oder zweiten Behälters --11 oder 12-. Das Kulturmedium wird durch eine Leitung - und die saccharogene Amylase durch eine Leitung --16 -- eingebracht. Die drei Behälter sind in Serie mit zwei Leitungen-17A und 17B-- verbunden. Ein Teil des Kulturmediums wird von dem zweiten Behälter zu dem ersten Behälter über eine Leitung --14-- rückgeleitet, wobei die Menge dieses rückgelei- teten Kulturmediums von der Geschwindigkeit des Wachsen der verwendeten Mikrobe,
der Kapazität der Behälter, der Konzentration der Mikrobe und der Konzentration und der Menge des in die Behälter anfänglich eingebrachten Kulturmediums abhängt.
Der Zweck der Rückführung eines Teiles des Kulturmediums von dem zweiten zu dem ersten Behälter besteht darin, den ersten Behälter mit einer eine hohe Wachstumsrate aufweisenden Mikrobe aus dem zweiten Behälter zu impfen und dadurch die mikrobielle Konzentration im ersten Behälter zu stabilisieren, so dass die
<Desc/Clms Page number 4>
sogenannte Auswaschungwirkung nicht vor sich geht, selbst wenn eine grössere Menge des Kulturmediums in den ersten Behälter eingebracht wird.
Bei Rückführung des Mediums bei einem kontinuierlichen mehrstufigen Kultivierungsverfahren wird gewöhnlich das Medium aus dem letzten Behälter rückgeleitet. Die erfindungsgemässe Vorgangsweise unterscheidet sich von dieser herkömmlichen Verfahrensweise dadurch, dass das Medium rückgeleitet wird, das die Mikrobe in ihrer logarithmischen Wachstumsphase enthält und eine hohe Aktivität aufweist, nämlich das Medium aus dem zweiten Behälter.
Bei dem kontinuierlichen dreistufigen Kulturmediumsystem dieses Beispiels wird demnach ein Anwachsen der mikrobiellen Wirksamkeit und eine Beschleunigung der Verzuckerung in dem ersten Behälter vor sich gehen, wobei in dem zweiten Behälter eine logarithmische Mikrobenwachstumsphase vorliegt und die grösste Wachstumsgeschwindigkeit vor sich geht, wogegen die Mikrobe in dem dritten Behälter sich in der sogenannten stationären Phase befindet. Der biologische Sauerstoffbedarf und der entsprechende Wert des Abwassers des Fermentationsverfahrens sind auf Grund der mikrobiellen Ausreifung und Assimilation des zurückbleibenden Zuckers in dem Behälter der letzten Stufe beträchtlich herabgesetzt.
Fig. 3 zeigt ein weiteres Beispiel der enzymatischen Verzuckerungs-und Kultivierungsstufe ; die Fermentationseinheit umfasst, ebenso wie die Einheit gemäss Fig. 2, drei in Serie angeordnete Fermentationsbe- hälter --21, 22 und 23--, wobei jedoch die Fermentationswirksamkeit wesentlich verbessert ist.
Bei einer herkömmlichen Kultivierungseinheit, bei der das sogenannte Überlaufsystem nach dem kontinuierlichen mehrstufigen Kultivierungsverfahren verwendet wird, wird lediglich das Kulturmedium, das von einem Fermentationsbehälter überfliesst, zu dem nächsten Fermentationsbehälter geleitet.
Bei dieser Verfahrensweise ist es nicht einfach, einen gleichbleibenden Flüssigkeitspegel in dem Behälter beizubehalten. Da bei einer Kultivierung aerober Mikroorganismen eine Belüftung selbstverständlich erforderlich ist, bildet sich ein starker Schaum. Hinzu kommt, dass bei Verwendung von Melassen von Abwässern aus Anlagen zur Lebensmittelherstellung oder Stärkelösungen als Ausgangsmaterialien für die Kultur auf Grund des Vorliegens verschiedener schaumbildender Komponenten in solchen Materialien ein heftiges Schäumen vor sich geht, wobei der Flüssigkeitsstrom von dem ersten zum zweiten Behälter oder jener vom zweiten zum dritten Behälter Schaum oder Luftblasen mit sich führt, wodurch der Strom von Behälter zu Behälter nicht konstant bleibt.
