CH632787A5

CH632787A5 - Verfahren zur herstellung der coenzyme q6 bis q10.

Info

Publication number: CH632787A5
Application number: CH1292577A
Authority: CH
Inventors: Yoshio Shimada; Keiichi Kagotani; Norio Noda; Hajime Kawaharada; Kiyoshi Watanabe
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Ind
Priority date: 1976-10-26
Filing date: 1977-10-24
Publication date: 1982-10-29
Also published as: JPS5352690A; DE2747510A1; SE433502B; FR2369342B1; SE7712016L; JPS5642912B2; US4194065A; GB1589172A; FR2369342A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung der Coenzyme Qe bis Qio (nachfolgend abgekürzt als «Co-Q» bezeichnet) aus Hefezellen, die auf wirksame Weise erzeugt werden und grosse Mengen Co-Q enthalten.

Bei Co-Q handelt es sich um Chinonderivate, die eine bedeutsame Rolle in dem Terminalelektronentransportsystem von Organismen spielen. Die Struktur von Co-Q ist diejenige eines 2,3-Dimethoxy-5-methyl-l,4-benzochinons mit einer Iso-prenoid-Seitenkette in der 6-Stellung, und es gibt verschiedene Homologe, wie z.B. Co-Qó bis Co-Qio, je nach der Anzahl der Isopreneinheiten in der Seitenkette. Co-Q kommt in verschiedenen Arten von Organismen vor, und diejenigen, die in Hefen vorkommen, sind bekannt als Co-Qe bis Co-Qio. Ihre phhysio-logischen Aktivitäten und pharmakologischen Wirkungen wurden vor kurzem aufgeklärt.

Co-Q wurde bisher hergestellt durch Extraktion aus Tieren und Pflanzen und teilweise durch chemische Synthese, die Kosten sind jedoch so hoch, dass die industrielle Herstellung in einem grosstechnischen Massstab bisher schwierig war, wes-5 halb neuerdings Versuche durchgeführt werden, um Co-Q durch Fermentation herzustellen. Der Co-Q-Gehalt der nach der üblichen Methode der Kultivierung von Mikroorganismen gebildeten Zellen ist jedoch sehr gering. Es ist zwar ein Verfahren bekannt, bei dem eine Hefe des Genus Candida in einem io Mediurn kultiviert wird, das n-Alkan enthält, unter Zugabe eines Vorläufers von Co-Q, wie z.B. p-Hydroxybenzoesäure, um den Co-Q-Gehalt der Zellen zu erhöhen (japanisches Patent 673 128), die bei diesem Verfahren gebildeten Mengen an Co-Q pro Kulturbrühe sind jedoch gering, und die verwendbare Kohls lenstoffquelle ist auf n-Alkan begrenzt.

Um die fermentative Herstellung von Co-Q zu ermöglichen, wurden verschiedene Hefearten, die Zusammensetzung der Medien und die Kultivierungsbedingungen untersucht, und es wurde ein Kultivierungsverfahren entwickelt, nach dem so Hefezellen, die grosse Mengen an Co-Q enthalten, in hohen Konzentrationen erzeugt werden können.

Die Herstellung von Co-Q unter Verwendung von Mikroorganismen wurde sodann in bezug sowohl auf den Co-Q-Gehalt der Zellen als auch in bezug auf die Zellenproduktivi-25 tät vom Standpunkt der Produktionskosten aus untersucht. Bei der Herstellung von Co-Q unter Verwendung von Hefen, wobei dem Kultivierungsverfahren Bedeutung auf eine Erhöhung des Co-Q-Gehaltes gelegt wurde, ging dies auf Kosten der Produktivität der Zellen, während andererseits die Anwen-3o dung des üblichen Verfahrens zur wirksamen Herstellung von Zellen zu einer Abnahme des Co-Q-Gehaltes der Zellen führte.

