DD229854A3 - Verfahren zur fermentativen herstellung von sekundaermetaboliten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Sekundaermetaboliten. Sie dient der limitationsfreien Durchfuehrung von Fermentationen zur Herstellung von Sekundaermetaboliten. Das Verfahren wird durch Verwendung der kontinuierlich erfassbaren und regelbaren globalen Prozessparameter p H-Wert, Lauge-Dosierrate, pO2-Wert, Reaktionswaerme und Abgaszusammensetzung durchgefuehrt. Die aktuelle Lauge-Dosierrate als Mass fuer die physiologisch wirksame Phosphatmenge wird zur Steuerung der Dosierung von Substraten benutzt. Speziell wird als Lauge Ammoniumhydroxid benutzt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zurfermentativen Herstellung von Sekundärmetaboliten, bevorzugt Antibiotika, deren Bildungscharakteristik durch Steuerung des Stoffwechsels der Produktionsorganismen mittels direkter oder/und indirekter Zufütterung verschiedener, beispielsweise phosphathaltiger Substanzen während der Fermentation beeinflußbar ist. Somit ist die Erfindung für die mikrobielle Industrie von Bedeutung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits vorgeschlagen worden, neben der Einstellung, insbesondere Absenkung, der Konzentration des verfügbaren Phosphats im Startmedium von Fermentationen zur Gewinnung von Sekundärmetaboliten phosphathaltige Substanzen zu Fermentationsbeginn und/oder während des weiteren Verlaufs der Fermentation bei Vermeidung weiterer Limitationen dosiert zuzugeben, um die regulativen Wechselwirkungen des biologischen Systems mit dem Ziel der Erhöhung der Produktbildungsrate zu beeinflussen.

Hinsichtlich der Anwendung o.g. Erfindung in sogenannten echtzeitgesteuerten Fermentationen besteht die Schwierigkeit, auf die in der Fermentationstechnik etablierten, kontinuierlich meßbaren globalen Prozeßparameter wie pH-Wert, pO₂-Wert, Dosierraten, Abgaszusammensetzung (CO₂-Bildung), Wärmebildung usw. anstelle der erst durch zeitaufwendige chemische Analytik nachträglich festzustellenden Substratkonzentrationen als primäre regulative Prozeßparameter ausweichen zu müssen. Diese Notwendigkeit resultiert aus dem gegebenen Stand der automatisierten Meßtechnik in der Biotechnologie (Sukatsch, D.A., Nesemann, G.: Automatische Parametererfassung bei industriellen Fermentationen. Chemie-Technik 6 [1977], 261).

Ziel der Erfindung

Die Erfindung beinhaltet das Ziel der limitationsfreien Durchführung von Fermentationen zur Herstellung von Sekundärmetaboliten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Sekundärmetaboliten zu beschreiben, das eine verfahrenstechnisch günstige Lösung für die Echtzeitsteuerung industrieller Fermentationen mit direkter oder/und indirekter Substratdosierung, insbesondere Phosphat, Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen, Spurenelementen und Substanzen mit Effektorwirkung beinhaltet. Dabei soll sich die Steuerung der Substratdosierungen von kontinuierlich erfaßbaren und regelbaren globalen Prozeßparametern wie pO₂-Wert, pH-Wert, Wärme- und CGyBildung und speziell von den Dpsierraten zurpH-Regelung bzw. den Bildungsraten für Wärme und CO₂ ableiten und die Realisierung der effektiven Produktbildungsrate über einen langen Zeitabschnitt der Fermentation erlauben.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß der Zeitverlauf der Lauge-Dosierrate bei der pH-Sollwertregelung den Zeitverlauf der Konzentration des für die Umsetzung von Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen, Spurenelementen und Substanzen mit Effektorwirkung physiologisch wirksamen Phosphats abbildet, solange bezüglich dieser Substrate und des Gelöstsauerstoffgehalts Limitationsfreiheit vorliegt. Damit ist gemeint, daß die zur Einhaltung einer ausgewählten unteren p-Regelschwelle notwendig zugesetzte Lauge, die genannte Lauge-Dosierrate, proportional zur physiologisch wirksamen Phosphatkonzentration ist. Der Abbildungsmaßstab hängt also von der Festlegung der unteren Regelgrenze des pH-Wertes ab; das Einsetzen der Laugedosierung ist durch die Pufferung des Startnährmediums bestimmt.

