DD249713A1 - Verfahren zur herstellung von nourseothricin - Google Patents

Abstract

Es wird ein fermentatives Nourseothricin-Herstellungsverfahren beschrieben, das sich von herkoemmlichen Verfahren dadurch unterscheidet, dass im Medium keine organischen Stickstoffquellen enthalten sind und hohe Phosphatanfangskonzentrationen keinen negativen Einfluss auf die Antibiotikumsynthese ausueben. Ein spezielles Sterilisationsverfahren ist nicht mehr notwendig.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Nourseothricin, einem Antibiotikum der Streptothricingruppe. Das Antibiotikum hat als Futterzusatz für landwirtschaftliche Nutztiere eine ergotrope Wirkung und besitzt demzufolge eine große ökonomische Bedeutung für die Landwirtschaft und für die mikrobiologische Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Nourseothricin ist ein aus der Kultur von Streptomyces noursei JA3890 b isoliertes Antibiotikum mit einem Wirkungsspektrum gegen grampositive und gramnegative Bakterien sowie Mycobakterien und hat antivirale Eigenschaften (BRADLER, G. und H.THRUM, 1963: Nourseothricin A und B, zwei neue antibakterielle Antibiotica einer Streptomyces noursei-Variante. Z. AiIg.

Mikrobiol. 3,105-112).

Nourseothricin ist ein Gemisch der Streptothricine F, D, G und F(GRAFE, U., H. BOCKER, G.REINHARD und H.THRUM, 1974:

Regulative Beeinflussung der Nourseothricinbiosynthese durch o-Aminobenzoesäure in Kulturen des Streptomyces noursei JA3890b. Z. AIIg. Mikrobiol. 14,659-673).

Der Einsatz von Inhibitoren der Atmungskette sowie Hemmstoffen des Aminosäuretransportes als Effektoren zur Erhöhung der Fermentationsausbeute ist bereits beschrieben worden.

Die Herstellung von Nourseothricin bei Verwendung polymerer C-Quellen und dafür geeigneter Selektanten auch ohne Verwendung von Inhibitoren der Atmungskette bzw, des Aminosäuretransports ist bereits vorgeschlagen worden, ebenso modifiziertes Nourseothricin-Herstellungsverfahren, bei dem durch Aufrechterhaltung eines bestimmten Glucose-Ammonium-Verhältnisses im Medium die NTC-Biosynthese fördernd beeinflußt wird.

In einer weiteren Patentanmeldung wird ein Herstellungsverfahren angegeben, welches durch Beeinflussung des Phosphatstoffwechsels (spezielle Sterilisation im alkalischen Milieu und Phosphat-Zufütterung) höhere Ausbeuten gestattet, und schließlich wird in einer anderen Patentanmeldung eine Steuerungsstrategie der Fermentationsführung beschrieben.

Nachteilig ist in allen diesen genannten Herstellungsverfahren die Verwendung organischer Stickstoffquellen, die entweder als komplexe Nährbodenbestandteile, ζ. B. Sojaextraktionsschrot oder Erdnußextraktionsschrot oder als Aminosäure bzw. Aminosäuregemische zugesetzt werden. In der Literatur wird die Verwendung von organischen Stickstoffquellen in technischen Fermentationen als unabdingbar zur Erreichung hoher Produktausbeuten erachtet. Es wird akzeptiert, daß nur mit diesen N-Substraten eine wirtschaftliche Antibiotika-Biosynthese erreicht werden kann (MARTIN, J. F. and L. E. MCDANIEL, 1974: The submerged culture production of the polyene antifungal antibiotics candidin and candihexin. Dev. Ind. Microbiol. 15, 324-337.

AHARANOWITZ, Y., 1980: Nitrogen metabolite regulation of antibiotic biosynthesis. Ann. Rev. Microbiol. 34, 209-233 und BORMANN, E. J., A. CHRISTNER and I. RÜCKBEIL, 1980: Investigations on substrate kinetics in antibiotic-forming Streptomyces.

In „Proc. 7 th Symp. Prague on Continuous Cultivation of Microorganisms" eds. SIKYTA, B., Z. FENCL and V. POLACEK, Czechoslovak Academy of Scieces, Praha, pp. 731-737).