Es wurde nun angenommen, dass die Aufrechterhaltung von stark oxydierenden Bedingungen während der Kultivierung einen günstigen Einfluss auf die Bildung von Co-Q im Hin-35 blick auf die bedeutsame Rolle des Co-Q in oxydativen Reaktionen in Organismen ausüben würde. Um den Oxydationszustand der Umgebung in der die Zellen wachsen, aufrechtzuerhalten, muss die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in einem Kulturmedium erhöht werden. Eine Erhöhung der 40 Sauerstoffzufuhr oder eine Verringerung des Sauerstoffverbrauchs führt zu einer Erhöhung des gelösten Sauerstoffs in einem Kulturmedium.

Es wurde nun die Beziehung zwischen der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in einem Kulturmedium (nachfolgend 45 abgekürzt mit «D.O.») und sowohl dem Co-Q-Gehalt der Zellen als auch der Zellenproduktivität bei verschiedenen Hefen untersucht, und dabei wurde gefunden, dass die unter hohen D.O.-Bedingungen erzeugten Hefezellen grosse Mengen an Co-Q enthielten.

so Es sind bereits viele Verfahren zur wirksamen Erzeugung von Hefezellen bekannt, z.B. ein solches, bei dem die Belüftung und die Rührung (Bewegung) erhöht werden, um die Sauerstoffzuführungsgeschwindigkeit zu erhöhen, ein solches, bei dem der Partialdruck des Sauerstoffs in den Belüftungsgasen 55 erhöht wird, ein solches, bei dem die Kultivierung unter erhöhten Drucken durchgeführt wird, und ein solches, bei dem die Kultivierungsvorrichtung verbessert ist. Die Erhöhung der Sauerstoffzufuhr zu der Kulturbrühe in den üblichen Kultivierungsverfahren zur Herstellung einer Zellmasse führt jedoch 60 zu einer Erhöhung der Zellenproduktivität (nachfolgend abgekürzt als «|iX» bezeichnet = g der gebildeten Zellen pro Liter pro Stunde) und zu einer Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs proportional zur Zunahme der |xX, und wegen des geringeren D.O. ist es dann schwierig, eine für dip Bildung von Co-Q geeig-65 nete oxydative Umgebung aufrechtzuerhalten. Der Co-Q-Gehalt von Hefezellen, die unter solchen Bedingungen wachsen, bei denen D.O.-Werte von nicht weniger als 2 ppm aufrechterhalten werden durch Zuführung ausreichender Mengen

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an Sauerstoff für das Wachstum der Zellen ungeachtet der Pro- ermöglicht die Co-Q-Herstellung durch Fermentation, wobei duktionskosten, ist manchmal höher als diejenige von Hefezel- die Nachteile der konventionellen Verfahren beseitigt werden, len, die bei D.O.-Werten von nicht mehr als 1 ppm kultiviert Dabei können sowohl übliche als auch speziell konstruierte worden sind. Durch eine Erhöhung des D.O.-Wertes wird aber Fermentationsbehälter verwendet werden.

nicht notwendigerweise der Co-Q-Gehalt der Hefezellen 5 Durch Regulierung von \i und D.O. während der Kultivie-erhöht, der abhängt von den Hefearten, den Kultivierungsbe- rung können Zellen, die grosse Mengen an Co-Q enthalten, auf dingungen (der Temperatur und dem pH-Wert) und der Zusam- wirksame und beständige (konstante) Weise erzeugt werden, mensetzung der Medien. Obgleich die Herabsetzung von (x manchmal zu einer

Bei der Kultivierung von Hefen unter Einstellung des D.O.- Abnahme von |iX führt, ist es möglich, Zellen mit einem hohen Wertes auf nicht weniger als 2 ppm und Änderung der Kultivie-10 Co-Q-Gehalt zu erzeugen, ohne dass eine Abnahme an p,X auf-rungsbedingungen und der Zusammensetzung der Medien tritt, durch Kultivierung bei hohen Konzentrationen (entweder wurde nun die Beziehung zwischen dem Co-Q-Gehalt der Zel- durch diskontinuierliche oder kontinuierliche Kultivierung), bei len, bezogen auf die Zellenkonzentration (nachfolgend mit «X» denen eine Abnahme des |i durch eine Zunahme des X ausgegli-bezeichnet), der spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit chen wird. Im erfindungsgemässen Verfahren kann eine Belüf-

