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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Eiweiss allein oder einem Gemisch von Eiweiss und Fett aus Kohlenhydraten von pflanzlichem Ursprung durch Kultur einer Mikrobe, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Kohlenhydrat mit einem dextrinogenen Enzym verflüssigt, um ein Kulturmedium für eine Mikrobe zu bilden, gleichzeitig die enzymatische Saccharifikation und die Kultur der Mikrobe durch aseptischen Zusatz einer saccharogenen Amylase zu dem genannten Kulturmedium durchführt, während die Mikrobe darin gezüchtet wird, und die gezüchteten Eiweiss oder ein Gemisch von Eiweiss und Fett enthaltenden mikrobiellen Zellen aus dem Kulturmedium abtrennt.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kohlenhydrat Stärke ist.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig die enzymatische Saccharifikation und die Kultur der Mikrobe unter Verwendung einer Fermentiereinheit durchgeführt wird, welche mindestens drei in Serie geschaltete Fermentiertanks enthält.
4. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Druckdifferenz zwischen den einzelnen Fermentiertanks aufrechterhalten wird, um die Menge an fliessender Fermentierflüssigkeit zwischen diesen Tanks zu regulieren.
5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobe eine Hefe vom Candida-Stamm ist, z.B. Candida utilis.
6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobe eine Hefe vom Rhodotorula Stamm ist, z.B. Rhodotorula gracilis.
7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dem Kulturmedium anorganische Nährsalze zugesetzt werden.
8. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium sterilisiert wird, bevor die gleichzeitige enzymatische Saccharifikation und die Kultur der Mikrobe erfolgt, z.B. bei 120 bis 135"C unter Druck.
9. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die kultivierten mikrobiellen Zellen durch Zentrifugieren vom Kulturmedium abgetrennt werden.
10. Mikrobielles Protein, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Eiweiss (im folgenden gelegentlich als S.C.P. bezeichnet) oder einem Gemisch von Eiweiss und Fett aus pflanzlichen Kohlenhydraten durch Züchtung einer Mikrobe in einem Kulturmedium, welches derartige Kohlenhydrate enthält. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren für die Herstellung von mikrobiellem Protein und Fett aus pflanzlichen Kohlenhydraten, insbesondere Stärke, welches durch die zweistufe Operation gekennzeichnet ist, welche die Verflüssigung von Stärke durch Zusatz von textrinogenen Enzymen zur Erzeugung eines Kulturmediums für eine Mikrobe und die Saccharifikation des verflüssigten Kulturmediums durch aseptischen Zusatz einer saccharogenen Amylase zu dem Kulturmedium, während die Mikrobe darin gezüchtet wird, umfasst.
In den letzten Jahren wurden einzellige Proteine künstlich aus pflanzlichen Kohlenhydraten oder mineralischen Kohlenwasserstoffen durch Züchtung eines Mikroorganismus hergestellt. Die derart erhaltene Proteine stammen aus den Zellen der gezüchteten Mikroorganismen und unterscheiden sich allgemein von denen, welche mit chemischen Mitteln aus pflanzlichen Quellen, z.B. Bohnen, nur extrahiert werden.
Diese künstlich erzeugten Proteine sind nützlich als Fleischersatz und finden zahlreiche Anwendungen in der Lebensmittelindustrie als Ersatz für Fleisch, als Zusatz zu Lebensmitteln und Futtermitteln usw.
Es wurden bisher zahlreiche Untersuchungen über die Herstellung von S.C.P. aus pflanzlichen Kohlenhydraten durch Züchtung einer Mikrobe in einem aus derartigen Kohlenhydraten hergestellten Kulturmedium beschrieben. In diesen Untersuchungen wurde als Ausgangsmaterial für die Fermentation oder Erzeugung von S.C.P. allein oder im Gemisch mit Fett Kohlenhydrate verwendet, welche typisch durch Monosaccharide und Oligosaccharide sowie Stärke vertreten sind, wobei die letztgenannte in grossen Mengen im Handel erhältlich ist. Die Verwendung von Stärke als Ausgangsmaterial ist daher vom wirtschaftlichen Standpunkt aus wünschenswert.
Wenn jedoch eine für die Kultur verwendete Mikrobe nur Monosaccharide oder Oligosaccharide verwerten kann, muss Stärke oder ähnliches hochmolekulares Material auf geeignete Weise zuvor hydrolysiert (saccharifiziert) werden, um es als Kulturmedium verwenden zu können.
Typische übliche Methoden zur Lösung dieses Problems sind das sogenannte Amyloverfahren, welches für die Erzeugung von Alkoholen aus Stärke verwendet wird, das Koji Verfahren und das Auswahlverfahren zwischen Koji- und Amyloverfahren. Gemäss diesen Methoden wird Koji (z.B.
Aspergillus oryzae) während mehreren zehn Stunden unter geeigneten Bedingungen in einer Vorstufe vor dem Hauptfermentationsverfahren gezüchtet, wobei Koji Amylase erzeugt, welche für die Saccharifikation im folgenden Verfahrensschritt verwendet wird. In diesem Fall sind die Regulierung und die Durchführung der Kultivation kompliziert und die Durchführung selbst benötigt eine lange Zeit. Diese Methoden sind daher nicht geeignet für solche Verfahren wie die Erzeugung von S.C.P., in welchen eine grosse Menge der Ausgangsmaterialien durch eine einfache Methode innerhalb einer kurzen Zeitspanne behandelt werden sollen.
Kürzlich erregte das Symb-Verfahren die öffentliche Aufmerksamkeit als ein Verfahren für die Herstellung von S.C.P.
aus einem Abwasser der Stärkeverarbeitung. Dieses Verfahren ist eine Methode mit gemischter Kultur (symbiotisch), in welchem die Saccharifikation von durch Wärme sterilisierter Stärke mit einer besonderen Art von Mikroben (Endomycopsis fibligar) durchgeführt wird, welche befähigt ist, Amylase zu erzeugen, welche Mikrobe in einem getrennten Fermentationsbehälter in einem Hauptfermentationsbehälter gezüchtet wird, worin die Haupthefe, Candida utilis, gezüchtet wird. Wenn jedoch die Anfangskonzentration der Stärke im Symba-Verfahren hoch ist, wird mit Sicherheit eine Gelatinisierung im Laufe der Wärmesterilisierungsbehandlung der Stärke erwartet. Es ist daher notwendig, eine Beschränkung der Konzentration der in das Verfahren eingeführten Stärke durchzuführen.
Da zwei verschiedene Arten von Hefen zusammen im Hauptfermentationsbehälter gezüchtet werden, wird ein gut ausgewogenes Wachstum zNi- schen den beiden Zellen als schwieriges Problem betrachtet.
Ausserdem ist die Aufrechterhaltung der Kultur und des Produktes mit stabiler Qualität in diesem Verfahren nicht einfach.
Unter diesen Umständen besteht ein grosser Bedarf für die Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von S.C.P. aus Stärke, bei welchem die Züchtung der Mikrobe einfach und wirksam ohne Störung durchgeführt werden kann.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht daher in der einfachen und automatisch regulierbaren Herstellung von
mikrobiellem Protein, welches als Ersatz für Fleisch und als Zusatz zu Lebensmitteln und Futtermitteln nützlich ist, durch Züchtung von Mikroben, welches eine Verflüssigungsstufe von Stärke durch die Wirkung eines dextrinogenen Enzyms sowie eine Stufe der enzymatischen Saccharifikation und der Kultur der Mikroben umfasst.
Es wurde nun gefunden, dass die Nachteile der bisherigen, oben beschriebenen Verfahren, überwunden werden können durch getrennte Ausführung einer Stufe der enzymatischen Verflüssigung von Stärke und einer Stufe der enzymatischen Saccharifikation und Züchtung zur Bewirkung der gleichzeitigen enzymatischen Saccharifikation und Züchtung einer Mikrobe.
