DD239221A1 - Verfahren zur gewinnung hochqualitativer biomasse auf kohlenwasserstoffbasis - Google Patents

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Gustav-Adolf Luebbert
Tatjana Lissat
Guenter Heidenreich
Walter Brendler
Joachim Bauch
Manfred Gesche
Klaus Pigorsch
Hans-Joachim Schell
Bernd Behm
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Petrolchemisches Kombinat
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Abstract

Verfahren zur Gewinnung von hochqualitativer Biomasse auf Kohlenwasserstoffbasis im unsterilen Prozess zur Zuechtung von Hefen und biotinliefernden Begleitbakterien durch Regulierung der Zuechtungsbedingungen ohne zusaetzliche technisch-oekonomische Massnahmen, indem durch kontinuierliche p H-Wert-Variation, die mit 10%iger NaOH in Zeitintervallen von 0,03-4 Stunden im Bereich 3,0-4,2 erfolgt, das chemostatische Prinzip fuer die Wasserstoffionenkonzentration aufgehoben wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur industriellen Gewinnung hochqualitativer Hefebiomasse bei der Züchtung von Hefen auf Kohlenwasserstoffen im unsterilen Prozeß. Die Erfindung gehört in das Gebiet der technischen Mikrobiologie.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Es sind zahlreiche Verfahren zur Züchtung von Hefen auf Kohlenwasserstoffen mit dem Ziel der Einzellerproteingewinnung bekannt.
Dabei werden n-alkanverwertende Hefen unter weitestgehend chemostatischen Bedingungen in intensiv sauerstoffversorgten Fermentoren gezüchtet, abgetrennt, getrocknet und gegebenenfalls zum Zwecke der Reinigung extraktiv behandelt.
Während der extraktiven Reinigungsprozesse werden eingelagerte oder adsorbierte Kohlenwasserstoffprodukte mit dem Ziel eines proteinreichen lagerstabilen applikationssicheren Futtereiweißes entfernt (DD 139650, DD 139651).
Für die Erreichung dieser Leistungs- und Qualitätskriterien sind jedoch auch günstige ökologische Voraussetzungen der Züchtung erforderlich.
So ist es zum Beispiel einerseits erforderlich durch Einstellung der H+-Ionenkonzentration zwischen 4—4,2 ein dominierendes Wachstum bakterieller Flora zu unterdrücken, jedoch andererseits gleichzeitig zur Biotinversorgung eine bestimmte bakterielle Begleitflora zu erhalten (DD 157865).
Dies wird in der Regel durch Einstellung eines pH-Wertes bei 4,1—4,2 erreicht. Tiefere pH-Werte beeinträchtigen nicht nur das Hefewachstum negativ, sondern hemmen zusätzlich das Wachstum der erwünschten biotinproduzierenden bakteriellen Begleitflora übermäßig.
Wesentliche chemostatische Voraussetzungen werden beispielsweise an die Gelöst-Sauerstoff-Konzentration gestellt. Innerhalb einer Generationszeit häufig variierende Gelöstsauerstoffkonzentrationsänderungen führen bekannterweise zu erhöhten Veratmungsraten und zur Bildung unerwünschter sauerstoffhaltiger Stoffwechselprodukte.
Um den Anteil unerwünschter eingelagerter oder adsorbierter nicht utilisierter Kohlenwasserstoffe oder nicht vollständig utilisierter biologisch bereits funktionalisierter Kohlenwasserstoffe zu verringern sind beispielsweise auch sogenannte Nachreifestufen bekannt.
Die Nachreifestufen stellen zusätzliche Fermentationsbehälter dar, in denen unter angepaßter verminderter Sauerstoffzufuhr bei relativ langen Verweilzeiten eine weitestgehende Utilisation dieser Stoffe erreicht werden soll. Weiterhin sind Verfahren bekannt, in denen mit pH-Schocks eine Synchronisation des Hefewachstums und damit eine bessere Steuerbarkeit der ökologischen Bedingungen (z.B. Substratzufuhr) für die Hefen erreicht wird (DD 140150, DD 206684). Gemäß DD 218777 ist ein Verfahren zur Beseitigung von Infektionen durch pigmentbildende Mikroorganismen bekannt. Durch die Unterbrechung der Zuführung von alkalischen Medien zur pH-Wert-Regulierung, eine Erhöhung der Phosphatkonzentration im Fermentationsmedium durch Zugabe von Phosphorsäure sowie eine Absenkung der Verweilzeit über einen bestimmten Zeitraum wird eine Ausspülung von Fremdorganismen erreicht. Nachteilig dabei ist, daß auch die biotinliefernden Begleitbakterien durch den pH-Schock geschädigt und ausgespült werden.
