DD258623A1 - Verfahren zur herstellung von impfkulturen bei antibiotikafermentationen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Impfkulturen auf komplexen Substraten bei Antibiotikafermentationen. Es liegt ihr die Aufgabe zugrunde, die Prozessfuehrung der Impfkultur so einzurichten, dass der definitive Reifezustand, gekennzeichnet durch das Auftreten spezifischer Enzyme, mittels kontinuierlich anstehender Prozessmessgroessen erfassbar ist. Dies wird dadurch erreicht, dass infolge der staendigen Aufrechterhaltung hoher Werte der relativen Geloestsauerstoffsaettigung der Kulturbruehe aus dem Zeitverlauf des p H-Werts die Abfolge bzw. das Vorliegen der Limitationen der Hauptsubstrate C, N, P hervorgeht. In einer speziellen Ausfuehrungsform wird zur Aenderung der Limitationsabfolge die Zudosierung freier Substrate in Ableitung von der p H-Bewegung in das Verfahren einbezogen.

Description

Hierzu 5 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von physiologisch definierten Impfkulturen bei Antibiotikafermentationen. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt also in der technischen Mikrobiologie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß der Verlauf von Fermentationsprozessen zur mikrowellen Produktgewinnung außer von den Startkdnzentrationen der freien oder komplexen Substrate, den Substratdosierungen im Prozeßverlauf und den technischen Bedingungen des verwendeten Ferrrtentors maßgeblich von Alter und Menge der Impfkulturstufen, insbesondere der letzten Impfkultur, bestimmt wird (C.T.Calam: Starting Investigational und Production Cultures, Process Biochemistry 1976, Heft 4, S.7-12). Hinsichtlich der Impfkulturführung besteht die übliche Verfahrensweise darin, daß ausgehend von Sporen-oder Mycelkonserven des Produktbildners submerse Impfkulturstufen durchlaufen werden, deren Mengen von Stufe zu Stufe in der Regel um den Faktor 10 ansteigen. Die letzte Impfkultur vor der Hauptkultur-Fermentation wird im industriellen Maßstab üblicherweiseso bemessen, daß diese Impfkultur 10% bis maximal 15% des Startvolumens der Fermentationsbrühe der Hauptkultur ausmacht. Dieses Impfverhältnis ist auf die Erfordernisse der Maßstabvergrößerung zugeschnitten, wobei insbesondere der Gesichtspunkt hinreichender Biomasse-Startkonzentrationen im Vordergrund steht. Bezüglich des Alters der Impfkulturen, insbesondere der letzten Impfkultur, werden zur Festlegung des Verwendungszeitpunkts verschiedene Beurteilungskriterien herangezogen, die allerdings,hinsichtlich der Festlegung des Zustands der Vorkultur nur approximativen Charakter besitzen:

— Aus der Abnahme der Säuerungsgeschwindigkeit wird unter Hinzuziehung der CO 2-Bildungsrate bzw. der 02-Verbrauchsrate (Abluftanalyse) auf die Erschöpfung der freien Substrate, beispielsweise der C-, N- oder P-Substrate, geschlossen. Damit wird die Reifebeurteilung auf das Verhalten globaler Prozeßparameter zurückgeführt, die nach dem technischen Stand (vgl. z. B. G. IMMING et al.: The use of automated analyzers to control microbial prozesses, IFAC Symposium on Modelling and Control of Biotechnical Processes, Helsinki, Finnland, 1982) kontinuierlich erfaßbar sind.

— Als empirisches Maß der Impfkulturbeurteilung findet die Bestimmung der Reduktionsaktivität mittels Zugabe von Farbstoffindikatoren (z. B. Methylenblau) zu Impfkulturproben Verwendung.

— Weiterhin wird das Sedimentationsverhälten der Impfkultur-Biomasse zur Reifebeurteilung herangezogen. Diese aufgezählten Kriterien sind zwar als Schnellteste durchführbar, sie stehen jedoch nicht in eindeutig definierten Korrelationen mit dem destillierten Stoffwechselzustand der Impfkultur. Ihre Anwendung trägt vordergründig den Charakter des passiven Reagierens auf den spezifischen Verlauf einer auch von anlagentechnischen Zufälligkeiten abhängigen Impfkulturanzucht.

