DD241916A1

DD241916A1 - Verfahren zur gewinnung von biomasse

Info

Publication number: DD241916A1
Application number: DD28189985A
Authority: DD
Inventors: Karin-Dagmar Wendlandt; Reinhard Paetz; Angelika Wandt; Horst Skrowny; Edda Bruehl; Michael Heine; Monika Hubald
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-10-21
Filing date: 1985-10-21
Publication date: 1987-01-07

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Biomasse durch Kultivierung von Hefen oder Hefen und Bakterien auf der Basis von niedermolekularen Kohlenhydraten, Fettsaeuren, Alkoholen und Aldehyden als Einzel- oder Kombinationssubstrate. Die Erfindung gehoert in das Gebiet der mikrobiologischen Eiweissgewinnung. Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zur Gewinnung von Biomasse zu entwickeln, das eine stabile Prozessfuehrung unter unsterilen Bedingungen bei Einsatz verschiedener Kohlenstoffquellen, vorzugsweise Essigsaeure enthaltender Substrate, ohne Anwendung von Wuchsstoffen, bei wahlweise hohen extrazellulaeren Konzentrationen der Kohlenstoffquelle mit hohen Produktivitaeten ermoeglicht. Es wurde gefunden, dass diese Zielstellung realisiert werden kann, wenn die Hefestaemme H 196 - ZIMET 43 735 und H 197 - ZIMET 43 736 einzeln oder im Gemisch, auch zusammen mit anderen Kohlenstoff-/Mikroorganismenkombinationen, kontinuierlich unter unsterilen Bedingungen bei einer Temperatur vorzugsweise von 32C bis 38C und einem p H-Wert vorzugsweise von 4,4 bis 5,5 kultiviert werden. Als Kohlenstoffquellen koennen neben reinen Substraten auch landwirtschaftliche und industrielle Abprodukte, wie Guelle, Maisquellwasser, Silisickersaft, Gruenfutterpresssaft, Melasse, Bruedenfett u. a. eingesetzt werden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung gehört in das Gebiet der mikrobiologischen Eiweißgewinnung.

Die Erfindung kann eingesetzt werden in Anlagen, in denen flüssige Kohlenstoffquellen mit Hilfe von Hefen mikrobiologisch umgesetzt werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen insbesondere Hefen, auf der Grundlage von flüssigen Kohlenstoffquellen, z. B.

Essigsäure, sind bekannt.

Dabei werden in der überwiegenden Mehrheit Hefen der Gattung Canida utilis eingesetzt. Diese Hefen werden in der Regel bei 30°C bis 38⁰C, pH = 3,5 bis 5,5 kultiviert, sie zeichnen sich durch eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit aus. Nachteilig beim Einsatz dieser Hefen ist ihre relativ große Empfindlichkeit gegenüber extrazellulären Axetatkonzentrationen. Bei niedrigen pH-Wert (pH = 4) ist zwar die Assimilationsgeschwindigkeit der Essigsäure größer als bei hohem pH-Wert (pH = 6), aber gleichzeitig nimmt die Toleranz gegenüber der Essigsäurekonzentration im Fermentationsmedium ab (D. PÖHLAND,

M. RINGPFEIL, U. BEHRENS, Zeitschr. Allgemein. Mikrobiol. 6 [1966], 387-95). So wurde z. B. bei einer Absenkung des pH-Wertes von 6,8 auf 4,5 eine Erhöhung der Wachstumsgeschwindigkeit um 23% festgestellt, aber die Ausbeuten sanken um 18%, wenn die Acetatkonzentration von nahezu Null auf ca. 2 g/l erhöht wurde, bei 5g/l Acetat im Medium betrug die Verringerung der Ausbeute 36% (M.RYCHTERA, V.GREGR, Contin. Cultiv. Microorganisms, Proc. 7th Symp. Prague, July 10 bis 14,1978; Prague 1980). Auch auf andere Hefen wirkt die nichtutilisierte Essigsäure stark toxisch. Das Wachstum von Saccharomyces ellipsoideus wird bei einer Konzentration von 10g/l Essigsäure vollständig inhibiert (W. V. GRUESS, Advances Enzymol. 3 [1943], 349 bis 386).

