DD253836A1

DD253836A1 - METHOD FOR THE CONTINUOUS MICROBIAL SYNTHESIS OF PRODUCTS OF INCOMPARABLE OXIDATION

Info

Publication number: DD253836A1
Application number: DD29644086A
Authority: DD
Inventors: Wolfgang Babel; Roland Mueller; Dietmar Miethe; Uwe Iske
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1986-11-20
Filing date: 1986-11-20
Publication date: 1988-02-03

Abstract

Das mikrobielle Syntheseverfahren betrifft die Herstellung von Produkten der unvollstaendigen Oxidation, z. B. von Gluconsaeure, Essigsaeure oder Dihydroxiaceton. Mikroorganismen, die zu simultanem Wachstum und Produktbildung auf einem einzigen Substrat in der Lage sind, werden chemostatisch kultiviert und dabei das Verhaeltnis zwischen Assimilation und Produktbildung ueber die Durchflussrate gesteuert. Hierfuer werden insbesondere Bakterien der Gattungen Acetobacter, Gluconobacter, Acinetobacter und Pseudomonas verwendet. Durch diese Verfahrensweise ist eine kontinuierliche Produktsynthese realisierbar.The microbial synthesis process relates to the production of products of incomplete oxidation, e.g. As of gluconic acid, acetic acid or dihydroxiacetone. Microorganisms capable of simultaneous growth and product formation on a single substrate are chemostatically cultured, controlling the ratio between assimilation and product formation via the flow rate. In particular bacteria of the genera Acetobacter, Gluconobacter, Acinetobacter and Pseudomonas are used for this purpose. By this procedure, a continuous product synthesis can be realized.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Produkten des mikrobiellen Stoffwechsels, insbesondere von Gluconsäure, Essigsäure und Dihydroxyaceton mit Hilfe von Mikroorganismen und kann in der mikrobiologischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie angewendet werden.The invention relates to a biotechnical process for the production of products of microbial metabolism, in particular of gluconic acid, acetic acid and dihydroxyacetone with the aid of microorganisms and can be used in the microbiological, pharmaceutical and food industries.

Characteristic of the known technical solutions

Mikrobielle Produktsynthesen, z. B. die Erzeugung von Citronensäure, Ethanol u.a. werden im allgemeinen diskontinuierlich, selten semikontinuierlich (DD-WP 204942) durchgeführt, wenn freie Zellen als „Katalysatoren" für die Synthese eingesetzt werden. Dies trifft auch zu für die Erzeugung von Essigsäure durch Oxidation von Ethanol oder Dihydroxyaceton durch Oxidation von Glycerol. Gluconsäure oder Gluconate werden im technischen Maßstab durch Oxidation von Glucose hergestellt, wobei als Katalysator meist Stämme von Aspergillus niger, aber auch Bakterien der Gattung Pseudomonas, insbesondere Glucono- und Acetobacter-Species genutzt werden (s. Röhr, M., Kubicek, C. P., Kominek, J.: Gluconic Acid. In: Biotechnology [ed. H. Dellweg), Vol.3, pp455—465. Verlag Chemie Weinheim 1982; Milson, P.E., J.L.Meers: Gluconic and Itaconic Acid. In: Comprehensive Biotechnology [ed. M. Moo-Young], Vol.3, pp681-700. Pergamon Press Oxford, New York... 1985; DD-WP 218387, DD-WP 236754, EP 071447).Microbial product syntheses, e.g. As the production of citric acid, ethanol u.a. are generally carried out discontinuously, rarely semicontinuously (DD-WP 204942), when free cells are used as "catalysts" for the synthesis, as well as for the production of acetic acid by oxidation of ethanol or dihydroxyacetone by oxidation of glycerol, gluconic acid or Gluconates are produced on an industrial scale by oxidation of glucose, with the strains of Aspergillus niger, but also bacteria of the genus Pseudomonas, in particular Glucono- and Acetobacter species are used as catalyst (see Röhr, M., Kubicek, CP, Kominek, J .: Gluconic Acid In: Biotechnology [edited by H. Dellweg], Vol.3, pp455-465 Published by Chemie Weinheim 1982, Milson, PE, JLMeers: Gluconic and Itaconic Acid In: Comprehensive Biotechnology [ed Moo-Young], Vol.3, pp681-700, Pergamon Press Oxford, New York ... 1985, DD-WP 218387, DD-WP 236754, EP 071447).