Die bekannten Verfahren zielen damit in der Regel auf biochemische und ökologische Züchtungsbedingungen, bei denen die Maximierung der Proteinanteile der Zelle zugunsten einer Minimierung, der eingelagerten Kohlenwasserstoffe sowie von Oxidationsprodukten, die das Ergebnis einer unvollständigen Utilisation sowie auch Endprodukte unerwünschter Stoffwechselwege sowohl der Hefezelle als auch der Begleitbakterienflora sein können.
Ein solches Zellmaterial besitzt dann naturgemäß auch die besten Voraussetzungen für eine technisch ökonomisch günstige Erreichung der Endproduktqualität durch extraktive Reinigung.
Im industriellen Maßstab kann die Realisierung dieses Konzeptes jedoch zu erheblichen Schwierigkeiten und Nachteilen führen.
So ist in industriellen Fermentoren mit einer Größe von mehreren hundert bis tausend m3 Fermentorflüssigkeitsinhalt bereits der konvektive Stofftransport zur Erreichung einer chemostatischen Homogenität problematisch.
Nachreifestufen sind apperateaufwendig und führen nur zu Teilerfolgen.
Industrielle Fermentoren dieses Maßstabes können kaum noch als Rührkessel mit dem Ziel der Erreichung einer angenähert idealen Rührkesselmischcharakteristik realisiert werden. Bekannt geworden sind großvolumige Blasensäulenumlauffermentoren und Strahlfermentoren. Die technischen Merkmale dieser Fermentoren gestatten es häufig nicht, die Lufteintragsstelle zur 02-Versorgung so über das gesamte Reaktorvolumen zu verteilen bzw. diese Stellen konvektivso zu beeinflussen, daß es nicht zu unerwünschten Konzentrationsgradienten im Gelöstsauerstoff kommt.
Die Wärmeabführung an industriellen Fermentoren muß häufig über Außenkühlkreisläufe erfolgen. Das Volumen dieser Kühlkreisläufe entzieht sich ebenfalls über nicht zu vernachlässigende Zeitintervalle jeweils der idealen Durchmischung und Chemostatisierung.
Mischcharakteristik und konvektiver Stofftransport in diesen Fermentoren können somit dazu führen, daß die Zeitintervalle, in denen die Hefen und insbesondere die Begleitbakterienpopulation diesen besonderen Bedingungen ausgesetzt sind, biochemische und ökologische Gegenreaktionen des biol. Systems auslösen, in deren Folge, die Einlagerung von kohlenwasserstoffen oder deren Oxidationsprodukte unerwünscht ansteigen oder chromophore Verbindungen gebildet werden, die den technisch-ökonomischen Aufwand für die Herstellung von Qualitätsfutterhefe ungünstig beeinflussen können.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist ein Verfahren der Hefezüchtung auf Kohlenwasserstoffbasis im unsterilen Prozeß unter industriellen Bedingungen in Großfermentoren zur Gewinnung einer an unerwünschten Kohlenwasserstoffen, Oxidationsprodukten und chromophoren Verbindungen verringerter Rohbiomasse, die in bekannten Verfahren der Lösungsmittelextraktion zu hochwertiger Futterhefe verarbeitet werden kann.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Regulierung der Züchtungsbedingungen ohne zusätzliche technischökonomische Maßnahmen eine Biomasse zu erzeugen, die sich durch einen hohen Wertstoff gehalt auszeichnet. Die technische Aufgabe der Erfindung wird gelöst, indem durch kontinuierliche pH-Wert-Variation, die mit 10%iger NaOH in Zeitintervallen von 0,03 bis 4 Stunden im Bereich 3,0-4,2 erfolgt, das chemostatische Prinzip für die Wasserstoffionenkonzentration aufgehoben wird. Die NaOH-Dosierung erfolgt entweder mittels Dosierlanze über die gesamte Fermentorhöhe oder punktförmig an der Fermentorwand
Unter den genannten Bedingungen werden offensichtlich folgende Wirkungen erzielt:
— Partielle Hemmung der Begleitbakterienflora zur Vermeidung der Abdriftung in unerwünschte Nischen bzw. Ausschaltung unerwünschter Nebenreaktionen ohne übermäßige Minderung der Biotinversorgung,
— Hemmung von Oxidasesystemen, die zur Bildung unerwünschter Oxidationsprodukte führen,
— Einleitung angeregter Zellzustände mit verstärkter Proteinbildung der Hefezellen.
