DD254028A1 - Verfahren zur kontrolle und steuerung von mikrobiellen stoffwandlungsprozessen - Google Patents

Abstract

Das Verfahren dient der Kontrolle und Steuerung von aeroben oder anaeroben mikrobiellen Stoffwandlungen und kann fuer Produkt- und Biomassebildungsprozesse, wie Gewinnung von Gaerprodukten oder Backhefe, angewendet werden. Basis der Kontrolle und Steuerung der Prozesse ist die spezifische Leistungsfaehigkeit der Mikroorganismen, die eng mit dem Agglutinationsverhalten bei Zugabe agglutinationsausloesender Substanzen korreliert. Erfindungsgemaess wird die aktuelle Geschwindigkeit der Zellagglutination ermittelt, mit einem mikroorganismen- und prozessspezifischen Optimalwert verglichen und bei Abweichungen wird dieser durch entsprechende prozessbeeinflussende Massnahmen korrigiert.

Description

Hierzu 2 Seiten Tabellen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrolle und Steuerung von aeroben oder anaeroben mikrobiellen Stoffwandlungen. Sie kann in all den Prozessen angewandt werden, in denen Eigenschaften der Zelloberfläche eine wesentliche Rolle für die Leistungsfähigkeit der eingesetzten Mikroorganismen haben, wie vorzugsweise bei der Gewinnung von Gärprodukten, wie Ethanol, Butanol, Milchsäure u.a., aber auch bei der Backhefeproduktion u.a.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Verfahren zur mikrobiellen Stoffwandlung sind in großer Zahl bekannt undsie gewinnen zunehmend an Bedeutung. In ihnen werden höchstmögliche Produktivitäten, Produktkonzentrationen und Substratausbeuten angestrebt. Dafür gibt es eine Vielzahl mikrobiologischer, technischer und technologischer Lösungsvorschläge (z. B. neue Mikroorganismen-Stämme, höhere Biomassekonzentrationen, Verringerung der Produktinhibierung, Optimierung des technischen Systems u.a.). Da diese Mikroorganismen sehr leicht Leistungsschwankungen unterliegen, werden hohe Anforderungen an die Kontrolle und Steuerung derartiger Prozesse gestellt.

Ein wesentliches Kriterium für die Leistungsfähigkeit des gesamten Systems der Stoffwandlung ist die spezifische Leistungsfähigkeit der eingesetzten Mikroorganismen. Diese ist von einer großen Anzahl von biotischen und abiotischen Faktoren abhängig (pH-Wert,Temperatur, Limitationen, Inrungen u.a.) und die maximale Leistung wird nur unter optimalen Bedingungen erreicht. Darüber hinaus macht es sich aus ökonomischen Gründen erforderlich, die Mikroorganismen so oft und solange wie möglich einzusetzen, da ihre Neuanzucht zusätzliche Kosten verursacht. Mit der Verlängerung der Einsatzdauer nimmt jedoch in mikroorganismen-spezifischen Zeiträumen die Leistungsfähigkeit ab. So ist es erforderlich, ständig die spezifische Leistungsfähigkeit zu bestimmen, um Veränderungen derselben zu erkennen und rechtzeitig regelnd eingreifen zu können. Zum Beispiel wird die spezifische Produktbildungsgeschwindigkeit auf der Grundlage mehrerer Parameter, wie aktuelle Biomassekonzentration, aktuelle Produktkonzentration, Fermentorinhalt, Verweilzeit, Substratströme u.a., berechnet. Für einige dieser Parameter gibt es Meßgeräte. Insgesamt liegen die Werte aber erst nach längerer Zeit vor, und sie haben keinen aktuellen Bezug zum unmittelbaren Prozeßverlauf, so daß bei einem Absinken der spezifischen Leistung keine unmittelbare Prozeßbeeinflussung mehr möglich ist.

Bekannte Verfahren zur Prozeßkontrolle und -Steuerung dienen meist der Aufrechterhaltung bestimmter Prozeßbedingungen, die vorher als besonders günstig für eine hoheAktivitätderMikroorganismen ermittelt werden (DE-OS 1080048, DE-OS 1442076, DE-OS 1953430, DE-OS 2217909).