Alle die bisher bekannten Verfahren zur Synthese von Gluconsäure bzw. Gluconaten sind diskontinuierlich. Der wesentliche Nachteil der diskontinuierlichen Verfahren besteht in der begrenzten Stabilität und Betriebsdauer, was darauf zurückgeführt wird, daß nicht vermehrungsfähige Zellen Denaturierungen und Abbauprozessen unterliegen, die schließlich zur Zellyse führen. Diesem Nachteil kann begegnet werden, indem während der Produktbildung periodisch oder kontinuierlich katalytisch aktive Biomasse zugegeben wird, die in einem „Wachstumsfermentor" erzeugt wird. Die damit verbundenen Nachteile können umgangen werden, wenn Wachstum und Produktbildung simultan in einem Fermentor stattfinden. Hierfür ist ein Verfahren bekannt (DD-WP 238067), bei dem eine Population von Acinetobacter calcoaceticus, die Glucose nicht assimilieren, sondern nur oxidieren kann, auf einem heterotrophen Substrat, z. B. Acetat oder Succinat, in Gegenwart von Glucose chemostatisch vermehrt wird. Dieses Verfahren hat jedoch wie die anderen Verfahren, die mit neutrophilen Mikroorganismen arbeiten, den Nachteil der pH-Empfindlichkeit, der sterilen Betriebsweise und daß quasi mit Substratgemischen gearbeitet wird.All the previously known processes for the synthesis of gluconic acid or gluconates are discontinuous. The main drawback of the batch processes is limited stability and service life, due to the fact that non-replicable cells undergo denaturation and degradation processes which eventually lead to cell lysis. This disadvantage can be counteracted by periodically or continuously adding catalytically active biomass during product formation which is produced in a "growth fermentor." The associated disadvantages can be circumvented if growth and product formation occur simultaneously in a fermentor known (DD-WP 238067), in which a population of Acinetobacter calcoaceticus, which can not assimilate glucose, but only oxidize, is chemostatically propagated on a heterotrophic substrate, such as acetate or succinate, in the presence of glucose However, like the other methods that work with neutrophilic microorganisms, the disadvantage of the pH sensitivity, the sterile mode of operation and that quasi working with substrate mixtures.

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur kontinuierlichen Synthese von Produkten der unvollständigen Oxidation zu entwickeln.The object of the invention is to develop a process for the continuous synthesis of products of incomplete oxidation.

Essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Produzenten und seine katalytische Aktivität zur Produktbildung zu erhalten. Erfindungsgemäß werden Mikroorganismen, die zu simultanem Wachstum und Produktbildung auf einem einzigen Substrat fähig sind, chemostatisch kultiviert und dabei das Verhältnis zwischen Assimilation und Produktbildung über die Durchflußrate gesteuert.The invention has for its object to obtain the producers and its catalytic activity for product formation. According to the invention, microorganisms capable of simultaneous growth and product formation on a single substrate are chemostatically cultured, thereby controlling the ratio between assimilation and product formation via the flow rate.

