DD253836A1

DD253836A1 - Verfahren zur kontinuierlichen mikrobiellen synthese von produkten der unvollstaendigen oxidation

Info

Publication number: DD253836A1
Application number: DD29644086A
Authority: DD
Inventors: Wolfgang Babel; Roland Mueller; Dietmar Miethe; Uwe Iske
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1986-11-20
Filing date: 1986-11-20
Publication date: 1988-02-03

Abstract

Das mikrobielle Syntheseverfahren betrifft die Herstellung von Produkten der unvollstaendigen Oxidation, z. B. von Gluconsaeure, Essigsaeure oder Dihydroxiaceton. Mikroorganismen, die zu simultanem Wachstum und Produktbildung auf einem einzigen Substrat in der Lage sind, werden chemostatisch kultiviert und dabei das Verhaeltnis zwischen Assimilation und Produktbildung ueber die Durchflussrate gesteuert. Hierfuer werden insbesondere Bakterien der Gattungen Acetobacter, Gluconobacter, Acinetobacter und Pseudomonas verwendet. Durch diese Verfahrensweise ist eine kontinuierliche Produktsynthese realisierbar.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Produkten des mikrobiellen Stoffwechsels, insbesondere von Gluconsäure, Essigsäure und Dihydroxyaceton mit Hilfe von Mikroorganismen und kann in der mikrobiologischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie angewendet werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Mikrobielle Produktsynthesen, z. B. die Erzeugung von Citronensäure, Ethanol u.a. werden im allgemeinen diskontinuierlich, selten semikontinuierlich (DD-WP 204942) durchgeführt, wenn freie Zellen als „Katalysatoren" für die Synthese eingesetzt werden. Dies trifft auch zu für die Erzeugung von Essigsäure durch Oxidation von Ethanol oder Dihydroxyaceton durch Oxidation von Glycerol. Gluconsäure oder Gluconate werden im technischen Maßstab durch Oxidation von Glucose hergestellt, wobei als Katalysator meist Stämme von Aspergillus niger, aber auch Bakterien der Gattung Pseudomonas, insbesondere Glucono- und Acetobacter-Species genutzt werden (s. Röhr, M., Kubicek, C. P., Kominek, J.: Gluconic Acid. In: Biotechnology [ed. H. Dellweg), Vol.3, pp455—465. Verlag Chemie Weinheim 1982; Milson, P.E., J.L.Meers: Gluconic and Itaconic Acid. In: Comprehensive Biotechnology [ed. M. Moo-Young], Vol.3, pp681-700. Pergamon Press Oxford, New York... 1985; DD-WP 218387, DD-WP 236754, EP 071447).

Alle die bisher bekannten Verfahren zur Synthese von Gluconsäure bzw. Gluconaten sind diskontinuierlich. Der wesentliche Nachteil der diskontinuierlichen Verfahren besteht in der begrenzten Stabilität und Betriebsdauer, was darauf zurückgeführt wird, daß nicht vermehrungsfähige Zellen Denaturierungen und Abbauprozessen unterliegen, die schließlich zur Zellyse führen. Diesem Nachteil kann begegnet werden, indem während der Produktbildung periodisch oder kontinuierlich katalytisch aktive Biomasse zugegeben wird, die in einem „Wachstumsfermentor" erzeugt wird. Die damit verbundenen Nachteile können umgangen werden, wenn Wachstum und Produktbildung simultan in einem Fermentor stattfinden. Hierfür ist ein Verfahren bekannt (DD-WP 238067), bei dem eine Population von Acinetobacter calcoaceticus, die Glucose nicht assimilieren, sondern nur oxidieren kann, auf einem heterotrophen Substrat, z. B. Acetat oder Succinat, in Gegenwart von Glucose chemostatisch vermehrt wird. Dieses Verfahren hat jedoch wie die anderen Verfahren, die mit neutrophilen Mikroorganismen arbeiten, den Nachteil der pH-Empfindlichkeit, der sterilen Betriebsweise und daß quasi mit Substratgemischen gearbeitet wird.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur kontinuierlichen Synthese von Produkten der unvollständigen Oxidation zu entwickeln.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Produzenten und seine katalytische Aktivität zur Produktbildung zu erhalten. Erfindungsgemäß werden Mikroorganismen, die zu simultanem Wachstum und Produktbildung auf einem einzigen Substrat fähig sind, chemostatisch kultiviert und dabei das Verhältnis zwischen Assimilation und Produktbildung über die Durchflußrate gesteuert.

