SU1423588A1 - Способ получени ноурзеотрицина - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Цель изобретени  - повышение производительности способа . Сущность способа сводитс  к тому, что культуру-продуцент на первой стадии ферментации выращивают в услови х лимитации по фосфору. Дл  этого концентрацию фосфата в питательной среде устанавливают ниже 10 мг/л. В процессе ферментации регулируют величину рН, поддержива  ее на уровне 5,0-6,5. Концентрацию углерода и азота в процессе ферментации поддержи вают в пределах 5-15 г глюкозы/л среды и 0,015-0,2 г аминного азота/л среды, а парциальное давление устанавливают на уровне 30-60% от полного насыщени  среды. Через 130 ч ферментации достигаетс  биологическа  активность пор дка 8000 - 11000 мкг антибиотика/мл культуральной жидкости. I (/ С

Description

4 К

о: Сл

а а

Изобретение относитс  к новому способу ферментативного получени  ноурзеотрицина

Ноурзеотрицин  вл етс  антибиотиком стрептотрициновой группы, который после его назначени  в эрготропных дозах вместе с кормовыми рационами сельскохоз йствен- но-полезным животным обуславливает ускоренный прирост живой массы, а также одновременно у.сньшение затрат корма. Ноурзеотрицин используют дл  животноводческого производства, а также дл  фармацевтиче- ской и комбикормовой промышленности.

Антибиотик Ноурзеотрицин, изолированный из культуры варианта штамма Strepto- myces noursei АТСС 11455, активен in vitro в отношении грамположительных и грамот- рицательных бактерий, а также в отношении микобактерий.

Образующий антибиотик Ноурзеотрицин штамм стрептомицетов под названием Strep- tomyces.noursei ZIMET JA 3890b депонирован в музее ;;-i O:,--.K.:J lUilTpajlblU;: ;; ЛНСТИТу-

та микробиологии и экспериментальной терапии Академии наук ГДР.

По известным из литературы способам культивирование штамма осуществл ют в аэробных услови х. Дл  этого лиофилизи- рованный на земле споровый материал этого штамма стрептомицетов перенос т на соответствующие агаризованные питательные среды. После 6-10-дневного инкубировани  при 28-30°С проросший спорулирующий мицелиальный газон используют дл  засева жидких стерильных питательных сред, засев можно осуществл ть также непосредственно при помощи консервированного лиофилиза- цией на желатине глубинного мицели  ноур- зеотрицинообразующего штамма стрептомицетов .

Жидкие питательные среды дл  глубинного выращивани  посевного материала содержат в качестве субстратов источники углерода и азота, а также неорганические соли. В качестве источника yi-лерода используют глюкозу и/или глицерин. В качест- ве источника азота примен ют, в частности, соевую муку, различные аминокислоты и/или аммонийные соли. Наиболее благопри тна  дл  выращивани  посевного материала кислотность имеетс  в начале культивировани  в пределах рН 6,0-6,7. Инкубирование провод т при 28-30°С в течение 24-48 ч. Получаемый таким образом посевной материал служит дл  засева жидких стерильных питательных сред дл  питани  основной культуры. Такие питательные среды состо т из источников углерода и азота, а также из неорганических солей. В качестве источника углерода, используют кукурузный экстракт и/или глюкозу. В качестве источника азота при.мен ют, в частности, соевую муку, различные аминокислоты и/или ам- мойийные соли. Наиболее благопри тна  дл  образовани  антибиотика кислотность составл ет в начале ферментации рН 6,0-

s

0

0 5

0

5

5

0

7,5. Культивирование осуществ ч ют при 26--32°С, предпочтителыю 28 -30°С, в течение 150 ч.

Глубинное культивирсг.акие штамма Streptomyces noursei ZIMET JA 3890 b осуществл ют известным образом на хачалке или в ферментаторах с перемеи иванием к аэрацией без прибавлени  субстратов или регулировани  значени  рН.

