DE2408752C2

DE2408752C2 - Verfahren zur Gewinnung von Cholesterin und Cholesterinestern aus Rückständen der Fettverarbeitung

Info

Publication number: DE2408752C2
Application number: DE2408752A
Authority: DE
Inventors: Frank Dr. 4000 Düsseldorf Hill; Carl. H. Dipl.-Chem.Prof.Dr. 4040 Neuß Krauch; Rudolf Dr. 4040 Neuss Lehmann; Hans F. Dipl.-Chem.Dr. 5657 Haan Pfeiffer; Joachim Dr. 4000 Düsseldorf Schindler
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 1974-02-23
Filing date: 1974-02-23
Publication date: 1982-11-25
Also published as: JPS5830039B2; FR2262111A1; JPS50123880A; FR2262111B1; GB1455231A; US3919045A; DE2408752A1; CH603688A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Gewinnung bzw. Anreicherung von Cholesterin oder Cholesterinestern aus Rückständen der Fettverarbeitung.

In der fettverarbeitenden Industrie fallen bei der Spaltung von Fetten und der anschließenden Fettsäuredestillation jährlich große Mengen bisher meist ungenutzter Rückstände an. Diese Rückstände, insbesondere soweit sie tierischen Ursprungs sind, enthalten beträchtliche Mengen an Cholesterin und Cholesterinestern. Wegen des ständig steigenden Bedarfs an Cholesterin für pharmazeutische Zwecke erscheint eine Gewinnung dieser Sterine aus den Rückständen der Fettverarbeitung durchaus lohnend.

Es ist bekannt, daß eine Reihe von Mikroorganismen Fette und Fettsäuren abzubauen vermögen. Es hat sich aber gezeigt, daß dieser Abbau in vielen Fällen nicht mit der für den praktischen Einsatz erforderlichen Geschwindigkeit erfolgt, bzw. daß ein Teil der Mikroorganismen durch die in den Rückständen im erheblichen Umfange vorhandenen Brenz- und Teerbestandteile oder sonstigen Oxidations- und Zersetzungsprodukte in ihrem Wachstum gehemmt werden.

Ziel der Erfindung ist es, geeignete Mikroorganismen-Stämme aufzufinden bzw. Kulturverfahren zu entwickeln, die die Gewinnung bzw. Anreicherung von Cholesterin und Cholesterinestern aus den bei der Aufarbeitung und Fraktionierung von Fetten anfallenden Rückständen ermöglichen. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von Cholesterin und Cholesterinestern aus den Rückständen der Fettverarbeitung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rückstände in emulgierter Form in einem wäßrigen Kulturmedium mit einem Mikroorganismus der Spezies Nocardia paraffinica, Nocardia salmonicolor, Nocardia opaca, Corynebacterium petrophilum bei einer Temperatur von 25 bis 55° C und einem pH-Wert von 4.0 bis 8.0 abbaut und anschließend die angereicherten Sterine durch Lösungsmittelextraktion aus der Kulturlösung abtrennt

Die genannten Mikroorganismen zeichnen sich durch besondere Unempfindlichkeit gegenüber den in den Rückständen enthaltenen teerigen Bestandteilen und sonstigen Oxidations- und Zersetzungsprodukten aus und besitzen darüber hinaus eine hohe biologische Aktivität gegenüber den abzubauenden Rückständen.

Der mikrobielle Abbau erfolgt in einem wäßrigen Nährmedium, das als Kohlenstoffquelle entweder nur den abzubauenden Rückstand oder aber noch eine zusätzliche metabolisterbare Kohlenstoffverbindung sowie ferner die üblicherweise von den Mikroorganismen benötigten Nähr- und Wuchsstoffe enthält

Das Kulturverfahren wird bevorzugt unter aeroben Bedingungen durchgeführt

Für das Verfahren werden vorwiegend Rückstände aus der Verarbeitung von Fetten tierischen Ursprungs, insbesondere Rückstände aus der Fettsäuredestillation eingesetzt Diese bestehen im wesentlichen aus Fettsäuren, Fettsäuremono- und -diglyzeriden. Polymer-, Oxy- dations- und Brenzprodukten von Fetten und Fettsäuren und teerigen Bestandteilen. Zur Stimulierung des Wachstums kann es sich empfehlen, eine zusätzliche metabolisierbare Kohlenstoffquelle anzubieten, wie z. B. Paraffine, Glycerin, niedere Carbonsäuren, Stärke, Dex trin. Rohrzucker, Glukose, Fruktose, Maltose und zuckerhaltige Abfallstoffe. Geeignete Stickstoffquellen bzw. Wuchsstoffe sind Ammoniumsalze, Nitrate, Harnstoff, Peptone, Maisquellwasser, Sojabohnfcnnehl bzw. -kuchen. Schlempe und Fischmehl. Weiterhin werden dem Nährmedium zweckmäßig anorganische Sake '.vie Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydrogenphosphat, Calcium-, Magnesium-, Mangan- und Eisensalze sowie Fermentationsbeschleuniger, z. B. Hefeextrakt, Fleischextrakt und Vitamine zugesetzt

Die abzubauenden Rückstände werden dem Nährmedium in emulgierter Form in Konzentration von I bis 20 Gewichtsprozent, insbesondere 2 bis 10 Gewichtsprozent zugesetzt Falls der Rückstand als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wird, wird dieser bereits zu Be- ginn des Kulturverfahrens angeboten und während des Wachstums gegebenenfalls kontinuierlich weiter zugeführt Man kann auch so vorgehen, daß man die Kulturen zunächst mit herkömmlichen, z. B. zuckerarttgen Stoffen oder anderen Kohlenstoffquellen zu möglichst hohen Zelldichten heranzüchtet und erst danach den abzubauenden Rückstand einsetzt, wobei die Konzentrationen höher liegen können.

