DD230562A3 - Verfahren zur herstellung von nourseothricin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues fermentatives Verfahren zur Herstellung von Nourseothricin auf der Basis grenzwertlimitierter Prozessfuehrung. Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren aufzuzeigen, welches es ermoeglicht, den Wirkstoff Nourseothricin durch gezielte Prozessfuehrung der Fermentation in hoher Raum-Zeit-Ausbeute darzustellen. Durch das vorgegebene Sterilisationsregime wird mit Beginn der Fermentation eine ratenlimitierte Phosphat-Phosphor-Freisetzung im Bereich von 0,1 bis 10 mg/l gewaehrleistet. Dieser Konzentrationsbereich wirkt sich besonders guenstig auf den zur Biosynthese des Antibiotikums notwendigen Stoffwechselverlauf im genannten Konzentrationsverhaeltnis aus. Waehrend der Fermentation wird ein Sauerstoff-Partialdruck von 30% bis 80% eingestellt sowie weitere Substratlimitationen bei Aufrechterhaltung eines Kohlenstoff-Stickstoff-Konzentrationsverhaeltnisses von 5 bis 15 g Glukoseeinheiten/l zu 0,015 g bis 0,2 g Ammonium-Stickstoff/l gewaehrleistet. Ueberraschenderweise wurde gefunden, dass das geeignete Sollwertintervall fuer die Regelung des p H-Wertes der Kulturloesung im Bereich physiologisch regulativ effektiver p H-Wert 5,0 bis 6,5 bei Zudosierung einer geeignet konzentrierten Ammoniumhydroxidloesung eingestellt und damit gleichzeitig die Stickstoffkonzentration fuer das Glukose-Stickstoff-Konzentrationsverhaeltnis garantiert wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nourseothricin.

Nourseothricin ist eine zur Gruppe der Streptothricine gehörendes Antibiotikum, welches nach Verabreichung in ergotropen Dosen mit dem Tierfutter bei landwirtschaftlichen Nutztieren eine beschleunigte Lebendmasse-Zunahme sowie gleichzeitig eine Verminderung des Futteraufwandes bedingt. Es ist für die Tierproduktion sowie für die pharmazeutische und Mischfutterindustrie von Nutzen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das aus der Kultur einer Variante von Streptomyces noursei ATCC 11455 isolierte Antibiotikum Nourseothricin ist in vitro wirksam gegen Gram-positive und -negative Bakterien sowie gegen Mykobakterien (Bradler, G. und Thrum, H.: Nourseothricin A und B, zwei neue antibakterielle Antibiotika einer Streptomyces-Noursei-Variante. Zschr. Allgem. Mikrobiol.3,105 bis 112 (1963)). Nourseothricin ist eine in Wasser und niederen Alkoholen lösliche Base. Handhabbare Formen sind seine Salze. Das Molekül des Nourseothricins (siehe Abb. 1) ist aus dem Aminozucker Gulosamin und den Aminosäuren Streptolidin und ß-Lysin aufgebaut. Die einzelnen Komponenten des Nourseothricins unterscheiden sich durch die Anzahl der peptidartig' miteinander verknüpften /3-Lysinreste im Molekül. Der Nourseothricin-Komplex besteht zu etwa 90% zu annähernd gleichen Anteilen aus den beiden Hauptkomponenten F und D sowie zu etwa 10% aus den beiden Nebenkomponenten CC und E (Gräfe, U.; Bocker, H.; Reinhardt, G. und Thrum, H.: Regulative Beeinflussung der Nourseothricinbiosynthese durch o-Aminobenzoesäure in Kulturen des Streptomyces noursei JA 3890b. Zschr. Allgem. Mikrobiol. 14, 659 bis 673 (1974)). Der das Antibiotikum Nourseothricin bildende Streptomycetenstamm ist unter der Bezeichnung Streptomyces noursei ZIMET JA 3890b in der Stammsammlung des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR hinterlegt.

Nach den aus der Literatur bekannten Verfahren (Bocker, H. und Thrum H.: Stimulation of nourseothricin production by aminobenzole acids. In: Herold, M. und Gabriel, Z.: Antibiotics — Adyances in research, production and clinical use. London 1966; p. 584 bis 587) erfolgt die Kultivierung unter aeroben Bedingungen. Hierzu wird an Erde lyophil getrocknetes Sporenmaterial dieses Streptomyces-Stammes auf geeignete Agarnährböden aufgebracht. Nach 6- bis 10tägiger Bebrütung bei 28 bis 30⁰C wird der so gewachsene versporte Mycelrasen zum Beimpfen von flüssigen sterilen Nährmedien verwendet. Die Beimpfung kann auch direkt mit einer Konserve von lyophil an Gelatine getrockneten Submersmycel des Nourseothricinbildenden Streptomycetenstammes erfolgen.