Bei Candida methanolica und Torulopsis methanolvescens werden den starke Abhängigkeiten der Länge der Lagphasen in diskontinuierlichen Prozessen von der Anfangskonzentration an Acetat festgestellt: bei 18 bis 20g/l Acetat in der Kulturflüssigkeit betrug die Länge der Lagphase 12 bis 18h (S.GOTO, R₁OKAMOTO₁T₁KUWAJIMA₁A₁TAKAMATSu, J.Ferment. Technol. 54 [1976], 213 bis 224).

Der starke Inhibierungseffekt der Essigsäure wird auch durch die Angabe von optimalen Konzentrationen für diskontinuierliche Prozesse unterstrichen: für Candida utilis liegen diese Werte bei 0,3 g/l (T. URAKAMI, Hakko Kogaku Kaishi 59 [1981 ], 501 bis 511).

Außer der hohen Empfindlichkeit gegenüber extrazellulärer Essigsäurekonzentrationen weisen die dargestellten Hefen noch einige Nachteile auf: es ist nicht bekannt, ob sie höhere Fettsäure >(C2> verwerten bzw. als Cosubstrattolerieren, außerdem benötigen die Hefen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus, Candida methanolica und Torulopsis methanolvescens Wuchsstoffe (J. A. BARNETT, R.W.PAYNE, D. JARROW, „YEASTS" characteristics and identification, Cambridge University Press, Cambridge, London, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney, 1983).

Verfahren zur Kultivierung von Mischpopulationen, die aus Bakterien und/oder Hefen bestehen können, sind in der Literatur ebenfalls bekannt.

In der Patentschrift DD 146616 wird die Gewinnung von Biomasse aus Gülle mittels einer aus einer biologischen Gülleaufbereitungsanlage eines Schweinemast- und Zuchtfcombinates gewonnenen Bakterienmischpopulation, der Hefe Canida utilis oder dem methanolutilisierenden Bakterienstamm MB58IMET B346 beschrieben. Als zusätzliches Kohlenstoffsubstrat zur Gülleflüssigkeit werden Methanol, Essigsäure oder Melasse vorgeschlagen. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß es auf dem Einsatz einer Undefinierten Bakterienmischkultur basiert, deren Selektion von den jeweiligen Standort- und Betriebsbedingungen der Gülleaufbereitungsanlage abhängig, daher wenig reproduzierbar und nicht zur Nacharbeit geeignet ist. Im Falle des Einsatzes von Candida utilis bestehen die bereits behandelten Nachteile der geringen Toleranz gegenüber der Essigsäurekonzentration im Fermentationsmedium. Der Bakterienstamm MB58IMET B346 hingegen toleriert zwar Essigsäure in niedrigen Konzentrationen, utilisiert aber die Essigsäure nicht zum Wachstum, so daß wertvolle C-Bestandteile der Gülleflüssigkeit nicht genutzt werden.

Eine gemeinschaftliche Kultivierung von Bakterien auf Methanol und einer Hefe mit einem weiteren Kohlenstoffsubstrat wird auch in der Patentschrift DD 141529 vorgeschlagen. Dabei werden Hefen der Gattungen Candida, Torulopsis und Hansenula verwendet.