Im weiteren Ausbau der Erfindung wird als Lauge-Dosierrate Ammoniumhydroxid für die Steuerung der Dosierung o.g. Substrate verwendet.

Das Verfahren wird wie folgt durchgeführt:

An der Regeleinrichtung für den pH-Wert wird die untere pH-Regelschwelle eingestellt, beispielsweise pH 6,2. Dadurch ergibt sich im Fermentationsverlauf die äquivalente Ammoniumhydroxid-Dosierrate als Funktion der Zeit. Wegen des beschriebenen funktionellen Zusammenhangs zwischen dieser Dosierrate und der Konzentration des physiologisch wirksamen Phosphats ist das Maß für die Stoffwechselaktivität der Fermentation aufgezeigt. Der dieser Stoffwechselaktivität entsprechende Verbrauch von C-Quellen, N-Quellen, Spurenelementen und Substanzen mit Effektorwirkung wird durch Zudosierung ausgeglichen. Das Verfahren läßt sich auch so durchführen, daß der für die Produktbildung effektivste Zeitverlauf der Phosphatkonzentration durch direkte Phosphatdosierung mittels Einstellung der für den Prozeßverlauf günstigsten Ammoniumhydroxid-Dosierrate realisiert wird. Bezüglich der direkten Phosphatdosierung in Form der Zugabe phosphathaltiger Substanzen aus einem externen Reservoir und der indirekten Phosphatdosierung als Bereitstellung von Phosphatverbindungen durch enzymatischen oder hydrolytischen Aufschluß komplexer Nährbodenbestandteile wie Stärke, Sojaschrot, Maisquellwasser u.a. wurde gefunden, daß der Betrag der Ammoniumhydroxid-Dosierrate Übergänge zwischen direkter und indirekter Phosphatdosierung durch signifikantes Anwachsen bzw. Abfallen anzeigt. Die Größe der Änderung wird durch den Phosphatnachfluß bestimmt. Die direkte Phosphatdosierung wird auch durch das Erreichen des aus physiologisch-regulativen Gründen minimal notwendigen

^3ek5stsauerstoffgehalts bestimmt bzw. mitbestimmt.

Außerdem wird im Verfahren die Tatsache benutzt, daß der Zeitverlauf der im Fermenter durch die Aktivität der Mikroorganismen entstehenden Reaktionswärme sowie der CGyBildung mit den Zeitverläufen der Ammoniumhydroxid-

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Dosierrate und der Konzentration des physiologisch wirksamen Phosphats korrespondiert. Aus diesem Grunde sind die aktuelle Reaktionswärme und die aktuelle CO₂-Bildung und damit auch die zu diesen Größen gehörenden Bildungsraten ebenfalls Steuergrößen für die Dosierung von Phosphat und den anderen Substraten.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird durch ein Ausführungsbeispiel anhand von Diagrammen erläutert.

Eine lyophil an Glukose-Gelatine getrocknete Mycelkonserve (Bruttogewicht des Konserveninhalts etwa 300mg) der Selektante BF 32 des Nourseothricin-bildenden Stammes IMETJA 3890b wird mit 3ml einer 0,9%igen Natriumchloridlösung aufgeschwemmt. Von dieser Suspension dienen 0,5ml als Inokulum von 400ml Vorzucht der ersten Stufe. Das Vorzuchtmedium enthält je Liter Leitungswasser folgende Einsatzstoffe: 40g Glukose, 15g entöltes Sojamehl, 0,3g KH₂PO₄, 5g NaCI und 3g CaCO₃. Die Azidität wird vor der Sterilisation auf den Wert pH 6,5 eingestellt. Dieses Medium wird in 2500ml fassende, mit Wattestopfen verschlossene Steilbrustflaschen in Mengen von je 400ml abgefüllt. Die Sterilisation erfolgt durch 35 Minuten dauernde Erhitzung auf 121⁰C im Autoklaven.