Die flüssigen Nährmedien für die submers Anzucht des Impfmaterials enthalten als Substrate Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze. Als Kohlenstoffquellen werden Glukose und/oder Glyzerin eingesetzt. Als Stickstoffquellen kommen insbesondere Sojamehl, verschiedene Aminosäuren und/oder Ammoniumsalze in Betracht. Die für die Anzucht des Impfmaterials günstigste Azidität zu Beginn der Kultivierung liegt im Bereich von pH 6,0 bis pH 6,7. Die Bebrütung erfolgt bei Temperaturen von 28 bis 30°C über einen Zeitraum von 24 bis 48 Stunden.

Das so angezogene Impfmaterial dient zur Beimpfung von sterilen flüssigen Nährmedien für die Hauptkultur. Solche Nährmedien bestehen aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganischen Salzen. Als Kohlenstoffquelle werden Maisstärke und/oder Glukose eingesetzt. Als Stickstoffquelle kommen insbesondere Sojamehl, verschiedenen Aminosäuren und/oder Ammoniumsalze ir Betracht. Die für die Antibiotkumbildung günstigste Azidität zu Beginn der Fermentation liegt im Bereich von pH 6,0 bis 7,5. Die Kultivierung erfolgt bei Temperaturen von 26 bis 32⁰C, vorzugsweise bei 2o bis 30⁰C zu 150 Stunden.

Die submerse Kultivierung des Streptomyces noursei ZIMETJA 3890b erfolgt in bekannter Weise als Schüttkultur oder in gerührten und belüfteten Fermentoren ohneZudosierung von Substraten bzw. Regelung des pH-Wertes. Bekannt ist (Bradler, G. und Thrum, H.: Nourseothricin A und B, zwei neue antibakterieile Antibiotika einer Streptomycesnoursei-Variante. Zsch. Allgem. Mikrobiol. 3,105 bis 112 (1963)), daß die verhältnismäßig geringe Nourseothricin-Bildung auf dem ursprünglichen Fermentationsmedium durch Zusatz von Aminoarylkarbonsäuren, insbesondere von 5 bis 10mmol/l o-Aminobenzoesäure, zum Beginn der Hauptkultur zugesetzt, unter den bekannten technischen Bedingungen um das 5 bis 10fache gesteigert werden kann (Bocker, H. und Thrum, H.: Stimulation of nourseothricin production by aminobenzole acids. In: Herold, M. und Gabriel, Z.: Antibiotics — Advances in research, production and clinical use. London 1966, p.584 bis 587). Es ist aus eigenen Untersuchungen der Jahre 1974 bis 1980 (zusammenfassend zitiert in: Gräfe, U.; Steudel, A.; Bocker, H. und Thrum, H.: Regulative influence of o-aminobenzoic acid (OABA) on the biosynthesis of nourseothricin in cultures of Streptomyces noursei JA 3890b. V. Effect of OABA on cytochrom levels and amino acid transport. Zschr. Allgem. Mikrobiol.

