CS264022B1 - Process for fermentative preparing of secondary metabolites - Google Patents

Description

(57) The solution ее concerns the recovery of by-products of the metabolites by fermentation. The process is carried out under continuously monitored and regulated common process parameters, such as pH ₉ of the caustic solution feed rate, ρθ2 value, the reaction heat and the composition of the outgoing gases · For the substrate dosing control, it is used as a measure of physiologically active amount of phosphate actual rate of dosing of alkaline solution · Ammonium hydroxide is mainly used as the solution ·

CS 264022 Βί

- 1 264022

Название изобретения

Способ ферментативного получения вторичных метаболитов

Область применения изобретения

Изобретение относится к способу ферментативного получения вторичных метаболитов, предпочтительно антибиотиков, на характеристику образования которых можно воздействовать путем управления обменом веществ микроорганизмов-продуцентов способом прямого или / и косвенного прибавления различных, например, фосфатсодержащих веществ во время ферментации. Таким образом, изобретение имеет значение для микробиологической промышленности.

Характеристика известных технических решений

Было уже предложено, чтобы, наряду с установкой, в частности уменьшением, концентрации доступного фосфата в начальной питательной среде для ферментаций, с целью получения вторичных метаболитов периодически прибавлять фос * фатсодержащие вещества в начале ферментации и / или во время дальнейшего про- * No текания ферментации избежанием'дальнейших лимитаций, чтобы повлиять на регулируемые взаимодействия биологической системы с целью повышениятор. Что касается применения вышеназванного изобретения в так называемых ферментациях с управлением в реальном масштабе времени , то трудность его осуществления заключается в том, что приходится пользоваться установившимися в ферментационной технике, непрерывно измеряемыми общими параметрами процес- »са, как значение pH значение р0 ₄ скорость дозирования, состав отходящего and газа (образования СО ^) образование тепла и т.д '., в качестве первичных ^ре: гулируемых параметров процесса вместо концентраций субстрата, которые еле- * дует дополнительно определить только при помощи трудоемкого химического анализа. Та необходимость вытекает из существующего уровня автоматизированной измерительной техники in области биотехнологии (Chem. Ges.).

- 2 иель изобретения

Целью изобретения является проведение без лимитаций ферментационных процессов получения вторичных метаболитов.

Изложение сущности изобретения

В основу изобретения положена задача описывать способ получения вторичных метаболитов, который включает в себя технологически удобное решение управления в реальном масштабе времени промышленными / процессами ферментации с прямым или / и косвенным дозированием субстрата, в частности фосфата, источников углерода, источников азота, микроэлементов и веществ с эффекторным действием. При этом управление дозированиями субстратов должно основываться на непрерывно учитываемых и регулируемых общих параметрах процесса , _как значение ρθ α, значение pH образование тепла и С0 ₂ в частности на скоростях дозирования для регулирования pH и соответственно скоростях образования тепла и С0 ^, и обеспечивать осуществление эффективной скорости образования продукта в течение длительного периода времени ферментации.

Неожиданно было найдено, что временная характеристика скорости дозирования щелочного раствора при регулировании заданного значения pH отражает временную характеристику концентрации фосфата, физиологически активного для превращения источников углерода, источников азота, микроэлементов и веществ с эффекторным действием, пока не будет лимитаций в отношении этих субстратов и содержания растворенного кислорода. Имеется в виду, что скорость дозирования щелочного раствора, который должен прибавляться для сохранения выбранного нижнего порога регулирования pH пропорциональна физиологически активной концентрации фосфата. Масштаб отображения, следовательно, зависит от установленного нижнего предела регулирования значения рН ^ начало дозирования щелочноорето.

В дальнейшем осуществлении изобретения в качестве дозируемого щелочного раствора для управления дозированием вышеназваннытсууссетсу.

Способ осуществляют следующим образом:

The pH value of the pH value of the pH value of the pH value was 6.2, which was determined by the pH value of the pH value. Таким образом в процессе ферментации эквивалентная скорость дозирования гидроокиси аммония находится в зависимости от времени. Описанная функциональная взаимосвязь между этой скоростью дозирования и концентрацией физиологически активного фосфлате фосфлате. Потребляемые источники углерода, источники азота, микроэлементы и вещества с эффекторным действием, находящиеся в соответствии с этой активностью метаболизма, компенсируются дозированием субстратов.