При этом известно, что сравнительно незначительное ноурзеотрицинообразование на первоначальной ферментационной среде может увеличиватьс  в 5-10 раз в известных технических услови х, если в начале выращивани  основной культуры прибавл ют амин.оарилкарбоновые кислоты, в частности 5-10 ммо. о-а.минобензойной кислоты (Becker Н. und Thrum Н.: Stimulation of nourseothricin production by aminoben- zoic acids, in: Herold M und Gabriel Z.: Antibiotics-Advances in reseatch,- production and clinical use. London, 96u, p. 564, bis 587).

Однако ферментативное производство ноурзеотрицина с использованием амино- арилкарбоновых кислот, которое, ка известно , хот  и позвол ет значительно увеличивать выход ферментации, но, в частности, в отношении затрат, стерилизации и пробле.м. св занных со сточными водами, имеет недо- статки, которые мешают внедрению способа в промышленное производство.

Известно также, что на биосинтез большинства вторичных метаболитов отрицательно вли ет избыточный фосфат (.Martin J. F., und Demain А. L.: Control of antibiotic biosynthesis.-Microbioi. Rev. 44, 230 bis 251 (1980). Поэтому микробиолог -гче- ские процессы ферментации дл  получени  вторичных метаболитов, например антибиотиков , провод т при концентраци5:х фосфата субоптимальных дл  роста образовател .

Дл  ферментации в технических масштабах в цел х получени  вторичных метаболитов используют, как правило, комплексные компоненты питательной среды растительного и животного происхождени , такие, как крахмал, соева  мука, кукурузный экстракт , меласса, м сной экстра.кт и ;,р. Такие комплексные питатгльиой среды имеют по мере происхождени  и предварительной обработки различное со.аержание общего фосфата с различной биологической доступностью. Часть .аоступкого фосфата имеетс  в ферментационной среде а форме растворимого фосфата. Это обсто тельстве принципиально затрудн ет стандартизацию питательных сред.

Однако начальные концентрации растворимого или доступного фосфата имеют ре- ц:ающее значение дл  фермектат1-:зного выхода ожидаемого вторичкого ;етаболита, поскольку определенное КОЛИЧССТЕО фосфата необходимо дл  роста микроорганизма- продуцента, а слишком высокие начальные

концентрации фосфата подавл ют образование вторичного метаболита.

При улучшении микробиальных способов получени  вторичных метаболитов питательную среду и микроорганизм - продуцент приспосабливают друг к другу путем взаимного модифицировани  так, чтобы между обоими гфотиводействуюш,ими регулирующими факторами воздействи  фосфата установилс  KOMnpOjVinCC.

Однако путь постепенного повышени  продуктивности св зан с затратами времени и расходами.

Кроме того, известно, что нар ду с регулирующим воздействием на процесс путе.м изменени  состава питательной среды выход ферментации можно улучщать также путем управлени  ферментационным процессом, предпочтительно управлени  в реальном мае штабе времени (Sukatsch D. А. и. Neserriann G.: Automatische Parametererfassung bei in- dustrielien Fermentationen.-Chemie-Technik 6, 261 (1977).

В случае использовани  режима управлени  в реальном масштабе времени, необходимого дл  эффективного ведени  процесса фермеггтации, трудность заключаетс  в то.м, что вместо концентраций субстратов, чаще всего определ емых только дополнительно трудоемким химическим анализом, приходитс  прибегать к измерению прин тых в ферментационной технике- непрерывно определ емых общих параметров процесса - рН, рОг, количества дозируемых добавок , состав отход щих газов, теплообразование - как первичных регулируемых параметров процесса.

Цель изобретени  - повышение производительности способа.

Сущность изобретени  сводитс  к следу юп1е;11 у.

В основу изобретени  положена задача представить технически, удобный способ, который путем ведени  лроцесса с лимитированием по предельным значени м и увеличени  времени продуктообразовани  позвол л бы осуществить промышленное производство ноурзеотрицина с высоким объемно- времень:ым выходом ф-ерментации.