Mikroorganismen, die in der Lage sind, einen Teil der angebotenen Substrate bei chemostatischer Vermehrung gleichzeitig in das angestrebte Produkt umzusetzen, sind insbesondere Bakterien der Gattungen Acetobacter, Gluconobacter, Acinetobacter, Pseudomonas sowie Thiobacillus. Zur Erzeugung von Gluconsäure auf Glucose bzw. Dihydroxyaceton auf Glycerol hat sich die Verwendung von Stämmen der Art Acetobacter methanolicus, z. Bb. IMET B346, als besonders vorteilhaft erwiesen. Die Produktbildung ist abhängig von der aktuellen Substratkonzentration und kann demzufolge im Chemostaten über die Durchflußrate ausgelöst und geregelt werden. Bei niedrigen Geschwindigkeiten wird das Substrat ausschließlich für Wachstum und Vermehrung verwendet. Durch Erhöhung der Geschwindigkeit wird nur noch ein Teil des Substrates assimiliert; der weitaus größere Teil des Substrates bleibt nach seiner Oxidation in Form des gewünschten Produktes liegen. Die Energie für die Zellsubstanzsynthese wird im wesentlichen aus dieser unvollständigen Oxidation des Substrates gewonnen. Die Wachstumsausbeute geht z. B. für die Erzeugung von Gluconsäure auf Glucose von theoretisch möglichen 0,5g · g"¹ auf 0,1 bis 0,05g g~¹ zurück; prog gebildete Biomasse können im Arbeitsbereich von D = 0,16h"¹ bis D = 0,35h~¹ bis zu 8g Gluconsäure gebildet werden, so daß sich die Produktausbeute auf ca. 80% belaufen kann. Theoretisch kann das Verhältnis von Biomasse- zu Produktkonzentration mit weiterer Erhöhung der Geschwindigkeit zugunsten des Produktes noch verbessert werden, maximal können bis zu 15g Gluconsäure gebildet werden, wobei die Ausbeute etwa 90% erreicht. Im Prinzip kann die Durchflußrate bis auf D_krit erhöht werden. Im Interesse der Stabilität des Prozesses, insbesondere der Aufarbeitung ist dies nicht zweckmäßig, da die Substratkonzentration im Produktstrom gegen Null zu führen ist, weshalb bei Durchflußraten unterhalb D_krit gearbeitet wird.Microorganisms which are able to convert a portion of the substrates offered in chemostatic amplification simultaneously in the desired product, in particular bacteria of the genera Acetobacter, Gluconobacter, Acinetobacter, Pseudomonas and Thiobacillus. For the production of gluconic acid on glucose or dihydroxyacetone on glycerol, the use of strains of the species Acetobacter methanolicus, z. Bb. IMET B346, proved to be particularly advantageous. The product formation is dependent on the current substrate concentration and can therefore be triggered and regulated in the chemostat via the flow rate. At low speeds, the substrate is used exclusively for growth and propagation. By increasing the speed only a part of the substrate is assimilated; the much larger part of the substrate remains after its oxidation in the form of the desired product. The energy for cell substance synthesis is essentially derived from this incomplete oxidation of the substrate. The growth yield is z. For example, for the production of gluconic acid on glucose of theoretically possible 0.5g · g ^"1 to 0.1 to 0.05 g g ~ ¹ back; prog biomass formed can in the working area of D = 0,16h ^'1 to D = 0 , 35h ~ ¹ to 8g gluconic acid are formed, so that the product yield can amount to about 80%. Theoretically, the ratio of biomass to product concentration with further increase in the speed in favor of the product can be further improved, a maximum of up to 15g gluconic acid can be formed, the yield reaches about 90%. In principle, the flow rate can be increased to D _crit . In the interest of the stability of the process, in particular the workup, this is not useful, since the substrate concentration in the product stream is close to zero, which is why working at flow rates below D _crit .

Die Produktkonzentration wird von der Biomassekonzentration, der Kapazität des Systems zur unvollständigen Oxidation des Substrates und von dem Energiegewinn aus der Produktbildung bestimmt.The product concentration is determined by the biomass concentration, the capacity of the system to incomplete oxidation of the substrate, and the energy gain from product formation.

Für den Fall der kontinuierlichen Synthese von Gluconsäure mittels Stämmen von Acetobacter methanolicus kann die Aufteilung des Substratstromes, die durch die Durchflußrate ausgelöst wurde, durch den pH-Wert verstärkt werden, offenbar weil bei Acetobacter methanolicus die Substratassimilation und unvollständige Oxidation der Glucose zu Gluconsäure unterschiedliche pH-Abhängigkeiten zeigen. Oberhalb pH4, zwischen 4,2 und 5 wird Glucose, in dem Maße wie die Stoffwechsellage bei gegebenem D Wachstum zuläßt, assimiliert, dagegen wird sie darunter, besonders um pH 3,3 bevorzugt oxidiert und das Wachstum ist stark eingeschränkt. Bei dem niedrigen pH-Wert zu arbeiten, bietet sich deshalb und wegen der weiter verminderten Infektionsgefahr besonders an.In the case of the continuous synthesis of gluconic acid by truncation of Acetobacter methanolicus, the distribution of the substrate current, which was triggered by the flow rate, can be enhanced by the pH, apparently because in Acetobacter methanolicus the substrate assimilation and incomplete oxidation of the glucose to gluconic acid have different pH Dependencies show. Above pH4, between 4.2 and 5, glucose is assimilated as the metabolic position allows for given D growth, whereas it is preferentially oxidized below, especially around pH 3.3, and growth is severely limited. Because of this and because of the further reduced risk of infection, it makes sense to work at the low pH.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die Synthese von Produkten angewendet werden, die durch unvollständige Oxidation von heterotrophen Substraten gebildet werden, wie z. B. Essigsäure aus Ethanol, Gluconsäure aus Glucose, Dihydroxyaceton aus Glycerol. Es bietet sich besonders an, wenn Mikroorganismen verwendet werden, die gleichzeitig als Quelle von Eiweiß oder anderen Werkstoffen, z. B. Enzymen, Coenzymen, Vitaminen o. ä. Bedeutung haben bzw. dadurch erlangen können. In nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.The process of the invention can be used for the synthesis of products formed by incomplete oxidation of heterotrophic substrates, such as e.g. As acetic acid from ethanol, gluconic acid from glucose, dihydroxyacetone from glycerol. It is particularly useful when microorganisms are used, at the same time as a source of protein or other materials, eg. As enzymes, coenzymes, vitamins o. Ä. Meaning or can obtain. In the following examples, the invention is explained in more detail.