Способ можно осуществить и таким образом, что наиболее эффективную для продуктообразования временную характеристику концентрации фосфата обеспечивают прямым дозированием фосфата за счет установки наиболее благоприятной для хода процесса скорости дозирования гидроокиси аммония. Что касается прямого дозирования фосфата путем добавления фосфатсодержащих веществ из внешней емкости, а также косвенного дозирования фосфата путем предоставления фосфатных соединений ферментативными или гидролитическим расщеплением комплексных компонентов питательной среды, как крахмал, соевой шрот, кукурузный экстракт и др., То было найдено, что величина скорости дозирования гидроокиси аммония своим достоверным нарастанием или падением указывает на переходы между

- 3 264022 прямым и косвенным методами дозирования фосфата. Величина изменения определяется притоком фосфата.

Прямое дозирование фосфата определяется также достижением содержания растворенного кислорода * минимально необходимого по причина.

Кроме того способ пользуется фактом * что временная характеристика тепла реакции, возникающего в ферментаторе вследствие активности микроорганизмов, а также образования С0 ^, соответствует временным характеристикам скорости дозирования гидроокиси аммония и концентрации физиологически активного фосфата. По этой причине актуальное тепло реакции и актуальное образование С0 ₂ а в то же время и относящиеся к этим величинам скорости образования тоже являются величинами управления дозированием фосфата и других субстратов .

1-й пример осуществления.

Изобретение поясняется при помощи примеров осуществления на основании диаграмм. ’

Лиофилизированный на глюкозо-желатине консервированный мицелий (общий вес консервного содержимого около 300 мг) селектанта BF 32 ноурзеотрицинообразующего штамма IMET JA 3890b суспендируют 3 мл 0.9% -ного раствора хлорида натрия * 0 * 5 мл этой суспензии служит в качестве инокулюма для мл 400 среды первого пассажа.

Среда первого пассажа содержит следующие вещества из расчета на один литр водопроводной воды; глюкозы - 40 г, обезмасленной соевой муки - 15 г, КН2РО4 - 0 * 3 г * NaCl - 5 г * СаСО ₃ - 3 г. The pH value of the pH 6.5 was measured. The 400 yards are available for a maximum of 2,500 miles *. They have a temperature of 35 ° to 121 ° C in the air.

Охлажденные до комнатной температуры и засеянные культуры инкубируют в течение 48 часов на качалке (180 мин ^"1) при 29 ° С. При помощи 800 мл получаемой! Таким образом культуральной жидкости первого пассажа засевают на втором пассаже наполненный 180 л термостерилизованной среды (60 минут при 121 ° С) того же состава Í * что и первого пассажа, и оснащенный устройствами для аэрации!

: стерильным воздухом и перемешивающим устройством ферментатор из высококаче—, ственной стали (общий объём 250 л). The 42 ° C (pH 5.2) bar is 27 ° C - 29 ° C, and is a 240-millimeter gauge. на литр культуральной жидкости в минуту * Ранее приведенные данные касаются необходимых подготовительных работ. . .

Для основной культуры предназначается оснащенный устройствами для аэрации стерильным воздухом и центрально расположенным перемешивающим устройством ферментатор из высококачественной стали (общий объем 4200 л) наполненный 2500 л питательной среды следующего состава из расчета на 1 литр водопровод ной воды: картофельного крахмала - 32 г, глюкозы - 60 г, обезмасленной соевой муки - 11 г, (NH _{4) 2} S0 _{4 to} 11 г _MgSO4 * * 7Н ₂ 0 - 2 * г NaCl - 1 г, СаСО ₃ - 6г, _ZnSO4 - 0,5 г . На литр культуральйой я ^ идкости прибавляют по 0.5 г пеногасите-; ля на силиконовой основе. The pH value of the pH was 6.2. Стерилизацию питательной среды (без гликозного компонента) произво- ® дят in situ путем подогрева паром рубашки до 75 ° С и затем нагревом при помощи острого пара до Т20 ° С в течение 15 минут »После охлаждения до 29 С прибавляют в асептических условиях глюкозу, раздельно стерилизованную в форме

502-ного водного раствора 30-минутным нагревом до 120 ° С. The pH was adjusted to a pH value of 7.4 in the pH range. Ферментационную среду основной культуры, засеянную 4% инокулюма второго пассажа, культивируют в течение 120 часов при 29 ° С, скорости аэрации 1250 литров в минуту (0 + 12-й-й часы) или литров в минуту 2500 (12-й + 120- 0.03 МПа при перемешивании с числом оборотов 180 мин ” ¹ .