Die bekannten technischen Lösungen zur Herstellung von Impfkulturen haben bezüglich der Impfkulturbeurteilung weiterhin den Nachteil, daß sie den physiologischen Zustand der Impfkulturen im Zusammenhang mit aufeinanderfolgend eintretenden oder gleichzeitig vorliegenden Substratlimitationen während der Impfkulturanzucht sowie die Induktion bestimmter Enzyme, die für den Aufschluß komplexer Substrate in der Hauptkultur wichtig sind, nicht einbeziehen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung beinhaltet das Ziel, Impfkulturen für Antibiotikafermentationen auf einen definierten physiologischen Zustand reproduzierbar einzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Impfkulturen für Antibiotikafermentationen zu beschreiben, in welchem hinsichtlich der Rrozeßführung der Impfkultur, insbesondere hinsichtlich des Auftretens substratlimitierter Entwicklungsabschnitte bzw. von Substratlimitationen im Fließgleichgewicht durch Substratdosierungen zur programmgemäßen Einstellung der Reife der Impfkultur eine Lösung realisiert wird, welche die Nachteile der bekannten technischen Lösungen vermeidet.

Es wurde überraschend gefunden, daß beiständiger Aufrechterhaltung einer hohen relativen Geistsauerstoffsättigung in der submersen Impfkultur (mit einer Untergrenze von 60%, gemessen als pO₂-Wert) aus dem Zeitverlauf des pH-Wertes die Abfolge bzw. das Vorliegen der Limitationen der bestimmenden Substrate (C, P und N) und damit auch die Indikation für die Anwendung gezielter Substratdosierungen zum Erreichen eines angestrebten Reifezustandes der Impfkultur hervorgeht. Die charakteristische Ausprägung der einzelnen Abschnitte des pH-Verlaufs in Abhängigkeit von der Prozeßdauer der Impfkulturanzucht wird von den Verbrauchskinetiken der freien Substrate und den enzymabhängigen Aufschlußkinetiken komplexer Substrate der Fermentationsbrühe bestimmt, solange das Substrat Sauerstoff im Überschuß (und somit als Voraussetzung (und somit als Voraussetzung für das Ablaufen von Oxidationsprozessen zur Energiegewinnung) vorliegt. Danach erfolgt die Bilanzierung der freien Substrate und der komplexen Nährmedienkomponenten so, daß die Reihenfolge der Limitationen freier Substrate zur beabsichtigten Einstellung der Impfkultur, erkennbar anhand des makroskopisch erfaßten Zustande, führt, wodurch in der anschließenden Hauptfermentation ein definierter Ablauf des Nachfließens von Substraten aus komplexen Komponenten des Kulturmediums gesichert ist.

Das Verfahren wird in seinem Grundzug wie folgt durchgeführt: Entsprechend dem Arbeitsvolumen der zu beimpfenden Hauptkulturfermentation beginnt die Anzucht der vorgeschalteten Impfkultur entweder durch Einbringen von Sporen- bzw. Mycelkonserven des Antibiotikumbildners oder durch Übertragung von vorgeschalteten submersen Impfkulturstufen, die der Maßstabsvergrößerung dienen. Als mikrobielle Antibiotikabildner werden Streptomyceten, Pilze usw. verwendet. Die Sporenkonserven bzw. Mycelkonserven stellen Konservierungsvarianten dar. Sporenkonserven werden in an sich bekannter Weise auf Schräg-Agar-Eprouvetten oder verspürten Trägersubstraten wie Hirse, Reis, Mais usw. angelegt; Mycelkonserven werden in an sich bekannter Weise durch lyophile Trocknung von Mycelbiomasse erhalten. Die Impfkulturmedien enthalten Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Stärke, Melasse usw., weiterhin Stickstoffqueilen wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Ammoniumsalze, Pflanzenmehle bzw. deren Hydrolysate oder andere komplexe Nährmedienbestandteile sowie anorganische Phosphatverbindungen und verschiedene Mineralsalze. Die komplexen Medienbestandteile sind nicht nur enzymatisch zugängliche Kohlenstoff- bzw. Stickstoffquellen, sondern fungieren insbesondere auch als indirekte Phosphatdepots. Die Zeitdauer der Anzucht der letzten Impfkultur beträgt 20 Stunden bis 80 Stunden. Es wird unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 20°C bis 35°C und pH-Werten im Bereich von pH 4 bis pH 8 gearbeitet.

Die Durchführung der Impfkulturanzucht erfolgt im Rührfermentor oder in Fermentoren mit anderen Umwälzungsprinzipien, z. B. in Tauchstrahl-, Blasensäulen- oder Hubkolbenfermentoren.