Eine als Folge davon auftretende Schwankung der Strömungsgeschwindigkeit und der Verdünnungsgeschwindigkeit bei den herkömmlichen kontinuierlichen Überlauf- oder Umwälzungsverfahren bedingt einen geringen Ruheinhalt von mikrobiellen Zellen und eine unerwünschte Herabsetzung der Ausbeute.
Die Fermentationseinheit gemäss vorliegendem Beispiel dient dazu, obige Nachteile zu überbrücken. Ihr besonderes Kennzeichen besteht darin, dass eine Differenz der Höhe des Druckes innerhalb der ersten, zweiund dritten Fermentationsbehälter aufrecht erhalten wird, wodurch eine kontinuierliche Kultivierung von aeroben Mikroben in regelmässiger Weise bewirkt wird.
Eine Regelung des Flüssigkeitspegels ist äusserst schwierig, wenn bei Verwendung eines leicht schäumenden Materials eine aus Schaum und Flüssigkeit gebildete Emulsion entsteht. Gemäss dem vorliegenden Beispiel ist der Flüssigkeitspegel in den Behältern ausgeglichen, da der Flüssigkeitsstrom geregelt wird, indem eine Differenz zwischen denDrücken-P und P-der Behälter-21 und 22-- bzw. --P2 und P --der Behälter --22 und 23-- aufrecht erhalten wird.
Wenn der Flüssigkeitspegel in dem ersten Fermentationsbehälter infolge heftigen Schäumens ansteigt, kann der Flüssigkeitspegel erniedrigt werden, indem der Druck--P1 -- leicht erhöht wird, wobei gleichzeitig auch die Drücke-P und P-leicht erhöht werden, so dass ein beständiger Vorgang bei der kontinuierlichen mehrstufigen Kultivierung eingehalten werden kann.
Bei Verwendung der kontinuierlichen mehrstufigen Fermentationseinheit, bestehend aus dem ersten Be- hälter --21--, dem zweiten Behälter --22-- und dem dritten Behälter-23-, welche durch Leitungen-26 und 27-- miteinander verbunden sind, wird das Ausgangsmaterial durch den Einlass --24-- in den ersten Be- hälter --21-- eingebracht, wobei Luft durch eine Leitung --25-- in die einzelnen Behälter eingeleitet und durch eine Entlüftung --28-- abgeleitet wird.
Die Strömungsgeschwindigkeiten in den einzelnen Behältern werden gut ausgeglichen, indem eine Druckdifferenz mit Bezug auf die einzelnen Behälter hergestellt wird, so dass die Druckhöhe gewöhnlich im ersten Behälter 0, 1 bis 0,25 bar, im zweiten Behälter bei 0,06 bis 0, 18 bar und im dritten Behälter bei 0,03 bis 0, 15 bar gehalten wird, während die Flüssigkeit zwischen den Behältern durch die Leitungen--26 und 27-- strömt. Erforderlichenfalls kann der Druck im ersten Behälter liber 0,25 bar erhöht werden.
WennMelassen, abgeleitete Stärkelösungen oder Abwässer aus Anlagen zur Lebensmittelherstellung oder andere Materialien, die schäumende Komponenten enthalten, als Kohlenstoffquellen bei Mikrobenkulturen, insbesondere aeroben Kulturen, eingesetzt werden, muss eine Belüftung durch die Leitungen --25-- sowie auch ein Rühren des Mediums mit mechanischen Mitteln vorgesehen werden. In solchen Fällen wird das Schäumen so heftig, dass eine Weiterführung des Verfahrens unmöglich werden kann. Nach der Ausführung-
<Desc/Clms Page number 5>
weise gemäss vorliegendem Beispiel kann jedoch der Flüssigkeitspegel leicht geregelt werden, indem unterschiedliche Drücke in den einzelnen Behältern hergestellt werden.
Eine leichte Erhöhung des Druckes in den Behältern dient auch dazu, die Geschwindigkeit der Sauer- stoffweiterleitung zu erhöhen, so dass die Wachstumsgeschwindigkeit der aeroben Mikroben und somit die Ausbeute erhöht wird. Bei kontinuierlicher Kultivierung einer Hefe der Candida-Art in einem Medium, das anorganische Nährsalze und eine aus landwirtschaftlichen Produkten erhaltene Kohlenstoffquelle enthielt, betrug die Ausbeute an S. C. P., wenn die Fermentationseinheit gemäss Fig. 3 verwendet wurde, 50 Gew.-% oder sogar mehr bezogen auf das zugeführte Substrat.