Gemäss der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren für die Herstellung von mikrobiellem Protein allein oder im Gemisch mit Fett aus pflanzlichen Kohlenhydraten, einschliesslich Stärke, durch Züchtung einer Mikrobe dadurch gekennzeichnet, dass man ein Kohlenhydrat, z.B. Stärke, mit einem dextrinogenen Enzym in einem Verflüssigungsbehälter verflüssigt, um ein Kulturmedium für eine Mikrobe zu bilden, gleichzeitig die enzymatische Saccharifikation und die Kultur der Mikrobe durch aseptischen Zusatz einer saccharogenen Amylase zum Kulturmedium durchführt, während die Mikrobe darin gezüchtet wird, und die erhaltenen Eiweiss oder ein Gemisch von Eiweiss und Fett enthaltenden mikrobiellen Zellen aus dem Kulturmedium abtrennt.
Verschiedene Arten von hochmolekularen Kohlenhydraten und Stärke können als Ausgangsmaterialien für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Die Verwendung von Stärke wird bevorzugt, weil sie im Handel in grossen Mengen zu niederen Preisen erhältlich ist. Verschiedene pflanzliche Stärken, wie Kartoffelstärke und ein Abwasser aus einer Stärke herstellenden Fabrik, können als Ausgangsmaterial verwendet werden.
Das Verfahren kann mit Vorteil wie folgt durchgeführt werden:
Wenn Stärke als Ausgangsmaterial für die Erzeugung von S.C.P. verwendet wird, muss sie zuerst hydrolysiert werden, sofern nicht die verwendete Mikrobe eine Amylasewirksamkeit aufweist. Die Hydrolyse von Stärke wird z.B. kontinuierlich und rasch mit Hilfe eines im Handel erhältlichen dextrinogenen Enzyms in der Verflüssigungsstufe durchgeführt.
Anorganische Nährsalze können sodann zu der hydrolysierten Flüssigkeit zugesetzt werden, bis die Konzentration der Salze optimal für die Züchtung einer Mikrobe wird.
In der Sterilisationsstufe wird das derart zubereitete Kulturmedium sodann mit Hitze sterilisiert und in eine Fermentiereinheit befördert, welche üblicherweise aus einer Serie von mehreren Fermentiertanks besteht. In den folgenden enzymatischen Saccharifikations- und Kulturstufe wird eine im Handel erhältliche saccharogene Amylase aseptisch zum Kulturmedium in den Fermentiertanks zugesetzt, in welchen die enzymatische Saccharifikation und die Kultur der Mikrobe gleichzeitig durchgeführt werden. Auf diese Weise erfolgt die Hydrolyse rasch und wirksam. Es ist bekannt, dass hydrolytische Enzymreaktionen, wie die Saccharifikation, im allgemeinen reversibel sind, und dass eine Produktinhibition auftritt.
Im erfindungsgemässen Verfahren, in welchem die Saccharifikation und die Kultur gleichzeitig durchgeführt werden, wird die durch die Einwirkung der saccharogenen Amylase freigesetzt Glukose oder Maltose fortlaufend durch die coexistierende Mikrobe konsumiert und auf diese Weise rasch aus der Teilnahme an der hydrolytischen Reaktion entfernt. Sowohl die Umkehr der Reaktionen wie auch die Produktinhibition werden auf diese Weise vernachlässigbar. In der Tat erfordert es 60 bis 90 Stunden, um eine verflüssigte Stärkelösung in einem saccharifizierenden Reaktionsbehälter unter Verwendung einer gegebenen Menge an saccharogener Amylase unabhängig zu saccharifizieren, bis der Grad an Saccharifikation DE 97 steigt.
Hingegen betrug die Zeit für die chargenweise Kultur einer Candida-Hefe über 14 bis 24 Stunden in der Saccharifikations- und Kulturstufe der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer verflüssigten Stärkelösung mit einem totalen Zuckergehalt von 4%. In der Trennungs- und Konzentrationsstufe werden die gezüchteten mikrobiellen Zellen geerntet, z.B. durch Dekantieren und zentrifugale Abtrennung. Die derart isolierten mikrobiellen Zellen werden schliesslich in der Trocknungsstufe getrocknet, wobei das gewünschte mirkobielle Protein erhalten wird. Die Ausbeute der gezüchteten mikrobiellen Zellen beträgt im allgemeinen 45 bis 52% bezogen auf die Gesamtmenge an zugesetztem Zucker und die Menge an verbleibendem, nicht-verwertetem Zucker beträgt 0,1 bis 0,2%.
Die vorliegende Erfindung kann besser aus der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen verstanden werden, in welchen:
Fig. 1 ein Fliessschema, welches die Stufen des Verfahrens zeigt,
Fig. 2 eine schematische Ansicht eines Beispiels für die Ausführung der enzymatischen Saccharifikations- und Kulturstufe,
Fig. 3 eine schematische Sicht eines anderen Beispiels für die Durchführung der enzymatischen Saccharifikations- und Kulturstufe darstellt.
In Fig. list 1 eine Vorstufe für die Herstellung des Ausgangsmaterials, 2 eine enzymatische Verflüssigungsstufe für die enzymatische Hydrolyse der Stärke, 3 eine Stufe für die Herstellung eines Kulturmediums, 4 eine Stufe der Sterilisation durch Erhitzen, 5 die enzymatische Saccharifikationund Kulturstufe, 6 eine Trenn- und Konzentrationsstufe für die Gewinnung der hergestellten mikrobiellen Zellen, 7 eine Trocknungsstufe und 8 das gewünschte Produkt.
In der Vorstufe für die Herstellung des Ausgangsmaterials werden verschiedene Materialien je nach ihren Eigenschaften und Formen behandelt, wodurch jede Schwierigkeit in den folgenden Stufen verhindert wird. Wenn beispielsweise rohe Cassava- oder andere ähnliche Arten von rohen Kartoffelknollen als Ausgangsmaterial verwendet werden, müssen sie gemahlen, gesiebt, wenn nötig ein zweites Mahl gemahlen und schliesslich mit Wasser vermischt werden, um die gewünschte Stärkekonzentration zu erzielen. Der pH-Wert der Aufschlämmung wird eingestellt. Wenn ein Abwasser aus einer Stärke verarbeitenden Fabrik als Ausgangsmaterial verwendet wird, wird, falls notwendig, eine Behandlung für die Entfernung von Protein durchgeführt, zusätzlich zu den wesentlichen Behandlungen für die Einstellung des pH-Wertes und der Konzentration der Stärke.
In der enzymatischen Verflüssigungsstufe wird das derart vorbereitete Ausgangsmaterial enzymatisch durch Zusatz eines dextrinogenen Enzyms (a-Amylase) verflüssigt. Sie werden im allgemeinen kontinuierlich in zweistufige Verflüssigungstanks eingefüllt und auf eine Temperatur von 85 bis 88"C erhitzt. Die Verweilzeit beträgt im allgemeinen 60 bis 90 Minuten.
In der Stufe für die Herstellung eines Kulturmediums wird das verflüssigte Material mit Wasser verdünnt, um eine Lösung mit einer Gesamtzuckerkonzentration von 1 bis 8%, üblicherweise 4%, zu erhalten. Dann werden die notwendigen Mengen an anorganischen Nährsalzen, welche Stickstoff, Phosphor, Magnesium und Kalium enthalten, zu dem Medium zugesetzt und der pH-Wert zwischen 4,5 und 6 eingestellt. Die Gegenwart einer Stickstoffquelle im Kulturmedium ist notwendig. Eine oder mehrere anorganische Verbindungen oder auch organischer stickstoffhaltiger Verbin dungen, wie Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und Ammoniumnitrat, werden als Stickstoffquellen im Kulturmedium verwendet. Ausserdem werden anorganische Salze, wie Kaliumdihydrogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat und Ferrosulfat zum Medium zugesetzt als weitere notwendige Nährmittelquellen.
In der Sterilisationsstufe wird das derart erhaltene Kulturmedium bei 120 bis 135"C unter Druck während 10 bis 60 Minuten sterilisiert. Diese Stufe wird im allgemeinen kontinuierlich nach der Herstellung des Kulturmediums durchgeführt.
