DD233753A3 - Verfahren zur herstellung nourseothricin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft die Herstellung des Streptothricin-Antibiotikums Nouresothricin durch mikrobielle Fermentationen mittels Beeinflussung des Phosphatstoffwechsels. Zu diesem Zweck werden zwei Manipulationen hintereinander bzw. einzeln durchgefuehrt:- Absenken der Anfangskonzentration an loeslichem und an verfuegbarem Phosphat auf ein niedriges Niveau waehrend der Sterilisation des Naehrmediums-Wiederzufuehrung von Phosphat durch Zugabe von phosphathaltigen Substanzen nach einem geeigneten Zugaberegime.Die Absenkung der Anfangskonzentration von verfuegbarem Phosphat erfolgt durch Erhoehung der p H-Werte waehrend der Sterilisation und durch Ausfaellen phosphathaltiger Sedimente bei Anwesenheit von phosphatfaellenden Ionen. Die Aziditaet der Fermentationsmedien wird waehrend der Sterilisation entweder direkt auf alkalische p H-Werte eingestellt oder durch die Anwesenheit hoeherer Sulfatkonzentrationen neben Calciumcarbonat waehrend der Direktdampfsterilisation indirekt erhoeht. Die Phosphatzufuehrung der phosphathaltigen Substanzen erfolgt nach einem optimalen Regime waehrend der Fermentation unter Vermeidung weiterer Limitationen oder anderer unguenstiger Bedingungen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung des Streptothricin-Antibiotikums Nourseothricin durch die zielgerichtete Beeinflussung der mikrobiellen Fermentation. Sie ist für die mikrobielle Industrie von Bedeutung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösung

Drei repressive Haupteinflüsse durch die Substrate werden im Zusammenhang mit der Sekundärmetabolit-Biosynthese in der Literatur genannt, die

1. durch Glukose und andere Zucker

2. durch Aminosäuren und Ammoniumsalze und

3. durch Phosphat

bewirkt werden (Martin, J. F. und A. L Demain: Control of antibiotic biosynthesis. Microbiol. Rev. 44,230-251 [1980]). Im Falle der Biosynthese des Streptothricin-Antibiotikums Nourseothricin mit Spreptomyces noursei IMETJA 3890 b ist bekannt, daß diese durch Aminosäuren und Ammoniumsalze negativ beeinflußt wird (Gräfe, U., Steudel, A., Bocker, H. u/id Thrum, H.: Regulative influence of o-aminobenzoic acid [OABA] on the biosynthesis of nourseothricin in cultures of Streptomyces noursei JA 3890 b. Z.

AIIg. Mikrobiol.20,185-194 [1980] und hier zitierte Literatur).

Bisher wurde als StickstoffqueHe im Nährmedium Ammoniumnitrat verwendet (siehe Gräfe et al. 1980). In dieser Verbindung liegt die Hälfte des Stickstoffs nicht als Ammoniumionen vor.

Nachteilig für die technische Anwendung ist, daß Ammoniumnitrat ein Sprengstoff ist und nur in Verbindung mit aufwendigen Sicherheitsmaßnahmen angewendet werden darf. Weiterhin kann bisher nur bei Zusatz der relativ kostenintensiven und umweltbelastenden Inhibitoren der Atmung und des Aminosäuretransports, beispielsweise o-Aminobenzoesäure (OABA), maximal 3000£ig/ml Nourseothricin bei Fermentationsende im Kulturfiltrat von Laborfermentationen nachgewiesen werden (Gräfe, U., Bocker, H., Reinhardt, G. und Thrum, H.: Regulative Beeinflussung der Nourseothricinbiosynthese durch o-Aminobenzoesäure in Kulturen des Streptomyces noursei JA 3890 b. Z. AIIg. Mikrobiol. 14,659-673 [1974]).

Es ist bekannt, daß die Biosynthese einer Reihe von Sekundärmetaboliten durch überschüssiges Phosphat negativ beeinflußt wird (Martin, J. F.: Control of antibiotic biosynthesis by phosphate. Adv. Biochem. Eng. 6,105-127(1977); Weinberg, D.:

Secondary metabolism: regulation by phosphate and trace elements. Folia Microbiol. 23,496-504(1978]). Deshalb werden einige technische mikrobielle Fermentationen zur Herstellung von Antibiotika, bei für das Wachstum des mikrobiellen Produzenten suboptimalen Phosphatkonzentrationen durchgeführt. In der Regel werden komplexe Medienbestandteile pflanzlicher und tierischer Herkunft, wie Stärke, Sojaschrot, Maisquellwasser, Melasse, Fleischextrakt u.a., bei technischen Fermentationen zur Gewinnung von Sekundärmetaboliten eingesetzt. Je nach Herkunft und Behandlung schwanken die Gesamtphosphatgehalte und die biologische Verfügbarkeit (Löslichkeit) eines komplexen Substrates.