Mikroorganismen, die in der Lage sind, einen Teil der angebotenen Substrate bei chemostatischer Vermehrung gleichzeitig in das angestrebte Produkt umzusetzen, sind insbesondere Bakterien der Gattungen Acetobacter, Gluconobacter, Acinetobacter, Pseudomonas sowie Thiobacillus. Zur Erzeugung von Gluconsäure auf Glucose bzw. Dihydroxyaceton auf Glycerol hat sich die Verwendung von Stämmen der Art Acetobacter methanolicus, z. Bb. IMET B346, als besonders vorteilhaft erwiesen. Die Produktbildung ist abhängig von der aktuellen Substratkonzentration und kann demzufolge im Chemostaten über die Durchflußrate ausgelöst und geregelt werden. Bei niedrigen Geschwindigkeiten wird das Substrat ausschließlich für Wachstum und Vermehrung verwendet. Durch Erhöhung der Geschwindigkeit wird nur noch ein Teil des Substrates assimiliert; der weitaus größere Teil des Substrates bleibt nach seiner Oxidation in Form des gewünschten Produktes liegen. Die Energie für die Zellsubstanzsynthese wird im wesentlichen aus dieser unvollständigen Oxidation des Substrates gewonnen. Die Wachstumsausbeute geht z. B. für die Erzeugung von Gluconsäure auf Glucose von theoretisch möglichen 0,5g · g"¹ auf 0,1 bis 0,05g g~¹ zurück; prog gebildete Biomasse können im Arbeitsbereich von D = 0,16h"¹ bis D = 0,35h~¹ bis zu 8g Gluconsäure gebildet werden, so daß sich die Produktausbeute auf ca. 80% belaufen kann. Theoretisch kann das Verhältnis von Biomasse- zu Produktkonzentration mit weiterer Erhöhung der Geschwindigkeit zugunsten des Produktes noch verbessert werden, maximal können bis zu 15g Gluconsäure gebildet werden, wobei die Ausbeute etwa 90% erreicht. Im Prinzip kann die Durchflußrate bis auf D_krit erhöht werden. Im Interesse der Stabilität des Prozesses, insbesondere der Aufarbeitung ist dies nicht zweckmäßig, da die Substratkonzentration im Produktstrom gegen Null zu führen ist, weshalb bei Durchflußraten unterhalb D_krit gearbeitet wird.

Die Produktkonzentration wird von der Biomassekonzentration, der Kapazität des Systems zur unvollständigen Oxidation des Substrates und von dem Energiegewinn aus der Produktbildung bestimmt.

Für den Fall der kontinuierlichen Synthese von Gluconsäure mittels Stämmen von Acetobacter methanolicus kann die Aufteilung des Substratstromes, die durch die Durchflußrate ausgelöst wurde, durch den pH-Wert verstärkt werden, offenbar weil bei Acetobacter methanolicus die Substratassimilation und unvollständige Oxidation der Glucose zu Gluconsäure unterschiedliche pH-Abhängigkeiten zeigen. Oberhalb pH4, zwischen 4,2 und 5 wird Glucose, in dem Maße wie die Stoffwechsellage bei gegebenem D Wachstum zuläßt, assimiliert, dagegen wird sie darunter, besonders um pH 3,3 bevorzugt oxidiert und das Wachstum ist stark eingeschränkt. Bei dem niedrigen pH-Wert zu arbeiten, bietet sich deshalb und wegen der weiter verminderten Infektionsgefahr besonders an.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die Synthese von Produkten angewendet werden, die durch unvollständige Oxidation von heterotrophen Substraten gebildet werden, wie z. B. Essigsäure aus Ethanol, Gluconsäure aus Glucose, Dihydroxyaceton aus Glycerol. Es bietet sich besonders an, wenn Mikroorganismen verwendet werden, die gleichzeitig als Quelle von Eiweiß oder anderen Werkstoffen, z. B. Enzymen, Coenzymen, Vitaminen o. ä. Bedeutung haben bzw. dadurch erlangen können. In nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

Das Bakterium Acetobacter methanolicus IMET B 346 wurde in einem für aerobe Kultivierung geeigneten Rührfermenterbei30°C und einem pH-Wert von 4,0 gezüchtet. Die Gelöstsauerstoffkonzentration betrug 60% des Sättigungswertes. Die chemostatische (C-Iimitierte) Kultivierung erfolgte mit Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle auf einem Medium folgender Zusammensetzung (in mg/l):

NH₄CI 3400

KH₂PO₄ 310

MgSO₄-7H₂O 15.