In der enzymatischen Saccharifikation- und Kulturstufe wird das sterilisierte Medium in die Fermentiertanks verbracht, in welchen Hefen, Bakterien oder andere Mikroorganismen gezüchtet werden. Die Verwendung von Hefen aus der Gruppe Candida und Lipid erzeugende Rhodotorula, z.B. Candida utilis und Rhodotorula glutinis, werden für das erfindungsgemässe Verfahren bevorzugt. Gleichzeitig wird eine vorgeschriebene Menge der saccharogenen Amylase (Glucoamylase) aseptisch zu den Tanks zugesetzt, wodurch das Medium (verflüssigte Lösung) saccharifiziert wird und gleichzeitig die Mikroben wirksam wachsen unter Verwertung der erzeugten Glucose und Maltose als Kohlenstoffquelle. Für den aseptischen Zusatz der saccharogenen Amylase wird z.B. eine Lösung der saccharogenen Amylase (z.B.
Glucuzyme-N-Lösung, Amano Seiyaku KK, Japan) sterilisiert, indem man sie durch ein Mikrofilter mit einer Porengrösse von etwa 0,2 p (z.B. EX Millipor-Filter, Millipore Corporation, USA) hindurchführt, und anschliessend zu dem Medium zugesetzt. Die Kultur wird unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 4,0 bis 7,0 und einer Temperatur von 30 bis 45"C unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Obwohl diese Stufe auch chargenweise durchgeführt werden kann, kann eine kontinuierliche Mehrstufenkultur verwendet werden, um wirksamere Resultate zu erzielen. Die kontinuierliche Mehrstufenkultur wird üblicherweise unter Verwendung einer Fermentiereinheit mit mehr als zwei Fermentiertanks, welche in Serie geschaltet sind, durchgeführt.
In Fig. 2, welche ein Beispiel der enzymatischen Saccharifi- kation- und Kulturstufe zeigt, umfasst eine derartige Fermentiereinheit drei Fermentiertanks 11, 12 und 13, die in Serie angeordnet sind. Das Volumen des dritten Tanks 13 ist das Doppelte von demjenigen des ersten oder zweiten Tanks 11 oder 12. Das Kulturmedium wird durch eine Leitung 15 zugeführt und die saccharogene Amylase durch eine Leitung 16.
Die drei Tanks sind in Serie mit zwei Leitungen 17A und 17B verbunden. Ein Teil des Kulturmediums wird aus dem zweiten Tank in den ersten Tank durch eine Leitung 14 zurückgeführt, wobei die Menge durch die Wachstumsgeschwindigkeit der verwendeten Mikrobe, dem Fassungsvermögen der Tanks, der Konzentration der Mikrobe und der Konzentration und Menge des zu Beginn in die Tanks eingeführten Kulturmediums abhängt.
Der Zweck der Rückführung eines Teiles des Kulturmediums aus dem zweiten in den ersten Tank besteht darin, den ersten Tank mit der Mikrobe von hoher Wachstumsgeschwindigkeit auf den zweiten Tank zu beimpfen und dadurch die mikrobielle Konzentration im ersten Tank zu stabilisieren, so dass das sogenannte Aufwaschen nicht stattfindet, selbst wenn eine grössere Menge des Kulturmediums in den ersten Tank eingefüllt wird. Wenn das Medium in einer kontinuierlichen mehrstufigen Kulturoperation zurück- geführt wird, ist es allgemein üblich, das Medium aus dem letzten Tank zurückzuführen. Das erfindungsgemässe Verfahren unterscheidet sich jedoch davon, indem das Medium, welches die Mikrobe logarithmischer Wachstumsphase mit hoher Aktivität aus dem zweiten Tank zurückgeführt wird.
In dem kontinuierlichen dreistufigen Kultursystem dieses Beispiels werden daher eine Erhöhung der mikrobiellen Wirksamkeit und eine Förderung der Saccharifikation im ersten Tank festgestellt, die Mikrobe in der logarithmischen Wachstumsrate im zweiten Tank, und die Mikrobe befindet sich in der sogenannten stationären Phase im dritten Tank.
Der biologische Sauerstoffbedarf und der entsprechende Wert des Abwassers des Fermentationsverfahrens werden möglich herabgesetzt infolge der mikrobiellen Reifung und der Assimilierung von restlichem Zucker im Tank der letzten Stufe.
In Fig. 3, welches ein anderes Beispiel der enzymatischen Saccharifikation- und Kulturstufe darstellt, umfasst die Fermentiereinheit drei Fermentiertanks 21, 22 und 23, welche in Serie geschaltet sind, wie in der Einheit von Fig. 2, jedoch eine wesentlich verbesserte Fermentierwirksamkeit aufweist.
Gemäss den üblichen Kultureinheiten, welche das sogenannte Overflow-System in einer kontinuierlichen mehrstufigen Kulturmethode anwenden, wird nur das Kulturmedium, welches von einem Fermentiertank überfliesst, in den nächsten Fermentiertank hinübergeführt. Es ist jedoch nicht so einfach, den Flüssigkeitsspiegel im Fermentiertank stabil zu halten. Da die Belüftung unerlässlich ist, um aerobe Mikroorganismen zu züchten, entsteht eine starke Schaumbildung.
Ferner, wenn Molassen, Abfallstärkelösungen oder Abwasser aus Nahrungsmittelindustrien als Ausgangsmaterial für die Kultur verwendet wird, entsteht eine starke Schaumbildung infolge der verschiedenen schäumenden Komponenten in derartigen Materialien, wodurch der Fluss der Flüssigkeit aus dem ersten Tank in den zweiten Tank oder diejenige aus dem zweiten Tank in den dritten Tank von Schaum oder Luftblasen begleitet wird, welche den Fluss von Tank zu Tank unstabil gestalten. Eine entsprechende Fluctation in der Verdünnung führt daher bei den üblichen kontinuierlichen Overflow- oder Rückführsystemen zu schlechter Aufrechterhaltung der mikrobiellen Zellen und unerwünschter Herabsetzung der Ausbeute der Produkte.
Die Fermentiereinheit des vorliegenden Beispiels wurde gestaltet, um die Nachteile der oben genannten Methode zu überwinden, und ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Unterschied in der Höhe des Druckes zwischen dem ersten, zweiten und dritten Fermentiertank aufrechterhalten wird, wodurch eine kontinuierliche Kultur von aeroben Mikroben unter ruhigen Bedingungen erhalten wird. Die Regulierung des Flüssigkeitsspiegels wird äusserst schwierig, wenn die Verwendung eines leicht schäumenden Material, seine gemischte Emulsion von Schäumen und Flüssigkeiten bewirkt. Gemäss dem vorliegenden Beispiel ist der Flüssigkeitsspiegel in den Tanks gut ausgewogen, weil der Fluss der Flüssigkeiten reguliert wird, indem eine Differenz zwischen den Druckhöhen Plund P2 der Tanks 21 und 22 und P2 und P3 der Tanks 22 und 23 gehalten wird.
Wenn der Flüssigkeitsspiegel im ersten Fermentiertank durch starkes Schäumen steigt, kann der Flüssigkeitsspiegel durch leichte Erhöhung des Druckes Pl herabgesetzt werden, während gleichzeitig auch die Drucke P2 und P3 leicht erhöht werden, wodurch eine stabile Operation der kontinuierlichen mehrstufigen Kultur ermöglicht wird.
In der kontinuierlichen mehrstufigen Fermentationseinheit, welche den ersten Tank 21, den zweiten Tank 22 und den dritten Tank 23 umfasst, welche durch die Leitungen 26 und 27 verbunden sind, wird das Ausgangsmaterial durch den Einlass 24 in den ersten Tank 21 eingeführt und die Luft durch eine Leitung 25 in die einzelnen Tanks eingeführt und durch einen Auslass 28 entlassen. Die Fliessgeschwindigkeiten in den einzelnen Tanks werden gut ins Gleichgewicht gebracht durch Erstellung einer Druckdifferenz zwischen den einzelnen Tanks in solcher Art, dass der Druck üblicherweise bei 1000 bis 2500 mm Aq. im ersten Tank, bei 600 bis
1800 mm Aq. im zweiten Tank und bei 300 bis 1500 mm Aq.
im dritten Tank gehalten wird, wodurch die Flüssigkeit zwischen den Tanks durch die Leitungen 26 und 27 fliesst. Falls notwendig kann der Druck im ersten Tank über 2500 mm Aq.
erhöht werden. Wenn Molassen, Abfallstärkelösung, ein Abwasser aus der Lebensmittelindustrie oder ähnliche schäumende Komponenten enthaltende Flüssigkeiten als Kohlenstoffquelle bei der Kultur von Mikroben verwendet werden, insbesondere von aeroben Mikroben, ist die Belüftung durch Dispergieren von Luft durch die Leitung 25 sowie das Rühren des Mediums mit mechanischen Mitteln unerlässlich.