Auf der Grundlage der für den eingesetzten Fermentor charakteristischen Sauerstoff-Transportrate wird zu Beginn der Impfkulturenzucht der Arbeitspunkt für das Regime von Belüftung und Umwälzung der Kulturbrühe so gewählt, daß derpO₂-Wertfürden Zeitraum von 15 Stunden bis 35 Stunden nach Fermentationsbeginn ohne Beanspruchung einer pO₂-Sollwertregelung oberhalb des 60%-Niveaus liegt.

In der ersten Phase der Impfkulturzucht, deren Dauer bis zu 35 Stunden beträgt, fällt der pH-Wert phasenweise linear mit einer Rate im Bereich von 0,005 je Stunde bis 0,08 je Stunde, wodurch die Biomassebildung, bevorzugt aus den im Medium frei verfügbaren Substraten, angezeigt wird. Das Eintreten der Erschöpfung, beispielsweise der freien P-Quelle, wird durch vorübergehendes Ansteigen des pH-Werts um Δ pH bis zu 1,5 pH-Einheiten signalisiert.

In dieser Phase beginnt infolge des Vorliegens einer oder mehrerer Substratlimitation die Induktion von Phosphatasen und/oder Proteasen und damit ein verstärkter Nachfluß von Substraten aus den komplexen Nährmedienbestandteilen. Diese enzyminduzierten Substratflüsse führen zum erneuten Absinken des pH-Werts unter den niedrigsten Wert der ersten Säuerungsphase und zum starken Ansteigen des Sauerstoffverbrauchs.

DerpH-Wert verbleibt zunächst auf diesem Wert für eine bis zu zwölf Stunden und steigt dann wieder an, wenn ein Substratfluß aus den komplexen Medienbestandteilen zu limitieren beginnt. Die Anstiegsphase dauert vier bis acht Stunden; der zugehörige pH-Anstieg ist linear mit der Rate im Bereich von 0,1 bis 0,2 je Stunde. Daran anschließend steigt der pH-Wert infolge mehrfach limitierender Substratflüsse exponentiell an und erreicht das alkalische Gebiet. Diese Phase ist durch das Vorhandensein der maximalen Enzymaktivitäten gekennzeichnet; die Impfkultur-Biomasse ist in dem Sinne reif, daß sie im Haupkulturmedium verfügbare komplexe Komponenten ohne Verzögerung verwerten kann. In der Phase des linearen Anstiegs des pH-Wertes besteht insofern Reife, als daß die Impfkultur-Biomasse bevorzugt Enzyme zur Freisetzung desjenigen speziellen Substrats (P oder N oder C) aus komplexen Komponenten des Hauptkulturmediums gebildet hat, welches als limitierender Faktor vorgesehen wurde. Der Reifezustand in der Phase des niedrigsten pH-Werts besteht im Wirken der induzierten Enzyme auf die komplexen Substrate. In der Alkalisierungsphase zwischen den Säuerungsphasen ist unter Reife die Limitation eines Substrats im herkömmlichen Sinne zu verstehen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Impfkulturanzucht dahingehend abgewandelt, daß durch Dosierungen freier Substrate die Induktion spezieller Enzyme unterdrückt wird, deren Vorhandensein für die Prozeßführung der anschließenden Hauptkultur von Nachteil ist. Dazu wird in einem der typischen Abschnitte der pH-Kinetik ein fester oder auch zeitlich variabler pH-Sollwert gewählt. Über den Säurekanal des pH-Reglers wird entweder ein Substrat (z. B. Glukose) oder ein Substratgemisch (z. B. Glukose und KH₂PO₄, Glukose und (NHJ₂SO₄ über 2 bis 6 Stunden dosiert.

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Im Extremfall ist diese Ausführungsform dahingehend modifiziert, daß mittels Dosierung von KH₂PO₄ und Glukose über die pH-Regelung die Bildung von Phosphatasen bei weiterhin wachsender Biomasse unterdrückt und zusätzlich ein Precursor für das Fermentationsprodukt der nachfolgenden Hauptkultur zur Impfkultur zugegeben wird. Damit ist der Phosphatfluß lediglich über Proteasen induziert, und in der Hauptkultur zur Gewinnung des Antibiotikums (als Sekundärmetabolit) liegt eine latente Phosphatlimitation vor.