Регулируема  в задаиньЕх ус;1овм х зна- .чений рМ в пределах 7,2-8,2 термостерилизаци  культура; ьной среды, раздельна  стерилизаци  компонентов (глюкоза и сульфат аммони ); лимитированное по скорости дозированное прибавление субстрата (прибавление извне или высвобождение субстратов из компонентов питательных веществ), регу. ирование заданного значени  рН в пределах 5,0-6,5 во врелш ферментации особенно эффективно вли ют на метаболические активности нoypзeoтpицинooбpaзyюп иx культур (дыхание, глюкозный обмен, азотный об.мен. антибиотикообразование).

При этом особое значение имеет, что на прот жении всего периода ферментации

отно1пение концентраций углерода к азоту

составл ет не менее 5-15 г глюкозы/л к

0,,2 г аммонийного азота/л среды.

За счгт заданного режима стерилизации

с начала ферментации обеспечиваетс  лимитированное по скорости высвобождение фосфатного буфера в пределах 0,1 -10 мг/л предпочтительно из комплексных азотных компонентов питательной среды. Этот предел концентрации особенно выгодно вли ет на

необходимый дл  биосинтеза антибиотика ход обмена веществ (C:N) в указанном соотношении концентраций.

В тесной св зи с эффективной метаболической активностью в процессе ферментации

5 следует рассматривать регулирование рН в пределах 5.0-6,5. Необходимый н выгодный дл  биосинтеза антибиотика ход обмена веществ особенно активируетс  в этих пределах .

Дл  сохранени  требуемого соотнощенц 

0 концентраций глюкозы/азота необходимо дозировать сульфат аммони  до достижени  физиологически оптимального диапазона рН. Неожиданно было найдено, что соответствующий интервал заданных значений регу5 лировани  рН ку.чс-туральной жидкости устанавливаетс  в пределах эффективных с точки зрени  физиологического регулировани  рН 5,0-6,5 при прибавлении раствора гидроокиси аммони  соответствующей концентрации , а вместе с тем гарантируетс 

0 концентраци  азота дл  соотнощени  концентрации глюкозы/азота.

Способ ведени  процесса обеспечивает лимитированное по скорости высвобождение фосфатного буфера.

Такой способ регулировани  процесса

5 позвол ет через 120-140 ч ферментации при парц1 альном давлении кислорода рО2 в пределах 30-80%, предпочтительно 40%, обеспечить биологическую активность, даю- длую 8-11 кг поурзеотрицина на тонну куль- тургльной жидкости.

Пример. Суспензи  лиофилизированного консервного мицели  в физиологическом растворе поваренной соли, полученного от шта.1. а - продуцента Streptomyces noursei, служит в качестве инокулюма дл  первого

0

5

глуби О1Ого пасса.жа.

Питательна  среда содержит, г/л: глюкоза 5; соева  NiyKa 15; карбонат кальци  1,0; хлорид натри  5,0; дигидрофосфат кали  0,3; водопроводна  вода до 1000 мл, рН 6,5- 6,9 (разливать по 50 мл в 500-.мл колбы на 0 качалке)..

Стерилизацию среды производ т при 120°С в течепие 35 мин.

После 48-часового культивировани  при 28°С на ротационной качалке культивируют 2-й глубинный пассаж (разлив 250 мл, 5 2000 - .мл колбы на качалке) в соотношении 1 ч инокулюма к 25 ч питательной среды в течение 24 ч на ротационной кача.чке. 600 мл 2-го глубинного пассажа ИСПОЛЬЗУЮТ

дл  засева 800 л среды посевного ферментатора .

Питательна  среда содержит, г/л: глюкоза 15; соева  мука 15; дигидрофосфат кали  0,3; хлорид натри  5,0; карбонат кальци  1,0; антафрон 5,0; подсолнечное масло 37,5.

Значение рН устанавливают перед стерилизацией на 7,6, после стерилизации оно составл ет 6,8-7,0. Стерилизацию осуществл ют при 120°С в течение 60 мин.