Bei den erwähnten Herstellungsverfahren für Nourseothricin wird kein anorganisches Phosphat dem Fermentationsmedium vor der Beimpf u ng zugesetzt. Das durch hydrolytische Prozesse, insbesondere während der Sterilisation, freigesetzte Phosphat wird hierbei durch Zusatz von phosphatfällenden Kationen und eine spezielle Sterilisationsführung im alkalischen Milieu weitgehend festgelegt.

Bei den hier erwähnten Verfahren wirkt sich weiterhin die hohe Empfindlichkeit der Nourseothricin-Biosynthese gegenüber hohen Phosphatanfangskonzentrationen (MÜLLER, P. J., G.HAUBOLD, M.MENNER, H.H.GROSSE, J.H.OZEGOWSKI and

H. BOCKER, 1984: Effect of phosphate on the biosynthesis of nourseothricin by Streptomyces noursei JA3890b. Z. al Ig.

Mikrobiol. 24, 555-564), die nur durch die Anwendung eines speziellen Sterilisationsverfahrens und/oder durch die Anwesenheit von Effektoren aufgehoben wird, nachteilig aus.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung beinhaltet das Ziel, Nourseothricin auf hinreichend effektive Weise herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

DerErfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein ökonomisch und technisch günstiges Verfahren zur Herstellu ng des Antibiotikums Nourseothricin anzugeben, bei dem keine organischen Stickstoffquellen verwendet werden.

Überraschend wurde gefunden, daß bei Verwendung eines Mineralsalzmediums hohe Produktausbeuten möglich sind.

Außerdem wurde gefunden, daß die hohe Empfindlichkeit der Nourseothricin-Biosynthese gegenüber hohen Phosphatanfangskonzentrationen nicht auftritt, sondern die kritischen Phosphat-Schwellkonzentrationen wesentlich höher liegen. Damit ist es dem Verfahren nicht abträglich, die Phosphat-Anfangskonzentrationen erheblich heraufzusetzen. Eine Hitzesterilisation im alkalischen Milieu ist somit nicht mehr erforderlich. Vor der Hitzesterilisation ist erforderlichfalls die Reaktion des Mediums auf den Bereich zwischen p_H5,5 bis 6,5 einzustellen.

Gleichzeitig vereinfacht die Verwendung der hier genannten Medien, die bei Ende der Fermentation keine partikulären Bestandteile außer der Biomasse enthalten, die Aufarbeitung durch Wegfall von Ballast und Verbesserung der Fließfähigkeit.

Dadurch wird die Herstellung des bentonithaltigen NTC-Myzeladsorbates effektiver.

Im Ergebnis dieser Befunde wird das beschriebene Verfahren wie folgt durchgeführt:

Vegetatives Impfmaterial bei Nourseothricin-Bildners, welches aus Mycel-Konserven in an sich bekannter Art und Weise in mehreren Vorkulturstufen angezüchtet worden ist, dient zur Beimpfung des Fementationsmediums.

Im Verlaufe einer 72- bis 144stündigen Fermentation unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen zwischen 28 und 32°C, sowie bei Konstanthaltung der Acidität der Kulturlösung zwischen Ph5,0 und 7,0 wird eine hohe Konzentration von Nourseothricin in der Kulturlösung erreicht.

Als Fermentationsmedium dient ein Mineralsalzmedium, das als Stickstoffquellen anorganische Ammoniumsalze und/oder Ammoniaklösung enthält, wobei diese am Fermentationsbeginn zugesetzt und/oder diskontinuierlich oder kontinuierlich während des Fermentationsprozesses in die Kulturlösung gegeben werden. Als Phosphatquellen dienen anorganische lösliche Phosphate, die in voller Menge am Fermentationsbeginn in das Medium gegeben werden und/oder diskontinuierlich oder kontinuierlich dem Medium während der Fermentation zugesetzt werden. Die Hitzesterilisation dieses Mineralsalzmediums erfolgt im Bereich zwischen p_H5,5 und 6,5.

Die Isolation des Wirkstoffes und dessen Reinigung erfolgt in an sich bekannter Weise auf adsorptivem Wege oder durch Fällung.

Im weiteren Ausbau des Verfahrens werden als Stickstoffquelle anorganische Ammoniumsalze und/oder Ammoniaklösung verwendet. Als Phosphatquellen dienen dabei anorganische lösliche Phosphate.

Ausführungsbeispiel

In einigen Ausführungsbeispielen soll die Erfindung näher erläutert werden.