Die auf Raumtemperatur rückgekühlten und beimpften Ansätze werden 48 Stunden als Schüttelkulturen (180min~¹) bei 29°C bebrütet. Mit 800 ml der so erhaltenen Kulturlösung der ersten Vorzucht wird als zweite Stufe der Vorzucht ein mit 180 Liter hitzesterilisiertem Medium (60 Minuten bei 121⁰C) der gleichen Zusammensetzung wie in der ersten Vorkulturstufe gefüllter, mit Vorrichtungen zur Sterilbelüftung und einem Rührwerk ausgestatteter Edelstahlfermenter (250 Liter Bruttovolumen) beimpft. Die Kultivierung erfolgt über den Zeitraum von 42 Stunden (pH-Wert 5,2 erreicht) bei 27⁰C bis 29°C, einer Rührwerksdrehzahl von 240min~¹ und einer Belüftungsrate von 1 Liter Luft pro Liter Kulturlösung in der Minute. Die bisherigen Angaben betreffen die notwendigen Vorarbeiten.

Für die Hauptkultur dient ein mit Vorrichtungen zur Sterilbelüftung und einem zentralgelagerten Rührwerk versehener Edelstahlfermenter (4200 Liter Bruttovolumen), der mit 2500 Liter Nährmedium folgender, auf 1 Liter Leitungswasser bezogener Zusammensetzung gefüllt ist: 32g Kartoffelstärke, 60g Glukose, 11g entöltes Sojamehl, 11 g (NH₄J₂SO₄,2g MgSO₄-7H₂0,1 g NaCI, 6g CaCO₃ und 0,5g ZnSO₄. Je Liter Kulturlösung werden 0,5g Entschäumungsmittel auf Silikonbasis zugesetzt. Die Azidität wird vor der Sterilisation auf den pH-Wert 6,2 eingestellt. Die Sterilisation des Nährmediums (ohne Glukoseanteil) erfolgt in situ durch Vorwärmung mit Mangeldampf auf 75°C und anschließende Erhitzung mittels Direktdampf auf 120⁰C für 16 Minuten. Nach Abkühlung auf 29⁰C wird die in Form einer 50%igen wäßrigen Lösung durch 30 minütiges Erhitzen auf 120°C getrennt sterilisierte Glukose unter aseptischen Bedingungen zugesetzt. Vor der Beimpfung erfolgt die Einstellung der Start-Azidität mit Schwefelsäure so, daß nach der Beimpfung der pH-Startwert bei 7,4 liegt. Der mit 4% Inokulum aus der zweiten Vorzuchtstufe beimpfte Fermentationsansatz der Hauptkultur wird 120 Stunden bei 29°C, einer Belüftungsrate von 1250 Liter pro Minute (0. bis 12. Stunde) bzw. 2500 Liter pro Minute (12. bis 120. Stunde) bei 0,03 MPa Überdruck unter Rühren mit 180 min~¹ kultiviert.

Die aufgenommenen Zeitverläufe zeigen:

Diagramm 1 Zeitliche Verläufe des produzierten Antibiotikums Nourseothricin und des Trockengewichtes der Biomasse Diagramm 2 Zeitverläufe des pH-Wertes, der Glukose- und Ammoniumstickstoffkonzentration Diagramm 3 Zeitverhalten der Ammoniumhydroxid-Dosierrate, der Phosphatkonzentration und des Gelöstsauerstoffgehalts Diagramm 4 Zeitverläufe der Abgaszusammensetzung aus Sauerstoff und Kohlendioxid sowie der Reaktionswärme Diagramm 5 Zeitverläufe der spezifischen Produktbildungsrate und der spezifischen Wachstumsrate. Die Fermentation wird hinsichtlich der Steuerungseingriffe mittels direkter Phosphatdosierung und Glukosedosierung nach Maßgabe des Verhaltens der Ammoniumhydroxid-Dosierrate geführt. Das pH-Sollwertintervall ist mit 6,2 + 0,05 festgelegt und die untere Grenze pH 6,15 wird nach 38 Stunden Fermentationszeit erreicht.

