DD230562A3 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF NOURSEOTHRICIN - Google Patents
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- DD230562A3 DD230562A3 DD25594383A DD25594383A DD230562A3 DD 230562 A3 DD230562 A3 DD 230562A3 DD 25594383 A DD25594383 A DD 25594383A DD 25594383 A DD25594383 A DD 25594383A DD 230562 A3 DD230562 A3 DD 230562A3
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein neues fermentatives Verfahren zur Herstellung von Nourseothricin auf der Basis grenzwertlimitierter Prozessfuehrung. Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren aufzuzeigen, welches es ermoeglicht, den Wirkstoff Nourseothricin durch gezielte Prozessfuehrung der Fermentation in hoher Raum-Zeit-Ausbeute darzustellen. Durch das vorgegebene Sterilisationsregime wird mit Beginn der Fermentation eine ratenlimitierte Phosphat-Phosphor-Freisetzung im Bereich von 0,1 bis 10 mg/l gewaehrleistet. Dieser Konzentrationsbereich wirkt sich besonders guenstig auf den zur Biosynthese des Antibiotikums notwendigen Stoffwechselverlauf im genannten Konzentrationsverhaeltnis aus. Waehrend der Fermentation wird ein Sauerstoff-Partialdruck von 30% bis 80% eingestellt sowie weitere Substratlimitationen bei Aufrechterhaltung eines Kohlenstoff-Stickstoff-Konzentrationsverhaeltnisses von 5 bis 15 g Glukoseeinheiten/l zu 0,015 g bis 0,2 g Ammonium-Stickstoff/l gewaehrleistet. Ueberraschenderweise wurde gefunden, dass das geeignete Sollwertintervall fuer die Regelung des p H-Wertes der Kulturloesung im Bereich physiologisch regulativ effektiver p H-Wert 5,0 bis 6,5 bei Zudosierung einer geeignet konzentrierten Ammoniumhydroxidloesung eingestellt und damit gleichzeitig die Stickstoffkonzentration fuer das Glukose-Stickstoff-Konzentrationsverhaeltnis garantiert wird.The invention relates to a novel fermentative process for the preparation of nourseothricin on the basis of limit-limited process control. The aim of the invention is to provide a method which makes it possible to display the active substance nourseothricin by targeted process control of the fermentation in high space-time yield. The prescribed sterilization regime guarantees a rate-limited phosphate-phosphorus release in the range from 0.1 to 10 mg / l at the beginning of the fermentation. This concentration range has a particularly favorable effect on the metabolic process necessary for the biosynthesis of the antibiotic in the stated concentration ratio. During the fermentation an oxygen partial pressure of 30% to 80% is set and further substrate limitations are maintained while maintaining a carbon-nitrogen concentration ratio of 5 to 15 g glucose units / l to 0.015 g to 0.2 g ammonium nitrogen / l. Surprisingly, it was found that the appropriate setpoint interval for the regulation of the p H value of the culture solution in the range of physiologically regulative effective p H value 5.0 to 6.5 is set when adding a suitably concentrated ammonium hydroxide solution and, at the same time, the nitrogen concentration for the glucose Nitrogen concentration ratio is guaranteed.
Description
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nourseothricin.The invention relates to a novel process for the fermentative production of nourseothricin.
Nourseothricin ist eine zur Gruppe der Streptothricine gehörendes Antibiotikum, welches nach Verabreichung in ergotropen Dosen mit dem Tierfutter bei landwirtschaftlichen Nutztieren eine beschleunigte Lebendmasse-Zunahme sowie gleichzeitig eine Verminderung des Futteraufwandes bedingt. Es ist für die Tierproduktion sowie für die pharmazeutische und Mischfutterindustrie von Nutzen.Nourseothricin is an antibiotic belonging to the group of streptothricins, which after administration in ergotropen doses with the animal feed on farm animals causes an accelerated increase in biomass and at the same time a reduction in feed expenses. It is useful for animal production as well as for the pharmaceutical and compound feed industries.