Unterschiedliche Anteile des Gesamtphosphats, das durch die komplexen Substrate in das Submersmedium übertragen wird, liegt dann bei Fermentationsbeginn als gelöstes, sofort verfügbares Phosphat vor.

Die aufgeführten Umstände erschweren grundsätzlich die Standardisierung der Nährmedien. Die biologische Verfügbarkeit des Phosphats hat eine entscheidende Bedeutung für die Ausbeute an angestrebten Sekundärmetaboliten, weil einerseits eine bestimmte Phosphatmenge für das Wachstum der produzierenden Mikroorganismen notwendig ist und zum anderen zu hohe Anfangskonzentrationen an löslichem Phosphat die Sekundärmetabolit-Bildung inhibieren können. Das DD-WP 155239 beansprucht die Verwendung der Konzentration der im Kulturmedium enthaltenden Phosphationen als Regelgröße zur Stabilisierung einer kontinuierlichen mikrobiellen Kultur. Das Verfahren bezieht sich jedoch nur auf die fermentative Gewinnung von Biomasse, wobei der Sollwert der Phosphatkonzentration im Bereich von 20bis60mg/l Phosphor einzustellen ist. Die Anwendung dieser Erfindung auf die Regulation der Biosynthese von Sekundärmetaboliten, insbesondere in mikrobiellen Batch-Kulturen, ist nicht bekannt.

Regulatorische Effekte von Phosphat auf die Nourseothricin-Biosynthese sind nicht bekannt.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung beinhaltet das Ziel, die Nachteile bisher beschriebener Noursütithricin-Herstellungsverfahren zu beheben und durch Beeinflussung des Fermentationsprozesses die Nourseothricin-Konzentrationen in technischen Fermentationen zu erhöhen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technisch günstiges Verfahren für die industrielle Produktion von Nourseothricin anzugeben. Überraschenderweise wurde gefunden, daß in Fermentationen zur Herstellung von Nourseothricin nach Absenken der Phosphat-Anfangskonzentration unter einen vorher als optimal gefundenen Wert und anschließender Zugabe einer entsprechenden oder höheren Phosphatmenge während der Kultivierung, zugesetzt nach einem bestimmten Zeitregime, wesentlich höhere Nourseothricin-Ausbeuten erhalten werden können.

Außerdem wurde gefunden, daß in einem CaCO3-haltigen Submersmedium bei einem Austausch der Stickstoffquelle Ammoniumnitrat durch das Sulfat-haltige Ammoniumsulfat in einem in Bezug auf den Stickstoffgehalt stöchiometrischen Verhältnis die Anfangskonzentrationen an Phosphat von etwa 15mg/l Phosphat-P auf 1 bis3mg/l im ansonsten unveränderten Medium nach der Sterilisation mit gespanntem Wasserdampf abgesenkt wird.

Generell kann die Anfangskonzentration an löslichem, biologisch, sofort verfügbarem Phosphat im sterilisierten Medium durch entsprechende Abstimmung von Sterilisationsregime und Gehalt an Sulfationen und an anorganischen Salzen bzw. Metallionen, die mit Phosphat- bzw. Sulfationen schwerlösliche Sedimente ergeben, erniedrigt werden.

AlsGrundfürdie Absenkung dieser Anfangskonzentration im Fall der Anwesenheit einer hinreichenden Menge von Sulfationen erwies sich eine Verschiebung der Azidität des schwach sauren Submersmediums zu alkalischen pH-Werten im Verlauf der Sterilisation, hervorgerufen durch Ausfällen von CaSO₄ und der damit verbundenen Entfernung physiologisch saurer Sulfationen aus dem Medium. Dementsprechend wird die Anfangskonzentration an löslichen bzw. biologisch verfügbaren Phosphat auch durch die externe Einstellung eines alkalischen pH-Wertes vor der Sterilisation erniedrigt. Die Erhöhung des pH-Wertes bewirkt, daß günstige Bedingungen für die Ausfällung des Phosphats mit bestimmten, im Nährmedium vorhandenen Metallionen gegeben sind. Die Ausfällung der Phosphathaitigen Sedimente wird durch die gezielte Zugabe solcher Metallionen, z. B. von Eisen(lll), Aluminium(lll), Magnesium(ll), Calcium(ll), Zink(ll) u. a. gefördert.