Die verfahrensgemäße Lösung hat folgende Vorteile:

Durch die Entwicklung des vorliegenden Verfahrens zur Herstellung von Impfkulturen bei Antibiotikafermentationen, welches durch die ständige Beibehaltung hoher pO₂-Werte der Impfkultur, die Gliederung des pH-Verlaufs durch Limitationen freier Substrate und von Substratflüssen aus komplexen Komponenten des Nährmediums sowie Nachdosierung von Substraten gekennzeichnet ist, wird die Abfolge zwischen Impfkultur und Hauptkultur als biochemisch-enzymatisch begründeter zyklischer fed-batch-Vorgang definiert und ein hauptkulturspezifischer Reifezustand der Impfkultur eingestellt. Die Erfindung soll an Beispielen näher erläutert werden:

Ausführungsbeispiele_A

Beispiel 1

Die Sporenkonserve (Trägersubstrat Hirse) einer Selektante des Stammes Penicillium chrysogenum dient als Impfmaterial für die Impfkultur einer Bencylpenicillin-Hauptkulturfermentation, indem eine Sporensuspension mit der Gesamtsporenzahl von ca. 5 · 10⁹ Sporen in die 47 Stunden dauernde Impfkultur überführt wird. Der mit 2,5 Liter Nährmedium gefüllte Impffermentor (Edelstahl-Glas-Rührfermentor mit 4,51 Bruttovolumen) wird 60 Minuten bei 121⁰C im Autoklaven sterilisiert. Das Nährmedium enthält je Liter die Komponenten:

Glucose 25g, Melasse 5g, Maisquellwasser (Trockensubstanz) 5g, Sojamehl 20g, CaCO₃ 2g, (NH₄I₂SO₄ 5g, NaNO₃ 3g, KH₂PO₄ 0,5g, MgSO₄ 7H₂O 0,1 g, ZnSO₄ · 7H₂O 0,02g, MnSO₄ · 5H₂O 0,007g, Sonnenblumenöl 5g, Polypropylenglycol 0,2 ml. Vor der Sterilisation erfolgt die Einstellung des pH-Werts auf 6,5 mit Natronlauge, nach der Sterilisation liegt der pH-Wert von 6,25 im auf 25⁰C (Prozeßtemperatur der Impfkultur-Fermentation) rückgekühlten Kulturmedium vor.

Am pO₂-Regterwird als Untergrenze der relativen Gelöstsauerstoffsättigung der Wert von 65% eingestellt und die Drehzahl als Stellgröße der p0₂-Sollwertregelung benutzt. Der Wertebereich für die Drehzahl wird (wie in Abbildung 1 dargestellt) so fixiert, daß die Grunddrehzahl n₀ = 650min"¹ für pO₂ > 65% und die aufgeschaltete Drehzahl η = 850min~¹ für ρθ₂ < 65% gelten. Hinsichtlich der Sauerstofftransportrate beträgt der Unterschied bei konstanter Belüftungsrate von 150 Liter Luft je Stunde ca. 1,4g Sauerstoff je Liter Kulturlösung und Stunde.

Während der Impfkultur-Fermentation werden der pH-Wert und die relative Gelöstsauerstoffsättigung der Kulturlösung als pO.₂-Wert sowie die Drehzahl kontinuierlich gemessen und registriert, durch Probenahme im Abstand von 6 Stunden werden die Kinetiken für die Biomasse (als Gesamtsediment), den anorganischen säurelöslichen Phosphat-Phosphor (PO₄-P), den Ammonium-Stickstoff (NH₄-N), die Glucose und die Enzymaktivitäten der extrazellulären pH 7,2-Phosphatase und der Protease in der Kulturlösung ermittelt. Die Abbildungen 1 bis 3 enthalten die Verknüpfungen der Zeitverläufe von PO₂-WeIi, Drehzahl, Gesamtsediment in der Abbildung 1, pH-Wert, PO₄-P, NH₄-N, Glucose in der Abbildung 2 und pH-Wert, extrazelluläre pH 7,2-Phosphatase, Protease in der Abbildung 3.