Zur direkten Phosphat-Dosierung wird eine sterile wässrige Lösung von Kalimdihydrogenphosphat benutzt. Von der 2. bis zur 32. Stunde wird diese Lösung so zudosiert, daß zur Anregung der Stoffwechselaktivität insgesamt pro Liter Kulturlösung 42 Milligramm Phosphor in Form von Phosphat eingesetzt werden.

Festgelegt durch das gewählte pH-Sollwertintervall, den Pufferungszustand des Nährmediums und die Lauge-Konzentration setzt ab der 38. Stunde die Ammoniumhydroxid (25%ig)-Dosierung ein. Die zu beobachtende Verringerung des Anstiegs der Ammoniumhydroxid-Dosierrate löst weitere direkte Phosphatdosierungen von jeweils 8,5 Milligramm Phosphat-Phosphor pro Liter Kulturlösung zwischen der 47. und 48. Stunde bzw. 53. und 54.Stunde aus.

Dadurch erreicht die Dosierrate ihren Maximalwert zur 62. Stunde und fällt dann dem Übergang von direkter und indirekter Phosphatdosierung entsprechend ab. Auf diese Weise befindet sich die Fermentation etwa 20 Stunden in der Nähe der günstigen spezifischen Dosierrate von 230 Milliliter 25%iger Ammoniumhydroxidlösung pro Kubikmeter Kulturlösung und Stunde. Die zuzugebende Ammoniumhydroxid-Lösung ist ausreichend, um die Stickstoffkonzentration im physiologisch günstigen Bereich zu halten. Deshalb werden keine weiteren Stickstoffquellen zudosiert. Bezüglich der Kohlenstoffquelle ist die nach der zweiten Phosphatdosierung verstärkte Verringerung des Anstiegs der Ammoniumhydroxid-Dosierrate Anlaß zur Zudosierung von 48 Gramm Glukose pro Liter Kulturlösung zur 56. Stunde. Die Indikation des Übergangs zur indirekten Phosphatdosierung durch den leichten Anstieg der Ammoniumhydroxid-Dosierrate um die 95. Stunde dient zur Auslösung der zweiten Glukosedosierung von 18 Gramm Glukose pro Liter Kulturlösung.

Bei der direkten Phosphatdosierung ergibt sich hinsichtlich des Gelöstsauerstoffgehalts keine Beschränkung. Reaktionswärme und CO₂-Bildung weisen den" Verlauf der Fermentationsphasen analog zur Ammoniumhydroxid-Dosierrate auf und dienen zur Vermeidung von Substratlimitationen.

Der Nourseothricin-Endwert von 10,5 Gramm pro Liter Kulturansatz wird erreicht, indem die effektive spezifische Produktbildungsrate über den Zeitraum von 45 Stunden zwischen 7-10"³ pro Stunde und 8-10~³ pro Stunde liegt. Außerdem wird die eingesetzte Glukose voll ausfermentiert und das aufarbeitungstechnisch gesetzte Biomasselimit nicht überschritten.