Полученные временные характеристики показывают:

Диаграмма 1 - Временные характеристики продуцированного антибиотика.ноурзеотрицин и сухого веса биомассы

Диаграмма 2 - Временные характеристики рН-значения, концентрации глюкозы и аммонийного азота ·

Диаграмма 3 - Временную характеристику скорости дозирования гидроокиси ам. мония, концентрации фосфата и содержания растворенного кислорода

Диаграмма 4 - Временные характеристики состава отходящих газов из кислорода и двуокиси углерода, а также тепла реакции

Диаграмма 5 - Временные характеристики специфической скорости образования продукта и специфической скорости рост

Что касается управляющего вмешательства в процесс, то ферментацию ведут путем прямого дозирования фосфата и дозирования глюкозы в зависимости от условий скорости дозирования гидроокиси аммония.

The pH buffer was 6.2 + 0.05, and the pH buffer was 6.15 to 38 calibrated.

Для прямого дозирования фосфата используют стерильный водный раствор дигидрофосфата калия. 2тот раствор добавляют от 32-го часа таким образом, что для возбуждения активности обмена на один литс

Е ч 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 252 Наблюдаемое уменьшение нарастания скорости дозирования гидроокиси аммония вызывает дальнейшее прямое дозирование фосфата в количестве по 8,5 мг фосфатного фосфора на литр культуральной жидкости в пределах между 47-м и 48 м часами и соответственно-53 54-м и м часами.

Ст т орт орт 62т 62т 62 62 62 62 62 62 62 62 62 62 62 62 62 62. 62. 62. 62 .т .т .т Таким образом процесс ферментации примерно в течение 20 часов протекает почти с благоприятной специфической скоростью дозирования порядка 230 мл 252-ного раствора гидроокиси аммония на кубический метр культуральной жидкости в час.

Прибавляемого раствора гидроокиси аммония достаточно для того, чтобы концентрацию азота держать в физиологически благоприя.

Поэтому дальнейших источников азота не прибавляют. Что касается источника углерода, то усиленное после второго дозирования фосфата уменьшение нараста

- 5 264022 бесплатный дезирования гидроокиси аммония служит поводом к прибавлению .48 глюкозы на литр культуральной жиукости на 56-м.

Показание к переходу к косвенному дозированию фосфата путем легкого увеличения скорости дозирования гидроокиси аммония на 95-м часу служит критерием пуска второго дозирования глюкозы в количестве 18 г на литр культуральной жидкости4

То касается прямого дозирования фосфата, то в отношении содержания растворенного кислорода лимитирований не имеется.

Тепло реакции и образование С0 ₂ имеют характеристику ферментационных фаз по аналогии со скоростью дозирования системии имени.

Конечное значение ноурзеотрицина порядка 10.5 г на литр культуральной жидкости достигается тем, что эффективная специфическая скорость образования продукта в течение 45 часов составляет 7 ΊΟ ^"3 в час + 8Ί0 ^'3 β час. Кроме того имеет место полная ферментация глюкозы, и заданный технологией очистки лимит по биомассе не превышается.

2-й пример осуществления

Консервированные'споры (спорулированное просо) селектднта DG1 штамма chrysogenum служат в качестве посевного материала для выращивания посевной культуры для двух процессов ферментации бензилпенициллина на основной культуре, переводя споровую суспензию с общим числом около 4 · 10спор в посевную культуру, выращиваемую в течение 42.5 часа. Посевной ферментер (ферментер из высококачественной стали и стекла с перемешивающим устройством, имеющий общий объем 4,5 л) наполненный 2.5 л питательной среды, стерилизуют в автоклаве в течение 60 минут при 121 ° С.

Питательная среда содержит следующие компоненты из расчета на один литр среды:.