1. Aus einer Mycelkonserve des Streptomyces noursei JA3890b Stamm BF32-Is werden Vorkulturen angelegt. Diese enthalten in 2,51-Steilbrustflaschen jeweils 400 ml des Anzuchtmediums mit folgender Zusammensetzung (g/l): Glucose 15, Sojaextraktionsschrot 15, KH₂PO₄ 0,3, NaCI 5, CaCO₃ 1. Der p_H-Wert wird vor der Sterilisation auf 6,5 eingestellt, die Sterilisation erfolgt 35 Minuten bei 121⁰C. Zwei Schüttelflaschen werden mit je 0,5 ml einer mit 4 ml physiologischer NaCI-Lösung aufgeschwemmten Konserve beimpft und 48 Stunden bei 27°C auf einem Rundschwingtisch kultiviert. 600 ml dieser Vorzucht werden zu einem Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung gegeben (Angaben in g/l Kulturlösung): Glucose 50, (NH₄I₂SO₄O₁O, NaCI 2,0, KCI 2,0, KH₂PO₄0,800, CaCO₃1,0, FeCl₃ 6H₂O 0,005, MgSO₄ · 7 H₂O 0,250, MnSO₄ 2 H₂O 0,02 und Polypropylenglycol 0,500. Glucose wird separat sterilisiert. Die übrigen Nährbodenbestandteile werden im Fermentationsgefäß in situ bei 121⁰C 35 Minuten sterilisiert. Der p_H-Wert beträgt vor der Sterilisation 5,8, danach 6,2. Die Kultivierung erfolgt in einem dampfsterilisierbaren Eigenbaufermenter mit 6I Arbeitsvolumen. Die Glucoselösung wird unmittelbar vor der Beimpfung zugegeben, der p_H-Wert mit 12,5%iger Ammoniaklösung auf 6,5 eingestellt und während der Fermentation automatisch mit 12,5%iger Ammoniaklösung auf diesem Niveau gehalten. Die Fermentation erfolgt bei 29°C, die Rührerdrehzahl beträgt anfangs 800 Umdrehungen pro Minute, die Belüftungsrate 1 Liter Luft pro Liter Fermentationsvolumen pro Minute. Während der Kultivierung werden folgende Parameter erfaßt und registriert: p_H, Po₂, Temperatur.

Von der 4. bis zur 30. Fermentationsstunde wird eine wäßrige, sterile KH₂PO₄-Lösung kontinuierlich mit eine Rate von 3,5mg P/Liter und Stunde zugepumpt. Zur Vermeidung von Kohlenstoffümitationen wird diskontinuierlich wäßrige, sterile Glucoselösung in drei Portionen zu je 50 g Glucose pro Liter Fermentationsvolumen zur 48.,72. und 96. Stunde zugegeben. Die Drehzahl des Rüherers und die Belüftungsrate werden in Abhängigkeit vom Sauerstoffpartialdruck schrittweise auf 1 400 Umdrehungen pro Minute bzw. 2,51 Luft pro Liter Fermentationsvolumen und Minute erhöht. Im Abstand von 8 Stunden werden steril Proben entnommen und auf den Gehalt an Glucose, Ammoniumstickstoff und säurelöslichem Phosphat analysiert. Gleichzeitig werden die Nourseothricingehalt mittels des Lochplattendiffusionstests und die Biomasse (gravimetrisch) bestimmt. Es ergaben sich folgende Produktausbeuten: nach 96 Stunden 7,99g/l und nach 120 Stunden 11,7 g/l Nourseothricin.