(nachfolgend mit «n» bezeichnet) und |iX bei jeder Kultivie- 15 tung mit Sauerstoffgas und die Kultivierung unter erhöhten rungsdauer untersucht und dabei wurde gefunden, dass eine Drucken durchgeführt werden. Dies erfolgt wegen hohen eindeutige Beziehung zwischen dem Co-Q-Gehalt der Zellen Kosten im allgemeinen nicht.

und n besteht. Der Co-Q-Gehalt der Zellen nimmt zu, wenn Bei der Hefe, die erfindungsgemäss verwendet werden unter optimalen Kultivierungsbedingungen eine Hefe kultiviert kann, kann es sich um irgendeinen beliebigen Hefetyp handeln, wird, die eine maximale spezifische Wachstumsgeschwindig- 20 der Co-Q enthält und dessen maximale spezifische Wachs-keit von nicht weniger als 0,15 Stunden-1 aufweist, während die tumsgeschwindigkeit unter den optimalen Kultivierungsbedin-durchschnittliche spezifische Wachstumsgeschwindigkeit ()x gungen nicht weniger als 0,15 Stunden-1 beträgt. Insbesondere von Beginn bis zum Ende der Kultivierung) durch die Kultivie- kann mit Vorteil eine Hefe verwendet werden, die zu dem rungsbedingungen und die Zusammensetzung der Medien Genus Rhodotorula, Cryptococcus, Candida, Trichosporon gesteuert wird. Insbesondere dann, wenn die Hefe bei der 25 oder Torulepsis gehört. Als Stämme können z.B. Rhodotorula durchschnittlichen spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit mucilaginosa AHU 3946, Cryptococcus Albidus AHU 3922, von nicht mehr als 0,1 Stunde-1 kultiviert wurde, nahm der Co- Candida utilis IAM 4200, Trichosporon fermentans ATCC Q-Gehalt der Zellen deutlich zu. 10675 und Torulopsis magnoliae IFO 0705 verwendet werden.

Die Beziehung zwischen dem Co-Q-Gehalt und dem D.O., In dem erfindungsgemässen Verfahren können übliche

H und nX sowie Verfahren zur Regulierung von jj. wurden wei- 30 Nährmedien verwendet werden. Es kann irgendeine beliebige ter im Detail untersucht, und dabei ist es gelungen, ein Kultivie- Kohlenstoffquelle, die von der zu verwendenden Hefe assimi-rungsverfahren zu entwickeln, das für die Co-Q-Herstellung liert werden kann, eingesetzt werden. Zu Beispielen für geeig-günstig ist. Es wurde nämlich gefunden, dass Hefezellen, die nete Kohlenstoffquellen gehören Zucker, wie Glukose, Saccha-Co-Q in grossen Mengen enthalten, auf wirksame Weise gebil- rose, Fructose, Stärkehydrolysat, Melassen, Sulfit-Abfallauge det werden, wenn man die durchschnittliche spezifische 35 oder die Flüssigkeit, die bei der Holzverzuckerung erhalten

Wachstumsgeschwindigkeit bei nicht mehr als 0,1 Stunden-1 wird, organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure, Citronen-und den D.O.-Wert bei nicht weniger als 2 ppm hält, und dies säure, Maleinsäure oder Milchsäure, Alkohole, wie Methanol, führte zu der vorliegenden Erfindung. Äthanol oder Propanol, und ausserdem flüssige Kohlenwasser-