Die Fermentation in Gegenwart der Hefen hat die Steigerung der Wachstumsgeschwindigkeit der Methanol utilisierenden Bakterien zum Ziel, sie dienen also lediglich als Wachstumsstimulatoren für den Methanolprozeß.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zur Gewinnung von Biomasse zu entwickeln, das eine stabile Prozeßführung unter unsterilen Bedingungen bei Einsatz verschiedener Kohlenstoffquellen, vorzugsweise Essigsäure enthaltender Substrate, ohne Anwendung von Wuchsstoffen, bei wahlweise hohen extrazellulären Konzentrationen der Kohlenstoffquelle mit hohen Produktivitäten ermöglicht.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Produktionskultur zu selektieren und einzusetzen, die verschiedene Kohlenstoffquellen verwertet, nicht wuchsstoffbedürftig ist, eine große Wachstumsgeschwindigkeit besitzt, gegebenenfalls hohe extrazelluläre Konzentrationen der Kohlenstoffquelle toleriert und mit noch anderen Kohlenstoff-/Mikroorganismenkombinationen gemeinsam kultiviert werden kann.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Hefestämme der Art Pichia membranaefaciens und der Gattung Metschnikowia einzeln oder im Gemisch oder zusammen mit einer weiteren Kohlenstoff-/Mikroorganismenkombination in Kultuvierungsverfahren verwendet werden, bei denen Hefen oder Hefen und Bakterien auf der Basis von niedermolekularen Kohlenhydraten, Fettsäuren, Alkoholen und Aldehyden als Einzel- oder Kombinationssubstrate kontinuierlich mit einer Durchflußrate von maximal 0,35 h"¹ bei einer Temperatur von 20^cCbis45°Cund einem pH-Wert von 3,5 bis 6,5 unter Normal oder erhöhtem Druck unter unsterilen Bedingungen kultiviert werden.

Besonders vorteilhaft ist die Verwendung der in der Stammsammlung des ZIMET Jena unter der Bezeichnung H196 ZIMET 43735 hinterlegten Stammes von Pichia membranaefaciens und/oder H197 ZIMET 43736 von Metschnikowia spez.

Die Hefestämme wurden mittels konventioneller Selektionsmethoden aus einem ungeschützten kontinuierlichen Fermentationsprozeß mit Essigsäure als einziger Kohlenstoffquelle bei einer Temperatur von 32⁰C und einem pH-Wert von 6,3 isoliert.

Die Zusammensetzung der Nährlösung war pro Liter aqua destillata (für 1 g Biomasse) folgende:

H₃PO₄ (80%ige) 0,028 ml

KH₂PO₄ 35 mg

MgSO₄-7 H₂O 25 mg

CuSO₄-5 H₂O . 0,785 mg

MnS0₄-4H₂0 » - * 1,825mg ' '

FeCI₂-4 H₂O 1,20 mg

ZnCI₂ 0,322 mg

CoSO₄ -7 H₂O 0,036 mg

NiSO₄-7 H₂O 0,109 mg

AI₂(SO₄J₃-18H₂O 0,186 mg

Ca(NO₃J₂-4 H₂O 0,883 mg

Na₂MoO₄-2 H₂O 0,041mg

H₃BO₃ 1,286 mg

CrCI₃ -6 H₂O 0,077 mg

CH₃COOH (80%ig) 4,4 ml

Stickstoff wurde in Form von Ammoniumionen über die pH-Regelung dem Kulturmedium zugeführt. Der Hefestamm H196, taxonomisch bestimmt als Pichia membranaefaciens, wurde in der Hinterlegungsstelle der ZIMET-Kulturensammlung im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR hinterlegt und unter der Nummer ZIMET 43735 registriert.

Der Hefestamm H196 — ZIMET 43735 wird durch folgende Merkmale charakterisiert: Zellmorphologie:

Nach einem Wachstum von 2 Tagen auf Malzextrakt-Agar pH 5,4 und einer Bebrütungstemperatur von 30⁰C sind die Zellen oval, länglich-oval oder teilweise zylindrisch. Die Zellen sind abgerundet bis abgeflacht. Die Zellen liegen einzeln, in Paaren oder in einem Pseudomycel vor.

Die Größe der Zellen beträgt (2 bis 5) χ (4,5 bis 8) μ,ιη bzw. in Flüssigkultur auf Glucose (3 bis 5,5) χ (5 bis 10) μ,ιη. Koloniemorphologie:

— Nach 2 Tagen Wachstum auf Glucose-Agar pH 5,4 bei 30°C werden von dem Stamm kreisförmige, mittelgroße (Durchmesser 0,5 bis 3 mm) filzig-rauhe Kolonien mit einem glatten Rand gebildet, deren Struktur leicht gekörnt ist. Die Farbe ist weiß bis beige und die Form konvex.