Besonders günstig für eine Phosphatausfällung ist die in den meisten technischen Fermentationen verwendete Sterilisationsmethode mit direkt einwirkendem gespanntem Wasserdampf sowie die Anwesenheit von CaCO₃, das zur pH-Pufferung der Fermentationen eingesetzt wird.

Der Phosphatgehalt des Mediums kann generell auch durch Verringerung des Anteils der Phosphat-haltigen komplexen Substrate erniedrigt werden. So enthält beispielsweise das bei der Nourseothricinfermentation eingesetzte Sojaextraktionsschrot ca. 8mg Phosphat-Phosphor pro g Schrot.

Unter den geschilderten Voraussetzungen wird die Phosphatanfangskonzentration an gelöstem bzw. verfügbarem Phosphat so niedrig, daß die für die Nourseothricin-produzierenden Mikroorganismen spezifischen oberen Toleranzwerte des Phosphats in jedem Fall unterschritten werden. Diese geringen Phosphatkonzentrationen bieten nun die Möglichkeit, durch eine definierte Phosphatzuführung nach der Sterilisation ein in bezug auf das Phosphat weitgehendst standardisiertes Medium zu erhalten. Darüber hinaus kann über das Zugaberegime des Phosphates der Phosphatstoffwechsel der Mikroorganismen so gesteuert werden, daß eine hohe Produktausbeute erhalten wird. Die Zuführung des Phosphates kann in Form einer Lösung oder eines Feststoffes oder einer Suspension durchgeführt werden. Das Phosphat kann entweder als freie Phosphationen oder als chemisch oder physikalisch gebundenes Phosphat vorliegen. Je nach Zuführungsregime erfolgt die Zuführung von Phosphat bzw. Phosphat-haltigen Substanzen nach der Sterilisation oder während der Fermentation durch eine einmalige und/oder mehrmalige und/oder eine kontinuierliche Zugabe. Die kontinuierliche Zugabe kann mit unterschiedlichen Zugaberaten während der Fermentation durchgeführt werden.

Als Randbedingung ist zu sichern, daß keine für die Produktbildung ungünstige Limitation durch Substrate oder durch Umweltbedingungen im Zusammenhang mit der Phosphatzuführung und daraus resultierendem Wachstum bzw. gesteigerten Stoffwechselaktivitäten entstehen. Auf diesem Wege gelingt es, die biologische Potenz des Nourseothricin-Bildners zur Produktbildung weitgehend auszuschöpfen und so die Produktausbeute zu erhöhen.

Ausführungsbeispiele

An Ausführungsbeispielen soll die Erfindung näher erläutert werden.