Das Ziel der gegenwärtigen Forschung konzentriert sich auf Führungsgrößen für die Prozeßregelung, die mit wichtigen Kenngrößen wie z.B. der spezifischen Produktbildungsrate korrelieren. So wurde in letzter Zeit bekannt, daß zwischen der Dehydrogenase-Aktivität und der Produktbildungsrate eine enge Korrelation besteht (WP-C 12 N/289970). Mit einem darauf basierenden Meßverfahren kann aber nur die potentielle Produktbildungsrate (z.B. das potentielle Gärvermögen bei der Ethanolproduktion) bestimmt werden. .

Damit ist zwar eine Aussage über die unter bestimmten Bedingungen erreichbare Leistung der Mikroorganismen möglich, die tatsächlich im Prozeß erreichte spezifische Leistung läßt sich daraus aber nicht direkt ableiten, da diese vo einer Vielzahl weiterer Einflußgrößen abhängt. So ist die Dehydrogenase-Aktivität als Führungsgröße für die Prozeßregelung mit einer Reihe von Unsicherheitsfaktoren behaftet und eine sichere Prozeßführung nur in Einzelfällen gegeben.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Kontrolle und Steuerung von mikrobiellen Stoffwandlungsprozessen mittels einer Methode zur schnellen und effektiven Charakterisierung des Prozeßzustandes, um unverzüglich auf Störungen des Prozesses Einfluß nehmen zu können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Kenngröße zu ermitteln, die mit der aktuellen spezifischen Leistungsfähigkeit der Mikroorganismen korreliert und auf deren Basis Einfluß auf den Prozeßverlauf genommen werden kann. Mikrobielle Zellen reagieren mit rezeptorspezifischen Proteinen, wie z. B. Immunseren, natürlichen Antikörpern und Lektinen, wenn auf der Zelloberfläche die entsprechenden Rezeptoren vorhanden sind. Die Reaktion läßt sich durch quantitative Bestimmung der Agglutinationsgeschwindigkeit beschreiben.

Die spezifische Leistungsfähigkeit vieler industriell genutzter Mikroorganismen ist in einem wesentlichen Umfang abhängig von Transportv.orgängen zwischen Zellinnerem und dem umgebenden Medium. Substrateintritt und Produktaustritt, und damit verbunden spezifische Umsatzgeschwindigkeiten sowie das Inhibierungsverhalten, werden stark beeinflußt von der Beschaffenheit der Zelloberfläche.

Es wurde gefunden, daß zwischen der unter standardisierten Bedingungen ermittelten Agglutinationsgeschwindigkeit der Mikroorganismen mit den rezeptorspezifischen Proteinen und der spezifischen Leistungsfähigkeit derselben eine enge Korrelation besteht.

Verändert sich auf Grund von beispielsweise Alterungserscheinungen der Zellen oder anderen Einflüssen, wie suboptimalen Fermentationsparametern (pH-Wert,Temperatur u.a.), Limitationen, Inhibierungen, die spezifische Leistungsfähigkeit der Mikroorganismen, so ändert sich ebenfalls die Agglutinationsgeschwindigkeit.

Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe so gelöst, daß das durch die Reaktion von agglutinationsauslösenden Substanzen mit der ZeMwand der eingesetzten Mikroorganismen verursachte Agglutinationsverhalten als direktes Maß für die aktuelle spezifische Leistungsfähigkeit der Mikroorganismen gewählt wird, indem die Geschwindigkeit der Zellagglutination ermittelt und mit einem mikroorganismen- und prozeßspezifischen Optimalwert verglichen wird. Dieser Optimalwert ist ein für den jeweiligen Mikroorganismus und den Prozeß spezifischer Wert, der unter optimalen Bedingungen erreicht wird und der der unter diesen Bedingungen maximal realisierbaren spezifischen Leistungsfähigkeit entspricht.

Als agglutinationsauslösende Substanzen werden Immunseren, natürliche Antikörper oder Lektine eingesetzt. Bei Prozessen zur aeroben Biomassezüchtung oder zur aeroben bzw. aneroben Produktbildung wird eine Verfahrensführung angestrebt, die auf die Konstanz der prozeßspezifischen Optimalwerte gerichtet ist.

In Abhängigkeit von den rezeptorspezifischen Proteinen, die zur Agglutination eingesetzt werden, kann der spezifische Optimalwert ein Maximum oder ein Minimum sein.