— AufMalz-AgarpH5,4:

Die Form der Kolonien nach 2 Tagen Wachstum bei 30°C ist leicht unregelmäßig. Der Rand der Kolonien ist mycelartig auswachsend und etwas heller. Der Durchmesser beträgt 0,5 bis 3 mm. Die Form der Kolonien ist flacher und die Struktur grobkörnig, die Farbe der Kolonien ist weiß bis beige. Weitere Merkmale:

Die Hefe ist nicht tamin-oder wuchsstoffbedürftig.

Sie wächst in einem Temperaturbereich von 20⁰C bis 45⁰C, vorzugsweise aber bei 32-38⁰C, und in einem pH-Bereich von 3,5 bis 6,5, optimal bei einem pH-Wert von 4,4-5,5. Der Hefestamm H 196—ZIMET 43735 zeigt eine gute Assimilationsfähigkeit z.B. für folgende Stoffe: D-, L-Lactat, Succinat, Glycerin, Ethanol, Glucose, Lysin, Essigsäure. Für die Kultivierung wird ein Nährmedium eingesetzt, das als Kohlenstoffquelle niedermolekulare Kohlenhydrate bzw. niedere und höhere Fettsäuren in reiner Form oder als Bestandteile enthält.

Der Hefestamm H 197, taxonomisch bestimmt als Metschnikowia spec, wurde in der Hinterlegungsstelle der ZIMET-Kulturensammlung im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelleTherapie der Akademie der Wissenschaften der DDR hinterlegt und unter der Nummer ZIMET 43736 registriert. Dieser Hefestamm wird durch folgende Merkmale charakterisiert: Zellmorphologie:

Nach einem Wachstum von 2Tagen auf Malzextrakt-Agar pH-Wert 5,4 und einer Bebrütungstemperatur von 30⁰C sind die Zellen vielgestaltig: sphäroid bis ellipsoid. Die Zellen liegen einzeln vor; nach 2 Tagen beginnende Pseudomycelbildung. Die Größe der Zellen beträgt (2 bis 3) x (4 bis 6)/im und in Flüssigkultur auf glucosehaltigem Nährmedium (3 bis 4) χ (5bis6^m. Koloniemorphologie:

— Nach 2 Tagen Wachstum auf Glucose-AgarpH 5,4 bei 30°C werden vom Stamm kreisförmige, mittelgroße (0,5 bis 2,5mm Durchmesser) ganzrandige, fein-amorphe, konvexe Kolonien gebildet. Die Oberfläche ist glatt, leicht glänzend, und die Farbe ist weiß. Nach 4 Tagen bildet sich Pseudomycel.

— Die gleiche Beschreibung trifft auch für das Wachstum auf Malz-Agar pH 5,4 zu. Weitere Merkmaie:

Die Hefe ist vitamin-oder wuchsstoffbedürftig. Auf einen Einsatz von Vitaminen oder Wuchsstoffen kann aber verzichtet werden, wenn im Fermentationsprozeß ein weiterer Wuchsstofflieferant — wie z.B. der Hefestamm Pichia membranaefaciens H 196 — ZIMET 43735 in Anteilen von 5 bis 50%, vorzugsweise 10-30%, gezüchtet wird. Bei Kultivierung des Hefestammes H 197 — ZIMET 43736 auf Gülle, Silosickersaft, Brüdenfett, Melasse, Maisquellwasser vermag dieser ohne zusätzliche Vitamin- oder Wuchsstoffbeigaben zu wachsen. DerHefestamm H 197—ZIMET 43736 zeigt einegute Assimilationsfähigkeit z. B. fürfolgende Stoffe: Glucose, D-Galaktose, Sorbose, Xylose, Saccharose, Maltose, Cellobiose, Succinat, Citrat, Glycerin, Ethanol, Lysin, Essigsäure.