In einem solchen Fall wird das Schäumen derart stark, dass das Weiterführen der Operation verunmöglicht werden kann.
Gemäss dem vorliegenden Beispiel kann jedoch der Flüssigkeitsspiegel leicht reguliert werden durch Erzeugen einer Differenz der Drucke zwischen den einzelnen Tanks sogar unter derartigen Verhältnissen. Ferner dient eine leichte Erhöhung des Druckes in den Tanks zur Erhöhung der Überführgeschwindigkeit von Sauerstoff, wodurch die Wachstumsgeschwindigkeit der aeroben Mikroben erhöht und die Ausbeute verbessert wird. Wenn eine Hefe, welche zu der Gruppe Candida gehört, kontinuierlich in einem Medium, das anorganische Nährsalze und eine Kohlenstoffquelle aus landwirtschaftlichen Produkten enthält, kontinuierlich kultiviert wird, in der in Fig. 3 dargestellten verbesserten Fermentiereinheit, beträgt die Ausbeute an S.C.P. 50% oder mehr, berechnet auf das zugeführte Substrat.
Bei der Trenn- und Konzentrationsstufe für die Gewinnung der kultivierten mikrobiellen Zellen wird das Kulturmedium, in welchem das Wachstum der Mikrobe beendet wurde, der Dekantierung unterworfen, um die überstehende Flüssigkeit von den Mikrobenzellen abzutrennen, welche sodann konzentriert werden. Wenn nötig wird die Aufschlämmung von Mikrobenzellen mit Wasser gespült und wiederum konzentriert. Diese Stufe wird im allgemeinen unter Verwendung einer Zentrifuge vom Düsentypus oder eines anderen Abscheiders, wie einer Dekantiervorrichtung, durchgeführt, je nach der Art der verwendeten Mikrobe.
In der Trocknungsstufe wird eine Aufschlämmung oder ein Kuchen der Mikrobenzellen getrocknet, um das Endprodukt zu erhalten. Diese Trocknungsbehandlung wird üblicherweise unter Verwendung eines Sprühtrockners, eines Trommeltrockners oder eines Schnelltrockners durchgeführt.
In gewissen Fällen kann eine spezielle Art von Trockner für die Herstellung des Produktes in Korn- oder Kugelform verwendet werden.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren, in welchem die enzymatische Verflüssigungsstufe unabhängig durchgeführt wird, kann das Verfahren als einfache chemische Reaktion betrieben werden im Vergleich zu den üblichen Verfahren (z.B. das Amylo-Verfahren, das Koji-Verfahren oder das Symba-Verfahren), in welchem die Amylase erzeugenden Mikroben zusammen vor dem Hauptfermentierverfahren gezüchtet werden müssen. Die vorliegende Erfindung ist daher vorteilhaft, indem grosse Mengen des Ausgangsmaterials leicht in einer kurzen Zeitspanne behandelt werden können, die Operation einfach ist und automatisch reguliert werden kann und das Ausgangsmaterial mit hoher Konzentration behandelt werden kann.
Weil die enzymatische Saccharifikation und die Kultur der Mikroben gleichzeitig durchgeführt werden kann, kann ein Behälter für die Saccharifikation weggelassen werden und die Hydrolyse erfolgt rascher und wirksamer. Diese Vorteile sind von besonderer Wichtigkeit für die grosstechnische Erzeugung von S.C.P.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiele
Cassava-Wurzeln (Tapioca) wurden vermahlen und mit
Wasser zu einer Aufschlämmung mit einem Stärkegehalt von etwa 16% verdünnt. Der pH-Wert der Aufschlämmung wurde auf 6,0 bis 6,2 eingestellt und ein dextrigenes Enzym (Spitase-K, Nagase Industrial Corporation, Japan) in einer
Menge von 0,2%, bezogen auf die Stärke, zugesetzt. Diese Aufschlämmung wurde kontinuierlich bei einer Temperatur von 85 bis 88 C in der enzymatischen Verflüssigungsstufe verflüssigt. Nach Entfernung der Verunreinigungen wurde die verflüssigte Lösung mit Wasser verdünnt, bis die Gesamtzuckerkonzentration in der Lösung 1,5 bis 6% betrug. Eine entsprechende Menge an anorganischen Nährsalzen wurde der Lösung zugesetzt und der pH-Wert auf 4,5 bis 5 eingestellt, wodurch ein Kulturmedium zubereitet war.
Das Kulturmedium wurde kontinuierlich mit Hitze in einem Sterilisierapparat sterilisiert und anschliessend in den ersten Fermentiertank befördert. In der enzymatischen Saccharifikations- und Kulturstufe wurde Candida utilis kontinuierlich im Medium gezüchtet, während die saccharogene Amylase kontinuierlich und aseptisch in einer bestimmten Menge zu dem Medium zugesetzt wurde. Die gesamte Kulturzeit (Verweilzeit) betrug 4 bis 8 Stunden. Nach der Abtrennung durch Zentrifugieren und der Konzentration des Mediums wurde das gewünschte Produkt, S.C.P. erhalten. Die Ausbeute an trockenen mikrobiellen Zellen betrug 45 bis 53%, berechnet auf die Stärke in Tapioca.
Beispiel 2
Cassava-Wurzeln (Tapioca) wurden auf dieselbe Art wie in Beispiel 1 behandelt und verflüssigt. Die verflüssigte Lösung wurde auf eine Konzentration von 4% Stärke verdünnt. Die notwendigen Mengen an anorganischen Salzen, wie anorganischen Verbindungen von Stickstoff, Phosphor, Kalium oder dergleichen, wurden zur Lösung zugesetzt, welche sodann durch Hitze sterilisiert und anschliessend im Fermentiertank verbracht wurde.
Eine Hefe von Saccharomyces cerevisiae wurde kontinuierlich im Kulturmedium gezüchtet, während 0,3 bis 0,5% saccharogenes Enzym, berechnet auf das Gewicht des gesamten Zuckers im Medium, aseptisch zum Medium zugeführt wurde. Die Erzeugung der Nebenprodukte der enzymatischen Saccharifikation, Glucose und Maltose, und die Vervielfachung der Hefe erfolgen gleichzeitig und rasch. Die totale Kulturzeit (Verweilzeit) betrug 6 bis 10 Stunden. Die Kultur von Saccharomyces cerevisiae, welche üblicherweise heikel ist in einer Zuckerlösung, kann ohne jede Schwierigkeit durchgeführt werden, selbst bei einer verhältnismässig hohen Konzentration an Zucker, wie mehrere Prozent, bezogen auf die Substrate des Kulturmediums.
Die Hefezellen im Medium wurden abgetrennt, konzentriert und getrocknet, wobei eine Masse aus trockenen Hefezellen erhalten wurden. Die Ausbeute an Hefezellen betrug 45 bis 50%, bezogen auf das Gewicht der Stärke in den Cassava Wurzeln.