2. Die Vorkultivierung erfolgt wie unter 1. beschrieben. 600ml dieser Vorzucht werden zu einem Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung (g/l Fermentationslösung) gegeben: Maisstärke 150, Glucose 10, (NH₄I₂SO₄ 6,5, KH₂PO₄ 0,800, NaCI 2,5, KCI 2,5, CaCO₃ 1,0, FeCI₃ · 6H₂O 0,005, MgSO₄ 7H₂O, MnSO₄ · 2H₂O 0,02 und Polypropylenglycol 0,500. Glucose wird separat sterilisiert. Zur Verflüssig u ng des hohen Anteils der polymeren Kohlehydratquel Ie ecfolgt deren Hydrolyse durch einstündige Einwirkung von Brauerei-Enzym (3g/100g Stärke) bei 65 bis 70°C unter Rührung und Belüftung. Das Fermentationsmedium (ohne Glucose) wird 35 Minuten bei 121⁰C im Fermenter mit Dampf sterilisiert. Der p_H-Wert wird vor der Sterilisation auf 5,6 eingestellt, danach betrug er 6,2. Die Kultivierung erfolgt in einem Eigenbaufermenter mit 6I Arbeitsvolumen. Unmittelbar vor der Beimpfung wird die Glucoselösung zugegeben und der pn-Wert mit 12,5%iger Ammoniaklösung auf 6,5 eingestellt und während der Fermentation vermittels dieser automatisch auf diesem Niveau gehalten. Die Kultivierung erfolgt bei 29°C, die Rührerdrehzahl beträgt anfangs 800 Umdrehungen pro Minute, die Belüftungsrate anfangs 1 Liter Luft pro Liter Fermentationsvolumen und Minute, nach 20 Stunden wird die Drehzahl auf 1 200/min und die Belüftungsrate auf 2 l/l min erhöht. Nach 28 Stunden erfolgt eine weitere Erhöhung auf 1400/min und 3 l/l min. Im Verlauf der Fermentation wird zugegeben: zur 24. Stunde 20 mg P/l, zur 44. Stunde 10mg P/l und von der 48. bis zur 96. Stunde kontinuierlich 5 mg P/l h in Form wäßriger, steriler KH₂PO₄-Lösungen. Während der Kultivierung werden erfaßt und registriert: Ph, Po₂ und Temperatur. Im Abstand von 8 Stunden werden unter sterilen Bedingungen Proben entnommen und aus diesen bestimmt: Nourseothricingehalt, Biomasse, Stärkegehalt, Glucosegehalt, Ammoniumstickstoff und säurelösliches Phosphat. Es ergaben sich folgende Ausbeuten: nach 48h 4,8g/l, nach 96h 7,18g/l und nach 112h 7,93g/l Nourseothricin.

3. Die Vorkultivierung erfolgt wie unter 1. beschrieben. 600 ml dieser Vorzucht werden zu einem Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung (Angaben in g/l Fermentationslösung) gegeben: Maisstärke 150, Glucose 10, (NH₄I₂SO₄ 6,5, KH₂PO₄OJOO, NaCI 2,5, KCI 2,5, CaCO₃ 1,0, FeCI₃ · 6H₂O 0,005, MgSO₄ · 7H₂O 0,250, MnSO₄ 2H₂O 0,02 und Polypropylenglycol 0,500. Die Maisstärke wird wie unter 2. beschrieben anhydrolysiert. Die Kultivierung erfolgt in einem Eigenbaufermenter mit 6I Arbeitsvolumen. Der p_H-Wert beträgt vor der Sterilisation 5,9, danach 6,2. Die Sterilisation erfolgt mittels Direktdampf bei 121⁰C und einer Dauer von 35 Minuten. Unmittelbar vor der Beimpfung wird der pH-Wert auf 6,5 mit 12,5%iger Ammoniaklösung eingestellt und mittels dieser im Verlauf der Fermentation automatisch auf diesem Niveau gehalten.

Die Kultivierung erfolgt bei 29⁰C, die Rührerdrehzahl beträgt anfangs 600 Umdrehungen pro Minute, nach 4 Stunden wird sie auf 800/min erhöht, nach 24 Stunden auf 1 000/min und nach 48 Stunden auf 1 200/min. Die Belüftungsrate beträgt anfangs 1 Liter Luft pro Liter Fermentätionslösung und Minute, nach 32 Stunden wird sie auf 2I/I · min erhöht und nach 56 Stunden auf 2,5l/l · min. Während der Fermentation wird kontinuierlich als wäßrige, sterile KH₂PO₄-Lösung zugegeben: von der 4. bis 24. Stunde 4mg P/l h, von der 24. bis 72. Stunde 1,5mg P/l h und von der 72. bis 120. Stunde 0,5mg P/l h. Während der Kultivierung werden erfaßt und registriert: p_H, Po₂ und Temperatur. Im Abstand von 8 Stunden werden steril Proben gezogen und auf die unter 2. angegebenen Parameter untersucht. Es ergab sich nach 144stündiger Fermentation ein Nourseothricingehalt von 11,1 g/l.

