DE3905624A1 - Verfahren zur kontinuierlichen vergaerung von melasse mit hilfe von butanol, aceton und ethanol als gaerungsprodukte bildenden bakterien - Google Patents

Verfahren zur kontinuierlichen vergaerung von melasse mit hilfe von butanol, aceton und ethanol als gaerungsprodukte bildenden bakterien

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Description

Butanol und Aceton gehören zu den preiswerten Chemikalien, die auf Erdöl­ basis leicht herstellbar sind. Zur Zeit ist in Europa und den USA die bio­ technologische Herstellung von Butanol und Aceton unwirtschaftlich. In Län­ dern mit geringen Erdölvolumen (wie Brasilien) stellt sich die Situation anders dar. Für die Wirtschaftlichkeit von ABE-Fermentationssystemen (ABE= Aceton, Butanol, Ethanol) im technischen Maßstab sind die Rohstoffkosten maßgebend. Zur Zeit liegt der Preis von Invertmelasse (HTM) in Brasilien so hoch wie etwa 70% des Marktpreises von Aceton und Butanol. Bei einer der­ art geringen Gewinnspanne ist die Produktausbeute und Restkohlenhydrat­ konzentration in der Fermentationsbrühe von großer Bedeutung.
Verfahren zur Vergärung von Melasse und/oder Stärke zur Aceton-, Butanol- und Ethanol-Produktion (Lösemittelproduktion) in Form einer Batch-Fermen­ tation sind seit Jahrzehnten bekannt. Dazu sei beispielsweise auf folgenden Stand der Technik verwiesen:
DE-PS 6 12 535, 6 29 679, 6 35 572, 6 59 389, 6 83 198, 7 00 493, 8 24 932, 9 20 724, 9 41 184 und 9 41 185.
GB-PS 4 845, 15 203, 15 204, 3 19 079, 3 19 642 und 4 96 137.
JP-PS 6 15 797.
US-PS 13 15 585, 15 10 526, 15 37 597, 15 38 516, 15 45 694, 16 68 814, 18 22 139, 19 08 361, 19 11 411, 19 13 164, 19 92 221, 20 50 219, 20 89 522, 20 89 562, 21 07 262, 21 13 471, 21 13 472, 21 23 078, 21 32 039, 21 32 358, 21 39 108, 21 39 111, 21 98 104, 22 02 161, 22 60 126, 23 26 425, 23 68 074, 23 69 680, 23 77 197, 23 98 837, 24 33 232, 24 39 791, 24 81 263 und 29 45 786.
Ferner US-Patent Quarterly, 12 (1932a) 47-57 und 15 (1932b) 237 und
EP O 1 25 983.
Wegen der nur geringen Produktivität, die sich mit Hilfe der Batch-Fermen­ tation erzielen läßt, wurden einige kontinuierliche Verfahren entwickelt, siehe z. B. US-PS 18 75 536, DE-PS 31 46 084 und EP-PS 01 12 459.
Nach der US-PS 18 75 536 wird Stärke oder Melasse ohne pH- und Tempera­ turregelung in mehreren hintereinander geschalteten Fermentern kultiviert. Entsprechend den damaligen Kenntnissen über kontinuierliche Fermentationen wurde versucht, in jedem der Fermenter möglichst eines der morphologischen Stadien, die bei einer Batchkultur auftreten, zu realisieren und dadurch den
Fermentationsvorgang zu beschleunigen. Über die Lösungsmittelproduktivitäten liegen keine Angaben vor. Nach diesem Fermentationsprinzip wird heute noch in der UdSSR aus einer Mischung von Melasse, Getreide und hydrolysierten Maiskolben in einer 7- bis 8-stufigen Rührkesselkaskade ABE produziert [Nakhmanovich et al., Mikrobiologiya, 18 (1959) 99-104]. In der Volksrepublik China wird ebenfalls nach einem ähnlichen Fermentationsprinzip aus Mais­ stärke ABE produziert. Bei diesen Fermentationen liegen die Lösungsmittelpro­ duktivitäten zwischen 0,5 bis 0,8 g l-1 h-1 und die Infektionsgefahr ist sehr hoch. Oft werden auch unterschiedliche Impfkulturen in verschiedenen Stu­ fen zugesetzt, um die Lösemittelkonzentration zu erhöhen, wobei es zu einer sehr hohen Säurekonzentration (hauptsächlich Essigsäure) kommt.