Beispiel 3
Ein Abfluss aus einer Kartoffelstärkefabrik (Gehalt an trockenen Stoffen: etwa 8%, Gehalt an löslichen stickstofffreiem Material: 3 bis 4%) wurde auf pH 6 eingestellt und durch Zusatz einer gegebenen Menge des Verflüssigungsenzyms verflüssigt. Die nötigen anorganischen Nährsalze werden zur Lösung zugesetzt, um ein Kulturmedium zu erhalten, welches sodann mit Hitze sterilisiert und kontinuierlich im Fermentiertank eingefüllt wurde. Eine Hefe, welche zum Candida-Stamm gehörte, wurde kontinuierlich in dem Medium kultiviert, während gleichzeitigt saccharogene Amylase aseptisch in einer vorgegebenen Geschwindigkeit zugesetzt wird. Die Hefezellen in dem Medium wurden abgetrennt, konzentriert und getrocknet, wobei eine Masse aus trockenen Hefezellen erhalten wurde.
In diesem Fall wurde geschätzt, dass etwa 45% des löslichen stickstofffreien Materials in Hefezellen umgewandelt worden waren.
Beispiel 4
Rohe Cassava-Wurzeln wurden wie in Beispiel 1 behandelt und verflüssigt. Die verflüssigte Lösung wurde zu einer Gesamtzuckerkonzentration von 2 bis 5% verdünnt. Anorganische Nährsalze wurden sodann zur Lösung zugesetzt, um ein Kulturmedium zu erhalten, in welchem das Verhältnis C/N der Stickstoffquelle auf 20 bis 40 beschränkt war.
Das Medium wurde sterilisiert und sodann in den Fermentiertank eingefüllt. Eine Hefe des Rhodotorula-Stammes, welcher fähig war Fett in hoher Geschwindigkeit zu erzeugen, wurde entweder chargenweise oder kontinuierlich im Medium kultiviert, während gleichzeitig saccharogene Amylase mit einer gegebenen Geschwindigkeit aseptisch zugesetzt wurde. Nach dem Abtrennen und dem Konzentrieren des Mediums wurde der Feststoff getrocknet, um trockene Hefezellen von hohem Fettgehalt zu erhalten. Die Ausbeute an trockenen Hefezellen betrug 40 bis 48%, bezogen auf die Stärke in der rohen Cassava. Der Fettgehalt in den trockenen Hefezellen betrug 15 bis 50%.
Wenn eine Fettextraktionsstufe nach der Abtrennung und der Konzentration zwecks Isolierung der Hefezellen erfolgt, wird ein Fett von hoher Qualität mit einer ähnlichen Zusammensetzung wie derjenigen eines pflanzlichen Öles erhalten.
Ferner ergibt der trockene Rückstand nach der Extraktion des Fettes eine trockene Masse von Hefezellen mit hohem Proteingehalt.
Beispiel5
Unter den unten aufgeführten Bedingungen wurde eine kontinuierliche Kultur einer Mikrobe, unter Verwendung der in Fig. 3 dargestellten Fermentiereinheit durchgeführt. Der Druck betrug 1800 mm Aq. im ersten Tank, 1500 mm Aq. im zweiten Tank und 1000 mm Aq. im dritten Tank. Die Belüftungsmenge betrug 0,5 VVM im ersten Tank, 1 VVM im zweiten und 0,5 VVM im dritten Tank. Die Gesamtvolumina des ersten, zweiten und dritten Tanks betrug 500 Liter bzw. 50 Liter bzw. 1000 Liter. Ein Kulturmedium wurde in Mengen von 300 Litern bzw. 300 Litern und 600 Litern in den entsprechenden Tanks gehalten und die Inkubation einer Mikrobe wurde bei einer Zufuhrgeschwindigkeit von 250 Liter pro Stunde durchgeführt. Die verwendete Mikrobe war eine Hefe aus der Candida-Art.
Das verwendete Kulturmedium enthielt die folgenden anorganischen Nährsalze: NH4NO3 6g KH2PO4 3g Na2HPO4- 12H20 0,5 g MgSO4- 7H20 0,5 g FeSO4 0,5 g Leitungswasser 1000 ml, pH 5,5 Als Kohlenstoffquelle wurde eine Lösung hergestellt durch Vermahlen, Verflüssigen und Saccharifizieren von rohen Süsskartoffeln als 4% Glucose zum obigen Kulturmedium zugesetzt. Der pH-Wert des Mediums wurde mit NH40H eingestellt. Als Resultat dieser kontinuierlichen dreistufigen Kultur, bei welcher eine Periode der kontinuierlichen Kultur 500 Stunden dauerte, betrug die Ausbeute 50% oder mehr, bezogen auf die zugesetzte Kohlenstoffquelle, und die Vervielfältigungsgeschwindigkeit (p) der Hefe betrug 0,6.
Beispiel 6
Die verwendete Zusammensetzung des Kulturmediums war dieselbe wie in Beispiel 5. Molassen wurden als Kohlenstoffquelle zu dem Medium in einer Konzentration von 4% (Gewicht/Gewicht) als Zucker zugesetzt. Candida utilis wurde kontinuierlich darin gezüchtet. Die Drucke in dem ersten, zweiten und dritten Tank betrugen 2500 mm Aq. (ei), 2000 mm Aq. (P2) und 1500 mm Aq. (P3), und die Mengen an Belüftung betrug 1,0 WM bzw. 1,0 VVM und 0,5 VVM in den einzelnen Tanks. Die kontinuierliche dreistufige Kulturmethode wurde unter Verwendung der in Fig. 3 dargestellten Fermentiereinheit durchgeführt. Die Grösse der Tanks und die Menge an eingefülltem Medium waren identisch mit denjenigen in Beispiel 5.
Als Resultat dieser Kultur wurde die kontinuierliche Kultur von mehr als 300 Stunden ohne jede Schwierigkeit durch Verunreinigung mit anderen Mikroorganismen durchgeführt. Die Ausbeute an mikrobiellen Zellen betrug 52% berechnet auf die Zuckerkonzentration in den zugesetzten Molassen. Es wurde keine Variation der mikrobiellen Zellen während der kontinuierlichen Kultur festgestellt.
Beispiel 7
Ein anorganisches Medium mit derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 5 beschrieben wurde zubereitet und eine Abfallösung aus der Kartoffelstärkeverarbeitung als Kohlenstoffquelle verwendet. Candida utilis wurde als Hefe in dem Medium gezüchtet. Die Kohlenstoffquelle wurde in einer Konzentration von 4% zugesetzt. Die kontinuierliche Kultur wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 6 durchgeführt. Die Kultur der Hefe konnte während mehr als 400 Stunden fortgesetzt werden ohne irgendwelche Schwierigkeiten durch Verunreinigung mit anderen Mikroorganismen.
Die Ausbeute an mikrobiellen Zellen betrug 48%, bezogen auf die Konzentration des zugesetzten Zuckers. Der Proteingehalt der mikrobiellen Zellen betrug 46 bis 52%.
Beispiel 8
Unter Verwendung von Molassen anstelle der üblicherweise für Candida utilis verwendeten Kohlenstoffquelle wurde Rhodotorula gracilis als Fett erzeugende Hefe kultiviert. Die Konzentration an Kohlenstoffquelle betrug 4% (Gewicht/Gewicht). Das anorganische Medium enthielt 75 mg/Liter Harnstoff und 25 mg/Liter KH2PO4 und wurde auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Die Belüftung erfolgt mit 0,5 WM. Eine kontinuierliche Kultur der Hefe wurde bei einer Temperatur von 32"C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 200 Touren pro Minute unter Verwendung der in Fig. 3 dargestellten Fermentiereinheit durchgeführt. Die Drucke in dem ersten, zweiten und dritten Tank betrugen 1200 mm Aq. (Pl), 800 mm Aq. (P2) und 500 mm Aq.
(P3). Als Resultat dieser kontinuierlichen Kultur, welche während 250 Stunden durchgeführt wurde, erreichte der Fettgehalt 39,6%, bezogen auf die trockenen Hefezellen.
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PATENT CLAIMS
1. A method for producing microbial protein alone or a mixture of protein and fat from carbohydrates of vegetable origin by culture of a microbe, characterized in that one liquefies a carbohydrate with a dextrinogenic enzyme to form a culture medium for a microbe, at the same time enzymatic saccharification and culture of the microbe by aseptically adding a saccharogenic amylase to said culture medium while the microbe is grown therein and separating the cultured protein or a mixture of protein and fat-containing microbial cells from the culture medium.