Die auf diese Weise erhaltene Rohbiomasse hatte eine sehr helle Farbe, einen geringen Anteil an extrahierbaren Kohlenwasserstoffen sowie Oxidationsprodukten und ließ sich als Trockenprodukt mittels Lösungsmittelextration zu einer Qualitätstrockenhefe verarbeiten.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung soll an 2 Beispielen der Züchtung von Candida maltosa auf n-paraffinhaltigem Erdöldestillat näher erläutert werden.
Beispiel 1
Zur Züchtung wurde eine kleintechnische Blasensäulenfermentationsanlage, in der wesentliche technische Merkmale eines Industriefermentors sowie in Industriefermentoren näherungsweise herrschende Strömungs- und Stoffübergangsbedingungen, realisiert waren, benutzt.
Der Fermentor hatte ein Volumen von 600 Litern. Das Verhältnis von Durchmesser zur Höhe betrug 1 -2,5. Der Inhalt an begastem Kulturmedium betrug 300kg.
Am Boden des Fermentors wurden über eine Düse von 5 mm Durchmesser ca. 15m3/h Luft eingeblasen. Vom Boden des Fermentors wurden über eine Pumpe ständig ca. 20 m3/h Fermentorflüssigkeit abgezogen und als Außenkreislauf über einen Wärmetauscher in den Fermentor zurückgeführt. Das Volumen des Außenkreislaufes betrug ca. 1201.
Nach einem Batchansatz mit Candida maltosa über 12 Stunden wurde in dem Fermentor kontinuierlich Trinkwasser, eine an Nähr-und Spurensalzen nach bekanntem Verfahren ausbilanzierte Nährlösung sowie 101/h Erdöldestillat einer Siedelage von 230 bis 380°C eingespeist. Der pH-Wert wurde mittels 10%iger NaOH zunächst bei 4,2 konstant gehalten.
Die Dosierung von NaOH erfolgte mittels einer Dosierlanze über die Fermentorhöhe gleichmäßig. Die Gesamtdurchflußrate wurde bei D = 0,16h"1 gehalten.
Das im kontinuierlichen Betrieb anfallende Kulturgemisch wurde einer Dekantation unterworfen. Das abgetrennte Kulturmedium wurde in den Fermentor zurückgeführt. Die Biomasse/Erdöldestillat/Kulturmedium-Suspension wurde separiert und die weitestgehend von Erdöldestillat befreite Hefesuspension chargenweise sprühgetrocknet und anschließend mittels Benzin/ Ethanol/Wasser nach bekanntem Verfahren extrahiert.
Beispiel 2
In der Fermentationsanlage nach Beispiel 1 wurden die gleichen Ausgangsbedingungen eingestellt, wobei die Ergebnisse der Zeile 1 derfolgenden Tabelle entsprachen. Nach 3Tagen wurde die 10%ige Natronlauge anstelle mittels Dosierlanze punktförmig an der Fermentorwand dosiert. Der pH-Wert wurde im oberen Fermentorviertel gemessen und dort auf 4,2 eingestellt. Eine zusätzlich am Fermentorboden angebrachte pH-Messung zeigte einen Wert von 3,5.
Die Umlaufzeit des Fermentationsmedium betrug 0,036 h, so daß der Fermentorinhalt in dieser Zeit einmal dem pH-Wechsel unterworfen war.
Die Aufarbeitung der Hefesuspension erfolgte wie in Beispiel 1.