Das aus der Kultur einer Variante von Streptomyces noursei ATCC 11455 isolierte Antibiotikum Nourseothricin ist in vitro wirksam gegen Gram-positive und -negative Bakterien sowie gegen Mykobakterien (Bradler, G. und Thrum, H.: Nourseothricin A und B, zwei neue antibakterielle Antibiotika einer Streptomyces-Noursei-Variante. Zschr. Allgem. Mikrobiol.3,105 bis 112 (1963)). Nourseothricin ist eine in Wasser und niederen Alkoholen lösliche Base. Handhabbare Formen sind seine Salze. Das Molekül des Nourseothricins (siehe Abb. 1) ist aus dem Aminozucker Gulosamin und den Aminosäuren Streptolidin und ß-Lysin aufgebaut. Die einzelnen Komponenten des Nourseothricins unterscheiden sich durch die Anzahl der peptidartig' miteinander verknüpften /3-Lysinreste im Molekül. Der Nourseothricin-Komplex besteht zu etwa 90% zu annähernd gleichen Anteilen aus den beiden Hauptkomponenten F und D sowie zu etwa 10% aus den beiden Nebenkomponenten CC und E (Gräfe, U.; Bocker, H.; Reinhardt, G. und Thrum, H.: Regulative Beeinflussung der Nourseothricinbiosynthese durch o-Aminobenzoesäure in Kulturen des Streptomyces noursei JA 3890b. Zschr. Allgem. Mikrobiol. 14, 659 bis 673 (1974)). Der das Antibiotikum Nourseothricin bildende Streptomycetenstamm ist unter der Bezeichnung Streptomyces noursei ZIMET JA 3890b in der Stammsammlung des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR hinterlegt.The antibiotic nourseothricin isolated from the culture of a variant of Streptomyces noursei ATCC 11455 is active in vitro against Gram-positive and -negative bacteria and against mycobacteria (Bradler, G. and Thrum, H .: Nourseothricin A and B, two new antibacterial antibiotics of one Streptomyces Noursei variant, in general, Mikrobiol, 3, 105 to 112 (1963)). Nourseothricin is a base soluble in water and lower alcohols. Handleable forms are its salts. The molecule of nourseothricin (see Fig. 1) is composed of the amino sugar gulosamine and the amino acids streptolidine and ß- lysine. The individual components of nourseothricin differ in the number of peptide-like 'linked / 3-lysine residues in the molecule. The nourseothricin complex consists of about 90% of approximately equal proportions of the two main components F and D and about 10% of the two minor components CC and E (Gräfe, U .; Bocker, H., Reinhardt, G. and Thrum, H .: Regulatory influence on nourseothricin biosynthesis by o-aminobenzoic acid in cultures of Streptomyces noursei JA 3890b, Zschr., General Microbiol., 14, 659-673 (1974)). The streptomycete strain which forms the antibiotic nourseothricin is deposited under the name Streptomyces noursei ZIMET JA 3890b in the strain collection of the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy of the GDR Academy of Sciences.
Nach den aus der Literatur bekannten Verfahren (Bocker, H. und Thrum H.: Stimulation of nourseothricin production by aminobenzole acids. In: Herold, M. und Gabriel, Z.: Antibiotics — Adyances in research, production and clinical use. London 1966; p. 584 bis 587) erfolgt die Kultivierung unter aeroben Bedingungen. Hierzu wird an Erde lyophil getrocknetes Sporenmaterial dieses Streptomyces-Stammes auf geeignete Agarnährböden aufgebracht. Nach 6- bis 10tägiger Bebrütung bei 28 bis 300C wird der so gewachsene versporte Mycelrasen zum Beimpfen von flüssigen sterilen Nährmedien verwendet. Die Beimpfung kann auch direkt mit einer Konserve von lyophil an Gelatine getrockneten Submersmycel des Nourseothricinbildenden Streptomycetenstammes erfolgen.According to the methods known from the literature (Bocker, H. and Thrum H .: Stimulation of nourseothricin production by aminobenzenes acids., In: Herold, M. and Gabriel, Z .: Antibiotics - Adyances in research, production and clinical use, London 1966 p 584 to 587), the cultivation is carried out under aerobic conditions. For this purpose, lyophilically dried spore material of this Streptomyces strain is applied to soil on suitable agar media. After 6 to 10 days of incubation at 28 to 30 0 C of the thus grown sporulated Mycelrasen is used to inoculate sterile liquid culture media. The inoculation can also be carried out directly with a preservative of lyophilically dried gelatin submersed mycelium of Nourseothricin forming Streptomycetenstammes.