2. The method according to claim 1, characterized in that the carbohydrate is starch.
3. The method according to claim 1, characterized in that the enzymatic saccharification and the culture of the microbe is carried out simultaneously using a fermentation unit which contains at least three fermentation tanks connected in series.
4. The method according to claim 3, characterized in that a pressure difference between the individual fermentation tanks is maintained in order to regulate the amount of flowing fermentation liquid between these tanks.
5. The method according to claim 1, characterized in that the microbe is a yeast from the Candida strain, e.g. Candida utilis.
6. The method according to claim 1, characterized in that the microbe is a yeast from the Rhodotorula strain, e.g. Rhodotorula gracilis.
7. The method according to claim 1, characterized in that inorganic nutrient salts are added to the culture medium.
8. The method according to claim 1, characterized in that the culture medium is sterilized before the simultaneous enzymatic saccharification and the culture of the microbe, e.g. at 120 to 135 "C under pressure.
9. The method according to claim 1, characterized in that the cultured microbial cells are separated from the culture medium by centrifugation.
10. Microbial protein, produced by the method according to claim 1.
The present invention relates to a process for producing microbial protein (hereinafter sometimes referred to as S.C.P.) or a mixture of protein and fat from vegetable carbohydrates by culturing a microbe in a culture medium containing such carbohydrates. In particular, the present invention relates to a process for the production of microbial protein and fat from vegetable carbohydrates, in particular starch, which is characterized by the two-stage operation which involves the liquefaction of starch by adding textrinogenic enzymes to produce a culture medium for a microbe and saccharification of the liquefied culture medium by aseptically adding a saccharogenic amylase to the culture medium while the microbe is grown therein.
In recent years, unicellular proteins have been artificially produced from vegetable carbohydrates or mineral hydrocarbons by growing a microorganism. The proteins thus obtained originate from the cells of the cultured microorganisms and generally differ from those which are obtained with chemical agents from plant sources, e.g. Beans, just be extracted.
These artificially produced proteins are useful as a meat substitute and have numerous uses in the food industry as a substitute for meat, as an additive to food and feed, etc.
So far, numerous studies on the production of S.C.P. described from vegetable carbohydrates by culturing a microbe in a culture medium prepared from such carbohydrates. In these studies, the raw material for the fermentation or production of S.C.P. used alone or in a mixture with fat carbohydrates, which are typically represented by monosaccharides and oligosaccharides and starch, the latter being commercially available in large quantities. The use of starch as a starting material is therefore desirable from an economic point of view.
However, if a microbe used for culture can only utilize monosaccharides or oligosaccharides, starch or similar high-molecular material must be suitably hydrolyzed (saccharified) beforehand in order to use it as a culture medium.
Typical common methods for solving this problem are the so-called amylo process, which is used for the production of alcohols from starch, the koji process and the selection process between koji and amylo processes. According to these methods, koji (e.g.
Aspergillus oryzae) grown for several tens of hours under suitable conditions in a preliminary step before the main fermentation process, Koji producing amylase, which is used for the saccharification in the following process step. In this case, regulation and implementation of cultivation are complicated, and implementation itself takes a long time. These methods are therefore not suitable for processes such as the production of S.C.P. in which a large amount of the starting materials are to be treated by a simple method within a short period of time.
Recently, the Symb process has attracted public attention as a process for the manufacture of S.C.P.
from a wastewater from starch processing. This method is a mixed culture (symbiotic) method in which the saccharification of heat sterilized starch is carried out with a particular type of microbe (Endomycopsis fibligar) which is capable of producing amylase, which microbe in a separate fermentation tank in one Main fermentation tank is grown in which the main yeast, Candida utilis, is grown. However, if the initial starch concentration in the Symba process is high, gelatinization is surely expected in the course of the heat sterilization treatment of the starch. It is therefore necessary to limit the concentration of the starch introduced into the process.
Because two different types of yeast are grown together in the main fermentation tank, well-balanced growth between the two cells is considered a difficult problem.
In addition, maintaining the culture and the product with stable quality is not easy in this process.
Under these circumstances, there is a great need for the development of a new process for the production of S.C.P. from starch, in which the cultivation of the microbe can be carried out simply and effectively without interference.
An object of the present invention is therefore the simple and automatically controllable production of
microbial protein, which is useful as a substitute for meat and as an additive to food and feed, by growing microbes, which comprises a liquefaction step of starch by the action of a dextrinogenic enzyme and a step of enzymatic saccharification and culture of the microbes.
It has now been found that the disadvantages of the previous methods described above can be overcome by separately carrying out a step of enzymatic liquefaction of starch and a step of enzymatic saccharification and cultivation to effect the simultaneous enzymatic saccharification and cultivation of a microbe.
According to the present invention, the process for the production of microbial protein, alone or in a mixture with fat from vegetable carbohydrates, including starch, is characterized by culturing a microbe in that a carbohydrate, e.g. Starch liquefied with a dextrinogenic enzyme in a liquefaction container to form a culture medium for a microbe while simultaneously carrying out enzymatic saccharification and culture of the microbe by aseptically adding a saccharogenic amylase to the culture medium while the microbe is grown therein, and the obtained protein or separates a mixture of protein and fat-containing microbial cells from the culture medium.
Various types of high molecular carbohydrates and starch can be used as starting materials for the present invention. The use of starch is preferred because it is commercially available in large quantities at low prices. Various vegetable starches such as potato starch and wastewater from a starch manufacturing factory can be used as a raw material.
The method can advantageously be carried out as follows:
When starch is the raw material for the production of S.C.P. is used, it must first be hydrolyzed, unless the microbe used has amylase activity. The hydrolysis of starch is e.g. carried out continuously and rapidly in the liquefaction stage using a commercially available dextrinogenic enzyme.
Inorganic nutrient salts can then be added to the hydrolyzed liquid until the concentration of the salts becomes optimal for growing a microbe.
In the sterilization stage, the culture medium prepared in this way is then sterilized with heat and transported to a fermentation unit, which usually consists of a series of several fermentation tanks. In the following enzymatic saccharification and culture step, a commercially available saccharogenic amylase is aseptically added to the culture medium in the fermentation tanks, in which the enzymatic saccharification and the culture of the microbe are carried out simultaneously. In this way, hydrolysis is quick and effective. It is known that hydrolytic enzyme reactions, such as saccharification, are generally reversible and that product inhibition occurs.
In the process according to the invention, in which the saccharification and the culture are carried out simultaneously, the glucose or maltose released by the action of the saccharogenic amylase is continuously consumed by the coexisting microbe and thus quickly removed from participation in the hydrolytic reaction. In this way, both the reversal of the reactions and the product inhibition become negligible. Indeed, it takes 60 to 90 hours to independently saccharify a liquefied starch solution in a saccharifying reaction vessel using a given amount of saccharogenic amylase until the level of saccharification DE 97 increases.
On the other hand, the time for batch culture of a Candida yeast was 14 to 24 hours in the saccharification and culture stage of the present invention using a liquefied starch solution with a total sugar content of 4%. In the separation and concentration stage, the cultured microbial cells are harvested, e.g. by decanting and centrifugal separation. The microbial cells isolated in this way are finally dried in the drying stage, the desired microbial protein being obtained. The yield of the cultured microbial cells is generally 45 to 52% based on the total amount of added sugar and the amount of remaining unused sugar is 0.1 to 0.2%.
The present invention can be better understood from the following description with reference to the accompanying drawings, in which:
1 is a flow diagram showing the stages of the process,
2 is a schematic view of an example of the execution of the enzymatic saccharification and culture step,
Figure 3 is a schematic view of another example of performing the enzymatic saccharification and culture step.
In Fig. 1, a precursor for the preparation of the starting material, 2 an enzymatic liquefaction step for the enzymatic hydrolysis of the starch, 3 a step for the preparation of a culture medium, 4 a step of sterilization by heating, 5 the enzymatic saccharification and culture step, 6 a separation - and concentration stage for the production of the microbial cells produced, 7 a drying stage and 8 the desired product.