example 1

Das Bakterium Acetobacter methanolicus IMET B 346 wurde in einem für aerobe Kultivierung geeigneten Rührfermenterbei30°C und einem pH-Wert von 4,0 gezüchtet. Die Gelöstsauerstoffkonzentration betrug 60% des Sättigungswertes. Die chemostatische (C-Iimitierte) Kultivierung erfolgte mit Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle auf einem Medium folgender Zusammensetzung (in mg/l):The bacterium Acetobacter methanolicus IMET B 346 was grown in a stirred fermenter suitable for aerobic cultivation at 30 ° C and a pH of 4.0. The dissolved oxygen concentration was 60% of the saturation value. The chemostatic (C-imitation) cultivation was carried out with glucose as carbon and energy source on a medium of the following composition (in mg / l):

NH₄CI 3400NH ₄ CI 3400

KH₂PO₄ 310KH ₂ PO ₄ 310

MgSO₄-7H₂O 15.MgSO ₄ -7H ₂ O 15.

CaCI₂-2 H₂O 20CaCl ₂ -2H ₂ O 20

FeSO₄-7 H₂O 5FeSO ₄ -7H ₂ O 5

ZnSO₄-7 H₂O 0,44ZnSO ₄ -7H ₂ O 0.44

MnSO₄-4 H₂O 0,82MnSO ₄ -4 H ₂ O 0.82

CuSO₄-OH₂O 0,78CuSO ₄ -OH ₂ O 0.78

Na₂MoO₄-2 H₂O 0,25Na ₂ MoO ₄ -2H ₂ O 0.25

Pantothensäure 20Pantothenic acid 20

Bei einer Durchflußrate von 0,25h"¹ wurden unter stationären Fermentationsbedingungen bei einer Glucoseausgangskonzentration von 12,0g/l eine Biomasseausbeute von 1,16g/l (Y_Bts = 0,097 g/g) und eine Gluconsäurekonzentration von 10,5g/l(Y_Gi_UConsäure = 0,88 g/g) erhalten. Das entspricht einer Produktivität von 2,26 g Gluconsäure pro g Biomasse und Stunde. Die Glucosekonzentration betrug unter stationären Bedingungen 0,15g/l. Aufgrund des chemostatischen Fermentationsprinzips bleibt diese Konzentration bei Erhöhung der Substratausgangskonzentration konstant.At a flow rate of 0.25 h ^-1 under steady-state fermentation conditions at a starting glucose concentration of 12.0 g / l, a biomass yield of 1.16 g / l (Y _B ts = 0.097 g / g) and a gluconic acid concentration of 10.5 g / l ( Y i _g _UC oic acid = 0.88 g / g). this corresponds to a productivity of 2.26 g of gluconic acid per g biomass per hour. the glucose concentration was at steady state conditions 0.15 g / l. Because of the chemo static fermentation principle is that concentration constant when increasing the substrate output concentration.

Example 2

Wurde Acetobacter methanolicus IMET B346 wie unter Beispiel 1 beschrieben, aber mit einer Durchflußrate von 0,18h"¹ kultiviert, so betrug die Biomasseausbeute 1,32g/l (Ybts = 0,11 g/g) und die Gluconsäurekonzentration 10,3g/l (Yduconsäure = 0,86g/g). Das entspricht einer Produktivität von 1,40 g Gluconsäure pro g Biomasse und Stunde. Die stationäre Glucosekonzentration betrug 0,09g/l.Acetobacter methanolicus has IMET B346 as described in Example 1, but grown at a flow rate of 0.18H ^"1, the biomass yield was 1.32 g / l (Ybts = 0.11 g / g), and the gluconic acid 10.3 g / l (Yduconic acid = 0.86 g / g), which corresponds to a productivity of 1.40 g of gluconic acid per g of biomass per hour, and the steady state glucose concentration was 0.09 g / l.

Example 3

Wurde Acetobacter methanolicus IMET B346 wie unter Beispiel 1 beschrieben, aber bei einem pH-Wert von 3,3 kultiviert, so betrug die Biomasseausbeute 0,96g/l (Ybts - 0,08g/g) und die Gluconsäurekonzentration 10,7g/l (Yduconsäure = 0,89g/g). Das entspricht einer Produktivität von 2,79g Gluconsäure pro g Biomasse und Stunde. Die stationäre Glucosekonzentration betrug 0,22g/l.When Acetobacter methanolicus IMET B346 was cultured as described in Example 1 but at a pH of 3.3, the biomass yield was 0.96 g / L (Ybts - 0.08 g / g) and the gluconic acid concentration was 10.7 g / L ( Yduconic acid = 0.89 g / g). This corresponds to a productivity of 2.79 g gluconic acid per g biomass and hour. The steady state glucose concentration was 0.22 g / L.