Das US-Patent 18 75 536 macht keine Angaben über die Produktkonzentration und Produktausbeute. Aber aus den in der Literatur vorhandenen Daten über die Melassevergärung von Clostridium acetobutylicum (Weizmann Stamm)
[S.C. Beesch, Ind. Eng. Chem., 44 (1952) 1677] und ähnlich verlaufende Fermentationssysteme [Nahkmanovich et al., Mikrobiologiya, 18 (1959) 99-104] kann folgende Aussage gemacht werden:
  • a: Clostridium acetobutylicum (Weizmann Stamm) vergärt Melasse mit relativ hoher Säurebildung.
  • b: Die erreichten Lösemittelproduktivitäten sind unbefriedigend.
  • c: Eine hohe Anzahl von Fermentationsstufen bedeuten höhere In­ vestionskosten und auch höhere Infektionsgefahren.
Die US-Patente 44 24 275 (1984) und 45 68 643 (1986) stellen eine Methode zur extraktiven Aufarbeitung von ABE während der Fermentation vor. Der gewählte Fermentationsprozeß bezieht sich auf das US-Patent 18 75 536 (1932) [US-Patent 44 24 275 Spalte 7 Zeile 60].
Nach der DE-PE 31 46 084 wird die Kultivierung zweistufig und phosphatli­ mitiert durchgeführt. Als Substrat wird Glukose eingesetzt und zu 15,9 bzw. 18,2 g l-¹ Lösemittel (Aceton, Butanol und Ethanol) mit einer Produktivität von 0,63 bzw. 0,54 g l-¹ h-¹ und 1,7 bzw. 1,3 g l-¹ Säuren (hauptsächlich Essig- und Buttersäure) verarbeitet. Der eingesetzte Stamm ist Clostridium acetobutylicum DSM 1731. Für die Fermentation von Melasse wäre eine Phos­ phatfällung notwendig, dieses würde die Wirtschaftlichkeit des Systems wesentlich verringern.
Nach dem EP-Patent 01 12 459 wird die Kultivierung zwei- bzw. dreistufig durchgeführt. Als Substrat wird lösliche Stärke mit geringem Dextrosegehalt eingesetzt. Durch Adsorption von Butanol an Aktivkohle in der letzten Fer­ mentationsstufe wird die Butanolinhibierung vermindert. Die volumetrische Produktivität beträgt hier etwa 0,9 g l-¹ h-¹. Die Konzentration der produ­ zierten Säuren wird nicht angegeben. Bei diesem Verfahren werden Clostri­ dium acetobutylicum ATCC 4259 und ATCC 39236 eingesetzt.
Nach dem EP-Patent 02 82 472 wird die Kultivierung zweistufig mit Zellimmo­ bilisierung an einem Trägermaterial in der zweiten Stufe durchgeführt. Als Substrat wird Xylose eingesetzt und zu 9,3 bzw. 10,87 g l-¹ Lösemittel mit einer Produktivität von 1,39 bzw. 1,64 g l-¹ h-¹ und 3 bzw. 3,7 g l-¹ Säuren verarbeitet. Hierbei wird als Kultur Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (DSM 792) eingesetzt.
Bei den EP-Patenten 01 12 459 und 02 82 474 ist die Restkohlen­ hydratkonzentration in der Fermentationsbrühe sehr hoch (bis etwa 10% nach der EP-PS 01 12 459 und bis etwa 25% nach der EP-PS 02 82 474). Wie eingangs schon angemerkt, hängt die Wirtschaftlichkeit solcher Verfahren stark von der Ausbeute an Lösemitteln ab. Wegen der sich ändernden Butanolaufnahmefähigkeit von Aktivkohle bzw. der sich ändernden Zellkon­ zentration bei der Verwendung von Trägermaterial ist die Anpassung der Verdünnungsrate an den jeweiligen Zustand sehr schwierig.