Bei der Trenn- und Konzentrierungsstufe zur Isolierung der kultivierten mikrobiellen Zellen wird das Kulturmedium, in dem das Wachstum der Mikroben beendet ist, einer Dekantation unterworfen, um die
EMI5.1
allgemeinen unter Verwendung einer Zentrifuge der Düsenart oder unter Verwendung von andern Abscheidern unter Berücksichtigung der verwendeten Mikrobenart ausgeführt.
Bei der Trocknungsstufe wird eine Aufschlämmung oder ein Kuchen der mikrobiellen Zellen getrocknet, um das Endprodukt zu erhalten. Diese Behandlung erfolgt gewöhnlich unter Verwendung eines Sprühtrockners, eines Trommeltrockners oder Zerstäubungstrockners. In manchen Fällen kann es erwünscht sein, einen speziellen Trockner zu verwenden, um ein granuliertes Endprodukt zu erhalten.
Das vorliegende Verfahren, nach welchem die enzymatische Verflüssigungsstufe separat ausgeführt wird, besteht aus einer einfachen chemischen Reaktion, wogegen bei den herkömmlichen Verfahren (z. B. dem Amylo-, Koji- oder Symba-Verfahren) amylasebildende Mikroben zusammen kultivert werden müssen, bevor der Hauptfermentationsvorgang vorgenommen wird. Demgemäss ist das erfindungsgemässe Verfahren vorteilhaft, weil eine grössere Menge von Ausgangsmaterial leicht in einer kurzen Zeit behandelt werden kann, weil ferner das Verfahren einfach ist und automatisch geregelt werden kann und schliesslich weil ein Ausgangsmaterial, das eine hohe Konzentration aufweist, behandelt werden kann.
Da die enzymatische Verzuckerung und die Mikrobenkultivierung gleichzeitig ausgeführt werden können, benötigt man keinen separaten Behälter für die Verzuckerung, und die Hydrolyse geht schneller und wirkungsvoller vor sich. Diese Vorteile sind von besonderer Bedeutung bei der Herstellung von S. C. P. in industriellem Ausmass.
Die Erfindung soll an Hand von Beispielen näher erläutert werden.
Bei s pie 1 1 : Kassavawurzeln (Tapioka) werden vermahlen, wonach Wasser zugesetzt wird, um eine Aufschlämmung mit einem Stärkegehalt von annähernd 16% zu erhalten. Der pH-Wert der Aufschlämmung
EMI5.2
in einem Anteil von 0, 2%, bezogen auf die Stärke, zugesetzt wird. Diese Aufschlämmung wird bei einer Temperatur von 85 bis 880C während der enzymatischen Verflüssigungsstufe kontinuierlich verflüssigt.
Nach Entfernung der Verunreinigungen wird die verflüssigte Lösung mit Wasser verdünnt, bis die gesamte Zuckerkonzentration in der Lösung 1, 5 bis 6% beträgt. Sodann wird ein entsprechender Anteil von anorganischen Nährsalzen der Lösung zugesetzt und der pH-Wert auf 4, 5 bis 5 eingestellt, womit ein Kulturmedium hergestellt ist. Das Kulturmedium wird kontinuierlich durch Erhitzen in einer Sterilisierungseinrichtung sterilisiert und dann einem ersten Fermentationsbehälter zugeführt.
Bei der enzymatischen Verzuckerungs- und Kultivierungsstufe wird Candida utllis in dem Medium kontinuierlich kultiviert, wobei die saccharogene Amylase dem Medium kontinuierlich und aseptisch zugesetzt wird. Die gesamte Kultivierungszeit (Verweilzeit) beträgt 4 bis 8 h. Nach erfolgter Abtrennung in einer Zentrifuge und Konzentration des Mediums wird das erwünschte Produkt, S. C. P., erhalten. Die Ausbeute an trockenen mikrobiellen Zellen beträgt, bezogen auf die Tapioka-Stärke, 45 bis 53%.
Beispiel 2: Kassavawurzeln (Tapioka) werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt und verflüssigt. Die verflüssigte Lösung wird verdünnt auf eine Stärkekonzentration von 4%. Die erforderliche Menge an anorganischen Salzen, wie anorganischen Stickstoff-, Phosphor- oder Kaliumverbindungen, werden der Lösung zugesetzt, die sodann durch Erhitzen sterilisiert und kontinuierlich in den Fermentationsbehälter eingebracht wird.