Die Ergebnisse dieses Regimes sind in Zeile 8 derfolgenden Tabelle analog denen aus Beispiel 1 dargestellt und weisen eine Verbesserung der spezifischen Leistungskennziffern in der gleichen Größenordnung wie in Beispiel 1 aus.
Nach jeweils drei Tagen wurde der pH-Wert im Rhythmus 1,2,4,5 Stunden jeweils zwischen 4,2 und 3,5 sowie 4,2 und 3,0 variiert.
Zur techn.-ökonomischen Bilanzierung des Fermentationsprozesses sowie zur Charakterisierung der erhaltenen extrahierten Futterhefeproben wurden folgende Kennziffern bestimmt:
1. Produktivität in g Hefetrockensubstanz/kg Fermentorinhalt
2. spezifischer Sauerstoffbedarf in g O2/kg HTS
3. Bakterienbegleitflora in 10x Keimen/ml v
4. Farbe des Kulturgemisches
5. Gehalt an Gesamtextrahierbarem (Kohlenwasserstoffe und O2-funktionalisierte Kohlenwasserstoffe im Trockenprodukt)
6. Der Rohrproteingehalt im extrahierten Produkt (nach 5facher Extraktion mittels Benzin/Ethanol/Wasser im Verhältnis 80/18/2 Ma.-%
7. Der Restgehalt an Kohlenwasserstoffen nach der 5fachen Extraktion gemäß 6.
Die Ergebnisse sind in Zeile 1-7 der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt. Angegeben sind der Vergleichszustand mit konstantem pH-Wert 4,2 sowie die Versuche bei 1, 2 und 4 Stunden Variation in den Bereichen 4,2-4,6.
Bei den Versuchen im 5 h-Rhythmus trat ein Absinken der Produktivität ein, so daß dieser Verfahrensbereich für ein industrielles Verfahren keinen techn.-ökon. Fortschritt darstellt.
Die Verbesserungen in den spezifischen Leistungskennziffern liegen in der für industrielle Verfahren zu beachtenden Größenordnung von 5%. Die möglichen Qualitätsverbesserungen sind ebenfalls deutlich.
pH—4,2 konstant 1 2 3 4 5 6 7
pH 4,2-3,6 gHTS gO2 gGE gRP gKW
variiert alle 2 h kg-h g-HTS 1O+ Farbe kg HTS kg HTS kg HTS
pH 4,2-3,6
variiertalle4h 1,85 3,6 5,6-109 bräunlich 22,5 62,4 2,4
pH 4,2-3,6 hellgelb
Fermentationsregime variiertalle 1 h 1,95 3,4 3,4-109 grünlich 19,4 65,1 1,1
1. pH 4,2-3,0 hellgelb
2. variiert alle 2 h 1,86 3,5 3,8-109 grünlich 20,3 64,7 1,2
pH 4,2-3,0 hellgelb
3. variiert alle 4 h 1,9 3,45 3,0-109 grün 20,4 65,0 1,4
pH 4,2-3,0 hellgelb
4. variiertalle 1 h 1,90 3,4 1,6-109 grün 18,7 65,4 1,6
pH 4,2-3,6 hellgelb
5. variiert alle 0,036 h 1,85 3,55 2,4-109 grün 20,2 65,1 1,8
hellgelb
6. 1,88 3,45 1,5-109 19,8 65,3 1,7
hellgelb
7. 1,87 3,5 4,1-109 grünlich 20,3 64,8 1,3
8.

Claims (1)

  1. Erfindungsanspruch:
    Verfahren zur Gewinnung von hochqualitativer Biomasse auf Kohlenwasserstoff basis im unsterilen Prozeß zur Züchtung von Hefen und biotin liefernden Begleitbakterien durch Regulierung der Züchtungsbedingungen, gekennzeichnet dadurch, daß die Regulierung durch kontinuierliche pH-Variation mit 10%iger NaOH in Zeitintervallen von 0,03 bis 4 Stunden im Bereich 3,0-4,2 erfolgt, wobei die NaOH-Dosierung entweder mittels Dosierlanze gleichmäßig über die gesamte Fermentorhöhe oder punktförmig an der Fermentorwand vorgenommen wird.
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