Bei den drei letztgenannten Patenten werden als Nährstoff bevorzugt ein­ heitliche Kohlenhydrate (wie Glukose oder Xylose) eingesetzt. Beim Einsatz von Kohlenhydratgemischen als Substrat, wie sie bei Invert- oder High-Test- Melasse vorliegen (16% Sucrose, 27% Glucose und 25% Fructose), steigt sicherlich die Säurekonzentration auf Kosten der ABE-Konzentrationen, damit verringert sich die Lösemittelproduktivität. Bei den oben erwähnten Patenten beträgt die Lösemittelproduktivität bei nicht zellimmobilisierten Systemen maximal 0,9 g l-¹ h-¹. Durch Zellfixierung erhöht sich die Lösemittelprodukti­ vität auf 1,6 g l-¹ h-¹.
Es stellte sich nun die Aufgabe, für die Vergärung von Melasse ein wirt­ schaftliches Verfahren zu finden, das zumindest die gleiche Lösemittelpro­ duktivität wie diejenigen Verfahren erbringt, die mit einheitlichen (und damit teuren) Kohlenhydraten durchgeführt werden.
Eine weitere Aufgabe war es, die zur Erhöhung der Ausbeute häufig einge­ setzte Methode der Zellrückhaltung dahingehend zu verbessern, daß die Pro­ duktivität und Ausbeute der Melassevergärung auf bisher auch bei anderen Gärverfahren nicht erreichte Werte gesteigert werden kann.
Erfindungsgemäß wurde deshalb ein Verfahren zum Vergären von Melasse entwickelt, inbesondere von Rüben-, Zucker- und/oder Invertmelasse, mit Hilfe von Butanol, Aceton und Ethanol als Gärungsprodukte bildenden Bakte­ rien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
  • - als erste Stufe zur Produktion von aktiven Zellen eine substratlimitierte Chemostatkultur eingesetzt wird und
  • - die Melasse in einer zweiten Stufe ohne Substratlimitierung vergoren wird.
Die der Erfindung zugrunde liegenden Fermentationssysteme sind zweistufig. Die erste Fermentationsstufe (Zellproduktionsstufe) ist eine substratlimitierte Chemostatkultur und dient zur Produktion von aktiven Zellen. Diese Stufe kann nur in Kombination mit einer zweiten Fermentationsstufe zur Produktion von Lösemitteln, wie Aceton und Butanol, aus Melasse eingesetzt werden.
Zur Erläuterung des Begriffs Chemostatkultur vergleiche man beispielsweise Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie, Thieme-Verlag, oder Rehm, Industrielle Mikrobiologie, Springer-Verlag.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird Melasse als Substrat verwendet, gege­ benenfalls im Gemisch mit anderen kohlenhydrathaltigen Medien, deren Anteil jedoch aus wirtschaftlichen Gründen gering sein sollte. Als Melasse eignet sich Rüben-, Zucker- und/oder Invertmelasse, beispielsweise Substrat-high- Test-Melasse.
Zur Fermentation eignen sich alle an Melasse adaptierte und Aceton, Butanol und/oder Ethanol produzierenden Bakterien. Beispielsweise können alle ABE- produzierenden Clostridium-Stämme in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden.
Bei der vorliegenden Erfindung ist trotz Vergärung von Melasse die minimale Lösemittel-Produktivität in kontinuierlicher Kultur 0,9 g l-¹ h-¹. Diese Pro­ duktivität erhöht sich durch Zellrückhaltung auf 3,3 g l-¹ h-¹ bei höheren Lösemittelkonzentrationen. Besonders gute Ergebnisse bezüglich der Produk­ tivität und Ausbeute lassen sich erzielen, wenn man für die erste Stufe die folgenden Rahmenbedingungen wählt, damit nach Einstellung des Fließgleich­ gewichtes (steady state) das Substrat vollständig umgesetzt und hauptsäch­ lich zu ABE verarbeitet wird:
  • Substratkonzentration 15 bis 30 g l-¹ Kohlenhydrate, vorzugsweise etwa 20 g l-¹ Kohlenhydrate Verdünnungsrate maximal 0,15 h-¹, insbesondere 0,08 bis 0,1 h-¹ pH 4,5 bis 6, insbesondere 5,3 bis 5,5 Temperatur 30 bis 40°C, insbesondere 31,5 bis 33°C
Wählt man eine wesentlich höhere Substratkonzentration oder eine sehr viel höhre Verdünnungsrate, so werden in der zweiten Stufe mehr Essig- und Buttersäure gebildet, d. h. die Kultur nähert sich dem Degenerationszustand. Bei zu geringer Substratkonzentration wird die Lösemittelbildungstendenz der Kultur nicht gefördert. Solche Kulturen produzieren in der zweiten Fer­ mentationsstufe auch hauptsächlich Säure. Bei zu geringer Verdünnungsrate ist die Zellproduktionsrate nicht optimiert, kann aber nachträglich reguliert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist hinsichtlich der Fermentationsstrategie in der zweiten Fermentationsstufe (Lösemittelproduktionsstufe) sehr flexibel. In Kombination mit der kontinuierlichen Zellproduktionsstufe können in der zweiten Fermentationsstufe in Form einer Batch-Fermentation (a) sowie in Form einer kontinuierlichen Fermentation ohne (b) oder mit Zellrück­ haltungseinheit (c) Lösemittel produziert werden. Investitions- und laufende Kosten liegen für Batch-Fermentationen niedriger, jedoch hat ein zweistufiges Fermentationssystem mit Batchkultur als zweiter Stufe eine wesentlich gerin­ gere Lösemittelproduktivität als ein zweistufiges kontinuierliches Fermen­ tationssystem mit Zellrückführung in der zweiten Stufe.