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstel- stoffe, Fette und öle, Glycerin, Molke und landwirtschaftliche lung von Co-Q, bei dem eine Hefe, deren maximale spezifische 40 Abfallprodukte, die von der zu verwendenden Hefe ausgenutzt Wachstumsgeschwindigkeit unter den optimalen Kultivie- werden können. Als Stickstoffquellen können anorganische rungsbedingungen nicht weniger als 0,15-1 beträgt, in einem oder organische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammo-Nährmedium, in dem Hefe wachsen kann, aerob kultiviert wird, niumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniakwasser, Harn-wobei die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Kul- stoff, Aminosäuren, Pepton und das Hydrolyat von Sojaboh-turbrühe bei einem Wert von nicht weniger als 2 ppm gehalten 45 nenprotein, verwendet werden. Als Mineralsalze können die wird, während die durchschnittliche spezifische Wachstumsge- Salze von Kalium, Magnesium, Phosphorsäure, Zink, Eisen, schwindigket während der gesamten Kultivierungsdauer so Mangan, Kupfer und Calcium verwendet werden. Erforderli-gesteuert wird, dass sie nicht mehr als 0,1 Stunde-1 beträgt, und chenfalls können auch andere Metallsalze in geringeren Men-bei dem dann das Co-Q aus den dabei erhaltenen Hefezellen gen, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Vitamine gewonnen wird. 50 und von Nucleinsäuren abgeleitete Verbindungen den Medien

Das erfindungsgemässe Verfahren ist unabhängig von den zugesetzt werden.

Arten der Co-Q-Homologen (Co-Qs bis Co-Qio), die in Hefe- Die aerobe Kultivierung kann auf diskontinuierliche zellen enthalten sind, anwendbar. (ansatzweise durchgeführte) oder kontinuierliche Weise bei

Zur wirksamen Herstellung von Hefezellen, wie zur SCP- beliebigem pH-Wert und bei einer Temperatur, welche das Produktion (Herstellung von Einzelzellenprotein), wird der 55 Wachstum der Hefe erlaubt, d.h. bei pH 2 bis 8 und einer Tem-D.O.-Gehalt in der Regel auf etwa 0,5 ppm einreguliert, weil peratur von 20 bis 45 °C, ausgeführt werden. Sauerstoff kann Sauerstoff keinen geschwindigkeitsbestimmenden Faktor für zugeführt werden durch Belüftung mit Luft, Sauerstoffgas oder (J.X bei einem D.O.-Gehalt von mehr als 0,5 ppm darstellt. Die Mischungen davon. Als Kultivierungsvorrichtung können die im erfindungsgemässen Verfahren vorgesehene Kultivierungs- üblicherweise verwendeten Kultivierungsvorrichtungen, wie methode, bei der [i reguliert wird, während der D.O.-Gehalt bei 60 z.B. solche vom Belüftungs-, Rühr- oder Luft-Förder-Typ oder hohen Konzentrationen von nicht weniger als 2 ppm gehalten speziell konstruierte Vorrichtungen, verwendet wird, kann als neu und charakteristisch zur Herstellung von werden.

Co-Q angesehen werden. Zur Steuerung des D.O.-Gehaltes während der Kultivierung

Bei der Kultivierung von Hefezellen in einem üblichen Fer- können Belüftungsverfahren, wie z.B. die Änderung des Sauermentier-Behälter unter vermindertem n nimmt der Co-Q- 65 stoffpartialdruckes durch Belüftung mit Luft, Sauerstoff oder Gehalt der Zellen zu, die Zunahme der Produktivität von Co-Q Mischungen davon, die Änderung der Kontaktfläche oder der ist jedoch nicht so hoch wegen des niedrigen \iX. Die im erfin- Kontaktzeit zwischen den Belüftungsgasen und der Kulturflüs-dungsgemässen Verfahren vorgesehene Kultivierungsmethode sigkeit, die Kultivierung unter erhöhten Drucken oder eine

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Kombination der vorstehend genannten Verfahren angewendet werden.

Die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit (p.) kann nach der folgenden Formel errechnet werden durch Bestimmung der Zellenkonzentration bei jeder Kultivierungszeit:

Bei der diskontinuierlichen Kultivierung:

Yt-

logl0q~) x 2.302 o t

X0 = die Anfangs-Zellenkonzentration

Xt = die Zellenkonzentration nach t Stunden t = Kultivierungszeit (Stunden)

Bei der kontinuierlichen Kultivierung:

_ Zellenmasse im Überlauf während tc Stunden ^ Zellenmasse in einem Gefäss x tc tc = die Dauer der kontinuierlichen Kultivierung (Stunden)

Die durchschnittliche spezifische Wachstumsgeschwindigkeit ist definiert als der n-Wert, der von Beginn bis zum Ende der Kultivierung im Falle der diskontinuierlichen Kultivierung errechnet wird, oder als der p.-Wert vom Beginn bis zum Ende der kontinuierlichen Kultivierung im Falle der kontinuierlichen Kultivierung.