So wird die Agglutinationsgeschwindigkeit von beispielsweise einem Fermentationsprozeß entnommenen Mikroorganismenzellen durch Zugabe einer spezifischen agglutinationsauslösenden Substanz sofort quantitativ bestimmt. Daraus lassen sich aufgrund der engen Korrelation aktuelle Werte für die spezifische Leistungsfähigkeit der Mikroorganismen ableiten.

Verringert sie sich, so läßt sich dies sofort anhand der Agglutinationsgeschwindigkeit feststellen, und auf der Basis dieses Signals ist es möglich, unverzüglich regulierend auf den Prozeß einzuwirken, indem z. B. die Aktivität der Biomasse durch Regenerierung oder partiellen Austausch wieder auf ihren spezifischen Optimalwert gebracht wird.

Des weiteren ist auf der Basis der bestimmten Agglutinationsgeschwindigkeit eine Entscheidung darüber möglich, innerhalb welcher Abweichung vom festgelegten Regelwert beispielsweise eine Regenerierung der Biomasse überhaupt noch sinnvoll ist.

Auch für Batch-Prozesse stellt dieses Signal eine wesentliche Führungsgröße dar. So kann hiermit z. B. der Zeitpunkt bestimmtwerden, von dem ab aufgrund der zu geringen spezifischen Leistungsfähigkeit eine Weiterführung nicht mehr effektiv ist. Unnütze Verlängerungen der Fermentationszeiten, die auch zu Ausbeuteverlusten führen, lassen sich damit vermeiden. Die Erfindung soll mit folgenden Beispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

In einem Rührfermentor mit einem Arbeitsvolumen von 51 wurde ein Backhefestamm der Art Saccharomycescerevisiae aerob mit Glucose als Kohlenstoffquelle gezüchtet. Die Glucosezufuhr wurde so gesteuert, daß die extrazelluläre Ethanolkonzentration unter 3 g/l lag. Das Nährmedium enthält alle notwendigen mineralischen Nährstoffe sowie Vitamine in Form von Hefeextrakt für einen Hefezuwachs von ca. 10g Hefetrockensubstanz-fHTS-l/i-.-Die-lmpfhefekonzentration betrug ca. 1 g HTS/1. Die ~~ Fermentationsparameter waren: pH = 4,5 T = 33⁰C, Belüftungsrate = 50l/l.h.

Es wurde die Geschwindigkeit der Agglutination der Backhefe im Verlauf der Reaktion ihrer Zellwand mit Linsenlektin innerhalb von 10 Minuten nach der Entnahme aus dem Fermentor bestimmt. In Abb. 1 sind die Ergebnisse graphisch dargestellt, und zwar neben der Agglutinationsgeschwindigkeit 1, die Ethanolkonzentration 2, die Substratkonzentration 3 und die Biomassekonzentration 4 in Abhängigkeit von der Versuchsdauer.

Die Geschwindigkeit der Agglutination steigt zunächst an, bis die Biomasse 2 eine Konzentration von ca. 10 HTS/I erreicht hat. Ab diesen Zeitpunkt ist eine Abnahme zu verzeichnen, und zwar infolge Auszehrung der Nährlösung und Auftreten von Nährstoff I imitation.

Der Punkt A kennzeichnet das Minimum in der Agglutinationskurve und den Zeitpunkt von Nährstoffgaben in den Fermentor.

Nach Komplettierung der Nährstoffversorgung und Aufhebung der Limitationsbedingungen nimmt die Geschwindigkeit der

Agglutination bis auf einen Maximalwert B wieder zu. *

Es wurde die Triebkraft der Backhefe an den Punkten a und B nach TGL 25111/05 bestimmt..Die Zuordnung der Meßwerte zur jeweiligen Agglutination zeigt die Korrelation zwischen beiden Größen:

Tabelle 1: Korrelation zwischen Agglutination und Triebkraft von Backhefe

Hefe Triebkraft Agglutinationsgeschwindigkeit

mlCO₂/110min. (ΔΕ/min.) .

A 51 0,14

B 87 0,17

Beispiel 2

Im oben beschriebenen Rührfermentor wurde jeweils nach entsprechender aeroben Anzucht und unter Verwendung der angezüchteten Backhefe als Gärhefe gemäß Qualität A bzw. B (siehe Beispiel 1) nacheinander zwei diskontinuierliche ethanolische Gärungen durchgeführt. .