Die flüssigen Nährmedien für die submers Anzucht des Impfmaterials enthalten als Substrate Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze. Als Kohlenstoffquellen werden Glukose und/oder Glyzerin eingesetzt. Als Stickstoffquellen kommen insbesondere Sojamehl, verschiedene Aminosäuren und/oder Ammoniumsalze in Betracht. Die für die Anzucht des Impfmaterials günstigste Azidität zu Beginn der Kultivierung liegt im Bereich von pH 6,0 bis pH 6,7. Die Bebrütung erfolgt bei Temperaturen von 28 bis 30°C über einen Zeitraum von 24 bis 48 Stunden.The liquid nutrient media for the submerged growth of the inoculum contain as substrates carbon and nitrogen sources as well as inorganic salts. As carbon sources, glucose and / or glycerol are used. As nitrogen sources are in particular soybean meal, various amino acids and / or ammonium salts into consideration. The most favorable acidity for the growth of the seed material at the beginning of the cultivation is in the range of pH 6.0 to pH 6.7. The incubation takes place at temperatures of 28 to 30 ° C over a period of 24 to 48 hours.
Das so angezogene Impfmaterial dient zur Beimpfung von sterilen flüssigen Nährmedien für die Hauptkultur. Solche Nährmedien bestehen aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganischen Salzen. Als Kohlenstoffquelle werden Maisstärke und/oder Glukose eingesetzt. Als Stickstoffquelle kommen insbesondere Sojamehl, verschiedenen Aminosäuren und/oder Ammoniumsalze ir Betracht. Die für die Antibiotkumbildung günstigste Azidität zu Beginn der Fermentation liegt im Bereich von pH 6,0 bis 7,5. Die Kultivierung erfolgt bei Temperaturen von 26 bis 320C, vorzugsweise bei 2o bis 300C zu 150 Stunden.The inoculated material thus used is for inoculation of sterile liquid culture media for the main culture. Such nutrient media consist of carbon and nitrogen sources as well as inorganic salts. The carbon source used is corn starch and / or glucose. In particular, soybean meal, various amino acids and / or ammonium salts are considered as nitrogen source. The most favorable acidity for the formation of an antibiotic at the beginning of the fermentation is in the range of pH 6.0 to 7.5. The cultivation is carried out at temperatures of 26 to 32 0 C, preferably at 2o to 30 0 C for 150 hours.
Die submerse Kultivierung des Streptomyces noursei ZIMETJA 3890b erfolgt in bekannter Weise als Schüttkultur oder in gerührten und belüfteten Fermentoren ohneZudosierung von Substraten bzw. Regelung des pH-Wertes. Bekannt ist (Bradler, G. und Thrum, H.: Nourseothricin A und B, zwei neue antibakterieile Antibiotika einer Streptomycesnoursei-Variante. Zsch. Allgem. Mikrobiol. 3,105 bis 112 (1963)), daß die verhältnismäßig geringe Nourseothricin-Bildung auf dem ursprünglichen Fermentationsmedium durch Zusatz von Aminoarylkarbonsäuren, insbesondere von 5 bis 10mmol/l o-Aminobenzoesäure, zum Beginn der Hauptkultur zugesetzt, unter den bekannten technischen Bedingungen um das 5 bis 10fache gesteigert werden kann (Bocker, H. und Thrum, H.: Stimulation of nourseothricin production by aminobenzole acids. In: Herold, M. und Gabriel, Z.: Antibiotics — Advances in research, production and clinical use. London 1966, p.584 bis 587). Es ist aus eigenen Untersuchungen der Jahre 1974 bis 1980 (zusammenfassend zitiert in: Gräfe, U.; Steudel, A.; Bocker, H. und Thrum, H.: Regulative influence of o-aminobenzoic acid (OABA) on the biosynthesis of nourseothricin in cultures of Streptomyces noursei JA 3890b. V. Effect of OABA on cytochrom levels and amino acid transport. Zschr. Allgem. Mikrobiol.The submerged cultivation of Streptomyces noursei ZIMETJA 3890b is carried out in a known manner as a bulk culture or in stirred and ventilated fermentors without metering of substrates or control of the pH. It is known (Bradler, G. and Thrum, H .: Nourseothricin A and B, two new antibacterial antibiotics of a Streptomycesnoursei variant, Zsch., General Microbiol., 3, 105 to 112 (1963)) that the relatively low formation of nourseothricin on the original fermentation medium by addition of Aminoarylkarbonsäuren, in particular from 5 to 10mmol / l o-aminobenzoic acid added to the beginning of the main culture under the known technical conditions can be increased by 5 to 10 times (Bocker, H. and Thrum, H .: Stimulation of nourseothricin production by aminobenzole acids In: Herold, M. and Gabriel, Z .: Antibiotics - Advances in research, production and clinical use, London 1966, p.584 to 587). It is from own investigations of the years 1974 to 1980 (summarized in: Gräfe, U., Steudel, A., Bocker, H. and Thrum, H .: Regulatory influence of o-aminobenzoic acid (OABA) on the biosynthesis of nourseothricin in cultures of Streptomyces noursei JA 3890b V. Effect of OABA on cytochrome levels and amino acid transport.