Außerdem ist es bei dieser Erfindung möglich, in der zweiten Fermentations­ stufe mit weniger sterilem Substrat zu fermentieren, wodurch sich im techni­ schen Maßstab wirtschaftliche Vorteile ergeben. Bei anderen bekannten Ver­ fahren ist der Einsatz von absolut sterilem Nährmedium notwendig, da jeweils das gesamte Substrat zunächst durch die erste Fermentationsstufe fließt.
Nachfolgend werden für die beiden erstgenannten Ausführungsformen (a) und (b) der zweiten Fermentationsstufe (=Lösemittelproduktiosstufe) Rah­ menbedingungen genannt, unter denen sich besonders gute Ergebnisse be­ züglich der Produktivität und Ausbeute erzielen lassen:
  • a: Lösemittelproduktionsstufe als Batchkultur Substratkonzentration: 45,9 bis 47,9 g l-¹ Kohlenhydrate pH: 4,5 bis 6, insbesondere 5,3 bis 5,5 Temperatur: 30 bis 40°C, insbesondere 31 bis 33°C Volumenverhältnis der ersten Fermentationsstufe zur zweiten Fermentationsstufe: 1 bis 2 : 20
    Der zweite Fermenter wird innerhalb eines Zeitraums von 10 bis 15 Stunden mit (beispielsweise 10 bis 15% des gesamten Fermentationsvolumens) der kontinuierlichen Kultur angeimpft. pH und Temperatur werden geregelt. Nach weiteren 12 bis 18 Stunden Fermentationsdauer kann eventuell zur Erhöhung der Butanolkonzentration nach­ geimpft werden. Dieses Fermentationssystem kann auch als Fed-batch durchgeführt werden.
  • b: Lösemittelproduktionsstufe als produktinhibierte Chemo­ statkultur Substratkonzentration: 40 bis 43 g l-¹ Kohlenhydrate pH: 4,5 bis 6, insbesondere 5,5 bis 5,6 Temperatur: 30 bis 40°C, insbesondere 30 bis 32°C. Das Volumenverhältnis der ersten Fermentationsstufe zur zweiten Fermentationsstufe beträgt 1 bis 2 : 20. Aus dem ersten Fermenter fließt das zellhaltige Medium in den zweiten Fermenter. Das für die ABE-Produktion benötigte Gärmedium wird direkt dem zweiten Fermenter zugeführt. Die optimale Verdünnungsrate im zweiten Fermenter be­ trägt 0,08 bis 0,12 h-¹.
Eine dritte, ebenfalls oben erwähnte Ausführungsform (c) der zweiten Fer­ mentationsstufe umfaßt zur turbidostatischen Regelung der Zellkonzentration erfindungsgemäß ein Mikrofiltrationsmodul. Durch Anpassung des Substrat­ flusses an die Zellkonzentration wird fast der gesamte Kohlenhydratgehalt in der Melasse vergoren. Damit verbunden ist eine Erhöhung der Raum-Zeit- Ausbeute in der zweiten Fermentationsstufe.