1) Einelyophil an Erde getrocknete Sporenkonserve der Selektante NG 13-14 des Nourseothricin-.bildenden Stammes Streptomyces noursei IMET JA 3890 b wird auf ein geeignetes Agarmedium, beispielsweise Emerson-Agar, ausgestreut. Nach etwa siebentägiger Bebrütung bei 30⁰C werden etwa 2cm² große Stücken des Myzelrasens herausgeschnitten und damit jeweils ein Kulturansatz der Vorzucht beimpft. Das Vorzuchtmedium enthält je Liter Leitungswasser folgende Einsatzstoffe: 40g Glukose, 15g entöltes Sojamehl, 0,3g KH₂PO₄,5g NaCI und 3g CaCO₃. Die Azidität wird vor der Sterilisation auf den Wert pH 6,5 eingestellt. Dieses Medium wird in 500 ml fassende, mit Wattestopfen verschlossene Steilbrustflaschen in Mengen zu jeweils 50 ml abgefüllt. Die Sterilisation erfolgt durch 35minütiges Erhitzen auf 121 °C im Autoklaven. Die beimpften Vorzuchtansätze werden 48 Stunden als Schüttelkulturen bei 29⁰C bebrütet. Mit 150 ml der so erhaltenen Vorzuchten wird der 2500ml beinhaltende Kulturansatz der Hauptkultur im Laborfermentor beimpft. Für die Hauptkultur wird ein Medium verwendet, welches im Liter folgende Einsatzstoffe enthält: 32g Kartoffelstärke, 29 g Glukose, 11 g entöltes Sojamehl, 11 g (NH₄J₂SO₄,2g MgSO₄ · 7H₂0,1 g NaCI, 6g CaCO₃ und 0,5g ZnSO₄ · 7H₂O. Auf 2500ml Nährmedium werden als Entschäumer auf Silikonbasis 1 ml Antaphron zugegeben. Vor der Sterilisation hat die Azidität der Wert pH 6,0. Nach der Sterilisation des mit 2500 ml gefüllten Fermentor-Kulturgefäßes bei 121 °C im Autoklaven und Wiederabkühlen auf 30⁰C wird die Start-Azidität durch aseptischen Zusatz von 10%iger steriler Schwefelsäure von pH 8,4 auf pH 6,8 eingestellt. Die beimpften Fermentationsansätze werden 168 Stunden bei einerTemperaturvon30°Cund einer Belüftungsrate von 2500ml Luft pro Minute unter Rühren von 800U-min"¹ bebrütet. Ab 1,5 Stunden nach Beimpfung der Hauptkultur wird eine Lösung von 4g KH₂PO₄ pro Liter destilliertem Wasser über einen Zeitraum von 5 Stunden mit einer Rate von 1,8ml/Stunde mittels einer Peristaltikpumpe kontinuierlich zudosiert; anschließend erfolgt diese Zugabe über einen Zeitraum von 21 Stunden mit einer Dosierrate von 3,5 ml/Stunde. Während der Fermentation werden unter aseptischen Bedingungen periodisch Proben der Kulturlösung entnommen und i diesen die Gehalte an Nourseothricin-Base mittels des Lochplattendiffusionstests unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Testkeim, an Glukose, an Ammoniumstickstoff und an Feststoffen bestimmt. Die Parameter pO₂, pH und CO₂-Gehalt in der Abluft werden während des Prozeßverlaufes durch registrierende Messung verfolgt. Das Absinken der Azidität der Kulturlösung unter den Wert pH 5,8 wird durch Zudosierung von steriler 5%iger Natronlauge verhindert.

Bei Absinken der Glukose-Konzentration auf 5g/l oder des Ammoniumstickstoffs auf 0,5g/l, was sich durch Erhöhen der gemessenen pH-Werte und der pO₂-Werte sowie Erniedrigung des CO₂-Gehalts in der Abluft anzeigt, werden 25g Glukose bzw. 10g (NH₄)₂SO₄als konzentrierte, sterile Lösungen diskontinuierlich zugegeben.

Eine weitere Fermentation wird ohne Zudosierung von KH₂PO₄, Glukose und (NH₄J₂SO₄ unter ansonsten gleichen Bedingungen durchgeführt. Bei Abbruch der Fermentation weist die Kulturlösung noch deutlich nachweisbare Mengen an Glukose und Ammonium auf. Die in den beiden unterschiedlichen Fermentationen im Kulturfiltrat bestimmten Konzentrationen an Nourseothricin-Base werden in der Tabelle 1 wiedergegeben. __ „ -

2) Eine lyophil an Glukose-Gelatine getrocknete Myzelkonserve (Bruttogewicht des Konserveninhaltes etwa 300mg) des im Beispiel 1 genannten Nourseothricin-bildenden Streptomyceten-Stammes wird mit 3ml einer 0,9%igen Natriumchlorid-Lösung aufgeschwemmt. Von dieser Suspension dienen 0,5 ml als Inokulum von 400 ml Vorzucht der ersten Stufe.

Das Vorzucht-Medium hat die gleiche Zusammensetzung und Azidität wie im Beispiel 1 angegeben. Dieses Medium wird in 2 500 ml-fassende, mit Wattestopfen verschlossene Steilbrustflaschen in Mengen von je 400 ml abgefüllt. Die Sterilisation erfolgt durch 35 Minuten dauernde Erhitzung auf 121⁰C im Autoklaven.