Die Emulgierung des Fettes in der Kulturlösung erfolgt mittels bekannter Emulgatoren. Insbesondere werden nichtionogene Emulgatoren, wie z. B. Fettsäuresorbitanester und deren Äthylenoxidaddukte mit 20 bis 200 Mol, vorzugsweise 20 bis 80 Mol Äthylenoxid verwendet Vor Beginn des Anzüchtens wird das verwendete Kulturmedium zweckmäßig durch Erhitzen sterilisiert. Die Inkubationstemperatur beträgt 25 bis 55° C, vorzugsweise 27 bis 39° C Der pH-Wert der Nährlösungen liegt bei pH 4,0 bis 8,0, vorzugsweise 5,0 bis 7,0. Das Kulturverfahren wird vornehmlich unter aeroben Bedingun- gen durch Schütteln oder Rühren und Belüften durchgeführt und erfordert im allgemeinen einen Zeitraum von 1 bis 5 Tagen.

Nachdem der mikrobielle Abbau der Rückstände beendet ist, wird die gesamte Ku'.turlösung mit einem Ii pophilen Lösungsmittel extrahiert, ohne die Zellen vor her abzutrennen. Die Extraktion wird vorzugsweise im Kulturgefäß durchgeführt Als Extraktionsmittel eignen sich beispielsweise Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Cyclohexan oder Benzingemische, Alkohole, wie Butanol

oder Hexanol, Ketone, wie Methylisobutylketon, Äther, wfc Diäthyiäther, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform oder andere übliche Lösungsmittel.

Nach dem Entfernen des Lösungsmittels verbleibt ein mit Cholesterin bzw. Cholesterinestern angereicherter Rückstand. Dieser Rückstand kann entweder als solcher weiter verarbeitet oder zur Gewinnung der reinen Sterine, beispielsweise durch Umkristallisation oder Chromatographie, aufgearbeitet werden.

Beispiel 1

Nocardia paraffinice ATCC 21198 wird 24 Std. bei 30⁰C unter Schütteln in einem Kulturmedium vorgezüchtet, das 1.56% Spezialpepton, 0,28% Hefeextrakt, 0,56% NaCl und 0,1% D( + )-Glukose enthält und einen pH-Wert von 6,8 aufweist. 10 ml dieser Impfkultur werden anschließend in 100 ml Hauptkultur eingeimpft und im 500 ml-Erlenmeyer-koIben auf der Schüttelmaschine bei 30⁰C inkubiert Die Zusammensetzung des Nährmediums der Hauptkultur ist wie folgt:

NaH₂PO₄^ H₂O 0.05%, K₂HPO₄ 0.18%, NH₄NO₃ 0.06%, MgSO₄.? H₂O 0.06%, MnCl₂.4 H₂O 0.02%, FeSO₄J H₂O 0.01%, CaCI₂.2 H₂O 0.01%, Maisquellwasser 0.50%, Sojamehl 0.50%, Tween 80« 0.05%, Fettsäuredestillationsrückstände 2%. Der pH-Wert der Nährlösung beträgt 65. Die Kulturen werden nach 72 Stunden Bebrütung geerntet Die gesamte Kultur wird mit Chloroform extrahiert Nach Abdestillation des Lösungsmittels verbleibt ein schwach gelblicher Rückstand, der zu 80—95% aus Cholestcrmester besteht

Aus 2 g Pettsäure-Destiiiationsrückständen in iOOmi Kulturlösung werden 0,5 g Cholesterin gewonnen.

Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn man den Abbau mit den Spezies Nocardia salmonicolor ATCC 19149 oder Nocardia opaca DSM 363 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Inst f. Mikrobiologie, Göttingen) durchführt

Beispiel 2

Corynebacterium peirophilum ATCC 19080 wird in der gleichen Weise wie unter Beispiel 1 als Impfkultur herangezüchtet und anschließend die geimpfte Hauptkultur bei 37°C auf der Schüttelmaschine inkubiert Die Zusammensetzung des Hauptmediums ist wie folgt:
NaH₂PO₄^ H₂O 0.05%, K₂HPO₄ 0.18%, NH₄NO₃ 0.06%, MgSO₄.? H₂O 0.06%, MnCI₂.4 H₂O 0.02%, FeSO₄J H₂O 0.01%, CaCW H₂O 0.01%, Maisquellwasser 0.80%, Sojamehl 0.50%, Stärke (mit Amylase abgebaut) 1.00%, Fettsäuredestillationsrückstände 0.50%, Tween 80® 0.07%. Der pH-Wert der Nährlösung beträgt 6.5. Nach 36 Stunden Bebrütung werden 10 Fettsäuredestillationsrückstände zugegeben und die Kultur nach weiteren 48 Stunden Bebrütung geerntet

Die Gesamtkultur wird mit Methylisobutylketon extrahiert Nach Trocknen und Abdestillation des Lösungsmittels verbleibt ein nur schwach gefärbter Rückstand, der zu 50—70% aus Cholesterin besteht

Aus 10,5 g Fettsäure-Destillationsrückständen in iOOmi Kulturiösung wurden 2,8g Cholesterin gewonnen.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Gewinnung von Cholesterin und Cholesterinestern aus den Rückständen der Fettverarbeitung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rückstände in emulgierter Form in einem wäßrigen Kulturmedium mit einem Mikroorganismus der Spezies Nocardia paraffinica, Nocardia salmonicolor, Nocardia opaca, Corynebacterium petrophilum bei einer Temperatur von 25 bis 55° C und einem pH-Wert von 4.0 bis 8.0 abbaut und anschließend die angereicherten Sterine durch Lösungsmittelextraktion aus der Kulturlösung abtrennt