Eine Hefe von Saccharomyces cerevisiae wird kontinuierlich in dem Kulturmedium kultiviert, wobei diesem aseptisch 0,3 bis 0,5% saccharogenes Enzym, bezogen auf das Gewicht des gesamten Zuckers in dem Medium, zugesetzt wird. Die unter Bildung von Glukose und Maltose vor sich gehende enzymatische Verzuckerung sowie die Hefevermehrung gehen gleichzeitig schnell vonstatten. Die gesamte Kultivierungsdauer (Verweilzeit) beträgt 6 bis 10 h. Die Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae, die in einer Zuckerlösung gewöhnlich unbeständig ist, geht ohne Schwierigkeiten, selbst bei einer verhältnismässig hohen Zuckerkonzentration von z. B. mehreren Prozenten, bezogen auf die Substrate des Kulturmediums, vor sich.
Die Hefezellen in dem Medium werden abgetrennt, konzentriert und getrocknet, wonach eine Masse von getrockneten Hefezellen erhalten wird. Die Ausbeute an Hefezellen beträgt 45 bis 50%, bezogen auf das Ge-
<Desc/Clms Page number 6>
wicht der Stärke in den Kassavawurzeln.
Beispiel 3 : Ein Abwasser aus einer Kartoffelstärkeanlage (Gehalt an Feststoffen ungefähr 8%, Gehalt an einem löslichen stickstofffreien Material 3 bis 4%) wird auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und durch Zusatz eines vorbestimmten Anteils von Verflüssigungsenzym verflüssigt. Sodann werden der Lösung Nährsalze zugesetzt, um ein Kulturmedium zu erhalten, das dann durch Erhitzen sterilisiert und kontinuierlich in den Fermentationsbehälter eingebracht wird. Eine Hefe der Candida-Art wird kontinuierlich in dem Medium kultiviert, wobei letzterem saccharogene Amylase mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit aseptisch zugesetzt wird. Die Hefezellen werden abgetrennt, konzentriert und getrocknet, wonach eine Masse von getrockneten Hefezellen erhalten wird.
Ungefähr 45% des löslichen stickstofffreien Materials wird zu Hefezellen umgesetzt.
Beispiel 4 : Rohe Kassava wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt und verflüssigt. Die verflüssigte Lösung wird auf eine Gesamtzuckerkonzentration von 2 bis 5% verdünnt. Hierauf werden Nährsalze zu der Lösung hinzugefügt, um einKulturmedium zu erhalten, in welchem das C/N-Verhältnis der Stickstoffquelle auf 20 bis 40 beschränkt wird.
Das Medium wird sterilisiert und in den Fermentationsbehälter geleitet. Eine Hefe der Rhodotorula-Art, die mit hoher Geschwindigkeit ein Lipid bilden kann, wird entweder ansatzweise oder kontinuierlich in dem Medium kultiviert, wobei diesem saccharogene Amylase aseptisch zugesetzt wird. Nach Abtrennung und Konzentration des Mediums wird der Feststoff getrocknet, um getrocknete Hefestellen mit einem hohen Lipidgehalt zu erhalten. Die Ausbeute an getrockneten Hefezellen beträgt 40 bis 48%, bezogen auf die Stärke in der rohen Kassava. Der Lipidgehalt der trockenen Hefezellen beträgt 15 bis 50%.
Wenn nach der Trennstufe und der Konzentrierung eine Lipid-Extraktionsstufe zur Isolierung der Hefezellen vorgesehen wird, wird ein Lipid hoher Qualität erhalten, das eine Zusammensetzung aufweist, die jener eines pflanzlichen Öls ähnlich ist. Ein nach der Extraktion des Lipids erhaltener trockener Rückstand liefert ferner eine trockene Masse von Hefezellen mit hohem Proteingehalt.
Beispiel 5 : Unter den nachstehend angegebenen Bedingungen wurde eine kontinuierliche Mikroben-
EMI6.1
EMI6.2
EMI6.3
betrugen 500,500 bzw. 1000 1. Ein Kulturmedium wurde in Anteilen von 300,300 und 600 1 in den entsprechenden Behältern vorgesehen, wobei die Mikrobeninkubation mit einer Zuleitungsgeschwindigkeit von 250 l/h ausgeführt wurde. Verwendet wurde eine Hefe der Candida-Art. Das eingesetzte Kulturmedium enthielt die nachstehenden anorganischen Nähr salze :
EMI6.4
<tb>
<tb> NHNO <SEP> 6 <SEP> g
<tb> KH2P04 <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Na2HPO. <SEP> 12H20 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> MgS04'7 <SEP> H20 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> FeSO <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> 1000 <SEP> ml, <SEP> PH <SEP> = <SEP> 5, <SEP> 5.