Der Einsatz von Mikrofiltrationsmodulen, wie kapillarförmigen Cross-Flow- Mikrofiltrationsmodulen, zur Zellrückführung hat gegenüber der bisher übli­ chen Zellfixierung an Trägermaterialien (siehe EP-PS 02 82 474) für ABE-Fer­ mentationssysteme folgende Vorteile:
  • (1) ABE-produzierende Clostridium-Stämme, die an einem Trä­ germaterial fixiert sind, tendieren zu höherer Säurepro­ duktion (Höggström & Morris, Biotechnol. Lett., 4 (1982) 477-482). Dies wird erfindungsgemäß vermieden.
  • (2) Im Gegensatz zur Zellfixierung ist die aktuelle Zellkon­ zentration bekannt. Deshalb ist die Anpassung des Sub­ stratflusses sowie die Optimierung des Fermentations­ systems möglich. Die entsprechenden Parameter sind bei unbekannter und häufig schwankender Zellkonzentration schwer einzustellen.
  • (3) Im Falle von Infektionen ist die Reinigung des Fermenters und der Peripherie wesentlich erleichtert.
  • (4) Die Einstellung der Zellkonzentration ist auch nach oben variabel; die Fermentation läßt sich auch in größerem Maßstab gut führen, was bei Einsatz größerer Mengen Trägermaterial schwierig wäre.
Nachfolgend sind für diese dritte Ausführungsform Rahmenbedingungen ge­ nannt, unter denen sich besonders gute Ergebnisse bezüglich der Produkti­ vität und Ausbeute erzielen lassen:
  • c: Lösemittelproduktionsstufe als kontinuierliche Kultur mit Zellrückführung Substratkonzentration: 42 bis 54 g l-¹ Kohlenhydrate pH: 4,5 bis 6, insbesondere 5,3 bis 5,5 Temperatur: 30 bis 40°C, insbesondere 30 bis 32°C. Das Volumenverhältnis der ersten Fermentationsstufe zur zweiten Fermentationsstufe beträgt 1 bis 4 : 20. Aus dem ersten Fermenter fließt das zellhaltige Medium in den zweiten Fermenter. Das für die ABE-Produktion benötigte Gärmedium wird direkt dem zweiten Fermenter zugeführt. Die Zellkonzentration im zweiten Fermenter wird durch Zellrückführung beispielsweise mit einem kapillar­ förmigen Cross-Flow-Mikrofiltrationsmodul und turbido­ statische Regelung konstant gehalten. Abbildung 1 zeigt die schematische Anordnung eines solchen zweistufigen Fermentationssystems mit Zellrückhaltung und turbido­ statischer Zellkonzentrationsregelung in der zweiten Stufe. Die optimale Verdünnungsrate ist abhängig von der aktiven Zellkonzentration, z. B. bei einer Biotrocken­ masse von 16 bis 17 g l-¹ beträgt die optimale Verdünnungsrate 0,24 h-¹.
Infektionen
Die anaerobe Fermentation von Aceton und Butanol ist hauptsächlich durch Milchsäurebakterien gefährdet. Solche Infektionen zeigen sich sehr schnell durch übermäßig hohen Laugeverbrauch. Daher ist eine saubere und streng sterile Fermentation besonders in der ersten Fermentationsstufe notwendig. Bei der zweiten Stufe kann unter weniger sterilen Bedingungen gearbeitet werden. Es reicht aus, das einzusetzende Substrat auf mindestens 70 oder vorzugsweise mindestens 80°C erhitzen. Bei einer Batch-Kultur als zwei­ ter Stufe kann man sogar auf Sterilität verzichten.
ABE produzierende Clostrida sind auch bakteriophageninfektionsgefährdet. Aus diesem Grund sind während des ersten und zweiten Weltkriegs zahlrei­ che Produktionsstätten stillgelegt worden. Die Phageninfektion äußert sich durch: Trägheit der Kultur, Verringerung der Produktionskonzentration und Auswaschen der Kultur im Chemostaten. Das Medium der von Phagen infizier­ ten Melassekultur sieht dunkler aus als normales Medium. Glücklicherweise sind angreifende Phagen bei einigen Stämmen stammspezifisch. Clostridium saccharoperbutylacetonicum DSM 2152 hat eine spezifische Phage. Die 12 cha­ rakteristischen für Clostridium-acetobutylicum-Kulturen bekannten Phagen sind bei diesem Stamm nicht wirksam (Hongo, M. und Murata, A., Agr. Biol. Chem., 29 (1965) 1135-1139).