In the preliminary stage for the production of the starting material, various materials are treated according to their properties and shapes, which prevents any difficulty in the subsequent stages. For example, if raw cassava or other similar types of raw potato tubers are used as the starting material, they must be ground, sieved, ground if necessary, and finally mixed with water to achieve the desired starch concentration. The pH of the slurry is adjusted. When a wastewater from a starch processing plant is used as a raw material, a treatment for removing protein is carried out, if necessary, in addition to the essential treatments for adjusting the pH and concentration of the starch.
In the enzymatic liquefaction stage, the starting material prepared in this way is liquefied enzymatically by adding a dextrinogenic enzyme (α-amylase). They are generally filled continuously into two-stage liquefaction tanks and heated to a temperature of 85 to 88 ° C. The residence time is generally 60 to 90 minutes.
In the culture medium preparation step, the liquefied material is diluted with water to obtain a solution with a total sugar concentration of 1 to 8%, usually 4%. Then the necessary amounts of inorganic nutrient salts, which contain nitrogen, phosphorus, magnesium and potassium, are added to the medium and the pH is adjusted between 4.5 and 6. The presence of a nitrogen source in the culture medium is necessary. One or more inorganic compounds or organic nitrogen-containing compounds, such as urea, ammonium sulfate, ammonium phosphate and ammonium nitrate, are used as nitrogen sources in the culture medium. In addition, inorganic salts such as potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium sulfate and ferrous sulfate are added to the medium as further necessary nutrient sources.
In the sterilization stage, the culture medium thus obtained is sterilized at 120 to 135 ° C. under pressure for 10 to 60 minutes. This stage is generally carried out continuously after the culture medium has been prepared.
In the enzymatic saccharification and culture stage, the sterilized medium is brought into the fermentation tanks in which yeast, bacteria or other microorganisms are grown. The use of yeasts from the Candida group and lipid-producing rhodotorula, e.g. Candida utilis and Rhodotorula glutinis are preferred for the method according to the invention. At the same time, a prescribed amount of the saccharogenic amylase (glucoamylase) is aseptically added to the tanks, whereby the medium (liquefied solution) is saccharified and, at the same time, the microbes grow effectively using the glucose and maltose produced as a carbon source. For the aseptic addition of saccharogenic amylase e.g. a solution of saccharogenic amylase (e.g.
Glucuzyme-N solution, Amano Seiyaku KK, Japan) by passing it through a microfilter with a pore size of about 0.2 p (e.g. EX Millipor filter, Millipore Corporation, USA) and then adding it to the medium. The culture is carried out under aerobic conditions at a pH of 4.0 to 7.0 and a temperature of 30 to 45 ° C. with aeration and stirring. Although this step can also be carried out in batches, a continuous multi-step culture can be used, The continuous multi-stage culture is usually carried out using a fermentation unit with more than two fermentation tanks connected in series.
In FIG. 2, which shows an example of the enzymatic saccharification and culture stage, such a fermentation unit comprises three fermentation tanks 11, 12 and 13, which are arranged in series. The volume of the third tank 13 is double that of the first or second tank 11 or 12. The culture medium is supplied through a line 15 and the saccharogenic amylase through a line 16.
The three tanks are connected in series with two lines 17A and 17B. A portion of the culture medium is returned from the second tank to the first tank through line 14, the amount being determined by the growth rate of the microbe used, the capacity of the tanks, the concentration of the microbe and the concentration and amount of that initially introduced into the tanks Culture medium depends.
The purpose of returning part of the culture medium from the second to the first tank is to inoculate the first tank with the microbe of high growth rate onto the second tank and thereby to stabilize the microbial concentration in the first tank so that the so-called washing does not occur takes place even if a large amount of the culture medium is filled in the first tank. When returning the medium in a continuous multi-stage culture operation, it is common practice to return the medium from the last tank. The method according to the invention, however, differs from this in that the medium which returns the microbe logarithmic growth phase with high activity from the second tank.
In the continuous three-stage culture system of this example, therefore, an increase in the microbial effectiveness and a promotion of saccharification in the first tank are found, the microbe in the logarithmic growth rate in the second tank, and the microbe is in the so-called stationary phase in the third tank.
The biological oxygen demand and the corresponding value of the waste water from the fermentation process are possibly reduced due to the microbial ripening and the assimilation of residual sugar in the tank of the last stage.
In Fig. 3, which is another example of the enzymatic saccharification and culture stage, the fermentation unit comprises three fermentation tanks 21, 22 and 23 which are connected in series as in the unit of Fig. 2, but has a substantially improved fermentation efficiency.
According to the usual culture units, which use the so-called overflow system in a continuous, multi-stage culture method, only the culture medium which overflows from one fermentation tank is transferred to the next fermentation tank. However, it is not so easy to keep the liquid level in the fermentation tank stable. Since ventilation is essential to grow aerobic microorganisms, strong foaming occurs.
Furthermore, when molasses, waste starch solutions, or sewage from food industries is used as the raw material for the culture, there is a strong foaming due to the various foaming components in such materials, thereby causing the flow of the liquid from the first tank to the second tank or that from the second tank in the third tank is accompanied by foam or air bubbles, which make the flow from tank to tank unstable. A corresponding fluctuation in the dilution therefore leads to poor maintenance of the microbial cells and an undesirable reduction in the yield of the products in the conventional continuous overflow or return systems.
The fermentation unit of the present example was designed to overcome the disadvantages of the above-mentioned method and is characterized in that a difference in the level of pressure is maintained between the first, second and third fermentation tanks, which results in a continuous culture of aerobic microbes calm conditions is maintained. The regulation of the liquid level becomes extremely difficult when the use of a slightly foaming material results in its mixed emulsion of foams and liquids. According to the present example, the liquid level in the tanks is well balanced because the flow of liquids is regulated by keeping a difference between the pressure levels Plund P2 of tanks 21 and 22 and P2 and P3 of tanks 22 and 23.
If the liquid level in the first fermentation tank rises due to strong foaming, the liquid level can be reduced by slightly increasing the pressure P1, while at the same time the pressures P2 and P3 are also slightly increased, which enables stable operation of the continuous multi-stage culture.
In the continuous multi-stage fermentation unit comprising the first tank 21, the second tank 22 and the third tank 23, which are connected by the lines 26 and 27, the raw material is introduced into the first tank 21 through the inlet 24 and the air through a line 25 is inserted into the individual tanks and discharged through an outlet 28. The flow velocities in the individual tanks are well balanced by creating a pressure difference between the individual tanks in such a way that the pressure is usually around 1000 to 2500 mm Aq. in the first tank, at 600 to
1800 mm Aq. in the second tank and at 300 to 1500 mm Aq.
is held in the third tank, whereby the liquid between the tanks flows through the lines 26 and 27. If necessary, the pressure in the first tank can exceed 2500 mm Aq.
increase. When molasses, waste starch solution, liquids containing wastewater from the food industry or similar foaming components are used as a carbon source in the culture of microbes, particularly aerobic microbes, aeration is by dispersing air through line 25 and stirring the medium by mechanical means essential.
In such a case, the foaming becomes so strong that the operation cannot be continued.
However, according to the present example, the liquid level can be easily regulated by generating a difference in pressure between the individual tanks even under such conditions. Furthermore, a slight increase in the pressure in the tanks serves to increase the transfer rate of oxygen, which increases the growth rate of the aerobic microbes and improves the yield. When a yeast belonging to the Candida group is continuously cultivated in a medium containing inorganic nutrient salts and a carbon source from agricultural products in the improved fermentation unit shown in Fig. 3, the yield of S.C.P. 50% or more, calculated on the substrate supplied.
In the separation and concentration step for the recovery of the cultured microbial cells, the culture medium in which the growth of the microbe has ended is subjected to decantation to separate the supernatant from the microbial cells, which are then concentrated. If necessary, the slurry of microbial cells is rinsed with water and concentrated again. This step is generally carried out using a nozzle type centrifuge or other separator such as a decanter, depending on the type of microbe used.
In the drying step, a slurry or cake of the microbial cells is dried to obtain the final product. This drying treatment is usually carried out using a spray dryer, a drum dryer or a quick dryer.
