DD210300A1 - Verfahren zur steuerung von prozessen der biotechnischen stoffwandlung - Google Patents

Abstract

Ziel der Erfindung ist das Erreichen niedriger Rohstoff- und Energieverbraeuche, Verbesserung der Produktqualitaeten und eine Erhoehung der Stabilitaet biotechnischer Prozesse.Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete Informationen aus dem biologischen System von Prozessen zur biotechnischen Stoffwandlung fuer die Steuerung dieser Prozesse zu nutzen. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe so geloest, dass Informationen genutzt werden, die aus Verteilungsfunktionen einzelner oder mehrerer Merkmale der an der Stoffwandlung beteiligten Mikroorganismen gewonnen werden.

Description

Titel

Verfahren zur Steuerung von Prozessen der biotechnischen Stoffwandlung

Anwendungsgebiet der Erfindung

*Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steuerung von Prozessen der biotechnischen Stoffwandlung, an denen einzellige Organismen (z._e B. Bakterien oder Hefen), die-auch genetisch verändert sein können, in Rein- oder Mischkultur beteiligt sind». Diese Prozesse können der Gewinnung von Biomasse, der Gewinnung von Produkten, der Beseitigung von Abfällen oder der Gewinnung von Energieträgern dienen. Die Erfindung ist in die IPE C- 12 Έ einzuordnen»

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen .

Die Prozesse der biotechnischen Stoffwandlung sind durch eine innere Hierarchiestruktur charakterisiert. Gemäß den bekann-ten Polgerungen aus der Kybernetik können solche Prozesse nicht eindeutig beschrieben werden, wenn nur ihre Ein- und Ausgangsgrößen bekannt sind (Uikolajev, P.I., Kantere, V.M., Surnal Vses. Chim. Obscestva im* Mendeleeva VJ_ (1972) 569). Typisch für diese Prozesse ist ein Hysteresisverhalten, das durch Bi- und.MultiStabilitäten bedingt ist, "overshoots" oder Oszillationen (HAREISOH, D.E.3¹., lOPIWALA, H.H., in: Adv. Biochem. Eng. 2. (1974))·

Aus diesem"Grunde ist das beschriebene "indirect measurement concept" (ΕΘΗΡΗΒΕΥ, A.B.,' Process Biochem. ΛΖ (1977) 19) nur bedingt in. der Lage, Informationen zur Kontrolle und Steuerung

dieser Prozesse zu liefern» So ist es nicht möglich, nach diesem Verfahren Änderungen in den Ausgangsgrößen eindeutig "bestimmten Änderungen des physiologischen Zustandes der Kultur zuzuordnen und daraus günstige Maßnahmen zur Steuerung des Prozesses abzuleiten·

Verfahren und Vorrichtungen, welche integral Änderungen auf der metabolischen Ebene solcher Prozesse direkt am biologischen System messen.und zur Steuerung verwenden, sind ebenfalls bekannt (DD-WP 154449, DD-WP 154545). Sie liefern aber nur Mittelwerte über die Populationen und die gewonnenen Informationen sind mehrdeutig in bezug auf die Zustände der Populationen·. Damit bleibt zum Beispiel die Verteilung der Populationen über die einzelnen Zustände des Zellzyklus unerkannt und die Informationen über die in den Zellen ablaufenden Prozesse können wegen ihrer Mehrdeutigkeit nicht für>eine Steuerung genutzt werden·

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung., ist das Erreichen niedriger Rohstoff- und Energieverbräuche, das Verbessern, der Produktqualitäten sowie eine Erhöliung, der Stabilität· biotechnischer. Prozesse«

Darlegung des Wesens der Erfindung;

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete Informationen aus dem biologischen System von Prozessen zur biotechnischen, St off Wandlung für die Steuerung dieser Prozesse zu nut-

zen» . ·

•Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß zur Steuerung von Prozessen der biotechnischen Stoffwandlung Informationen genutzt werden, die aus Verteilungsfunktionen einzelner oder mehrerer Merkmale der an der Stoffwandlung beteiligten Mikroorganismen gewonnen wurden. Diese Informationen können aus der und/oder Höhe der Maxima und/oder'Minima der gewonnenen

Verteilungsfunktionen beziehungsweise ihrer Form, die durch statistische Maßzahlen wie Streuung, Schiefe, Sscess oder Momente höherer Ordnung beschrieben wird, hergeleitet werden. Die Bestimmung der Verteilungen- für das erfindungsgemäße Ver-

fahren kann wie folgt realisiert werden:

1· Ein repräsentativer Teil der Populationen wird nach morphologischen Merkmalen untersucht und jede untersuchte Zelle oder Zellgruppe einer bestimmten diskreten Merkmalsklasse zugeordnet oder eine kontinuierliche Merkmalsverteilung geschätzt· Die Untersuchung kann z· B· durch Auszählen am .Mikroskop oder durch automatische Bildanalyse erfolgen.