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30,185 bis 194(1980)) bekannt, daß.o-Aminobenzoesäure und/oder andere Aminoarylkarbonsäuren spezifisch die Bildung von Cytochrom des a-Typs (Cytochrom-Oxydasen) reprimieren und dadurch indirekt sowohl den Aminosäuretransport aus dem Nährmedium in das Mycel als auch die oxydative Desaminierung der Aminosäuren in den Zellen des Nourseothricin-Bildners hemmen. Hierdurch wird einerseits eine Repression des Sekundärstoffwechsels durch ein zelluläres Überangebot an Stickstoff-Kataboliten vermieden. Andererseits wird auf diese Weise verhindert, daß als Precursoren des Nourseothricins dienende Aminosäuren des Mediums vom Antibiotikum-Bildner während dessen Wachstumsphase weitgehend aufgebraucht werden. Diese Aminosäuren sind somit dem Sekundärstoffwechsel im Verlaufe der Nourseothricin-Bildung besser verfügbar, da für die Biomassebildung bevorzugt die anorganische Stickstoffquelle (Ammonium-Stickstoff) genutzt wird. Die fermentative Nourseothricin-Produktion unter Verwendung von Aminoarylcarbonsäuren, die bekanntermaßen zwar eine wesentliche Steigerung der Fermentationsausbeute ermöglicht, weist jedoch insbesondere hinsichtlich der Kosten, der Sterilisation und der Abwasserproblematik Nachteile auf, die einer großtechnischen Anwendung entgegenstehen. Bekannt ist weiterhin, daß die Biosynthese der meisten Sekundärmetabolite durch überschüssiges Phosphat negativ beeinflußt wird (zusammenfassend zitiert in: Martin, J.F. und Demain, A. L.: Control of antibiotic biosynthesis. Microbiol. Rev. 44, 230 bis 251 [1980]). Deshalb werden technisch-mikrobielle Fermentationen zur Herstellung von Sekundärmetaboliten, zum Beispiel Antibiotika, bei für das Wachstum des Bildners suboptimalen Phosphatkonzentrationen durchgeführt. In der Regel werden komplexe Nährbodenbestandteile pflanzlicher und tierischer Herkunft, wie Stärke, Sojamehl, Maisquellwasser, Melasse, Fleischextrakt u.a., bei Fermentationen im technischen Maßstab zur Gewinnung von Sekundär-Metaboliten eingesetzt. Je nach Herkunft und Vorbehandlung besitzen solche komplexen Nährbodenbestandteile unterschiedliche Gehalte an Gesamtphosphat von unterschiedlicher biologischer Verfügbarkeit. Ein Teil des verfügbaren Phosphats liegt in den Fermentationsmedien als lösliches Phosphat vor. Dieser Umstand erschwert grundsätzlich die Standardisierung der Nährmedien.30,185 to 194 (1980)) that .o-aminobenzoic acid and / or other aminoarylcarboxylic acids specifically repress the formation of cytochrome a-type (cytochrome oxidases) and thereby indirectly both the amino acid transport from the nutrient medium into the mycelium and the oxidative Inhibit the deamination of the amino acids in the cells of the nourseothricin former. As a result, on the one hand repression of the secondary metabolism is avoided by a cellular oversupply of nitrogen catabolites. On the other hand, it is prevented in this way that serving as precursors of nourseothricin amino acids of the medium are largely used up by the antibiotic agent during its growth phase. These amino acids are thus better available to the secondary metabolism in the course of nourseothricin formation, since the inorganic nitrogen source (ammonium nitrogen) is preferably used for biomass formation. However, the fermentative nourseothricin production using aminoarylcarboxylic acids, which is known to allow a substantial increase in the fermentation yield, however, has disadvantages, especially in terms of cost, sterilization and wastewater problems, which preclude large-scale application. It is also known that the biosynthesis of most secondary metabolites is adversely affected by excess phosphate (cited in summary: Martin, J. F. and Demain, A. L .: Control of antibiotic biosynthesis, Microbiol, Rev. 44, 230 to 251 [1980]). Therefore, technical-microbial fermentations for the production of secondary metabolites, for example antibiotics, are performed at suboptimal phosphate concentrations for the growth of the generator. In general, complex nutrient components of plant and animal origin, such as starch, soybean meal, corn steep liquor, molasses, meat extract, etc., are used in fermentation on an industrial scale for the production of secondary metabolites. Depending on the origin and pretreatment, such complex nutrient medium components have different contents of total phosphate of different biological availability. Part of the available phosphate is present in the fermentation media as soluble phosphate. This fact makes it more difficult to standardize the nutrient media.