Aus der Abbildung 1 geht hervor, daß in der Startphase bis ca. 20 Stunden zunächst die Auskeimung der Sporen stattfindet. Anschließend tritt exponentielles Wachstum ein, was sich in der rapiden Abnahme des pO₂-Werts widerspiegelt. Das Maximum der Biomasse wird nach 36 Stunden erreicht. Zur 34. Stunde setzt infolge Unterschreitung des p0₂-Sollwerts von 65% die pO₂-Sollwertregelung ein. Wegen der ständigen Inanspruchnahme der aufgeschalteten Drehzahl η = 850 min"¹ werden ab der 36. Stunde als neue Einstellungen der Drehzahlniveaus n₀ = 850 min"¹ und η = 1 000 min""¹ fixiert. Die Verknüpfung der in der Kulturlösung verfügbaren freien Leitsubstrate PO₄-P, NH₄-N und Glucose mit dem pH-Wert der Kulturlösung zunächst nur schwach ab und in Korrespondenz dazu ändern sich die Konzentrationen der Glucose und des NH₄-N nur geringfügig. Dagegen sinkt die PO₄-P-Konzentration als Ausdruck des beginnenden Wachstums deutlich ab. Damit verbunden ist die Induktion der extrazellulären pH 7,2-Phosphatase, wie aus Abbildung 3 ersichtlich. Die Formierung der Phosphataseaktivität bewirkt gemäß Abbildung 2 den beginnenden Phosphatnachfluß aus den komplexen Substraten des Kulturmediums. In der exponentiellen Wachstumsphase tritt eine schnelle Phosphat-Aufnahme ein; die Alkalisierungstendenz ab der 30. Stunde indiziert das Eintreten der P0₄-P-Limitation und entsprechend Abbildung 3 die Ausbildung starker Phosphataseaktivität zur Behebung des Phosphatmangels durch Aufschluß der komplexen Substrate des Nährmediums. Die Abnahme der Biomasse und der PO₄-P-Verlauf zeigen, daß kein völliges Fließgleichgewicht zwischen Freisetzung und Verbrauch zustande kommt. Infolge der PO₄-P-Freisetzung tritt erneut Säuerung ein, die noch vorhandene freie Glucose wird verbraucht. Gleichzeitig durchläuft die pH-Kurve die Phase des pH-Minimalwerts während der Impfkultur-Fermentation. Als Ausdruck der Glucose-Limitation steigt dann der pH-Wert drastisch an. Damit koindizierend (Abbildung 3) verdreifacht sich die proteolytische Aktivität, die den Nachfluß von Kohlenstoff-Verbindungen aus komplexen Substraten sichert. Der erste Anstieg der proteolytischen Aktivität um die 20. Stunde entspricht dem Übergang zwischen Auskeimungsphase und exponentiell Wachstumsphase.

Das starke Ansteigen des pH-Werts signalisiert, daß der C-Nachf luß zusätzlich zum P-Nachfluß limitiert, während NH₄-N noch im Überschuß vorliegt. Beim pH-Wert von 7,2 ist die Impfkultur in dem Sinne reif, daß die enzymatischen Bedingungen die verzögerungsfreie Umsetzung der Startsubstrate des Hauptkulturmediums in Biomasse und das frühzeitige Einsetzen der Säuerung sichern.

Aus den Abbildungen 1 bis 3 wird deutlich, daß die ständige Aufrechterhaltung hgher pO₂-Werte zur aufeinanderfolgenden Erschöpfung der Leitsubstrate PO₄-P und Glucose führt. Diese Abfolge und die Formierung des Enzymspecktrums der reifen Impfkuitur ist aus der zeitlichen Gliederung des pH-Verlaufs abzulesen.

Beispiel 2

Als Impfmaterial für die Impfkultur wird analog zum Beispiel 1 eine Sporenkonserve mit dem Trägersubstrat Hirse (die NH₂-N-Konzentration kann während der Hirsepräparation modifiziert werden) einer Selektante von Penicillium chrysogenum verwendet. Die Gesamtsporenzahl der in die Impfkultur zu überführende Sporensuspension ist mit der des Beispiels 1 identisch.

Als Fermentersystem wird ein 301-Reaktor eingesetzt, der mit 201 Nährmedium mit den folgenden Substratkonzentrationen beschickt wird (g/l):Saccharose 25,0; Melasse 10,0; Maisquellwasser (100%TS) 5,0; Sojamehl 5,0; Rügenkreide 2,0; ( NH₄J₂SO₄ 2,0; NaNO₃ 3,0; KH₂PO₄1,0; MgSO₄ 7H₂O 0,1; ZnSO₄ 7H₂O 0,02; MnSO₄ · 5H₂O 0,007; Sonnenblumenöl 5,0; Polypropylenglycol 0,2 ml.