Für die Kultivierung wird ein Nährmedium eingesetzt, das als Kohlenstoffquelle niedermolekulare Kohlenhydrate bzw. niedere und höhere Fettsäuren in reiner Form oder als Bestandteile von Abprodukten (z. B. Gülle, Silosickersaft, Brüdenfett, Melasse, Maisquellwasser) enthält. Die Kultivierung der Hefe erfolgt in einem Temperaturbereich von 25 bis 40⁰C, vorzugsweise bei 32-38°C, und in einem pH-Bereich zwischen 4,0 und 6,5, vorzugsweise zwischen 4,5 bis 5,0.

Die aus den Hefen gewonnene Biomasse besitzt ein gutes Sedimentationsverhalten und Qualitätskennzahlen (z. B.

Rohproteingehalt 45-48%) die ihren Einsatz als Futtermittel oder auch als organischen Dünger empfehlen. Durch gemeinsame Kultivierung mit anderen Kohlenstoff-/Mikroorganismen (Bakterien)-Kombinationen kann der Rohproteingehalt der Biomasse noch erhöht werden.

Durch die nachfolgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

In einen Rührfermentor werden 51 vorgezüchtetes Impfmaterial der Hefen H 196 — ZIMET 43735 und H 197 — ZIMET 43736 mit einer Konzentration von 3 bis 4g/l eingesetzt. Die Temperatur wird auf 38°C, der pH-Wert auf 5,5 eingestellt. Das Medium wird mit 75l/l · h Luftbegast. Es erfolgt eine diskontinuierliche Kultivierung bis zum Erreichen einer Hefekonzentration von 15g/l. Während dieses Wachstumsprozesses wird der pH-Wert mit 10%iger Schwefelsäure geregelt. Das Nährmedium hatte (für 1g Biomasse) folgende Zusammensetzung: proilaquadestillata:

H₃PO₄ (80%ige) 0,028 ml

KH₂PO₄ 35 mg

MgSO₄-7 H₂O 25 mg

CuSO₄-OH₂O 0,785 mg

MnSO₄-4 H₂O 1,825 mg

FeCI₂-4 H₂O 1,200 mg

ZnCI₂ 0,322 mg

CoSO₄ -7 H₂O 0,036 mg

NiSO₄-7 H₂O 0,109 mg

AI₂(SO₄)S-18H₂O 0,186 mg

Ca(NOa)₂-4 H₂O 0,883 mg

Na₂MoO₄- 2 H₂O 0,041mg

H₃BO₃ 1,286 mg

CrCI₃-6 H₂O 0,077 mg

CH₃COOH (80%ige) 4,4 ml

Diese Nährlösung und Ammoniumchlorid werden dem Fermentationsmedium sukzessive so zugesetzt, daß folgende Konzentrationsgrenzen in der Kulturflüssigkeit eingehalten werden: P (als Phosphat):30 bis200mg/l, N (als Ammoniumion):30 bis 300mg/l, Essigsäure 0 bis 6g/l. Anschließend wird weiter kontinuierlich kultiviert mit einer Durchflußrate D = 0,25h"¹. Die pH-Regelung erfolgt während dieses Prozesses mit 10%iger NH₄OH-Lösung. Die Phosphat-, Ammoniumstickstoff-und Essigsäurekonzentration wird in den o.g. Grenzen gehalten. Unter diesen Bedingungen werden im stabilen kontinuierlichen Prozeß Hefekonzentrationen von 21,9g/l entsprechend einer Produktivität von 5,48g/l · h erzielt. Zwischen den beiden Hefen stellt sich ein konstantes Zellzahlverhältnis ein: 30% H 196,70% H 197.

Beispiel 2

Die Kultivierung der Hefen H 196 und H 197 erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben.