Vor Beginn der Gärungen werden jeweils die Belüftung unterbunden, die Restluft durch CO₂-Begasung aus dem Reaktor verdrängt, portionsweise 135g Glucose/I sowie Nährstoffe für ein Hefezuwachs von ca. lOgHTS/linden Fermentorgegeben. In Tabelle 2 sind die wichtigsten Ergebnisse der beiden Gärprozesse zusammengestellt:

Tabelle 2: Ergebnisse zweier Gärprozesse mit Hefen unterschiedlicher Start-Agglutination

Versuch	Final	Gär	Ethanol-	Agglutinations-	0 anaerob
Hefe	Ethanol-	dauer	synthese	keis
	Konz.		rate0	Start
	g EtOH/l	h	g EtOH/	ΔΕ/min.	0,11
			g HTS.h		0,135
A	60	8	0,3	0,14
B	63	6	0,45	0,17

Die Ergebnisse beider Beispiele machen den Vorteil der Meßgröße Agglutinätionsgeschwindigkeit und ihre Eignung als Prozeßführungsgröße deutlich: Eine hohe Agglutinationsgeschwindigkeit garantiert sowohl eine hohe Triebkraft als auch eine hohe Gäraktivität und kurze Gärdauer während des Gärprozesses. Eine geringe Agglutinationsgeschwindigkeit signalisiert suboptimale aerobe Anzucht- bzw. Gärbedingungen und die Notwendigkeit von Prozeßkorrekturen wie gegebenenfalls einen Hefeaustausch im Gärprozeß.

Beispiel 3

Im oben beschriebenen Rührfermentor wurde mit einem Gärhefestamm derArt Saccharomycescerevisiae, seine maximale Agglutinationsgeschwindigkeit von 0,18AE/min (Extinktionsänderung je Minute) eine kontinuierliche Gärung mit Heferückhaltung durchgeführt. Die Bestimmung der Agglutinationsgeschwindigkeit erfolgte analog Beispiel 1.

Zur Heferückhaltung war der Fermentor mit einem Membranmodul ausgerüstet, das stetig ein hefefreies, ethanol haltiges Filtrat lieferte, während eine Saccharoselösung entsprechend einer Verdünnungsrate von D = 0,25 h"¹ in den Fermentor dosiert wurde. Die Saccharoselösung enthielt alle erforderlichen Nährstoffe und Vitamine, sowie Saccharose in einer Konzentration von 158g RS/I. Die Hefekonzentration betrug 30 g HTS/I und blieb mit Hilfe einer speziellen Regelungstechnik während des Prozesses konstant. Der pH-Wert betrug 4,5 und die Temperatur 33°C.

In Abb. 2 ist der Verlauf der Biomassekonzentration 2 der Agglutinationsgeschwindigkeit 1, der Ethanolkonzentration 3 und der spezifischen Ethanolsyntheserate 4 dargestellt.

Die Gärparameter konnten über einen Zeitraum von 116h konstant gehalten werden. Zwischen der 116. und 117. h war eine Abnahme der Agglutinationsgeschwindigkeit zu verzeichnen, die zum Anlaß genommen wurde die gesamte Hefemasse im Fermentorzum Zeitpunkt C gegen Frischhefe mit einer Agglutinationsgeschwindigkeit von 0,18AE/min auszutauschen.

Die dem Fermentor entnommene Gärhefe wurde einem Regenerierungsfermentor zugeführt, wo mit Hilfe aerober Bedingungen und einer Nährlösungsdosierung in Abhängigkeit von der Prozeßführungsgröße Agglutination, die Hefe mit dem Ergebnis regeneriert wurde, daß die gemessene Agglutinationsgeschwindigkeit am Ende der Behandlung einen Wert von 0,135ΔΕ/min aufwies. Die Gärhefe konnte mit einer guten Gäraktivität einem weiteren analogen Gärprozeß zugeführt werden.

Claims (2)

1. Verfahren zurKontrolle und Steuerung mikrobieller Fermentationsprozesse, dadurch gekennzeichnet, daß die Geschwindigkeit derZellagglutination der Mikroorganismen nach Zugabe agglutinationsauslösender Substanzen unter standardisierten Bedingungen ermittelt und mit einem vorgegebenen, prozeßspezifischen Wert verglichen wird und bei Abweichungen von diesem Wert prozeßbeeinflussende Maßnahmen vorgenommen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Agglutination rezeptorspezifische Proteine wie Antikörper, Lektine oder andere die Agglutination auslösende Substanzen verwendet werden.