In certain cases, a special type of dryer can be used to manufacture the product in the form of a grain or ball.
According to the method according to the invention, in which the enzymatic liquefaction stage is carried out independently, the method can be operated as a simple chemical reaction compared to the usual methods (eg the amylo method, the koji method or the symba method), in which the Amylase-producing microbes must be grown together before the main fermentation process. The present invention is therefore advantageous in that large amounts of the starting material can be easily treated in a short period of time, the operation is simple and can be regulated automatically, and the starting material can be treated at a high concentration.
Because the enzymatic saccharification and the culture of the microbes can be carried out simultaneously, a container for the saccharification can be omitted and the hydrolysis is faster and more efficient. These advantages are of particular importance for the large-scale production of S.C.P.
The present invention will now be explained in more detail with the aid of the following examples.
Examples
Cassava roots (tapioca) were ground and with
Dilute water to a slurry with a starch content of approximately 16%. The pH of the slurry was adjusted to 6.0 to 6.2 and a dextrigenic enzyme (Spitase-K, Nagase Industrial Corporation, Japan) in one
Amount of 0.2%, based on the starch, added. This slurry was continuously liquefied at a temperature of 85 to 88 C in the enzymatic liquefaction step. After removing the contaminants, the liquefied solution was diluted with water until the total sugar concentration in the solution was 1.5 to 6%. An appropriate amount of inorganic nutrient salts was added to the solution and the pH was adjusted to 4.5 to 5, whereby a culture medium was prepared.
The culture medium was continuously sterilized with heat in a sterilizer and then transported to the first fermentation tank. In the enzymatic saccharification and culture stage, Candida utilis was grown continuously in the medium, while the saccharogenic amylase was continuously and aseptically added to the medium in a certain amount. The total culture time (residence time) was 4 to 8 hours. After centrifugal separation and concentration of the medium, the desired product, S.C.P. receive. The yield of dry microbial cells was 45 to 53%, calculated on the starch in Tapioca.
Example 2
Cassava roots (tapioca) were treated and liquefied in the same manner as in Example 1. The liquefied solution was diluted to a concentration of 4% starch. The necessary amounts of inorganic salts, such as inorganic compounds of nitrogen, phosphorus, potassium or the like, were added to the solution, which was then sterilized by heat and then placed in the fermentation tank.
A yeast from Saccharomyces cerevisiae was grown continuously in the culture medium, while 0.3 to 0.5% saccharogenic enzyme, calculated on the weight of the total sugar in the medium, was aseptically added to the medium. The production of the by-products of enzymatic saccharification, glucose and maltose, and the multiplication of the yeast take place simultaneously and quickly. The total culture time (residence time) was 6 to 10 hours. The cultivation of Saccharomyces cerevisiae, which is usually delicate in a sugar solution, can be carried out without any difficulty, even with a relatively high concentration of sugar, such as several percent, based on the substrates of the culture medium.
The yeast cells in the medium were separated, concentrated and dried, whereby a mass of dry yeast cells was obtained. The yield of yeast cells was 45 to 50% based on the weight of the starch in the cassava roots.
Example 3
A drain from a potato starch factory (dry matter content: about 8%, soluble nitrogen-free material content: 3 to 4%) was adjusted to pH 6 and liquefied by adding a given amount of the liquefying enzyme. The necessary inorganic nutrient salts are added to the solution in order to obtain a culture medium which was then sterilized with heat and filled continuously into the fermentation tank. A yeast belonging to the Candida strain was continuously cultured in the medium, while saccharogenic amylase was simultaneously added aseptically at a predetermined rate. The yeast cells in the medium were separated, concentrated and dried to give a mass of dry yeast cells.
In this case, it was estimated that approximately 45% of the soluble nitrogen-free material had been converted to yeast cells.
Example 4
Raw cassava roots were treated and liquefied as in Example 1. The liquefied solution was diluted to a total sugar concentration of 2 to 5%. Inorganic nutrient salts were then added to the solution to obtain a culture medium in which the C / N ratio of the nitrogen source was limited to 20 to 40.
The medium was sterilized and then filled into the fermentation tank. A yeast of the Rhodotorula strain, which was able to produce fat at a high rate, was cultured either batch-wise or continuously in the medium, while at the same time saccharogenic amylase was added aseptically at a given rate. After separating and concentrating the medium, the solid was dried to obtain dry high fat yeast cells. The yield of dry yeast cells was 40 to 48%, based on the starch in the raw cassava. The fat content in the dry yeast cells was 15 to 50%.
When a fat extraction step is carried out after the separation and concentration to isolate the yeast cells, a high quality fat with a composition similar to that of a vegetable oil is obtained.
Furthermore, the dry residue after extraction of the fat gives a dry mass of yeast cells with a high protein content.
Example 5
Continuous culture of a microbe was carried out under the conditions listed below using the fermentation unit shown in FIG. The pressure was 1800 mm Aq. in the first tank, 1500 mm Aq. in the second tank and 1000 mm Aq. in the third tank. The ventilation amount was 0.5 VVM in the first tank, 1 VVM in the second and 0.5 VVM in the third tank. The total volumes of the first, second and third tanks were 500 liters, 50 liters and 1000 liters, respectively. A culture medium was kept in the appropriate tanks in amounts of 300 liters and 300 liters and 600 liters, respectively, and the incubation of a microbe was carried out at a feed rate of 250 liters per hour. The microbe used was a Candida yeast.
The culture medium used contained the following inorganic nutrient salts: NH4NO3 6g KH2PO4 3g Na2HPO4-12H20 0.5 g MgSO4-7H20 0.5 g FeSO4 0.5 g tap water 1000 ml, pH 5.5 As a carbon source, a solution was prepared by grinding, liquefying and saccharifying raw sweet potatoes as 4% glucose added to the above culture medium. The pH of the medium was adjusted with NH40H. As a result of this continuous three-stage culture in which a period of the continuous culture lasted 500 hours, the yield was 50% or more based on the carbon source added, and the replication rate (p) of the yeast was 0.6.
Example 6
The composition of the culture medium used was the same as in Example 5. Molasses were added as a carbon source to the medium at a concentration of 4% (w / w) as sugar. Candida utilis was continuously grown in it. The pressures in the first, second and third tanks were 2500 mm Aq. (ei), 2000 mm Aq. (P2) and 1500 mm Aq. (P3), and the amount of ventilation was 1.0 WM, 1.0 VVM and 0.5 VVM in each tank, respectively. The continuous three-stage culture method was carried out using the fermentation unit shown in FIG. 3. The size of the tanks and the amount of medium filled were identical to those in Example 5.
As a result of this culture, the continuous culture of more than 300 hours was carried out without any problem by contamination with other microorganisms. The yield of microbial cells was 52% calculated on the sugar concentration in the molasses added. No variation in microbial cells was observed during continuous culture.
Example 7
An inorganic medium having the same composition as described in Example 5 was prepared and a waste solution from potato starch processing was used as a carbon source. Candida utilis was grown as a yeast in the medium. The carbon source was added at a 4% concentration. The continuous culture was carried out under the same conditions as in Example 6. The culture of the yeast could be continued for more than 400 hours without any problems due to contamination with other microorganisms.
The yield of microbial cells was 48%, based on the concentration of the added sugar. The protein content of the microbial cells was 46 to 52%.
Example 8
Using molasses instead of the carbon source commonly used for Candida utilis, Rhodotorula gracilis was grown as a fat-producing yeast. The concentration of carbon source was 4% (w / w). The inorganic medium contained 75 mg / liter urea and 25 mg / liter KH2PO4 and was adjusted to a pH of 5.0. The ventilation takes place with 0.5 WM. A continuous culture of the yeast was carried out at a temperature of 32 "C. with stirring at a speed of 200 revolutions per minute using the fermentation unit shown in Fig. 3. The pressures in the first, second and third tanks were 1200 mm Aq. ( Pl), 800 mm Aq. (P2) and 500 mm Aq.
(P3). As a result of this continuous culture, which was carried out for 250 hours, the fat content reached 39.6% based on the dry yeast cells.