Zur Steuerung von [i. kann jedes beliebige Verfahren angewendet werden, dessen Bedingungen die Bildung von Co-Q nicht hemmen und dennoch innerhalb der Grenzwerte für das Wachstum der Hefezellen liegen. So kann beispielsweise die Kontrolle der Kultivierungsbedingungen, wie z.B. der Temperatur und des pH-Wertes, die Kontrolle der Zugabemenge an Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralquellen und die Kontrolle der Menge der Wachstumsfaktoren, wie z.B. der Vitamine, Aminosäuren und von Nuclein-Säure abgeleiteten Verbindungen, als Massnahme zur Steuerung von \i angewendet werden. Ausserdem können zur Steuerung von u Chemikalien, welche das Wachstum der Zellen vermindern und dennoch die Bildung von Co-Q nicht hemmen, wie z.B. organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Caprylsäure, Pelar-gonsäure, Caprinsäure, Citronensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure und Salze davon, und Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Amylalkohol und Octylalkohol, zugesetzt werden. Die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Steuerung von |i, d.h. die Kontrolle der Kultivierungstemperatur, des pH-Wertes und der Zusammensetzung des Mediums sowie der Zugabe der wachstumshemmenden Chemikalien, können unabhängig voneinander oder in Kombination miteinander angewendet werden. Die Wahl der Verfahren zur Steuerung von u. hängt von den Hefearten, der Kohlenstoffquelle und dergleichen ab, die Steuerung durch die Temperatur und den pH-Wert ist jedoch bevorzugt. Die Steuerung von (i kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt der Kultivierung und für jede beliebige Zeitdauer zugeführt werden. Während der Kultivierung kann a bis zu jedem beliebigen Wert variiert werden, die Einstellung von jj. auf einen Wert von nicht mehr als 0,1 Stunde-1 liefert jedoch ein gutes Ergebnis. In jedem Falle darf die durchschnittliche spezifische Wachstumsgeschwindigkeit während der gesamten Kultivierungsdauer nicht mehr als 0,1 Stunde-1 betragen.

Die Endzellenkonzentration kann irgendeinen beliebigen Wert haben, die Kultivierung bei hohen Zellenkonzentrationen von nicht weniger als 20 g trockenen Zellen pro Liter ist jedoch wegen der Zunahme des |iX bevorzugt.

Der Co-Q-Gehalt der so erhaltenen Hefezellen ist hoch, und die Kosten für die Extraktion und Reinigung pro Gewichtseinheit Co-Q können stark vermindert werden.

Für die Isolierung von Co-Q aus den nach dem erfindungsgemässen Verfahren erzeugten Hefezellen können konventionelle Verfahren angewendet werden. So können die Hefezellen beispielsweise mit methanolischem Alkali in Gegenwart von Pyrogallol verseift und mit organischen Lösungsmitteln, wie Petroläther, Chloroform und dergleichen, extrahiert werden. Eine weitere Reinigung kann durchgeführt werden durch Adsorptionschromatographie an Aluminiumoxid, Silicagel, Flo-risil und dergleichen, und durch Umkristallisation können reine Kristalle erhalten werden. Die dabei erhaltenen Kristalle sind vollständig identisch mit dem nach dem konventionellen Kultivierungsverfahren erhaltenen Co-Q im Hinblick auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften, wie z.B. den Schmelzpunkt, die UV-, IR- und Massenspektren.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Rhodotorula mucilaginosa AHU 3946 wurde in einem 20-1-Medium, das pro Liter enthielt 4 g KH2PO4,1 g (NH-t^SO-t, 1 g MgS04- 7H20,10 mg ZnS04- 7H20,100 mg FeS04- 7H20,1 g Hefeextrakt und 2 g Äthanol, bei 30 °C und pH 5,0 unter Rühren mit 1000 UpM und Belüftung mit 1 vvm (Belüftung mit Luft als Standardbedingung) in einer Kolben-Fermentier-Einrich-tung kultiviert, bis die Zellenkonzentration 20 g (Trockengewicht) pro Liter erreicht hatte.