Die Anfangskonzentrationen an löslichen bzw. verfügbarem Phosphat haben aber eine entscheidende Bedeutung für die fermentative Ausbeute an dem angestrebten Sekundärmetabolit, weil einerseits eine bestimmte Phosphatmenge für das Wachstum der produzierenden Mikroorganismen erforderlich ist und zum anderen zu hohe Phosphat-Anfangskonzentrationen die Sekundärmetabolit-Bildung inhibieren.However, the initial concentrations of soluble or available phosphate have a crucial importance for the fermentative yield of the desired secondary metabolite, because on the one hand a certain amount of phosphate for the growth of the producing microorganisms is required and on the other hand to high initial phosphate concentrations inhibit the secondary metabolite formation.
Das Patent DD 155329 beansprucht die Verwendung der Konzentration der im Kulturmedium enthaltenen Phosphationen als Regelgröße zur Stabilisierung des Kultivierungsprozesses. Das Verfahren bezieht sich jedoch nur auf die fermentative Gewinnung von Biomasse, wobei der Sollwert der Konzentration im Bereich von 20 bis 60mg/l Phosphor einzustellen. Die Anwendung dieses Verfahrens auf die Regulation der Biosynthese von Sekundärmetaboliten in mikrowellen Batch-Kulturen ist nicht bekannt.The patent DD 155329 claims the use of the concentration of phosphate ions contained in the culture medium as a controlled variable for stabilizing the cultivation process. However, the method only relates to the fermentative recovery of biomass, adjusting the target value of the concentration in the range of 20 to 60 mg / l of phosphorus. The application of this method to the regulation of biosynthesis of secondary metabolites in microwave batch cultures is not known.
Bei der Verbesserung mikrobieller Herstellungsverfahren für die Produktion von Sekundärmetaboliten werden das Nährmedium und der produzierende Mikroorganismus durch wechselseitiges Modifizieren so aneinander angepaßt, daß ein Kompromiß zwischen den beiden gegenläufigen regulativen Einflüssen des Phosphats zustande kommt. Dieser Weg der stufenweisen Leistungssteigerung ist jedoch zeitaufwendig und kostenintensiv.In the improvement of microbial production processes for the production of secondary metabolites, the nutrient medium and the producing microorganism are adapted to each other by mutual modification in such a way that a compromise between the two opposing regulatory influences of the phosphate is achieved. However, this way of incremental performance increase is time consuming and costly.
Bekannt ist ferner, daß neben der regulativen Beeinflussung durch die Zusammensetzung des Nährmediums eine Verbesserung derfermentativen Ausbeute auch über eine Steuerung des Fermentationsprozesses, vorzugsweise als Echtzeitsteuerung, zu erreichen ist (Sukatsch, D. A. u. Nesemann, G.: Automatische Parametererfassung bei industriellen Fermentationen. Chemie-Technik 6, 261 [1977]).It is also known that, in addition to the regulative influence of the composition of the nutrient medium, an improvement of the fermentative yield can also be achieved by controlling the fermentation process, preferably as real-time control (Sukatsch, DA and Nesemann, G .: Automatic Parameter Recording in Industrial Fermentations -Technik 6, 261 [1977]).