4. Je ein ml mit physiologischer Kochsalzlösung (4ml) aufgeschwemmten MycelkonservedesS. noursei JA3890b Stamm BF32-2cdientzur Beimpf ung zweier Schüttelf laschen mit 2,51 Bruttovolumen und einem Inhalt von je 400 ml einer Nährlösung folgender Zusammensetzung: je Liter Leitungswasser Glucose 15g, Sojaextraktionsschrot 15g, KH₂PO₄ 0,3g, NaCI 5g, CaCO₃ 1 g. Der p_H-Wert der Lösung wird'vor der Sterilisation auf 6,5 bis 6,8 eingestellt. Die Sterilisation erfolgt 30 Minuten bei 121 ⁰C. Die Flaschen werden 48 Stunden bei 27⁰C bebrütet. Der vereinigte Inhalt dieser ersten Vorzuchten dient zur Beimpfung eines 250I Nährlösung dergleichen Zusammensetzung wie in der ersten Vorzucht. Die Kultivierung erfolgt über 36 Stunden bei 29⁰C bei einer Drehzahl von 240 Umdrehungen pro Minute und einer Belüftungsrate von 0,5 VVM.

25 Liter dieser Impfkultur dient als Inokulum für 500I Nährlösung folgender Zusammensetzung (g/l): Maisstärke 65, Glucose 10, (NH₄I₂SO₄6,5, KH₂PO₄0,100, NaCI 2,5, KCI 2,5, CaCO₃1,0, FeCI₃- 6H₂O 0,005, MgSO₄ · 7H₂O 0,250, MnSO₄ · 2H₂O 0,02 und Polypropylenglycol 0,500. Derp_H-Wert beträgt vor der Sterilisation 6,25, danach 6,50, danach 6,50. Zur Verflüssigung des Stärkeanteils wird Brauereienzym, wie in Beispiel 2. ausgeführt, zugegeben. Die Sterilisation erfolgt mit Direktdampf bei 121⁰C über 35 Minuten.

Die Kultivierung wird in einem gerührtem und belüfteten Edelstahlfermenter bei 29°C, einer Drehzahl von 320 Umdrehungen pro Minute und einer Belüftungsrate von 0,5VVM (bis zur 6. Stunde), 1VVM (6. bis 12. Stunde) und 1,5VVM (12. Stunde bis Ende der Fermentation) durchgeführt. Nach der Beimpf ung wird der pH-Wert mit 25%iger Ammoniaklösung auf 6,7 eingestellt und nach Erreichen von 6,50 automatisch mit eben dieser auf diesem Niveau gehalten. Während der Fermentation herrscht ein Überdruckvon0,04MPa.lm Verlaufe der Fermentation werden zug eg eben: in der 8., 16., 24. und 32. Stun de jeweils 15 mg P/l, in der 36., 48. und 60. Stunde jeweils 10 mg P/l und in der 72. und 96. Stunde jeweils 5 mg P/l in jeweils 1 Liter wäßriger, steriler KH₂PO₄-Lösung.

Im Verlaufe der Fermentation werden erfaßt und registriert: p_H und Temperatur. Im Abstand von 8 Stunden werden Proben gezogen und aus diesem bestimmt: Nourseothricingehalt, Biomasse, Stärkegehalt, Glucose, Ammoniumstickstoff und säurelösliches Phosphat. Es ergaben sich folgende Ausbeuten: nach 100 Stunden 5,94g/l und nach 124 Stunden 8,84g/l Nourseothricin.