Nach der Einstellung des pH-Wertes auf pH = 6,5 mit Natronlauge wird dieses Medium 40 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert und damit präpariert. Der Start-pH-Wert der Impfkultur beträgt 6,3. Als Untergrenze der relativen Gelöstsauerstoffsättigung wird ein Sollwert von 65% durch entsprechende Maßnahmen sichergestellt.

Während der Impfkulturfermentation werden die in der Abb. 4 dargestellten Werte kontinuierlich gemessen und registriert, sowie durch Probenahmen die Kinetiken für die Biomasse, PO₄-P, NH₄-N und Glucose ermittelt.

Aus der Abb. 4 wird ersichtlich, daß in der Startphase bis ca. 17 Stunden die Schwellung und Keimung der Konidien abläuft. Mit dieser Phase korrespondiert eine nur schwache Abnahme des pH-Wertes und der Konzentrationen der Leitsubstrate NH₄-N, PO₄-P und Glucose.

In der exponentiellen Wachstumsphase werden die frei verfügbaren Substrate NH₄-N, PO₄-P und Glucose schneller metabolisiert.

Da in diesem verwendeten Medium im Gegensatz zum Medium des Beispieles 1 die NH₄-N-Startkonzentration drastisch abgesenkt und die P0₄-P-Konzentration erhöht ist, wird zuerst die NH₄-N-Limitation während der Vorkulturfermentation erreicht. Der im pH-Profil abgebildete Alkalisierungspeak zeigt den durch die NH₄-Limitation erzwungenen Übergang zur oxydativen Desaminierung an. Der erneute Abfall des pH-Wertes läuft konform mit der starken Abnahme der noch frei verfügbaren Substrate PO₄-P und Glucose unter retardiertem Nachfluß von NH₂-N aus dem polymeren N-Substrat. Nach Erreichen der Glucoselimitation steigt der pH-Wert analog zum Beispiel 1 (Abb. 2) wieder drastisch an. Mit dem mit dieser pH-Phase korreliertem Nachfluß von Kohlenstoff-Verbindungen aus dem komplexen N-Substrat läuft die Induktion von Phosphatasen durch die vor der Glucoselimitation liegende PO₄-P-Limitation parallel. Beim pH-Wert von 7,0 ist die Impfkultur in dem Sinne reif, daß die enzymatischen Bedingungen die verzögerungsfreie Aussetzung der polymeren Startsubstrate des Produktbildungsmediums in Biomasse und das frühzeitige Einsetzen des pH-Wert-Abfalles sichern. Die Reifekriterien der Impfkultur bei pH = 7,0 sind durch die Abfolge der Limitation NH₄-N, PO₄-P und Glucose sowie durch das abgebildete korrelierende pH-Profil beschrieben.

Beispiel 3

Als Impfmaterial für die 1. Impfkultur wird analog zu den Beispielen 1 und 2 eine Sporenkonserve (Trägersubstrat Reis) einer Selektante von Penicillium chrysogenum verwendet. Die Sporeneinsaat beträgt ca. 10⁹ Sporen je Liter Nährmedium. Der mit 3 Liter Nährmedium gefüllte Vorimpffermenter(Edelstahl-Glas-Führfermenter mit 4,51 Bruttovolumen) wird 60 Minuten beil 21 °C im Autoklaven sterilisiert.

Das Nährmedium enthält je Liter die Inhaltsstoffe:

Saccharose 20g, Maisquellwasser (Trockensubstanz) 16,5g Erdnußmehl 10g, NaNO₃ 3g, CaCO₃2g, KH₂PO₄ 0,5g, MgSO₄ -7 H₂O 0,1 g, ZnSO₄ · 7H₂O 0,02g, MnSO₄ · 5H₂O 0,007g, Sonnenblumenöl 5g, Polypropylenglycol 0,1 ml. Vor der Sterilisation wird der pH-Wert auf 6,4 mit 40%iger Natronlauge eingestellt. Die Impfkulturanzucht wird bei 25°C durchgeführt.

Im Unterschied zu den Beispielen 1 und 2 wird im Nährmedium kein (NH₄J₂SO₄ eingesetzt, die NH₄-N-Startkonzentration von ca. 40mg/l ist durch die Sterilisation der komplexen Substratkomponenten bedingt.