Die auf Raumtemperatur rückgekühlten und beimpften Ansätze werden 48 Stunden als Schüttelkulturen (180U-min~¹) bei 29⁰C bebrütet. Mit 1200 ml der so erhaltenen Kulturlösung der ersten Vorzucht wird als zweite Stufe der Vorzucht ein mit 150 Liter hitzesterilisiertem Medium (60 Minuten bei 121⁰C) der gleichen Zusammensetzungwie in der ersten Vorkulturstufe gefüllter, mit Vorrichtungen zur Sterilbelüftung und einem Rührwerk ausgestatteter Edelstahlfermenter (250 Liter Bruttovolumen) beimpft. Die Kultivierung erfolgt bei 27^CC bis 29⁰C, einer Geschwindigkeit des Rührwerks von 240 U-min~¹ und einer Belüftungsrate von 1 Liter pro Liter Kulturlösung in der Minute.

Für die Hauptkultur dienen mit Vorrichtungen zur Sterilbelüftung und einem zentralgelagerten Rührwerk versehene Edelstahlfermenter (710 Liter Bruttovolumen), die mit je 500 Liter Nährmedium (Rezeptur siehe Beispiel 1) gefüllt sind. Als Entschäumer wird 0,5g/l Antaphron zugesetzt. Die Azidität wird vor der Sterilisation auf denpH-Bereich 6,7 bis 7,0 eingestellt.

Die Sterilisation des Nährmediums (ohne Glukose-Anteil) erfolgt in situ durch Vorwärmung mit Manteldampf auf etwa 7O⁰C und anschließender Erhitzung mittels Direktdampf auf 121⁰C für 15 Minuten. Nach der Abkühlung auf etwa 30⁰C wird die in Form einer 50%igen wäßrigen Lösung durch 30 minütiges Erhitzen auf 121⁰C getrennt sterilisierte Glukose unter aseptischen Bedingungen zugesetzt. Vor der Beimpfung erfolgt die Erniedrigung der Start-Azidität von pH 8,6 auf Werte zwischen pH 6,9 bis 7,1 mittels steriler 10%iger Schwefelsäure.

Die mit jeweils 5% Inokulum aus der zweiten Vorzuchtstufe beimpften Fermenter-Ansätze der Hauptkultur werden 120 Stunden bei Temperaturen zwischen 28°C bis 30⁰C, einer Belüftungsrate von 500 Liter Luft pro Minute (Druck 0,14 bis 0,16MPa) unter Rühren (320U · min"¹) kultiviert.

Zu einem der beiden Fermenter-Ansätze werden ab der 2. bis zur 32. Stunde nach der Beimpfung eine wäßrige Lösung, die 87 g/l KH₂PO₄ enthält, mittels Peristaltikpumpe mit konstanter Rate so dosiert, daß innerhalb von 30 Stunden pro Liter Kultur 40mg Phosphat-P zufließen.

Während der Fermentation werden unter aseptischen Bedingungen periodisch Proben der Kulturlösung entnommen und in diesen die Konzentrationen aus Nourseothricin-Base mittels des Lochplattendiffusionstestes unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC6633 als Testkeim, an Glukose, an Ammoniumstickstoff und an Feststoffen bestimmt. Die Parameter pH und CO₂-Gehaltin der Abluft werden währenddes Prozeßverlaufes durch registrierende Messung verfolgt.

Beim Absinken der Glukose-Konzentration unter 5g/l oder des Ammoniumstickstoffs unter 0,5g/l, erkennbar an einem Anstieg der pH-Werte und Erniedrigung desCO₂-Gehaltes in der Abluft, werden 5000g Glukose bzw. 1800g Ammoniumsulfat als konzentrierte, sterile wäßrige Lösung diskontinuierlich zugegeben.

Der andere Fermenter-Ansatz erhält keine Zudosierungen an Phosphat, Glukose bzw. Ammoniumsulfat. Eine ph-Regulierung erfolgt nicht; die kontinuierlich gemessenen Aziditäts-Werte bewegen sich in dem Bereich von pH 6,4 bis pH 7,2. Bei Abbruch der Fermentation enthält die Kulturlösung noch Mengen über5g/l Glukose und 0,5g/l Ammoniumstickstoff.

Die in den beiden unterschiedlichen Fermentationen im Kulturfiltrat bestimmten Konzentrationen an Nourseothricin-Base werden in der Tabelle 2 wiedergegeben.

3) Eine lyophil an Glukose/Gelatine getrocknete Myzelkonserve (Bruttogewicht des Konserveninhaltes etwa 300mg) einer Selektante des Nourseothricin-bildenden Stammes IMET JA 3890 b wird hinsichtlich der Vorkultivierung wie in Beispiel 2) behandelt.