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30,185 bis 194(1980)) bekannt, daß.o-Aminobenzoesäure und/oder andere Aminoarylkarbonsäuren spezifisch die Bildung von Cytochrom des a-Typs (Cytochrom-Oxydasen) reprimieren und dadurch indirekt sowohl den Aminosäuretransport aus dem Nährmedium in das Mycel als auch die oxydative Desaminierung der Aminosäuren in den Zellen des Nourseothricin-Bildners hemmen. Hierdurch wird einerseits eine Repression des Sekundärstoffwechsels durch ein zelluläres Überangebot an Stickstoff-Kataboliten vermieden. Andererseits wird auf diese Weise verhindert, daß als Precursoren des Nourseothricins dienende Aminosäuren des Mediums vom Antibiotikum-Bildner während dessen Wachstumsphase weitgehend aufgebraucht werden. Diese Aminosäuren sind somit dem Sekundärstoffwechsel im Verlaufe der Nourseothricin-Bildung besser verfügbar, da für die Biomassebildung bevorzugt die anorganische Stickstoffquelle (Ammonium-Stickstoff) genutzt wird. Die fermentative Nourseothricin-Produktion unter Verwendung von Aminoarylcarbonsäuren, die bekanntermaßen zwar eine wesentliche Steigerung der Fermentationsausbeute ermöglicht, weist jedoch insbesondere hinsichtlich der Kosten, der Sterilisation und der Abwasserproblematik Nachteile auf, die einer großtechnischen Anwendung entgegenstehen. Bekannt ist weiterhin, daß die Biosynthese der meisten Sekundärmetabolite durch überschüssiges Phosphat negativ beeinflußt wird (zusammenfassend zitiert in: Martin, J.F. und Demain, A. L.: Control of antibiotic biosynthesis. Microbiol. Rev. 44, 230 bis 251 [1980]). Deshalb werden technisch-mikrobielle Fermentationen zur Herstellung von Sekundärmetaboliten, zum Beispiel Antibiotika, bei für das Wachstum des Bildners suboptimalen Phosphatkonzentrationen durchgeführt. In der Regel werden komplexe Nährbodenbestandteile pflanzlicher und tierischer Herkunft, wie Stärke, Sojamehl, Maisquellwasser, Melasse, Fleischextrakt u.a., bei Fermentationen im technischen Maßstab zur Gewinnung von Sekundär-Metaboliten eingesetzt. Je nach Herkunft und Vorbehandlung besitzen solche komplexen Nährbodenbestandteile unterschiedliche Gehalte an Gesamtphosphat von unterschiedlicher biologischer Verfügbarkeit. Ein Teil des verfügbaren Phosphats liegt in den Fermentationsmedien als lösliches Phosphat vor. Dieser Umstand erschwert grundsätzlich die Standardisierung der Nährmedien.

Die Anfangskonzentrationen an löslichen bzw. verfügbarem Phosphat haben aber eine entscheidende Bedeutung für die fermentative Ausbeute an dem angestrebten Sekundärmetabolit, weil einerseits eine bestimmte Phosphatmenge für das Wachstum der produzierenden Mikroorganismen erforderlich ist und zum anderen zu hohe Phosphat-Anfangskonzentrationen die Sekundärmetabolit-Bildung inhibieren.

Das Patent DD 155329 beansprucht die Verwendung der Konzentration der im Kulturmedium enthaltenen Phosphationen als Regelgröße zur Stabilisierung des Kultivierungsprozesses. Das Verfahren bezieht sich jedoch nur auf die fermentative Gewinnung von Biomasse, wobei der Sollwert der Konzentration im Bereich von 20 bis 60mg/l Phosphor einzustellen. Die Anwendung dieses Verfahrens auf die Regulation der Biosynthese von Sekundärmetaboliten in mikrowellen Batch-Kulturen ist nicht bekannt.

Bei der Verbesserung mikrobieller Herstellungsverfahren für die Produktion von Sekundärmetaboliten werden das Nährmedium und der produzierende Mikroorganismus durch wechselseitiges Modifizieren so aneinander angepaßt, daß ein Kompromiß zwischen den beiden gegenläufigen regulativen Einflüssen des Phosphats zustande kommt. Dieser Weg der stufenweisen Leistungssteigerung ist jedoch zeitaufwendig und kostenintensiv.

Bekannt ist ferner, daß neben der regulativen Beeinflussung durch die Zusammensetzung des Nährmediums eine Verbesserung derfermentativen Ausbeute auch über eine Steuerung des Fermentationsprozesses, vorzugsweise als Echtzeitsteuerung, zu erreichen ist (Sukatsch, D. A. u. Nesemann, G.: Automatische Parametererfassung bei industriellen Fermentationen. Chemie-Technik 6, 261 [1977]).