Nachdem sich ein stabiler kontinuierlicher Prozeß eingestellt hat, wird die Durchflußrate auf D = 0,15h"¹ vermindert und die Nährlösung teilweise durch Gülle (mit ca. 17g/l wasserdampfflüchtiger Fettsäuren) ersetzt. Dadurch wird ein Nährmedium folgender Zusammensetzung in den Fermentor dosiert: anorganischer Stickstoff: 2,9g/l, Essigsäure: 19,1 g/l, Propionsäure: 6,9g/l, Buttersäure: 6,7 g/l, Acetaldehyd: 1,6g/l. Die pH-Regelung erfolgt mit 10%iger Schwefelsäure. Unter diesen Bedingungen werden im stabilen kontinuierlichen Prozeß Hefekonzentrationen von 21,3g/l entsprechend einer Produktivität von 3,2g/l · h

Beispiel 3

Nachdem sich ein stabiler kontinuierlicher Prozeß eingestellt hat, wird die Durchflußrate auf D = 0,15h"¹ verringert und die Nährlösung teilweise durch Gülle (mit ca. 17g/l wasserdampfflüchtiger Fettsäuren) und Silosickersaft (mit 20,4g/l wasseredampfflüchtiger Fettsäuren) ersetzt. Die Mischung erfolgt so, daß in den Fermentor ein Nährmedium folgender Zusammensetzung dosiert wird: anorganischer Stickstoff: 2,4g/l, Essigsäure: 19,8g/l, Propionsäure: 7,0g/l, Buttersäure: 6,9g/l, Acetaldehyd: 1,8g/l. Die pH-Regelung erfolgt mit 10%iger Schwefelsäure. Unter diesen Bedingungen werden im stabilen kontinuierlichen Prozeß Hefekonzentrationen von 22,5g/l entsprechend einer Produktivität von 3,4g/l · h erreicht.

Beispiel 4

In einen Rührfermentor werden 51 vorgezüchtetes Impfmaterial der Kultur MB 58 mit einer Konzentration von 3—4g/l eingesetzt.

DieTemperaturwirdauf 32°C, pH-Wert auf 4,1 eingestellt. Das Medium wird mit Luft begast. Es erfolgt eine diskontinuierliche Kultivierung bis zum Erreichen einer Bakterienkonzentration von 20 g/l. Während des Wachstumsprozesses wird der pH-Wert mit 5%iger NH₃-Lösung geregelt. Die Zusammensetzung der Nährlösung erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben, nur ohne Essigsäure. Nach Erlangen eines stabilen kontinuierlichen Prozesses, wird eine Durchflußrate von D = 0,125 h"¹ eingestellt.

Dem Kulturmedium werden danach 500 ml einer Hefesuspension, bestehend aus den Hefen H 196 und H 197, zugesetzt. Das 30%ige Methanolsubstrat wird mit 5% Essigsäure versetzt.

Unter diesen Bedingungen wird in einem stabilen kontinuierlichen Prozeß eine Biomassekonzentration von 25,0g/l entsprechend einer Produktivität von 3,1 g/l · h erreicht.

Zwischen den Bakterien- und den Hefestämmen stellt sich ein konstantes Zellzahlverhältnis ein: 80% MB 58,20% H 196 und

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von Biomasse durch Kultivierung von Hefen und Bakterien auf der Basis von niedermolekularen Substraten wie Kohlehydraten, Fettsäuren, Alkoholen und Aldehyden als Einzel- oder Kombinationssubtrate, gekennzeichnet dadurch, daß als Hefen Stämme der Art Pichia membranaefaciens und der Gattung Metschnikowia einzeln oder im Gemisch kontinuierlich mit einer Durchflußrate von maximal 0,35 h"¹ bei einer Temperatur von 20⁰C bis 45°C und einem pH-Wert von 3,5 bis 6,5 unter Normal oder erhöhtem Druck kultiviert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung der in der Stammsammlung des ZIMET Jena unter der Bezeichnung H 196 ZIMET 43735 hinterlegten Stammes von Pichia membranaefaciens und/oder H 197 ZIMET 43736 von Metschnikowia spez.