Während die Kultivierung wurde der pH-Wert mit Ammoniakwasser eingestellt und die Äthanol-Konzentration wurde durch Zuführung bei einem Wert von weniger als 1 g/1 gehalten. Die D.O.-Konzentration wurde unter Verwendung des Beck-man-D.O.-Meters gemessen und durch Belüftung mit einem Gemisch aus Luft, Sauerstoffgas und Stickstoffgas in einem geeigneten Verhältnis auf einen konstanten Wert einreguliert. Die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit (n) wurde bestimmt durch Messung der Zellenkonzentration bei jeder Kultivierungszeit (Stunde) und sie wurde kontrolliert durch Variieren der Temperatur innerhalb eines Bereiches von 23 bis 33 °C und des pH-Wertes innerhalb eines Bereiches von 3 bis 5, so dass der durchschnittliche (x-Wert während der gesamten Kultivierungsperiode sich dem gewünschten Wert näherte. Die Beziehung zwischen D.O., der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit und dem Co-Q-Gehalt ist in der folgenden Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Co-Q-Gehalt der Zellen

(mg/g)

D.O. (ppm) nicht

0-1 1-2 2-4 4-7

durchschnittl.

kontrol

ii (St-1)

liert*

0,13-0,18

0,30

0,25 0,28 0,38 0,35

0,08-0,10

-

0,31 0,40 0,91 0,85

0,04-0,07

-

0,41 0,45 1,15 1,28

* kultiviert unter Standardbedingungen: D.O.: 7 bis 9 ppm am Beginn und 0 bis 1,5 ppm am Ende.

Die Ausbeuten an gebildetem Co-Q, bezogen auf die äthanolverbrauchten (YCo-Q)-Mengen an Co-Q, die pro Liter der Kulturbrühe gebildet wurden, und die Mengen der aus den Zellen erhaltenen Kristalle sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

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Tabelle II

D.O.

P-

YCo-Q

gebildetes

Kristallaus

(ppm)

(Std.-1)

(mg/g)

Co-Q

beute

(mg/1)

nicht

0,17

6,0

3,7

kontroll.

0-1

0,15

0,13

5,0

3,0

2-4

0,10

0,41

18,2

11,5

4-7

0,06

0,51

25,6

14,7

an Co-Q-Kristallen, die aus den Zellen erhalten wurden, betrugen 0,61 bis 0,70. Es wurde bestätigt, dass es sich bei den Kristallen um Co-Q? handelte.

Tabelle IV

Durch Schmelzpunkte, UV- und Massenspektrum und Papierchromatogramm wurde bestätigt, dass es sich bei den Kristallen um Co-Qio handelte.

Beispiel 2

Cryptococcus albidus AHU 3922 wurde in einem 20-Liter-Medium, das pro Liter 30 g Palmitinsäure, 4 g KH2PO4,1 g (NH4)2SC>4,2 g MgSÛ4 • 7H20,10 mg ZnSCU • 7H20,100 mg FeSOf 7H2O und 2 g Maisquellwasser enthielt (der pH-Wert wurde auf 5 eingestellt), auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 angegeben kultiviert. Die folgende Tabelle III zeigt den D.O., das durchschnittliche (i und den Co-Q-Gehalt der Zellen. Die Ausbeute für die Extraktion und Reinigung von Co-Q betrug 0,57 bis 0,62. Es wurde bestätigt, dass es sich bei den dabei erhaltenen Kristallen um Co-Qio handelte.

Tabelle III

D.O.

durch-

Zellenkon

Co-Q-

Zellenpro

Co-Q-Pro-

(ppm)

schnittl.

zentration

Gehalt duktivität duktivität

H(Std.-')

(%)

(mg/g)

(g/l/Std.)

(mg/l/Std).

nicht*

0,25

1,7

0,37

4,3

1,6

kontroll.