Bei der für eine effektive Fermentationsführung erforderlichen Anwendung der Echtzeitsteuerung besteht die Schwierigkeit, auf die in der Fermentationstechnik etablierten, kontinuierlich meßbaren globalen Prozeßparameter, wie pH-Wert pO₂-Wert, Dosierraten, Abgaszusammensetzung, Wärmebildung, anstelle der erst durch meist zeitaufwendige chemische Analytik nachträglich festzustellenden Substratkonzentrationen als primäre regulative Prozeßparameter ausweichen zu müssen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, den Wirkstoff Nourseothricin durch gezielte Prozeßführung der Fermentation in hoher Raum-Zeit-Ausbeute darzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein technisch günstiges Verfahren anzugeben, welches durch grenzwertlimitierte Prozeßführung und Verlängerung der Produktbildungsrate die industrielle Produktion von Nourseothricin mit hoher Raum-Zeit-Ausbeute der Fermentation ermöglicht.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß im Zusammenhang mit einer unter vorgegebenen pH-Wert-Bedingungen im Bereich von 7,2 bis 8,2 geregelten Hitzesterilisation des Kulturmediums bei getrennter Sterilisation der Komponenten Glukose und Ammoniumsulfat die metabolischen Aktivitäten der Nourseothricin-bildenden Kulturen (Respiration, Glukosestoffwechsel, Stickstoffwechsel, Antibiotikumbildung) besonders effektiv beeinflußt werden sowie durch ratenlimitierte Substratdosierungen (Dosierung von außen bzw. Freisetzung der Substrate aus Nährstoffkomponenten) und Regelung des pH-Sollwertes im Bereich von pH 5,0 bis 6,5 während der Fermentation.

Dabei ist von besonderer Bedeutung, daß während des gesamten Fermentationszeitraumes ein Kohlenstoff-Stickstoff-Konzentrationsverhältnis von 5 bis 15g Glukoseeinheiten/I zu 0,015 bis 0,2g Ammonium-Stickstoff/I nicht unterschritten wird.

Durch das vorgegebene Sterilisationsregime wird mit Beginn der Fermentation eine ratenlimitierte Phosphat-Phosphor-Freisetzung im Bereich von 0,1 bis 10mg/l vorzugsweise aus den komplexen Stickstoffkomponenten des Nährmediums gewährleistet. Dieser Konzentrationsbereich wirkt sich besonders günstig auf den zur Biosynthese des Antibiotikums notwendigen Stoffwechselverlauf (C:N) im genannten Konzentrationsverhältnis aus.

In engem Zusammenhang mit der effektiven metabolischen Aktivität während der Fermentation ist die pH-Sollwert-Regelung im Bereich von pH 5,0 bis 6,5 zu sehen.

Die für die Biosynthese des Antibiotikums erforderlichen und günstigen Stoffwechselverläufe werden in diesem Bereich besonders aktiviert.

Zur Aufrechterhaltung des erforderlichen Glukose-Stickstoff-Konzentrationsverhältnisses ist es erforderlich bis zur Erreichung des physiologisch-optimalen pH-Wert-Bereiches Ammoniumsulfat zu dosieren.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß das geeignete Sollwertintervall für die Regelung des pH-Wertes der Kulturlösung im Bereich physiologisch-regulativ effektive pH-Werte 5,0 bis 6,5 bei Zudosierung einer geeignet konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung eingestellt und damit gleichzeitig die Stickstoffkonzentration für das Glukose-Stickstoff-Konzentrationsverhältnis garantiert wird.

Gleichzeitig wird mit dieser Art der Prozeßführung die ratenlimitierte Phosphat-Phosphor-Freisetzung weiterhin gewährleistet.

Mit dieser Art der Prozeßregelung werden nach einer Fermentationszeit von 120 bis 140 Stunden bei einem Sauerstoffpartialdruck, pO₂, im Bereich von 30 bis 80%, vorzugsweise 40%, biologische Aktivitäten von 8 bis 11 kg Nourseothricin pro Tonne Kulturlösung gebildet

Die Erfindung soll durch das nachfolgende Ausführungsbeispiel näher erläutert werden:

Ausführungsbeispiel

Die Suspension einer Mycellyophilkonserve in physiologischer Kochsalzlösung eines Leistungsstammes von Streptomyces noursei dient als Inoculum für die LSubmerspassage.

Das Nährmedium besteht aus (g/l) Glukose 15, Sojamehl 15, Kalziumkarbonat 1,0, Natriumchlorid 5,0, Kaliumdihydrogenphosphat 0,3, Leitungswasser ad 1 000 ml, pH 6,5 bis 6,9 (Abfüllung zu je 50ml in 500ml Schüttelkolben).

Die Sterilisation des Mediums erfolgt bei 12O⁰C 35 Minuten.

Nach 48stündiger Kultivierung bei 28⁰C auf einer Rotationsschüttelmaschine wird die 2. Submerspassage (250ml Abfüllung, 2000ml Schüttelkolben) im Verhältnis von 1 Teil Inoculum zu 25 Teilen Nährmedium über 24 Stunden auf der Rotationsschüttelmaschine kultiviert.