Die Prozeßführung der 1. Impfkultur entspricht den im Beispiel 1 angegebenen Bedingungen, wobei als Untergrenze des pO₂-Werts 45% eingestellt wird. Die Abbildung 5 enthält die Kinetiken für die Biomasse (als Gesamtsediment), den pH-Wert, den anorganischen säurelöslichen Phosphat-Phosphor (PO₄-P), den Ammonium-Stickstoff (NH₄-N) und die Saccharose. Im Unterschied zum Beispiel 1 zeigt Abbildung 5, daß die NH₄-N-Limitation zuerst eintritt. Sie wird durch das absolute pH-Minimum angezeigt. Das anschließende Alkaiisierungsverhalten (unter starkem O₂-Verbrauch) drückt aus, daß die oxidative Desaminierung bzw. die NO₃-Verwertung zur N-Versorgung ausgenutzt werden.

Gleichzeitig findet das Hauptwachstum und die Abnahme der Substrate PO₄-P und Saccharose statt, wobei das relative pH-Maximum nach ca 32 Stunden die Aufhebung der Reprimierung der extrazellulären Phosphatasen durch den Level des PO₄-P anzeigt. Das nachfolgende relative pH-Minimum zeigt den enzymatisch aktivierten PO₄-P-Nachf luß aus den Komplexsubstraten an. Der zeitliche Abstand der pH-Minima (absolut bzw. relativ) beträgt unter den Bedingungen der limitationsfreien O₂-Versorgung ca. 10 Stunden. Diese Zeitangabe hängt nicht von der Sporeneinsaat ab, wie eine parallele Anzucht mit 10 Sporen pro Liter als Einsaatmenge ergibt.

Die Überführung der Vorimpfkultur in die 2. Stufe der Impfkulturanzucht (Vermehrungsstufe des Impfmaterials) erfolgt 5 Stunden nach dem absoluten pH-Minimum, d. h. vor dem Eintreten der PO₄-P-Limitation.

Als Fermenter wird ein 301-Reaktor wie im Beispiel 2 eingesetzt. Die Zusammensetzung des Nährmediums ist identisch mit der Vorimpfstufe, die Sterilisation wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Durch pO₂-Sollwertregelung bei 50% des Sättigungswerts unter Benutzung der Drehzahl als Stellgröße wird bezüglich der O₂-Versorgung Limitrationsfreiheit eingehalten.

Die pH-Kinetik zeigt wieder zuerst das absolute pH-Minimum, wobei sein Eintreten nach 15 bis 25 Stunden von der aktuellen Biomasseeinsaat ( aus der Vorimpfstufe) abhängig ist.

Der Reifezeitpunkt für die bezüglich PO₄-P limitationsfreie Vorkultur ist ca. 5 Stunden nach dem absoluten pH-Minimum. Der Reifezeitpunkt für die Vorkultur mit induzierten Phosphatasen bzw. Proteasen, die einen schnellen Start der Hauptkulturfermentation unter sofort beginnender Ausbeutung der Komplexsubstrate bewirkt, wird durch das relative pH-Minimum angezeigt.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung von Impfkulturen bei Antibiotikafermentationen auf komplexen Substraten mit einer Substratbilanzierung für eine Biomassekonzentration bis zu 30 g/l, gekennzeichnet dadurch, daß bei Aufrechterhaltung eines pO₂-Wertes des Kulturmediums von mehr als 40% bevorzugt jedoch.mehr als 60%, der pH-Verlauf mit mindestens zwei Minima zwischen denen ein lokales Maximum liegt, im Bereich von 5,5 bis 7,5 als Indikator für die Reife des Impfmaterials verwendet und die Kultur als reif angesehen wird, wenn das zweite pH-Minimum erreicht bzw. mehrere Stunden lang eingehalten wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das pH-Maximum nach dem ersten pH-Minimum entweder zur Anzeige der PO₄-P-Limitation und damit der Induktion von Phosphatasen oder der C- oder N-Limitation und damit der Induktion von Proteasen dient, wenn das Gesamtphosphat-P0₄-P-Verhältnisim Medium auf 1,8 eingestellt wird und die C-und N-Konzentration im Überschuß vorliegt bzw. das Gesamtphosphat-PO₄-P-Verhältnis 0,9 beträgt und die Gesamtstickstoffkonzentration im Medium um 60% gesenkt wird.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine externe Zudosierung freier Substrate (P oder/und C oder/und N) vorgenommen wird.

4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Dosierung eines Produkt-Precursors der Hauptfermentation vorgenommen wird.