0-1

0,08

3,5

0,52

2,8

1,5

0-2

0,10

4,8

0,60

4,8

2,9

2-4

0,22

3,2

0,31

7,0

2,2

2-4

0,09

4,5

1,05

4,1

4,3

2-4

0,05

6,5

1,21

3,3

4,0

Co-Q-Gehalt der Zelle

(mg/g)

D.O. (ppm) nicht

0-1 1-2 2-4 4-7

durchschnittl.

kontrol

|j.(Std._1 )

liert*

0,10-0,15

0,15

0,18 0,21 0,25 0,20

0,07-0,09

-

0,23 0,32 0,55 0,61

0,03-0,05

-

0,25 0,30 0,73 0,66

* kultiviert unter Standardbedingungen: der D.O.-Wert betrug am Beginn 7 bis 9 ppm und am Ende 0 bis 1 ppm.

* kultiviert unter Standardbedingungen Beispiel 4

Torulopsis magnoliae IFO 0705 oder Trichosporon fer-mentans ATCC10657 wurde in einem 10-1-Medium, das pro Liter enthielt 4 g KH2PO4,3 g (NH4)2S04,2 g MgS04- 7H20,20 mg ZnSÛ4- 7H20,50 mg FeS04-7H20,1 g Hefeextrakt und 1 g Maisquellwasser (der pH-Wert wurde auf 5 eingestellt) sowie Glukose oder Glycerin als Kohlenstoffquelle, bei 33 °C und einem pH-Wert von 2 bis 6 unter Rühren mit 500 UpM unter Belüftung mit 0,1 bis 2,0 vvm (pH 5,1 vvm Belüftung mit Luft ist die Standardbedingung), so lange kultiviert, bis die Zellenkonzentration 30 g/Liter erreicht hatte. Intermittierend wurde eine Kohlenstoffquelle in einer Menge von 10 g/1 jeweils so eingeführt, dass die Zellen nicht verkümmerten. Die Kontrolle des D.O.-Wertes wurden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Ver-35 fahren durchgeführt. Die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit wurde reguliert durch Zugabe eines Wachstumshemmittels und durch Variieren des pH-Wertes. Der D.O.-Wert, die durchschnittliche Wachstumsgeschwindigkeit und der Co-Q-Gehalt sind in der folgenden Tabelle V angegeben. Bei den aus 40 den Zellen isolierten Kristallen von Co-Q handelte es sich um C0-Q9.

25

30

45

50

Beispiel 3

Candida utilis IAM 4200 wurde unter Anwendung eines kontinuierlichen Kultivierungsverfahrens in einem 10-1-Medium, das pro Liter 3 g H3PO4,2 g KCl, 2 g MgS04-7Hi0, 2 g (NH4)2S04,30 mg ZnS04- 7H20,100 mg FeS04- 7H20,2 g Maisquellwasser, 2 mg Thiaminhydrochlorid und 3 g Essigsäure enthielt (der pH-Wert wurde mit Ammoniakwasser auf 6,5 eingestellt), bei 33 °C und pH 6,5 unter Rühren mit 700 UpM und unter Belüftung mit 1 vvm (Belüftung mit Luft als Standardbedingung) kultiviert. Der pH-Wert während der Kultivierung wurde mit H2SO4 oder NaOH eingestellt und es wurde CH3COONH4 zugeführt, um die Konzentration bei 1 bis 3 g pro Liter als freie Säure zu halten. Der D.O.-Wert während der Kul- 55 tivierung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 eingestellt (kontrolliert). Das |j. wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 in der Vorkultur kontrolliert und in der kontinuierlichen Kultur wurde ji errechnet aus dem erforderlichen Volumen der Kulturbrühe, das aus dem Gefäss abgezogen wurde, 60 um den Gleichgewichtszustand der Zellenkonzentration in der Kulturbrühe aufrechtzuerhalten, und es wurde gesteuert (kontrolliert) durch Variieren der Kultivierungstemperatur innerhalb eines Bereiches von 25 bis 35 °C und des pH-Wertes innerhalb eines Bereiches von 5 bis 7. Die Ergebnisse der kontinuier- 65 liehen 96stündigen Kultivierung sind in der folgenden Tabelle IV angegeben. Die Zellenausbeuten, bezogen auf verbrauchte Essigsäure, betrugen in jedem Falle 0,35 bis 0,41. Die Ausbeuten