600ml der 2. Submerspassage werden für die Beimpfung von 800I Impffermentormedium verwendet.

Das Nährmedium besteht aus (g/l) Glukose 15, Sojamehl 15, Kaliumdihydrogenphosphat 0,3, Natriumchlorid 5,0, Kalziumkarbonat 1,0, Antaphron 5,0, Sonnenblumenöl 37,5.

Der pH-Wert wird vor der Sterilisation auf 7,4 eingestellt, er beträgt nach der Beendigung der Sterilisation 6,8 bis 7,0. Die Sterilisation erfolgt bei 120⁰C 60 Minuten.

Nach ca 30 Stunden Kultivierung bei 28°C werden ca 60mg/l lösliches Phosphat verbraucht und dabei 12 bis 15g/l Biomasse gebildet.

Die Inoculummenge von 800I ist ausreichend für die Beimpfung von ca 18m³ Produktionsmedium der Hauptkultur.

Das Nährmedium des Produktionsfermentors besteht aus (g/l) Kartoffelstärke 32,0, Sojamehl 15,0, Natriumchlorid 1,0, Kalziumkarbonat 6,0, Zinksulfat 0,5, Magnesiumsulfat 2,0, Sonnenblumenöl 3,0, Antaphron 0,3, Glukose von 10 bis 35, Ammoniumsulfat 2 bis 11.

Die Komponenten Glukose und Ammoniumsulfat werden nach separater Sterilisation (120°C, 30 Minuten) dem Nährmedium zugeführt.

Die Sterilisation des Mediums erfolgt bei 115⁰C 60 Minuten, wobei vor Beginn ein pH-Wert von 7,8 eingestellt wird, der nach Beendigung der Sterilisation Werte zwischen 7,2 bis 8,2 erreicht.

Das komplettierte Medium erreicht pH-Wert zwischen 7,0 bis 7,4. Die Fermentation erfolgt bei 28°C mit einem Belüftungsverhältnis von 0,3:1 (m³ Luft:m³ Kulturlösung von 60%.

Bei Unterschreitung der Grenzwerte für Glukose 5g/l und Ammoniumstickstoff 0,2 g/l werden diese Komponenten als 50%ige sterile Lösungen zudosiert, bis die Kulturlösung einen pH-Wert von 5,2 bei einem Ammoniumstickstoffwert über 300 mg/l erreicht.

Die weitere Ammoniumstickstoffzugabe erfolgt über die Dosierung von Ammoniakwasser bei konstanten pH-Wert von 5,5.

Nach einer Fermentationszeit von 130 Stunden wird eine biologische Aktivität von 8000-11 OOOug Nourseothricin/ml Kulturlösung gebildet.

Claims (3)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung von Nourseothricin unter Verwendung eines geeigneten Nourseothricin-bildenden Streptomyceten-Stammes der unter submersen aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthaltenden Nährmedium kultiviert wird, gekennzeichnet dadurch, daß durch Anwendung einer Kombination von Maßnahmen der Sterilisations- und Fermentationsprozeßführung ohne weitere Dosierung von phosphathaltigen Substanzen gearbeitet wird, so daß die Konzentration an löslichem Phosphat zu Beginn der Fermentation unter 10mg/l Phosphat eingestellt wird.
2. 2. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß weiterhin ein pH-Wert im Bereich von pH 5,0 bis 6,5 während der Fermentation eingehalten und ein Sauerstoff-Partialdruckvon 30 bis 80%, vorzugsweise von 40 bis 60% eingestellt wird, so wie weitere Substratlimitationen, insbesondere von Ammoniumstickstoff und Glukose bzw. Oligo- oder Polysaccharide bei Aufrechterhaltung eines Kohlenstoff-Stickstoff-Konzentrationsverhältnisses von 5 bis 15g Glukoseeinheiten/I zu 0,015 bis 0,2g Ammoniumstickstoff/I vermieden werden.
3. 3. Verfahren gemäß der Punkte 1 bis 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur pH-Sollwertregelung zur Steuerung der Zugabe von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie zur ratenlimitierten Phosphatfreisetzung während des Fermentationsprozesses vorzugsweise eine Ammoniakwasserdosierung verwendet wird und mit dieser Art der Prozeßregelung in einem Fermentationszeitraum von 120 bis 140 Stunden biologische Aktivitäten von 8 bis 11 kg Nourseothricin pro t Kulturlösung gebildet werden.