Bei der für eine effektive Fermentationsführung erforderlichen Anwendung der Echtzeitsteuerung besteht die Schwierigkeit, auf die in der Fermentationstechnik etablierten, kontinuierlich meßbaren globalen Prozeßparameter, wie pH-Wert pO2-Wert, Dosierraten, Abgaszusammensetzung, Wärmebildung, anstelle der erst durch meist zeitaufwendige chemische Analytik nachträglich festzustellenden Substratkonzentrationen als primäre regulative Prozeßparameter ausweichen zu müssen.When required for effective fermentation procedure application of real-time control is the difficulty established on the in fermentation technology, continuously measurable global process parameters such as pH pO 2, metering, exhaust gas composition, heat generation, subsequently replacing the chemical only by the most time-consuming analysis To be detected substrate concentrations as the primary regulatory process parameters.
Die Erfindung hat das Ziel, den Wirkstoff Nourseothricin durch gezielte Prozeßführung der Fermentation in hoher Raum-Zeit-Ausbeute darzustellen.The invention aims to present the drug nourseothricin by targeted process control of the fermentation in high space-time yield.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein technisch günstiges Verfahren anzugeben, welches durch grenzwertlimitierte Prozeßführung und Verlängerung der Produktbildungsrate die industrielle Produktion von Nourseothricin mit hoher Raum-Zeit-Ausbeute der Fermentation ermöglicht.The invention is based on the object to provide a technically advantageous method, which allows by Grenzwertlimitierte process control and prolongation of the product formation rate, the industrial production of nourseothricin with high space-time yield of fermentation.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß im Zusammenhang mit einer unter vorgegebenen pH-Wert-Bedingungen im Bereich von 7,2 bis 8,2 geregelten Hitzesterilisation des Kulturmediums bei getrennter Sterilisation der Komponenten Glukose und Ammoniumsulfat die metabolischen Aktivitäten der Nourseothricin-bildenden Kulturen (Respiration, Glukosestoffwechsel, Stickstoffwechsel, Antibiotikumbildung) besonders effektiv beeinflußt werden sowie durch ratenlimitierte Substratdosierungen (Dosierung von außen bzw. Freisetzung der Substrate aus Nährstoffkomponenten) und Regelung des pH-Sollwertes im Bereich von pH 5,0 bis 6,5 während der Fermentation.Surprisingly, it has been found that, in connection with a heat sterilization of the culture medium controlled under given pH conditions in the range from 7.2 to 8.2 with separate sterilization of the components glucose and ammonium sulfate, the metabolic activities of the nourseothricin-producing cultures (respiration, glucose metabolism , Nitrogen changes, antibiotic formation) are particularly effectively influenced and by rate-limited substrate dosing (metering from the outside or release of the substrates from nutrient components) and control of the pH setpoint in the range of pH 5.0 to 6.5 during the fermentation.
Dabei ist von besonderer Bedeutung, daß während des gesamten Fermentationszeitraumes ein Kohlenstoff-Stickstoff-Konzentrationsverhältnis von 5 bis 15g Glukoseeinheiten/I zu 0,015 bis 0,2g Ammonium-Stickstoff/I nicht unterschritten wird.It is of particular importance that during the entire fermentation period, a carbon-nitrogen concentration ratio of 5 to 15 g glucose units / I to 0.015 to 0.2 g ammonium nitrogen / I is not exceeded.
Durch das vorgegebene Sterilisationsregime wird mit Beginn der Fermentation eine ratenlimitierte Phosphat-Phosphor-Freisetzung im Bereich von 0,1 bis 10mg/l vorzugsweise aus den komplexen Stickstoffkomponenten des Nährmediums gewährleistet. Dieser Konzentrationsbereich wirkt sich besonders günstig auf den zur Biosynthese des Antibiotikums notwendigen Stoffwechselverlauf (C:N) im genannten Konzentrationsverhältnis aus.Due to the prescribed sterilization regime, a rate-limited phosphate-phosphorus release in the range from 0.1 to 10 mg / l, preferably from the complex nitrogen components of the nutrient medium, is ensured at the beginning of the fermentation. This concentration range has a particularly favorable effect on the metabolism course (C: N) necessary for the biosynthesis of the antibiotic in the stated concentration ratio.
In engem Zusammenhang mit der effektiven metabolischen Aktivität während der Fermentation ist die pH-Sollwert-Regelung im Bereich von pH 5,0 bis 6,5 zu sehen.Closely related to the effective metabolic activity during fermentation, the pH set point control is seen in the range of pH 5.0 to 6.5.