Nachstehend wird die Erfindung durch weitere Erläuterungen der Fermenta­ tionsbedingungen und des optimierten Verfahrensablaufs an Hand von Bei­ spielen und einer Abbildung erläutert.
Bei dieser Untersuchung wurde als Mikroorganismus Clostridium saccharoper­ butylacetonicum DSM 2152 und als Substrat Melasse (High Test Melasse (HTM), Fa. Copersucar, Brasilien) eingesetzt.
  • a) Erste Fermentationsstufe
    Die Fermentation wurde bei 31,5°C und einem pH-Wert von 5,4 streng anaerob durchgeführt. Es wurde ein wäßriges Medium folgender Zusammensetzung verwendet:
Gärmedium
Angabe pro Liter:
HTM 28,6 g (ca. 20 g Gesamtkohlenhydrat)
(NH₄)₂SO₄ 2 g
KH₂PO₄ 1 g
MgSO₄ × 7 H₂O 0,08 g
Hefeextrakt 2 g
FeSO₄ × H₂O 0,03 g
MnSO₄ × H₂O 0,015 g
NaCl 0,02
NaMoO₄ × 2 H₂O 0,02 g
CaCl₂ × 2 H₂O 0,02 g
ZnCl₂ 0,14 mg
CoCl₂ × 6 H₂O 0,38 mg
CuCl₂ × 2 H₂O 0,03 mg
NiCl₂ × 2 H₂O 0,05 mg
Biotin 0,2 mg
Thiamin-hydrochlorid 2 mg
p-Amino-benzoesäure 2 mg
Produktkonzentration in der ersten Stufe
Angaben pro Liter, bei Verdünnungsraten zwischen 0,08 und 0,10 h-¹
Ethanol
0,18 bis 0,22 g
Aceton 0,78 bis 1,2 g
Essigsäure 0 bis 0,5 g
Butanol 3,9 bis 4,5 g
Buttersäure 0,5 bis 0,95 g
Biotrockenmasse 2,3 bis 2,8 g
Die Stabilität der substratlimitierten Chemostatkultur wurde zweimal (einmal für 27 Tage im 1-l-Fermenter und ein weiteres Mal für 28 Tage im 2-l-Fer­ menter) untersucht.
In Kombination mit der oben erwähnten Chemostatkultur wurde in einem zweistufigen Fermentationssystem in drei unterschiedlichen Prozessen ABE aus Melasse produziert.
Beispiel 1 Zweistufige ABE-Produktion aus HTM mit einer Batchkultur als zweite Stufe
Die kontinuierliche Kultur aus der ersten Stufe wird als Animphkultur für den zweiten Fermenter eingesetzt. Das zweistufige Fermentationssystem hat ein Volumenverhältnis von 1 : 10. Die aktive Chemostatkuktur aus dem Anzuchtfermenter garantiert einen gleichmäßigen und schnellen Gärungsverlauf.
Gärmedien in der zweiten Stufe:
Angabe pro Liter
HTM 64,2 g (ca. 47,5 g Gesamtkohlenhydrat)
(NH₄)₂SO₄ 4 g
KH₂PO₄ 2 g
MgSO₄ × 7 H₂O 0,16 g
Hefeextrakt 2,5 g
FeSO₄ × H₂O 0,03 g
MnSO₄ × H₂O 0,015 g
Fermentations-Bedingungen in der zweiten Stufe:
pH|5,4
T 31°C
RPM 150
ohne Begasung
Der zweite Fermenter mit 10 l Nährmedium wird innerhalb von 14 Stunden mit 1,4 l zellhaltiger Kultur aus dem ersten Fermenter beimpft. Abbildung 2 zeigt an Hand eines Beispiels den Verlauf einer solchen Batch-Fermentation. Hierbei beträgt die Fermen­ tationsdauer 24 bis 26 Stunden mit einer Produktkonzentration von
Ethanol|0,4 gl-¹
Aceton 3,5 gl-¹
Butanol 9,95 gl-¹
Buttersäure 0,3 gl-¹
Gesamtlösungsmittel 13,9 gl-¹
Biotrockenmasse 3,1 gl-¹
Beispiel 2 Zweistufige ABE-Produktion aus HTM mit einer produktinhibierten Chemostatkultur als zweite Stufe
Dieses Fermentationssystem ist eine zweistufige Kaskade. Aus dem ersten Fermenter fließt das zellhaltige Medium in den zweiten Fermenter. Das für die ABE-Produktion benötigte Gärmedium wird direkt dem zweiten Fermenter zugeführt.