Example 4

Acetobacter methanolicus IMET B346 wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, bei 3O⁰C und pH4,0 aerob kultiviert. Als Kohlenstoff- und Energiequelle diente Glycerol. Bei einer Durchflußrate von 0,18h"¹ wurden unter stationären Fermentationsbedingungen bei einer Glycerolausgangskonzentration von 12,0g/l eine Biomasseausbeute von 2,15g/l (Ybts = 0,18g/g) und eine Dihydroxyacetonkonzentration von 9,1 g/l (Yuihydroxyaceton = 0,76g/g) erreicht. Das entspricht einer Produktivität von 0,76g Dihydroxyaceton pro g Biomasse und Stunde. Die Glycerolkonzentration betrug unter stationären Bedingungen 0,11 g/l.Acetobacter methanolicus IMET B346 was prepared as described in Example 1, aerobically cultivated at 3O ⁰ C and pH 4.0. The source of carbon and energy was glycerol. At a flow rate of 0.18h- ¹ under steady state fermentation conditions at a glycerol starting concentration of 12.0g / l, a biomass yield of 2.15g / l (Ybts = 0.18g / g) and a dihydroxyacetone concentration of 9.1g / l ( Yihydroxyacetone = 0.76 g / g), which corresponds to a productivity of 0.76 g of dihydroxyacetone per g of biomass per hour The glycerol concentration was 0.11 g / l under steady state conditions.

Example 5

Gluconobacter suboxidans A^XCC 621 wurde auf dem in Beispiel 1 beschriebenen Mineralsalzmedium bei pH4,2 und 3O⁰C kultiviert, die Gelöstsauerstoffkonzentration betrug 60% des Sättigungswertes. Als Kohlenstoff- und Energiequelle diente Glycerol in einer Ausgangskonzentration von 12g/l. Bei einer Durchflußrate von 0,17h"¹ wurden unter stationären Fermentationsbedingungen eine Biomasseausbeute von-1,95g/l (Ybts = 0,16g/g) und eine Dihydroxyacetonkonzentration von 9,19g/l (YDihydroxyaceton = 0,77g/g) erreicht. Das entspricht einer Produktivität von 0,80g Dihydroxyaceton pro g Biomasse und Stunde. Die Glycerolkonzentration betrug unter stationären Bedingungen 0,13g/l.Gluconobacter suboxydans A ^X CC 621 was cultured in the manner described in Example 1, mineral salt medium at pH4,2 and 3O ⁰ C, the dissolved oxygen concentration was 60% of the saturation value. The source of carbon and energy was glycerol at a starting concentration of 12g / l. At a flow rate of 0.17 h ^-1 , a biomass yield of -1.95 g / l (Ybts = 0.16 g / g) and a dihydroxyacetone concentration of 9.19 g / l (Y dihydroxyacetone = 0.77 g / g) were achieved under steady-state fermentation conditions This corresponds to a productivity of 0.80 g of dihydroxyacetone per g of biomass per hour The glycerol concentration was 0.13 g / l under steady state conditions.

Claims

A process for the continuous microwave synthesis of incomplete oxidation products such as gluconic acid, dihydroxyacetone and acetic acid characterized by chemostatically cultivating microorganisms capable of simultaneous growth and product formation on a single substrate, the ratio between assimilation and product formation exceeding the flow rate is controlled.

2. The method according to claim 1, characterized by chemostatic cultivation of bacteria of the genera Acetobacter, Gluconobacter, Acinetobacter, Pseudomonas and Thiobacillus at speeds at which the current substrate concentration exceeds the threshold above which incomplete oxidation is triggered.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that for the recovery of gluconic acid bacteria of the species Acetobacter methanolicus chemostatically to glucose as the only carbon and energy source in the pH range of 3-5 and at flow rates of 0.16-0.35 h ~ ^{1 to be} cultivated.

4. The method according to claim 1 or 2, characterized in that for the recovery of dihydroxyacetone bacteria of the species Acetobacter methanolicus chemostatically glycerol as the only carbon and energy source in the pH range of 3-5 and at flow rates of 0.14 to 0.28 h ~ ^{1 to be} cultivated.