2. Ausführungsbeispiel

Die Sporenkonserve (verspotte Hirse) der Selektante DG 1 des Stammes Penicillium chrysogenum dient als Impfmaterial für die Impfkultur von zwei Bencylpenicillin-Hauptkulturfermentationen, indem eine Sporensuspension mit der Gesamtsporenzahl von ca. 4-10⁹ Sporen in die 42,5 Stunden dauernde Impfkultur überführt wird. Der mit 2,5 Liter Nährmedium gefüllte Impffermentor (Edelstahl-Glas-Rührfermentor mit 4,51 Bruttovolumen) wird 60 Minuten bei 121⁰C im Autoklaven sterilisiert. Das Nährmedium der Impfkultur enthält je Liter die Einsatzstoffe:

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0,5g, MgSO₄- 7H₂O 0,1 g, ZnSO₄-7H₂O 0,02g, MuSO₄- 5H₂O 0,007g, Sonnenblumenöl 5g, Polypropylenglycol 0,2 ml. Vorder Sterilisation erfolgt die Einstellung des pH-Wertes mit Natronlauge auf 6,5, nach der Sterilisation liegt der pH-Wert von 6,25 im auf 25° (Prozeßtemperatur der Impfkultur- und der Hauptkulturfermentationen) rückgekühltem Medium vor. Während der Impfkulturanzucht wird der kontinuierlich gemessene und registrierte pO₂-Wert durch Nachstellung der Drehzahl ständig größer als 60% der Sättigungskonzentration gehalten. Der pH-Wert wird ebenfalls kontinuierlich gemessen und registriert. Zunächst fällt der pH-Wert ab und durchläuft ein relatives pH-Minimum. Anschließend zeigt er ein lokales Ansteigen und danach erreicht der pH-Wert die Phase seines Minimalwerts, der ein schneller Anstieg folgt. Beim pH-Wert von 7,2 ist die Reife der Impfkultur erreicht und jeweils 500ml werden zur Beimpfung der Hauptkulturen in Rührfermentoren mit 4,51 Bruttovolumen verwendet. Nach der Zugabe der Impfkultur beträgt das Arbeitsvolumen jeweils 3 Liter. Die Mediumsansätze von 2,5 Litern enthalten die Komponenten Baumwollsamenmehl 120g, Glucose 45g (NH₄J₂SO₄7,5g, CaCO₃12g, Sonnenblumenöl 15g, Na₂S₂O₃ 5 H₂O 24g, Polypropylenglycol 0,6g und werden nach Einfüllung in den Fermentor ohne vorherige Einstellung des pH-Wertes 60 Minuten bei 121 °C im Autoklaven sterilisiert. Nach der Sterilisation liegt der pH-Wert bei 7,2.

Am pH-Regler wird die untere Regelschwelle auf 6,6 eingestellt. Zur pH-Regelung wird als Lauge 12,5%iges Ammoniumhydroxid verwendet (Vorlage 200ml, sterilfiltriert). Als weitere Dosierungssubstrate werden jeweils 10%ige Phenylessigsäure^auf pH 7,0 mit Kalilauge eingestellt, 350ml) und 70%ige Glukoselösung (1 000ml) bevorratet. Die Sterilität dieser Lösungen wird gleichzeitig mit der Sterilisation der Fermentoren hergestellt, da die Vorratsgefäße vor der Autoklavierung angeschlossen sind. Ein Fermentor ist mit einem weiteren Dosierungsbehälter versehen, der 400 ml Phosphatlösung mit insgesamt 2,63 g KH₂PO₄ enthält.

Zur Schaumbekämpfung werden jeweils 20ml Polypropylenglykol steril bevorratet. Davon werden in der Startphase der Hauptkulturen jeweils 5ml in die Fermentoren gegeben, um die Schäumungsneigung zu unterdrücken. Es tritt ein schneller Abfall des pH-Werts ein, die Regelschwelle wird nach einer halben Stunde erreicht. Damit setzt die NH₄OH-Dosierung ein; die anfallende Laugedosierrate wird stündlich erfaßt. Im Diagramm 6 sind die Zeitverläufe für die NH₄0H-Rate und davon abgeleitet Dosierungen für PO₄-P und Glukose für einen der beiden Hauptkulturfermentoren dargestellt. Die Laugedosierrate fällt (entsprechend der Abnahme des löslichen PO₄-P durch die wachsende Kultur) rasch ab.