Глюкозы - 25 г, мелассы - 5 г, кукурузного экстракта (сухого вещества) 5 г, соевой муки - 20 г, СаСО ^ - 2 г (ΝΗ ^ ί-χδΟ ^ - 5 г, NaN0 _3-3 г, _КН й Р0 г ₄ 0.5, MgSO ₄ * 7H _Z 0 - 0.1 г, ΖηδΟ ₄ · ₂ 7Η Ο - 0.02 г, Μηδ0 5Η ₄ · ₂ 0 - 0,007 г, подсолнечного масла - 5 г, полипропиленгликоля - 0 2 мл. Перед стерилизацией значение pH устанавливают при помощи водного раствора едкого натра на 6.5 а после стерилизации значение pH в среде, охлажденной до 25 С (температура процесса ферментации посевной и основной культур) .. составляет 6.25.

В процессе выращийания посевной культуры непрерывно измеряемое и регулируемое значение р0> постоянно держат на уровне свыше 60% концентрации насыщенности путем регулирования числа оборотов перемешивающего устройства. · The pH value of the water is less than or equal to. Поначалу pH снижается, проходя относительный минимум »рН. The pH value of the monoclonal monohydrate is increased, and the monoclonal phosphate is the same as the monoclonal monohydrate. При значении pH 7.2 посевная культура достигает степени эре · * лости, а от нее используют по 500 мл для засева основных культур в ферментерах с общим объемом по 4,5 л · После подачи посевной культуры рабочий объем составляет по 3 литра. Рл 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2.5 2,5 с с л лл лл - 120 2,5 г г. - 45 г (NH ^ SO ^, - 7,5 г, СаСО ^ - 12 г, подсолнечного масла - 15 г, Na ₂ S ₂ 0y5Н _г 0 - 24 г, полипропиленгликоля - 0,6 г и стерилизуются в автоклавени 60 мин при 121 ° С после их внесения в ферментер без предварительной установки значения pH. после стерилизации значение pH 7.2 составляет _О. - о -. 264022

The pH of the pH was lowered to 6.6. The pH value of the solution was adjusted to a pH value of 200 milliliters (pH pH pHь.) Филь)))......... П п п п п п п п п п п п п п п п п). В качестве дальнейших дозируемых субстратов запасаются для каждого ферментера 10% -ной фенилуксусной кислотой (pH 7.0 установлено на при помощи водного раствора едкого кали, объем 350 мл) и 70% -ным раствором глюкозы (1000 мл). Эти растворы стерилизуют одновременно с ферментерами, так как сосуды с запасными растворами уже подключены перед автоклавированием * Один ферментер имеет еще один дополнительный сосуд дозирования с 400 мл фосфатного раствора, содержащего всего

2.63 г КН * РО ₄ .

Для пеногашения запасаются стерильным полипропиленгликолем в количествах по 20 мл. Х них ар ва ва оа оер кер вер в ерер пер пер пер пер 5 п 5 п 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Наступает ί быстрое снижение значения pH, порог регулирования достигается через полчаса / Здесь начинается дозирование ΝΗ _< ΟΗ; данная скорость дозирования раствора регистрируется каждый час. На диаграмме 6 представлены временные характеристики скорости дозирования ΝΗ ₄ ΟΗ и на основе этого скорости дозирования РО4-Р и глюкозы на один из ферментеров с основной культурой . Скорость дозирования щелочного раствора быстро снижается (в соответствии со снижением количества растворимого Р0 ₄ )

Такой тенденции к снижению противодействуют способом внешнего дозирования фосфата, начиная со 2-го часа процесса. РО ₄ -Р увеличивают только до такой меры, чтобы скорость подачи ΝΗ4ΟΗ продолжала монотонно снижаться. Featuring a flat-screen TV with a 6-ounce floor, the room is equipped with a РО ₄ -Р удовлетворяет потребности. того, как стартовое количество Р0 ₄ -Р (87 мг / л свободной стерилизации) израсходовано. Ту частичную лимитацию по РО4-Р используют для направленного формирования внеклеточной активности фосфатазы, т.е. косвенное дозирование 'Ρόψ-Ρ путем ферментативной эксплуатации комплексных субстратов устанавливается на реологическоес.