2. An einem repräsentativen Teil der Populationen werden an den einzelnen Zellen physikalische Eigenschaften, z. B* elektrische oder lichtoptische Eigenschaften, vermessen und daraus werden entsprechende Merkmalsverteilungen "bestimmt·

3· Ein repräsentativer Teil der Populationen wird merkmalsspezifisch angefärbt und die einzelnen ZeIIeA.lichtoptisch in Extinktion oder Emission im Durchfluß vermessen und daraus werden die entsprechenden Merkmalsverteilungen bestimmt·

Aus den Parametern der nach 1·, 2. und 3* bestimmten Verteilungen können alle zum Erreichen des Zieles der Erfindung wesentlichen Zustandseigenschaften der am Prozeß beteiligten

" mikrobiellen Populationen bestimmt werden·.

Die Kenntnis des Zustandes ermöglicht eine gezielte Beeinflussung des Prozesses, indem z. B. die Dosierung des Kohlenstoffund Energiesubstrates oder bestimmter Nährstoffe verändert wird· Auch eine gezielte Veränderung des Durchsatzes durch das Kultivierungsgefäß, der Temperatur, des'pHi-Wertes, der Belüftungsrate und anderer Parameter ist je nach der Art des Prozesses möglich

Besonders ist das Verfahren geeignet, die Prozeßführungsparameter während dynamischer Prozeßführungen (vgl- ζ. B. DD-WP 140150) zu bestimmen

Das Verfahren sei an folgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1

In einem Rührkesselfermentor werden Hefen der Art Saccharomyces cerevisiae nach der Methode der Phasenkulturen gezüchtet (P, S. S. DAWSOlT, J. appl. Chem. Biotechnol, 22 (1972) 79)» Als Kohlenstoff- und Energiequelle diente Glucose in einer Konzentration von 30 g/l* Die Kährlösungszusaiiimensetzung wurde wie bei v. MEYEEBURG gewählt (H-K, τοη MEZESBtIRG, Arch, Mikrooiol. 66 (1969) 289)

Weitere !Fermentationsparameter waren:

Temperatur 32 ⁰G

Masseinhalt des Fermentors 10 kg pH-Wert · . 4,2

Die Zustandsverteilung wurde über den Proteingehalt der Einzelzellen geschätzt. Der Proteingehalt wurde zytometrisch bestimmt*

Die Ethanol produzierende Subpopulation ist durch einen "peak" im Kanal 90 des Histogramms charakterisiert, die Subpopulation, die Ethanol als Substrat benutzt, durch einen "peak" im Kanal 30.

Die Sthanolproduktion kann somit anhand der zjtometrischen Messung gesteuert werden.

Im Beispiel wurde bei Erscheinen eines "peak" im Kanal 30 solange mit 50 l/kg»h "belüftet, "bis wieder eine einheitliche Population Torlag, Anschließend erfolgte der Austausch der

Hälfte des Mediums. . ·

Beispiel 2

In einem Ruhrkesselfermentor wurde der Bakterienstamm E.coli K12 kontinuierlich bei einer Yerweilzeit von 1,5 h auf Glukose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle mit dem Ziel der Gewinnung proteinreicher Zellsubstanz gezüchtet. Das lahrmedium enthielt pro liter:

3000 mg .H als ₄ 250 mg K als K₂GO-

25 mg Mg als MgSO^

250 mg P als H₃PO₄ (85

40 g Glucose

0,2 % Hefeextrakt

sowie Spurensalze in ausreichender Menge. Weitere Fermentationsparameter -waren:

Temperatur 37 ⁰C

Masseinhalt des Fermentors 10 kg pH-Wert 7,0

Der Wachstumsprozeß wurde über die Glucosezufuhr limitiert. Die Hährmedienzufuhr wurde mittels einer Zustandsverteilung gesteuert, die a us.._: zytometrischen Messungen des Proteingehaltes der einzelnen Zellen bestimmt wurde. Bei Erscheinen eines "peaks" im Kanal 25 des Histogrammes, der auf eine Vergrößerung der Anzahl proteinärmerer Zellen deutet, wurde die Eahrmedienzufuhr sprunghaft reduziert. Bei Verschwinden des "peaks" wurde die. Hährmedienzufuhr wieder sprunghaft erhöht.

Durch diese gezielte Uahrmedienzufuhr konnte der Rohproteingehalt der Zellsubstanz von 70 % auf SO % erhöht und der spezifische Glucoseyerbrauch von 2,0 g/g BTS auf 1,8 g/g BTS gesenkt werden.