CaCI₂-2 H₂O 20

FeSO₄-7 H₂O 5

ZnSO₄-7 H₂O 0,44

MnSO₄-4 H₂O 0,82

CuSO₄-OH₂O 0,78

Na₂MoO₄-2 H₂O 0,25

Pantothensäure 20

Bei einer Durchflußrate von 0,25h"¹ wurden unter stationären Fermentationsbedingungen bei einer Glucoseausgangskonzentration von 12,0g/l eine Biomasseausbeute von 1,16g/l (Y_Bts = 0,097 g/g) und eine Gluconsäurekonzentration von 10,5g/l(Y_Gi_UConsäure = 0,88 g/g) erhalten. Das entspricht einer Produktivität von 2,26 g Gluconsäure pro g Biomasse und Stunde. Die Glucosekonzentration betrug unter stationären Bedingungen 0,15g/l. Aufgrund des chemostatischen Fermentationsprinzips bleibt diese Konzentration bei Erhöhung der Substratausgangskonzentration konstant.

Beispiel 2

Wurde Acetobacter methanolicus IMET B346 wie unter Beispiel 1 beschrieben, aber mit einer Durchflußrate von 0,18h"¹ kultiviert, so betrug die Biomasseausbeute 1,32g/l (Ybts = 0,11 g/g) und die Gluconsäurekonzentration 10,3g/l (Yduconsäure = 0,86g/g). Das entspricht einer Produktivität von 1,40 g Gluconsäure pro g Biomasse und Stunde. Die stationäre Glucosekonzentration betrug 0,09g/l.

Beispiel 3

Wurde Acetobacter methanolicus IMET B346 wie unter Beispiel 1 beschrieben, aber bei einem pH-Wert von 3,3 kultiviert, so betrug die Biomasseausbeute 0,96g/l (Ybts - 0,08g/g) und die Gluconsäurekonzentration 10,7g/l (Yduconsäure = 0,89g/g). Das entspricht einer Produktivität von 2,79g Gluconsäure pro g Biomasse und Stunde. Die stationäre Glucosekonzentration betrug 0,22g/l.

Beispiel 4

Acetobacter methanolicus IMET B346 wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, bei 3O⁰C und pH4,0 aerob kultiviert. Als Kohlenstoff- und Energiequelle diente Glycerol. Bei einer Durchflußrate von 0,18h"¹ wurden unter stationären Fermentationsbedingungen bei einer Glycerolausgangskonzentration von 12,0g/l eine Biomasseausbeute von 2,15g/l (Ybts = 0,18g/g) und eine Dihydroxyacetonkonzentration von 9,1 g/l (Yuihydroxyaceton = 0,76g/g) erreicht. Das entspricht einer Produktivität von 0,76g Dihydroxyaceton pro g Biomasse und Stunde. Die Glycerolkonzentration betrug unter stationären Bedingungen 0,11 g/l.

Beispiel 5

Gluconobacter suboxidans A^XCC 621 wurde auf dem in Beispiel 1 beschriebenen Mineralsalzmedium bei pH4,2 und 3O⁰C kultiviert, die Gelöstsauerstoffkonzentration betrug 60% des Sättigungswertes. Als Kohlenstoff- und Energiequelle diente Glycerol in einer Ausgangskonzentration von 12g/l. Bei einer Durchflußrate von 0,17h"¹ wurden unter stationären Fermentationsbedingungen eine Biomasseausbeute von-1,95g/l (Ybts = 0,16g/g) und eine Dihydroxyacetonkonzentration von 9,19g/l (YDihydroxyaceton = 0,77g/g) erreicht. Das entspricht einer Produktivität von 0,80g Dihydroxyaceton pro g Biomasse und Stunde. Die Glycerolkonzentration betrug unter stationären Bedingungen 0,13g/l.

Claims

1. Verfahren zur kontinuierlichen mikrowellen Synthese von Produkten der unvollständigen Oxidation wie zum Beispiel Gluconsäure, Dihydroxyaceton und Essigsäure, gekennzeichnet durch chemostatische Kultivierung von Mikroorganismen, die zu simultanem Wachstum und * Produktbildung auf einem einzigen Substrat fähig sind, wobei das Verhältnis zwischen Assimilation und Produktbildung über die Durchflußrate gesteuert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch chemostatische Kultivierung von Bakterien der Gattungen Acetobacter, Gluconobacter, Acinetobacter, Pseudomonas sowie Thiobacillus bei Geschwindigkeiten, bei denen die aktuelle Substratkonzentration die Schwelle überschreitet, oberhalb derer unvollständige Oxidation ausgelöst wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur Gewinnung von Gluconsäure Bakterien der Art Acetobacter methanolicus chemostatisch auf Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle im pH-Bereich von 3-5 und bei Durchflußraten von 0,16-0,35 h~¹ kultiviert werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur Gewinnung von Dihydroxyaceton Bakterien der Art Acetobacter methanolicus chemostatisch auf Glycerol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle im pH-Bereich von 3-5 und bei Durchflußraten von 0,14 bis 0,28 h~¹ kultiviert werden.