Diese Abfallstendenz wird mittels externer Phosphatdosierung ab der 2.Stunde vermindert. Dabei wird die P0₄-P-Dosierung nur in dem Maß erhöht, daß die NH₄OH-Rate monoton abnehmend bleibt. Ihre Nullstelle ab der 6. Stunde zeigt unter diesen Bedingungen, daß die PO₄-P-Nachdosierung den Bedarf nicht vollständig deckt, nachdem das PO₄-P-Startdepot (87mg/l freisterilisiert) verbraucht ist. Diese partielle PO₄-P-Limitation wird zur gezielten Formierung der extrazellulären Phosphataseaktivität verwendet, d. h. die indirekte PO₄-P-Dosierung mittels enzymatischer Ausbeutung der Komplexsubstrate wird auf das Fließgleichgewicht eingestellt.

Ab der NH₄OH-Nullstelle beginnt die Dosierung der Phenylessigsäurelösung mit 0,65ml/l-h. Ab der 11. Stunde setzt die Laugedosierung wieder ein und die externe PO₄-P-Dosierung wird reduziert, da die interne PO₄-P-Versorgung induziert ist. Nach 14,5 Stunden wird die externe PO₄-P-Dosierung ganz beendet. Nach 15 Stunden zeigt die NH₄OH-Rate über eine weitere Nullstelle die Erschöpfung der Startglucose an. Diese Nullstelle ist somit der Startpunkt für die Glucosedosierung. Sie wird zunächst mit 0,55g/l-h eingestellt und ab der 15.Stunde auf 1,25g/l-h erhöht, um die NH₄OH-Rate bei 0,1 ml/l-h zu stabilisieren. Diese Einstellungen bewirken Limitationsfreiheit bezüglich der Kohlenstoff- und Stickstoffversorgung während der Dauer der Fermentation, die als Basiszyklus einer zyklischen Bencylpenicillin-Fermentation ausgelegt ist. Der Vergleichsfermentor wird ohne Benutzung der NH₄-OH-Dosierrate für die Echtzeitsteuerung der Dosierungen nach dem Standardverfahren betrieben. Die Phenylessigsäuredosierung wird ab der 11. Stunde mit 0,65 ml/l-h durchgeführt, die Glucosedosierung läuft ab der 23. Stunde mit 1,25g/l-h. Es wird keine externe Phosphatdosierung einbezogen. Während der Fermentationen wird der pO₂-Wert mittels Drehzahlveränderung immer größer als 50% gehalten. Die Dosierraten werden entsprechend der Volumenzunahme nachgestellt

Während des Basiszyklus ergeben sich für die Produktausbeute folgende Zeitverläufe:

Bencylpenicillin (IE/ml)

Zeit(h) Fermentor mit Fermentor ohne

Echtzeitsteuerung Echtzeitsteuerung

22 1750 900

35 4000 3450

47 6700 4800

59 8600 6100

71 13800 8 200

Esliegtalsoeine Steigung der Produktausbeute um ca. 60%zumEndedes Basiszyklus vor. Die Ausbeute von 8000 bis9000 IE/ml nach ca. 70 Stunden ist bisheriger Stand der Technik.

Claims (3)

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   Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Echtzeitsteuerung derfermentativen Herstellung von Sekundärmetaboliten mit Substratdosierung und Zusatz der Menge an Lauge, die für die Einhaltung der ausgewählten unteren pH-Regelschwelle notwendig ist, dadurch gekennzeichnet, daß die pro Zeiteinheit zugegebene Laugemenge (Lauge-Dosierrate) zur Steuerung der Dosierung von Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Spurenelementen und Substanzen mit Effektorwirkung verwendet und Limitationsfreiheit eingestellt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Stickstoffdosierung mittels Verwendung von Ammoniumhydroxid über die Lauge selbst erfolgt.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Lauge-Dosierrate durch Zufütterung phosphathaltiger Substanzen eingestellt wird.

   Hierzu 6 Seiten Zeichnungen