' Beispiel 3 '

Der genetisch manipulierte Bakterienstamm Ξ. coil C 600 wurde auf Glucose aerob und semikontinuierlich mit dem Ziel der Ascorbinsäuregewinnung gezüchtet. Die Permentationsparameter ' waren die gleichen wie in Beispiel 2.

Uach diskontinuierlicher Anzucht der Bakterien "bis zu einer Zellkonzentration von 20 g/l wurde die Hälfte des Fermentationsmediums aus dem Fermentor abgelassen und durch eine äquivalente Menge Mahrmedium ersetzt.

Heben den üblichen Fermentationsparametern wurde die Zellvolumenverteilung mit einem Coulter Counter bestimmt». Beim Auftreten nahezu gleichgroßer Sxtrema der Volumenverteilung wurde die Temperatur und/oder der pH-Wert des Fermentationsmediums einmalig oder mehrmalig kurzperiodisch verändert.

Bei Absinken der Ascorbinsäurebildungsrate.unter den maximalen Yfert wurde der Fermentorinhalt abgelassen und der Aufarbeitung zugeführt.

Beispiel 4 '

Der genetisch manipulierte Bakterienstamm E, coli C 600 wurde auf Glucose aerob und diskontinuierlich mit dem Ziel der Aseorbinsäuregewinnung gezüchtet» Die Permentationsparameter waren die gleichen wie in Beispiel 2» Mittels Immunofluoreszenzfärbung der Zellmembran wurde der genetisch manipulierte Stamm gegenüber dem Wildstamm diskriminiert. Die Population wurde mittels sytometrischer Durchflußanalyse analysiert. Die relative Häufigkeit des manipulierten Stammes wurde mittels der Populationsverteilung kontrolliert· Bei Auftreten eines großen Anteils des Wildstammes, wurde der Prozeß abgebrochen und neu angeimpft.

Beispiel 5 .

Der Hefestamm- Candida utilis wurde auf Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle aerob und kontinuierlich in einem 10 l-Fermentor bei einer Yerv/eilzeit von 4 h, einer Temperatur von 32 ⁰C und einem pH-Wert des Permentationsmediums. von. 4»2 gezüchtet. Das wäßrige ITährsBlzmedium enthielt pro Liter Wasser:

2000 mg IT als IiH₄Cl

300 mg P als H₃PO₄ (85 %) 300 mg K als K₂CO₃ 250 mg Mg als MgSO. .7H₂O ; 40 g Glucose Spurenelementeverbindungen in ausreichender Menge.

Um die kontinuierliche Kultivierung nach dem Zustand der Population steuern zu können, wurde der Anteil sprossender Zellen an der Population mittels eines automatischen Scanners bestimmt. ¥/enn die Mehrzahl der Zellen im Einzelzeilzustand vorlag, wurde die liährstoffzufuhr verringert. Sie wurde erhöht, wenn der Anteil der sprossenden Zellen sprunghaft anstieg. Durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens konnte der spezifische Glueοseverbrauch bei der Kultivierung verringert werden.

Claims (6)

Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Steuerung von Prozessen der biotechnischen StoffWandlung, dadurch gekennzeichnet, daß die Eingangsgrößen dieser Prozesse entsprechend der Anzahl, Höhe und/oder Porm der Maxiina und/oder Minima der Verteilungsfunktionen einzelner oder mehrerer Merkmale der am Prozeß beteiligten Zellpopulationen gesteuert werden«

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verteilungsfunktionen über morphologische Merkmale oder physikalische Eigenschaf ten der Population be stimmt 'wer- > den.

3« Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuerung durch eine Veränderung der Durchflußrate durch das System, eine Veränderung der Konzentrationen einzelner Stoffe im Zulauf und/oder eine Veränderung des Gasdurchsatzes durch das System be-wirkt wird.«

4. Verfahren nach Punkt 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Auftreten unerwünschter Populationen von Begleitorganismen, die auch unerwünschte Mutationen von genetisch veränderten Zellen sein können, durch Einstellen von für diese Begleitorganismen ungünstigen Wachstumsbedingungen (z, 3. durch Sffektorenmangel) unterdrückt werden kann«

5. Verfahren nach Punkt 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Permentaiionsphasen, die hohe Anteile an wenig effektiv wachsenden Zellen enthalten, die Kohlenstoff enthaltenden Substrate geringer dosiert werden*

6« Verfahren nach Punkt 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß in den Fermentationsphasen, die hohe Anteile nicht oder wenig produzierender Zellen enthalten, die Wachstumsbedingungen, z* B. durch Verringerung des Stickstoff- und/oder Phosphatangebotes, verschlechtert werden.