5. Die Vorkultivierung erfolgt wie unter 1. beschrieben. 600 ml dieser Vorzucht werden zu einem Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung gegeben (Angaben in g/l Kulturlösung): Maisstärke 150, Glucose 5, (NH₄J₂SO₄ 6,5, KH₂PO₄ 0,080, NaCI 2,5, KCI 2,5, CaCO₃ 1,0, FeCI₃ 6H₂O 0,005, MgSO₄ 7 H₂O 0,250, MnSO₄ 2 H₂O, 0,020 und PolypropylenglycolO,500. Zur Verflüssigung des hohen Anteils der polymeren Kohlenhydratquelle erfolgt deren Hydrolyse wie unter 2. beschrieben. Das Fermentationsmedium wird 35 Minuten bei 121 °C im Fermenter mit Dampf sterilisiert. Der p_H-Wert wird vorder Sterilisation mit 25%iger Schwefelsäure auf 5,6 eingestellt. Die Kultivierung erfolgt in einem Eigenbaufermenter mit 6I . Arbeitsvolumen. Unmittelbar vor Beimpfung wird derp_H-Wert, der nach der Sterilisation bei 6,2 liegt, mit 12,5%iger Ammoniaklösung auf 6,5 eingestellt und während der Fermentation vermittels dieser automatisch auf diesem Wert gehalten. Die Kultivierung erfolgt bei 29⁰C, die Drehzahl des dreistufigen Rührers beträgt anfangs 400 min"¹, die Belüftungsrate anfangs 1 Liter Luft pro Liter Fermentationsvolumen und Minute, nach 24 Stunden wird die Drehzahl auf 750 min"¹ erhöht, nach 32 Stunden auf 900 min"¹ und die Belüftungsrate auf 21/1 min, nach 48 Stunden auf 1 200 min"¹ und 2,51/1 min. Von der 8. bis zur 24. Fermentationsstunde wird eine wäßrige sterile KH₂PO₄-LOSung kontinuierlich mit einer Rate von 1 mg P/l h und von der 73. bis zur 120. Stunde mit einer Rate von 0,25 mg P/l h. Zur 56. Stunde werden 1 325g Maisstärke, die in 800 ml Wasser

angemaischt werden und 3 Stunden unter der Einwirkung von 64g Brauereienzym bei 70⁰C unter Rühren hydrolysiert, anschließend 35 Minuten bei 121⁰C im Autoklaven sterilisiert werden, zugegeben. Die Rührerdrehzahl wird danach auf 1400 min"¹ erhöht. Während der Fermentation werden erfaßt und registriert: p_H, ρ_θ2, Temperatur. Im Abstand von 8 Stunden werden unter sterilen Bedingungen Proben entnommen und auf Nourseothricingehalt, Biomasse, Stärkegehalt, Glucosegehalt, Ammoniumstickstoffgehalt und säurelösliches Phosphat untersucht.

Es ergeben sich folgende Ausbeuten: nach 120 Stunden 34,7 g/l Nourseothricin, nach 144 Stunden 52,8g/l Nourseothricin. Im Vergleich dazu ergibt unter den oben genannten Fermentationsbedingungen eine Kultivierung in einem Medium, bestehend aus (Angaben in g/l Kulturlösung) Kartoffelstärke 32, Glucose 29, Sojaextraktionsschrot 11, Ammoniumsulfat 11, MgSO* 7H₂O 2, NaC11, CaCO₃ 6 und ZnSO₄ 7 H₂O 0,5 ohne Phosphatdosierung und ohne sonstige Nährstoff nachführung nach 120 Stunden 8,8g/l Nourseothricin

Vorteile des Verfahrens

Die komplexe organische Stickstoffquelle, wie z. B. Sojaextraktionsschrot, wird durch in der DDR produzierte Salze substituiert. Außerdem wird Verfahren vereinfacht und besser reproduzierbar, das Soja-Extraktionsschrot qualitativen Schwankungen unterliegt, die sich aus dessen Natur als pflanzliches Produkt sowie dessen Vorbehandlung ergeben. Durch den Wegfall störender Ballaststoffe kann eine Vereinfachung der Aufarbeitung, z.B. durch chemische Fällung, erreicht werden.

Claims (3)

1. Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Herstellung von Nourseothricin unter submersen aeroben Kulturbedingungen mit geeigneten Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphatquellen sowie ausrechenden Konzentrationen von Mineralsalzen, gekennzeichnet dadurch, daß die Kultivierung im Mineralsalzmedium für die Dauervon 72 bis 144 Stunden bei einer Temperatur von 28°C bis 32⁰C bei Konstanthaltung der Acidität der Külturlösung im Bereich von Ph5,0 bis 7,0 erfolgt, anorganische Stickstoffquellen am Fermentationsbeginn zugesetzt und Ammoniaklösung und/oder anorganischen Ammoniumsalze diskontinuierlich oder kontinuierlich während des Fermentationsprozesses in die Kulturlösung gegeben werden, anorganische Phosphatquellen in voller Menge am Fermentationsbeginn in das Medium eingegeben werden und/oder diskontinuierlich oder kontinuierlich während des Fermentationsprozesses dem Kulturmedium zugefügt werden und die Hitzesterilisierung zwischen Ph 5,5 und 6,5 erfolgt.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Stickstoffquelle anorganische Ammoniumsalze und/oder Ammoniaklösung verwendet werden.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Phosphatquellen anorganische lösliche Phosphate verwendet werden.