М ₄ ΟΗ ч ч ΝΗ ΝΗ 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 The 11-year-old has been designed to accommodate the раствора, as well as the РО4-Р, a _4- inch window. 14ерез 14,5 часа полностью заканчивается внешнее дозирование РО ₄ -Р. 15ерез 15 часов нулевая точка оро каΝΗ оΝΗ оΝΗ ΟΗо ΟΗо оΝΗ оΝΗ оΝΗ ΝΗΝΗ ΝΗΝΗ .ΝΗ ΝΗΝΗ. Эта нулевая точка и является стартовой точкой дозирования глюкозы. With a maximum of 0.55 grams per square meter, and with a 15-grams, a maximum of 1.25 grams per square meter is available. 0,1ΝΗ ΟΗ 0,1 0,1 0,1 0.1 0,1 / л-час. Эти установки вызывают безлимитационность в отношении снабжения углеродом и азотом на протяжении ремени ферментации, которая проводитсисс Ηерментер сравнения работает по стандартному способу без использования показателя скорости дозирования ΝΗ ₄ 0Η для управления дозиреа. .

О з ф ф к к п п с с с с с с с с с с с с с с с с 11 11 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 с 0,6 0,6 с с с - с - с; Режим внешнего дозирования фосфата не используется. Оер вре мерта пм пер п з п з з з з з з 50 50 50 50 50 50 50 50 50О 50 50 50 50О 50 50О 50 50О 50 50 50О 50О 50О 50О ОО Скорости дозирования регулируют по мере увеличения объема.

- 7 264022

Временные характеристики выхода продукта во время основного цикла?

Бейзилпенициллин (МЕ / мл)

Время (час). Ферментер с управлением в истинном масштабе времени Ферментер без управления в истинном масштабе времени 22nd 1750 900 35 4000 3450 47 6700 4800 59 8600 6100 71 13800 8200

In the case of an increase in the price of the product, it shall be less than 60%. Выход 8000-9000 МЕ / мп через 70 часов соответствует прежнему сосФоянию техники. '. .

Формула изобретения. ·

First Способ управления в истинном масштабе времени ферментативным получением вторичных метаболитов с дозированием субстрата и добавлением количества щелочного раствора, необходимого для сохранения выбранного нижнего порога регулирования значения pH о'т л и ч а ю щ и й с я тем, что добавляемое за единицу времени количество щелочного раствора (скорость дозирования щелочного раствора) используют для управления дозированиемесисовое елочнооро. углерода, источников азота, микроэлементов и веществ с эффекторным действием, а также устанавливают 'безлимитационность.—

2. Способ по п, 1, отличающийся тем, что | дозирование, азота с использованием гидроокиси аммония осуществляется через самый щелочный раствор. ·

3. Способ по п.п. 1 и 2, отличающийся тем, что корость до-эирования щелочного раствора устанавливается путем добавления фосфатсодержащив вещ

Аннотация.

Об об ер * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *. Оли предназначается для безлимитационного ведения ферментаций для по-> лучения вторичных метаболитов. , '

Способ проводится путем применения непрерывно учитываемых и регулируемых общих параметров процесса, как значение pH скорость дозирования щелочного раствора, значение р0 <, тепло реакции, состав отходящих газов »Актуальная скорость дозирования щелочного раствора как мера физиологически активного количества фосфата используется для управления дозированием субстратов. В частности в качестве щелочного раствора используется гидроокись ам; мония.

- 8 264022

Признано изобретением по результатам экспертизы, осуществленной Ведомством по делам изобретений и патентов ГДР.

Claims (3)

SUBJECT OF THE INVENTION Process for the fermentative production of secondary metabolites with controlled substrate dosing over a period of time and adding the amount of alkaline solution needed to maintain and control a lower pH. characterized in that the amount of alkali solution added per time unit, i.e. the rate of dosing of the alkaline solution, is used to control the dosages. on the forging of carbon sources, nitrogen sources, microelements and effectors as well as adjusting the limitless course · 2. A process according to claim 1, characterized in that the nitrogen using ammonium hydroxide is carried out via the alkaline solution itself. Method according to claim 1, characterized in that the rate of dosing of the alkali solution is adjusted by the addition of phosphate-containing substances.