Die für die Biosynthese des Antibiotikums erforderlichen und günstigen Stoffwechselverläufe werden in diesem Bereich besonders aktiviert.The favorable and favorable for the biosynthesis of the antibiotic metabolic processes are particularly activated in this area.
Zur Aufrechterhaltung des erforderlichen Glukose-Stickstoff-Konzentrationsverhältnisses ist es erforderlich bis zur Erreichung des physiologisch-optimalen pH-Wert-Bereiches Ammoniumsulfat zu dosieren.In order to maintain the required glucose-nitrogen concentration ratio, it is necessary to dose ammonium sulfate until the physiologically optimum pH range has been reached.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß das geeignete Sollwertintervall für die Regelung des pH-Wertes der Kulturlösung im Bereich physiologisch-regulativ effektive pH-Werte 5,0 bis 6,5 bei Zudosierung einer geeignet konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung eingestellt und damit gleichzeitig die Stickstoffkonzentration für das Glukose-Stickstoff-Konzentrationsverhältnis garantiert wird.Surprisingly, it has been found that the appropriate setpoint interval for regulating the pH of the culture solution in the range physiologically-regulatively effective pH 5.0 to 6.5 set when adding a suitably concentrated ammonium hydroxide and thus simultaneously the nitrogen concentration for the glucose-nitrogen Concentration ratio is guaranteed.
Gleichzeitig wird mit dieser Art der Prozeßführung die ratenlimitierte Phosphat-Phosphor-Freisetzung weiterhin gewährleistet.At the same time, the rate-limited phosphate-phosphorus release continues to be ensured with this type of process control.
Mit dieser Art der Prozeßregelung werden nach einer Fermentationszeit von 120 bis 140 Stunden bei einem Sauerstoffpartialdruck, pO2, im Bereich von 30 bis 80%, vorzugsweise 40%, biologische Aktivitäten von 8 bis 11 kg Nourseothricin pro Tonne Kulturlösung gebildetWith this type of process control, after a fermentation time of 120 to 140 hours at an oxygen partial pressure, pO 2 , in the range of 30 to 80%, preferably 40%, biological activities of 8 to 11 kg of nourseothricin per ton of culture solution are formed
Die Erfindung soll durch das nachfolgende Ausführungsbeispiel näher erläutert werden: The invention will be explained in more detail by the following embodiment:
Die Suspension einer Mycellyophilkonserve in physiologischer Kochsalzlösung eines Leistungsstammes von Streptomyces noursei dient als Inoculum für die LSubmerspassage.The suspension of a Mycellyophilkonserve in physiological saline solution of a performance strain of Streptomyces noursei serves as an inoculum for LSubmerspassage.
Das Nährmedium besteht aus (g/l) Glukose 15, Sojamehl 15, Kalziumkarbonat 1,0, Natriumchlorid 5,0, Kaliumdihydrogenphosphat 0,3, Leitungswasser ad 1 000 ml, pH 6,5 bis 6,9 (Abfüllung zu je 50ml in 500ml Schüttelkolben).The nutrient medium consists of (g / l) glucose 15, soya flour 15, calcium carbonate 1.0, sodium chloride 5.0, potassium dihydrogen phosphate 0.3, tap water ad 1 000 ml, pH 6.5 to 6.9 (50 ml each in 50 ml) 500ml shake flask).
Die Sterilisation des Mediums erfolgt bei 12O0C 35 Minuten.The sterilization of the medium takes place at 12O 0 C 35 minutes.
Nach 48stündiger Kultivierung bei 280C auf einer Rotationsschüttelmaschine wird die 2. Submerspassage (250ml Abfüllung, 2000ml Schüttelkolben) im Verhältnis von 1 Teil Inoculum zu 25 Teilen Nährmedium über 24 Stunden auf der Rotationsschüttelmaschine kultiviert.After 48 hours of culture at 28 0 C on a rotary shaker, the 2nd Submerspassage (250ml filling, 2000ml shake flask) in the ratio of 1 part inoculum to 25 parts of nutrient medium for 24 hours on a rotary shaker cultivated.
600ml der 2. Submerspassage werden für die Beimpfung von 800I Impffermentormedium verwendet.600ml 2nd Submerspassage are used for inoculation of 800I vaccine fermentation medium.