После 30-часового культивировани  при 28°С потребл етс  около 60 мг растворимого фосфата на литр, причем образуетс  12- 15 г биомассы на литр.

Количество инокулюма в 800 л достаточно дл  засева около 18 м производственной среды основной культуры.

Питательна  среда производственного ферментатора содержит, г/л: картофельный крахмал 32,0; соева  мука 15,0; хлорид натри  1,0; .карбонат кальци  6,0; сульфат цинto

15

0,3:1 (м воздуха:м культуральной жидкости в 60%).

Если предельные значени  не достигают величины 5 г/л дл  глюкозы и 0,2 г/л дл  аммонийного азота, эти компоненты прибавл ют как 50%-ные стерильные растворы, пока культуральна  жидкость не достигает рН 5,2 при значении аммонийного азота свыше 300 мг/л.

В дальнейшем прибавление аммонийного азота осуществл ют дозированным прибавлением аммиачной воды при посто нном рН 5,5. Через 130 ч ферментации достигаетс  биологическа  активность пор дка 800- 11000 мкг ноурзеотрицина на 1 мл культуральной жидкости.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  ноурзеотрицина путем культивировани  штамма Streptomyces nour- sei ZIMET JA 38906 в питательной среде.

   ка 0,5; сульфат магни  2,0; подсолнечное 20 содержащей источники углерода, азота, фосмасло 3,0; антафрон 0,3; глюкоза 10-35; сульфат ам.мони  2-11.

   Компоненты глюкозы и сульфата аммони  прибавл ют к питательной среде после раздельной стерилизации (120°С, 30 мин).

   Стерилизацию среды производ т при 115°С в течение 60 мин, причем до начала устанавливают значение рН 7,8, которое по окончании стерилизации достигает значений в пределах 7,2-8,2.

   Пополненна  среда достигает значени  рН в пределах 7,0-7,4. Ферментацию производ т при 28°С с соотношением аэрации

   25

   фора, минеральные и органические добавки, в услови х аэрации и перемешивани , отличающийс  тем, что, с целью повышени  производительности способа, в начале фер.мен- тации устанавливают концентрацию растворимого фосфата в питательной среде ниже 10 мг/л, в процессе ферментации поддержи- вают величину рН в пределах 5,0-6,5, отношение концентраций углерода и азота поддерживают в пределах 5-15 г глюкозы/л 30 среды и 0,015-0,2 г аминного азота/л среды, а парциальное давление кислорода устанавливают на уровне 30-60% от полного насыщени  среды.

   o

   5

   0,3:1 (м воздуха:м культуральной жидкости в 60%).

   Если предельные значени  не достигают величины 5 г/л дл  глюкозы и 0,2 г/л дл  аммонийного азота, эти компоненты прибавл ют как 50%-ные стерильные растворы, пока культуральна  жидкость не достигает рН 5,2 при значении аммонийного азота свыше 300 мг/л.

   В дальнейшем прибавление аммонийного азота осуществл ют дозированным прибавлением аммиачной воды при посто нном рН 5,5. Через 130 ч ферментации достигаетс  биологическа  активность пор дка 800- 11000 мкг ноурзеотрицина на 1 мл культуральной жидкости.

   Формула изобретени 

   Способ получени  ноурзеотрицина путем культивировани  штамма Streptomyces nour- sei ZIMET JA 38906 в питательной среде.

   0 содержащей источники углерода, азота, фос5

   фора, минеральные и органические добавки, в услови х аэрации и перемешивани , отличающийс  тем, что, с целью повышени  производительности способа, в начале фер.мен- тации устанавливают концентрацию растворимого фосфата в питательной среде ниже 10 мг/л, в процессе ферментации поддержи- вают величину рН в пределах 5,0-6,5, отношение концентраций углерода и азота поддерживают в пределах 5-15 г глюкозы/л 0 среды и 0,015-0,2 г аминного азота/л среды, а парциальное давление кислорода устанавливают на уровне 30-60% от полного насыщени  среды.