Für die Hauptkultur wird ein mit Vorrichtungen zur Sterilbelüftung und einem zentralgelagerten Rührwerk versehener Laborfermentorvon7l Bruttovolumen, der mit 4,51 Nährmedium gefüllt wird, verwendet.

Die Kultivierung erfolgt in einem modifizierten Medium (Ausführungsbeispiel 1), das 60g/l Glukose enthält. Als Entschäumer wird je I Kultur 0,5g Antaphron NM 40 zugesetzt.

Zur Simulierung der technischen Bedingungen erfolgt die Sterilisation in einem Edelstahlfermentor, der mit-2500l des Nährmediums ohne den Glukoseanteil gefüllt ist. Die Azidität wird vor der Sterilisation auf pH 7,4 eingestellt. Die Sterilisation erfolgt in situ durcl-Vorwärmung mit Manteldampf auf 75°C und anschließender Erhitzung mittels Direktdampf auf 120⁰C für 15 Minuten. Nach Abkühlen auf 29°C wird die in Form einer 50%igen Lösung durch 30rrinütiges Erhitzen auf 120⁰C getrennt sterilisierte Glukose unter aseptischen Bedingungen zugesetzt. Vor der Beimpfung wird die Start-Azidität mit Schwefelsäure von pH 8,1 so erniedrigt, daß nach der Beimpfung der Startwert bei pH 7,4 liegt. Der Fermentationsansatz wird mit 4% Inokulum aus der zweiten Vorzuchtstufe beimpft. Aus dem Fermentor werden zur Durchführung des Versuches 4,51 in den Laborfermentor überführt, der getrennt in ungefülltem Zustand im Autoklaven sterilisiert wird.

Die Hauptkultur dauert 146 Stunden bei einer Temperatur von 29°Cund einer Belüftungsrate von 4,51 Luft pro Minute. Die ,_: Startdrehzahl des Rührers von 800U · min"¹ wird zur Erreichung einer besseren Sauerstoffversorgung der Kultur erhöht; ab der 28. Stunde beträgt die Rührerdrehzahl 1000 U · min"¹. Zwischen der 2.-40. Stunde nach Beimpfen werden 784mg KH₂PO₄ als wäßrige Lösung mittels einer Peristaltikpumpe mit zeitvarianten Raten zwischen 1,25 und 1,75mg Phosphat-P pro Stunde und Liter Kultur zudosiert. Mittels automatischer Zugabe von 25%iger wäßriger Ammoniaklösung wird das Nichtunterschreiten der Regelschwelle pH 6,2 und damit auch eine ausreichende Versorgung der Kultur mit Ammoniumstickstoff gewährleistet. Glukose wird als konzentrierte wäßrige Lösung diskontinuierlich immer dann zugegeben, wenn die prozeßbegleitende Analytik den Abfall der Glukosekonzentration unter 10g/l anzeigt. Während der Fermentation werden unter aseptischen Bedingungen periodisch Proben der Kulturlösung entnommen und in den Kulturfiltraten die Konzentration der Nourseothricin-Base mittels Lochplattendiffusionstest bestimmt. (Tab.3).

-4- *»/o /υ

4) In einer analog zu Ausführungsbeispiel 3) durchgeführten Fermentation wird der Zinksulfatanteil des Hauptkulturmediums durch 0,2g/l Fe₂(SO₄I₃ · 9 H₂O ersetzt. Die Nourseothricinkonzentration im Kulturfiltrat beträgt nach 120stündiger Fermentationsdauer 8200jug/ml (Tab.4).

5) In einer analog zu Ausführungsbeispiel 3) durchgeführten Fermentation wird der Zinksulfatanteil durch 0,13 g/l AI₂(SO4>3 · H₂O ersetzt. Die Nourseothricinkonzentration im Kulturfiltrat beträgt nach 120stündiger Fermentationsdauer 8400/xg/ml (Tab. 4).