Das Nährmedium besteht aus (g/l) Glukose 15, Sojamehl 15, Kaliumdihydrogenphosphat 0,3, Natriumchlorid 5,0, Kalziumkarbonat 1,0, Antaphron 5,0, Sonnenblumenöl 37,5.The nutrient medium consists of (g / l) glucose 15, soybean meal 15, potassium dihydrogen phosphate 0.3, sodium chloride 5.0, calcium carbonate 1.0, Antaphron 5.0, sunflower oil 37.5.
Der pH-Wert wird vor der Sterilisation auf 7,4 eingestellt, er beträgt nach der Beendigung der Sterilisation 6,8 bis 7,0. Die Sterilisation erfolgt bei 1200C 60 Minuten.The pH is adjusted to 7.4 before sterilization, it is 6.8 to 7.0 after completion of sterilization. Sterilization takes place at 120 ° C. for 60 minutes.
Nach ca 30 Stunden Kultivierung bei 28°C werden ca 60mg/l lösliches Phosphat verbraucht und dabei 12 bis 15g/l Biomasse gebildet.After about 30 hours cultivation at 28 ° C about 60mg / l of soluble phosphate consumed and thereby 12 to 15g / l biomass formed.
Die Inoculummenge von 800I ist ausreichend für die Beimpfung von ca 18m3 Produktionsmedium der Hauptkultur.The inoculum amount of 800I is sufficient for the inoculation of about 18m 3 production medium of the main culture.
Das Nährmedium des Produktionsfermentors besteht aus (g/l) Kartoffelstärke 32,0, Sojamehl 15,0, Natriumchlorid 1,0, Kalziumkarbonat 6,0, Zinksulfat 0,5, Magnesiumsulfat 2,0, Sonnenblumenöl 3,0, Antaphron 0,3, Glukose von 10 bis 35, Ammoniumsulfat 2 bis 11.The nutrient medium of the production fermentor consists of (g / l) potato starch 32.0, soybean meal 15.0, sodium chloride 1.0, calcium carbonate 6.0, zinc sulfate 0.5, magnesium sulfate 2.0, sunflower oil 3.0, Antaphron 0.3 , Glucose from 10 to 35, ammonium sulfate from 2 to 11.
Die Komponenten Glukose und Ammoniumsulfat werden nach separater Sterilisation (120°C, 30 Minuten) dem Nährmedium zugeführt.The components glucose and ammonium sulfate are fed to the nutrient medium after separate sterilization (120 ° C, 30 minutes).
Die Sterilisation des Mediums erfolgt bei 1150C 60 Minuten, wobei vor Beginn ein pH-Wert von 7,8 eingestellt wird, der nach Beendigung der Sterilisation Werte zwischen 7,2 bis 8,2 erreicht.The medium is sterilized at 115 ° C. for 60 minutes, with a pH of 7.8 being set before starting, which reaches values between 7.2 to 8.2 after sterilization has ended.
Das komplettierte Medium erreicht pH-Wert zwischen 7,0 bis 7,4. Die Fermentation erfolgt bei 28°C mit einem Belüftungsverhältnis von 0,3:1 (m3 Luft:m3 Kulturlösung von 60%.The completed medium reaches a pH between 7.0 to 7.4. The fermentation is carried out at 28 ° C with a ventilation ratio of 0.3: 1 (m 3 air: m 3 broth of 60%.
Bei Unterschreitung der Grenzwerte für Glukose 5g/l und Ammoniumstickstoff 0,2 g/l werden diese Komponenten als 50%ige sterile Lösungen zudosiert, bis die Kulturlösung einen pH-Wert von 5,2 bei einem Ammoniumstickstoffwert über 300 mg/l erreicht.If the limit values for glucose 5 g / l and ammonium nitrogen are below 0.2 g / l, these components are metered in as 50% sterile solutions until the culture solution reaches a pH of 5.2 with an ammonium nitrogen value above 300 mg / l.
Die weitere Ammoniumstickstoffzugabe erfolgt über die Dosierung von Ammoniakwasser bei konstanten pH-Wert von 5,5.The further ammonium nitrogen addition takes place via the dosage of ammonia water at a constant pH of 5.5.
Nach einer Fermentationszeit von 130 Stunden wird eine biologische Aktivität von 8000-11 OOOug Nourseothricin/ml Kulturlösung gebildet.After a fermentation time of 130 hours, a biological activity of 8000-11000ug nourseothricin / ml of culture solution is formed.
Claims (3)
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Family Applications (1)
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