<tb>
Als Kohlenstoffquelle wurde eine Lösung, die durch Vermahlen, Verflüssigung und Verzuckern von rohen süssen Kartoffeln erhalten worden war, als 4% Glukose dem obigen Kulturmedium zugesetzt. Der pH-Wert des Mediums wurde mit NH40H eingestellt. Bei dieser kontinuierlichen dreistufigen Kultivierung war die Dauer der kontinuierlichen Kultivierung 500 h und betrug die Ausbeute zumindest 50%, bezogen auf die zugesetzte
EMI6.5
wobei x dasMikrobengewicht zum Zeitpunkt t ist.
Beispiel 6 : Die Zusammensetzung des Kulturmediums war dieselbe wie in Beispiel 5. Als Kohlenstoffquelle wurde dem Medlum Mqlasse mit einer Konzentration von 4 Gew.-% als Zucker zugesetzt. Candidautilis wurde kontinuierlich kultiviert. Die Drücke waren In den ersten, zweiten und dritten Behältern 0,25 bar (P), 0, 12 bar (P) bzw. 0, 15 bar (P) ; die Belüftungsmenge betrug 1, 0 VVM, 1,0 VVM bzw. 0, 5 VVM. Es wurde das kontinuierliche dreistufige Kulturverfahren unter Verwendung der In Fig. 3 gezeigten Fermentationseinheit ausgeführt.
Die Grösse der Behälter und die in diese eingebrachten Mediummengen waren die gleichen, wie die In Beispiel 5. Bei Durchführung dieser Kultivierung wurde eine kontinuierliche Kultivierung von mehr als 300 h ohne jegliche Schwierigkeit auf Grund von Verunreinigungen durch andere Mikroorganismen erzielt. Die Aus-
<Desc/Clms Page number 7>
beute an mikrobiellen Zellen betrug 52%, bezogen auf die Zuokerkonzentration in den verwendeten Melassen.
Es wurde keine Veränderung der mikrobiellen Zellen während der kontinuierlichen Kultivierung beobachtet.
EMI7.1
eine kontinuierliche Kultivierung unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 6 ausgeführt. Die Kultivierung der Hefe konnte ohne jegliche Schwierigkeit infolge von Verunreinigungen mit ändern Mikroorganismen während mehr als 400 h vorgenommen werden. Die Ausbeute an mikrobiellen Zellen betrug 48%, bezogen auf die Konzentration des zugesetzten Zuckers. Der Proteingehalt der mikrobiellen Zellen war 46 bis 52%.
Beispiel 8 : Unter Verwendung von Melassen an Stelle der herkömmlich als Kohlenstoffquelle verwendeten Candida-utilis wurde Rhodotorula gracilis als eine lipidbildende Hefe kultiviert.
Die Konzentration der Kohlenstoffquelle betrug 4 Gew.-%. Das anorganische Medium bestand aus 75 mg/l
EMI7.2
0,5 VVM. Es wurde eine kontinuierliche Kultivierung der Hefe bei einer Temperatur von 320C unter Rühren bei einer Geschwindigkeit von 200 Umdr/min unter Verwendung einer Fermentationseinheit gemäss Fig. 3 aus-
EMI7.3
Selbstverständlich können, wie für jeden Fachmann ersichtlich, die Beispiele sowohl mit Bezug auf die eingesetzten Materialien als auch auf die Kultivierungsbedingungen bei Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens abgeändert werden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Protein und Lipid aus Kohlenhydraten pflanzlichen Ursprungs durch Mikrobenverzuckerung und-kultivierung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kohlenhydrat mit einem destrinogenen Enzym unter Bildung eines Kulturmediums für eine Mikrobe verflüssigt wird, eine gleichzeitige enzymatische Verzuckerung und Kultivierung der Mikrobe vorgenommen wird, indem eine saccharogene Amylase dem Kulturmedium zugesetzt wird, während die Mikrobe in diesem kultiviert wird, und die kultivierten mikrobiellen Zellen und die Flüssigkeit von diesem Kulturmedium abgetrennt werden.