In dem hier beschriebenen Beispiel wurde ein Volumenverhältnis der beiden Fermenter von 1 : 10 gewählt. Aus dem ersten Fermenter fließt 0,1 lh-¹ zellhaltiges Medium in den zweiten Fermenter mit 10 l Kulturvolumen. Zusätzlich fließt in den zweiten Fer­ menter 0,7 lh-¹ Gärmedium mit folgender Zusammensetzung (Angabe pro Liter):
HTM
60 g (ca. 42 g Gesamtkohlenhydrat)
(NH₄)₂SO₄ 5 g
KH₂PO₄ 2 g
MgSO₄ × 7 H₂O 0,2 g
Hefeextrakt 4 g
FeSO₄ × H₂O 0,03 g
MnSO₄ × H₂O 0,015 g
Thiaminhydrochlorid 2 mg
P-Aminobenzoesäure 2 mg
Das zellhaltige Auslaufmedium des zweiten Fermenters enthält im Fließgleichgewicht (steady state): 3,5 bis 3,7 gl-1 Biotrockenmasse, 0,2 bis 0,4 gl-¹ Ethanol, 3,0 bis 3,4 gl-¹ Aceton, 6,9 bis 7,8 gl-¹ Butanol, 0 bis 0,6 gl-¹ Essigsäure und 0 bis 0,2 gl-¹ Buttersäure.
Die Lösemittelproduktivität in der zweiten Fermentationsstufe beträgt 0,9 bis 1,0 gl-¹h-¹ bei einer Verdünnungsrate von 0,08 bis 0,1 h-¹ und einer Lösemittelausbeute von etwa 0,3 g ABE pro g Kohlenhydrat. Die Stabilität der Kultur im zweiten Fer­ menter wurde durch zweimalige kontinuierliche Fermentation mit einer Dauer von 10 und 14 Tagen untersucht.
Beispiel 3 Zweistufige ABE-Produktion aus HTM mit kontinuierlicher Kultur mit Zellrückhaltung
Die substratlimitierte Chemostatkultur aus dem ersten Fermenter wird dem zweiten Fermenter laufend zugeführt. Das für die ABE-Produktion benötigte Gärmedium fließt direkt in den zweiten Fermenter. Die Zellkonzentration im zweiten Fermenter wird durch Zellrückführung und turbidostatische Regelung bei einer bestimmten Konzentra­ tion konstant gehalten.
Das produkthaltige Auslaufmedium aus dem zweiten Fermenter ist hauptsächlich (80 bis 95%) zellfreies Medium.
Bei den ausgeführten Beispielen wurde ein Volumenverhältnis der beiden Fermenter von 2 : 10 gewählt. Hierbei fließt aus dem ersten Fermenter 0,18 bis 0,2 lh-¹ zellhal­ tiges Medium in den zweiten Fermenter mit 10 l Kulturvolumen. Zusätzlich fließen in den zweiten Fermenter 2,1 bis 2,3 lh-¹ eines Gärmediums mit folgender Zusammen­ setzung:
Angaben pro Liter
HTM 69 g (ca. 48 g Gesamtkohlehydrat)
(NH₄)₂SO₄ 5 g
KH₂PO₄ 2 g
MgSO₄ × 7 H₂O 0,2 g
Hefeextrakt 4 g
FeSO₄ × H₂O 4 g
MnSO₄ × H₂O 0,015 g
NaMoO₄ × 2 H₂O 0,02 g
Thiaminhydrochlorid 2 mg
P-aminobenzoesäure 2 mg
Die Zellrückführung wurde mit einem Cross-flow-Mikrofiltrationsmodul, bestehend aus Polypropylenkapilaren, mit einer Porenweite von 0,2 µm (Fa. ENKA, Wuppertal) durch­ geführt. Durch Zellrückhaltung und turbidostatische Regelung wurde eine Zellkonzen­ tration von 16 bis 17 gl-¹ Biotrockenmasse im zweiten Fermenter aufrechterhalten. Das zellfreie Auslaufmedium des zweiten Fermenters enthält im Fließgleichgewicht (steady state) 0,32 bis 0,4 gl-¹ Ethanol, 4,4 bis 4,8 gl-¹ Aceton und 8,1 bis 8,3 gl-¹ Butanol, 0 bis 0,2 gl-¹ Buttersäure und keine Essigsäure.