6) In einer weiteren, weitgehenst nach Ausführungsbeispiel 5) durchgeführten Fermentation, wird der Gehalt des Submersmediumsvon 11 g/l entöltem Sojaschrots auf 4g/l reduziert. Weiter wird der pH-Wert des Mediums vor der Sterilisation mit verdünnter Natronlauge auf pH 8,1 eingestellt. Nach der Sterilisation mit gespanntem Dampf wird der pH-Wert mit konzentrierter Schwefelsäure so eingestellt, daß er nach der Beimpf ung bei pH 7,2 liegt. Die Phosphatdosierung erfolgt zwischen der 2. bis 72. Stunde durch eine wässrige KH₂PO₄-Lösung, die mit konstanter Rate so zugegeben wird, daß eine Phosphatversorgung von 1,4mg Phosphat-P pro Stunde und Liter Kultur erzielt wird. Während der Fermentation wird Glukose diskontinuierlich so zugegeben, daß die Glukosekonzentration nicht unter 1 g/l absinkt. Der pH-Wert wird durch Titration mit 25%iger Ammoniumhydroxid-Lösung auf pH 6,0 gehalten.

Die erreichten Nourseothricin-Konzentration sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Tabelle 1: Nourseothricin-Gehalte in mit KH₂PO₄, Glukose und (NH₄J₂SO₄ dosierten und in nichtdosierten Laborfermenterkulturen des Stammes Streptomyces noursei IMETJA3890b-//NG 1-3-14 in Abhängigkeit von der Fermentationszeit

Fermentationszeit Mit Dosierung Ohne Dosierung (Kontrolle)

h /ig/ml % /ig/ml %

Tabelle 2: Nourseothricin-Gehalte in mit HK₂PO₄, Glukose und (NH₄J₂SO₄ dosierten und nicht dosierten 5001-Fermenterkulturen des Stammes Streptomyces noursei IMET JA 3890b—//NG 13-14 in Abhängigkeit von der Fermentationszeit

Fermentationszeit Mit Dosierung Ohne Dosierung (Kontrolle)

h jag/ml % /Lig/ml %

Tabelle 3: Nourseothricin-Gehalt in einer mit KH₂PO₄, Glukose und (NH₄I₂SO₄ dosierten 4,51 Fermenterkultur einer Selektante des Stammes Streptomyces noursei IMET JA 3890b in Abhängigkeit von der Fermentationszeit

1035	249	415	100
2980	165	1805	100
5412	294	1840	100
8311	213	3905	100
8800	195	4520	100
9230	213	4005	100

225	216	104	100
1600	228	702	100
4858	299	1627	100
4903	208	2362	100
6862	191	3585	100
7781	200	3885	100

Fermentationszeit	20	Nourseothricinkonzentration
h	44	Mg/ml
68	320
92	2330
116	6240
146	8010
11040
14070

Tabelle 4: Nourseothricin-Gehalte einer entsprechend Au'sführungsbeispiel 4) mit Fe(lll)-Ionen und einer entsprechend Ausführungsbeispiel 5) mit Al(lll)-Ionen durchgeführten Fermentation in Abhängigkeit von der Fe. wüsntationszeit

Fermentationszeit Nourseothricinkonzentration μg/ml bei Ausführungsbeispiel

h 4)5)

530	800
2500	3200
5400	6300
7250	7400
8200	8400

— ο — **/»» ι\ι

Tabelle 5: Nourseothricin-Gehalte einer mit KH₂PO₄, Glukose und Ammoniumhydroxid dosierten und Al(lll)-Ionen enthaltenden Laborfermentatorkulturen in Abhängigkeit von der Fermentationszeit

Fermentationszeit	24	Nourseothricmkonzentration
h	48	//,g/ml
72	800
96	2000
120	5660
8900
11000 *

Claims (1)

1. — I - t/O IV

   Erfindungsanspruch:

   Verfahren zurfermentativen Herstellung von Nourseothricin durch Einstellen der Konzentration an biologisch verfügbarem Phosphat, dadurch gekennzeichnet, daß einzeln oder kombiniert angewendete Maßnahmen angewendet werden, indem

   — die Sterilisation der Nährmedien mit gespanntem Wasserdampf in Gegenwart von Metallionen, die mit Phosphat schwerlösliche Sedimente bilden, nach vorigem Einstellen der Azidität der Nährmedien auf Werte zwischen pH 7 bis pH 9 und/oder gleichzeitiger Anwesenheit von Sulfationen und Calciumcarbonat durchgeführt wird,

   — der Gehalt der Nährmedien an Phosphat-haltigen komplexen Substraten vor der Sterilisation erniedrigt wird,

   — Phosphat zu Fermentationsbeginn und/oder während des weiteren Verlaufs der Fermentation unter Vermeidung weiterer Limitationen zugeführt wird.