Tabelle V

Co-Q-Gehalt der Zellen (mg/g)

Stamm

Torulopsis

Trichosporon

magnoliae fermentans

Kohlenstoffquelle

Glukose

Glycerin

Wachs-

D.O. (ppm) nicht

nicht tumshemm- durchschnittl.

kon

2-4

kon- 2-4

mittel )i(Std._1)

trol

trol-

liert*

0,15-0,31

0,43

0,40

0,38 0,50

0,04-0,10

0,58

1,05

0,41 0,95

Methanol** 0,13-0,20

0,39

0,55

0,43 0,73

0,5-1,0% 0,05-0,09

0,60

1,21

0,40 1,15

Caprylsäure 0,12-0,18

0,42

0,51

0,32 0,41

0,5 g/1 0,03-0,07

0,55

1,08

0,41 1,30

Ameisen- 0,15-0,25

0,33

0,61

0,41 0,38

säure

1-2 g/1 0,06-0,10

0,33

1,35

0,50 1,25

* kultiviert unter Standardbedingungen: Der D.O.-Wert betrug 8 bis 10 ppm am Beginn und 0 bis 1 ppm am Ende. ** Die Konzentration wurde durch Ergänzung konstant gehalten.

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Die oben erwähnten «optimalen Kultivierungsbedingun-gen» schwanken in gewissem Ausmass in Abhängigkeit von der Art der Hefe. Im allgemeinen liegen die optimalen Kulturbedingungen jedoch unter den folgenden Verhältnissen vor: Als Kul-tivierungsgefäss wird eine Kolben-Fermentier-Einrichtung (jar fermentor) verwendet, wie er auch im Beispiel 1 eingesetzt wurde. Das Medium enthält 20 g/1 Glucose, 10 g/1 Pepton und 5 g/1 Hefeextrakt. Die Temperatur liegt bei 25 bis 35 °C. Es wird mit einer Geschwindigkeit von 700 UpM gerührt unter einer Belüftung mit 2 vvm (Volumenteile Luft pro Volumenteile der s Kulturbrühe pro Minute).

o

Claims

632787 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung der Coenzyme Qs bis Qio, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Hefe, deren maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit unter optimalen Kultivierungsbedingungen nicht weniger als 0,15 Stunden-1 beträgt, in einem Nährmedium, in dem die Hefe wachsen kann, aerob kultiviert, wobei man die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Kultorbrühe bei nicht weniger als ppm hält und die durchschnittliche spezifische Wachstumsgeschwindigkeit während der gesamten Kultivierungsdauer so steuert, dass sie nicht mehr als 0,1 Stunde-1 beträgt, und die Coenzyme Qó bis Qio aus den dabei erhaltenen Hefezellen gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Hefe verwendet, die zu einer der Gattungen Rhodotorula, Cryptococcus, Candida, Trichosporon und Toru-lopsis gehört.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenstoffquelle in dem Nährmedium einen Zucker, eine organische Säure, einen Alkohol, einen flüssigen Kohlenwasserstoff, ein Fett, ein Öl, Glycerin, Molke oder landwirtschaftlich Abfälle verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die aerobe Kultivierung durch Belüftung mit einem Gas, das aus Luft, Sauerstoffgas und Mischungen davon gewählt ist, ausführt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Fermentiereinrichtung verwendet, die dem Luft-Rührungs-Typ oder dem Luft-Förder-Typ angehört.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, das man die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit der Hefe durch Kultivierung bei hohen Konzentrationen steuert.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit der Hefe durch Regelung der Kultivierungstemperatur, durch Regelung des pH-Wertes des Mediums, durch Regelung der Menge der Mineralquellen in dem Medium und/ oder durch Regelung der Menge der Wachstumsfaktoren in dem Medium steuert.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit der Hefe durch Zugabe einer organischen Säure, eines Salzes davon oder eines Alkohols steuert.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung unter Anwendung eines diskontinuierlichen (ansatzweise durchgeführten) oder kontinuierlichen Verfahrens ausführt.