Die Lösemittelproduktivität im zweiten Fermenter beträgt 3,0 bis 3,3 gl-¹h-¹ bei einer Verdünnungsrate von 0,24 h-¹ und einer Lösemittelausbeute von 0,3 g ABE pro g Kohlenhydrat.
Die Kulturstabilität im zweiten Fermenter wurde durch zweimalige kontinuierliche Fermentation von 8 und 16 Tagen Dauer untersucht.

Claims (16)

1. Verfahren zum Vergären von Melasse, insbesondere von Rüben-, Zucker- und/oder Invertmelasse, mit Hilfe von Butanol, Aceton und/oder Ethanol als Gärungsprodukte bildenden Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß
- als erste Stufe zur Produktion von aktiven Zellen eine substratlimitierte Chemostatlultur eingesetzt wird und
- die Melasse in einer zweiten Stufe ohne Substratlimitierung vergoren wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der ersten Stufe zur Produktion von aktiven Zellen die Substratkonzentration 15 bis 30 g l-¹ Kohlenhydrate, vorzugsweise etwa 20 g l-¹ Kohlenhydrate beträgt.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß in der ersten Stufe zur Produktion von aktiven Zellen die Ver­ dünnungsrate maximal 0,15 h-¹, vorzugsweise 0,08 bis 0,1 h-¹ beträgt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß in der ersten Stufe zur Produktion von aktiven Zellen der pH auf 4,5 bis 6, vorzugsweise auf 5,3 bis 5,5 eingestellt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß in der ersten Stufe zur Produktion von aktiven Zellen die Temperatur auf 30 bis 40°C, vorzugsweise auf 31,5 bis 33°C eingestellt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß in der zweiten Fermentationsstufe diskontinuierlich vergoren wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Substrat­ konzentration 45,9 bis 47,9 g l-¹ Kohlenhydrate beträgt und/oder der pH auf 4,5 bis 6, vorzugsweise auf 5,3 bis 5,5 eingestellt wird und/oder die Tempe­ ratur auf 30 bis 40°C, insbesondere auf 31 bis 33°C eingeregelt wird und/oder das Volumenverhältnis der ersten Fermentationsstufe zur zweiten Fermentationsstufe 1 bis 2 : 20 beträgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Fermentationsstufe eine kontinuierliche produktinhibierte Chemo­ statkultur ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Substrat­ konzentration 40 bis 43 g l-¹ Kohlenhydrate beträgt und/oder der pH auf 4,5 bis 6, vorzugsweise auf 5,5 bis 5,6 eingestellt wird und/oder die Temperatur auf 30 bis 40°C, insbesondere auf 30 bis 32°C eingeregelt wird und/oder das Volumenverhältnis der ersten Fermentationsstufe zur zweiten Fermen­ tationsstufe 1 bis 2 : 20 beträgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Fermentationsstufe eine kontinuierliche Kultur mit Zellrückfüh­ rung ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Substrat­ konzentration 42 bis 54 g l-¹ Kohlenhydrate beträgt und/oder der pH auf 4,5 bis 6, vorzugsweise auf 5,3 bis 5,5 eingestellt wird und/oder die Temperatur auf 30 bis 40°C, vorzugsweise auf 30 bis 32°C eingeregelt wird und/oder das Volumenverhältnis der ersten Fermentationsstufe zur zweiten Fermen­ tationsstufe 1 bis 4 : 20 beträgt.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellrückführung mit Hilfe eines Mikrofiltrationsmoduls, beispielsweise eines kapillarförmigen Cross-Flow-Mikrofiltrationsmoduls durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Substrat High Test Melasse (HTM) eingesetzt wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Gärungsbakterium ein Clostridium-Stamm, beispielsweise Clostridium saccaroperbutylacetonicum DSM 2152 eingesetzt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das in die zweite Stufe einzusetzende Substrat unsterilisiert ver­ wendet.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man das in die zweite Stufe einzusetzende Substrat vor seinem Einsatz auf mindestens 70°C und insbesondere mindestens 80°C aufkocht.
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