DE1932443A1

DE1932443A1 - Verfahren zum Zuechten von Hefe

Info

Publication number: DE1932443A1
Application number: DE19691932443
Authority: DE
Inventors: Cavallo John James; Hines Paul Richard
Original assignee: Atlantic Richfield Co
Current assignee: Atlantic Richfield Co
Priority date: 1968-06-26
Filing date: 1969-06-26
Publication date: 1970-01-02
Also published as: GB1274885A; BE734297A; US3616249A; NL6909735A; FR2011676A1

Description

PATENTANWÄLTE

dr. W. Schalk · dipl.-ing. P. Wirth · dipl.-ing. G. Dannenberg DR.V. SCHMIED-KOWARZIK ■ DR. P. WEINHOLD · DR. D. GUDEL

.6 FRANKFURT AM MAIN

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BA-14614 Atlantic Richfield Company

717 Fifth Avenue _ _ . .. New York, N.Y. /USA

Verfahren zum Züchten von Hefe

Bekanntlich können bestimmte Mikroorganismen Kohlenwasserstoffverbindungen im Stoffwechsel verarbeiten. Neuerdingp besteht ein beträchtliches Interesse an der Entwicklung von Verfahren zur Herstellung proteiihaltiger Nahrung für den manschlichen und tierischen Verbrauch durch mikrobiologische Umwandlung von Kohlenwasserstoffen.

Zahlreiche Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung von KohlenwasserstoÖverbindungen in Protein enthaltende Nahrungs-r mittel sind z.B. in den US-Patentschriften 3 264 196, 3 268 412, 3 268 413, 3 268 414 und 3 268 419 sowie in der südafrikanischen Patentschrift 655 843 beschrieben.

Es wurden Hefen aus der Familie Cryptococcaceae, insbesondere aus der Unterklasse Cryptococcoideae bevorzugt, es können

jedoch auch ascosporogene Hefen der Unterklasse Saccharomycoideae verwendet werden. Im allgemeinen werden die Unterklassen Torulopsis und Candida der Cryptococcoideae bevorzugt. Candida lipolytica, Candida pulcherrima, Candida utilis und Candida tropicalis sind bekanntlich zweckmäßig Hefen zur Herstellung

\ proteinhaltiger - 2 -

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Nahrung aus Kohlenwasserstoffsubstraten.Andere, in ähnlichen Verfahren geeignete Mikroorganismen sind Bakterien aus der Faimlie Bacillaceae und Pseudomonadaceae und Schimmel aus der Familie Aspergillaceae.

Verfahren und Vorrichtungen zur Erzielung der Nahrungsprodukte sind in den oben genannten Patentschriften beschrieben; eine Vorrichtung zur Durchführung einer derartigen Fermentation ist in der US-Anmeldung Ser.Nr. 723 457 vom 23. April 1968 beschrieben.

Die V/achstumsgeschwindigkeit und Proteinproduktion der Hefe Candida intermedia ist von Miller et al, "Biotechnology and Bioengineering!¹, Bd. VI, Seite 299-307 (1964) untersucht worden. Der identifizierte, als NRRL-Y-6328-1 vom Northern Regional Research Laboratory at Peoria, 111., bezeichnete Organismus wurde als dem Candida intermedia sehr ähnlich genannt. Die Taxonomie der Hefen einschließlich Candida intermedia ist in "The Yeasts - A Taxonomie Study" (Interscience Publishers Inc., New York, 1952) beschrieben; die Isolierung von Candida intermedia ist in den oben genannten Literaturstellen und hier zitierten Veröffentlichungen beschrieben.

Miller et al (s.o.) untersuchte die Wachstumsgeschwindigkeit und Proteinproduktion von Candida intermedia auf normalen Alkanen unter Verwendung einer Nährlösung aus ZnSO^.7H₂O in einer Menge von 800 Mikrogramm pro 1 -(183 Mikrogramm. Zink pro l). Es wurde nun gefunden, daß man eine unerwartete Erhöhung der Wachstumsgeschwindigkeit und Proteinproduktion erreichen kann, indem man die Hefe Candida intermedia

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auf normalen Alkanen unter Verwendung eines Nährmediums mit we seitlich erhöhtem Zinkgehalt züchtet.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Züchten von Hefen, insbesondere Hefen der Art Candida inter- media, auf normalen Alkanen in Anwesenheit eines Nahrmediums, das etwa 8000-10 000 Mikrogramm JZink pro 1 enthält, wobei das Zink als lösliches, nicht-toxisches Salz anwesend ist. Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher hauptsächlich die Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von Nahrungsprodukten mit hohem Proteingehalt aus Kohlenwasserstoffen.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Erhöhung der Hefewachstumsgeschwindigeit auf normalen Alkanen durch Schaffung eines Nahrmediums mit änem Zinkgehalt von etwa 8000-10 000 Mikrogramm pro 1.

Durch das erfindungsgemäße verbesserte Verfahren wird ein Nahrungsprodukt mit erhöhtem Proteingehalt durch Züchtung von Hefe auf normalen Alkanen in Anwesenheit eines Nahrmediums mit einem Gehalt von etwa 8000-10 000 Mikrogramm Zink pro 1 hergestellt.

Das erfindungsgemäße verbesserte Verfahren ergibt weiterhin eine Erhöhung der Wachtsumgeschwindigkeit von Candida intermedia auf normalen Alkanen und eine Erhöhung des Proteingehaltes der Hefezellen, indem man die Hefe Candida intermedia auf normalen Alkanen in Anwesenheit eines Nährmediums mit einem Gehalt von etwa 9000 Mikrogramm Zink pro 1 züchtet.

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Das erfindungsgemäße Verfahren,erfolgt vorzugsweise nach dem von Miller at al beschriebenen Verfahren (s.o.) und unter Verwendung des genannten ,Organismus Candida intermedia.

Das eVerfahren erfolgt in einem Fermeintationsgefäß bei einer Temperatur von etwa 25-4O⁰C, vorzugsweise etwa 3>0°C. Zur Aufrechterhaltung aerober Bedingungen im Fermentationsreaktor wird Sauerstoff oder ein sauerstoff haltiges Gas, wie luft, verwendet.

Das Verfahren kann kontinuierlich oder absatzweise erfolgen. Der. pH-Wert wird in jedem Falls zwischen 4,5 und 6,5, vorzugsweise bei etwa 5»5 gehalten, und zwar durch geregelte Ammoniakzugabe, vorzugsweise als 5-3o-%ige wässrige Ammoniumhydroxydlösung. · :

Der Substratkohlenwasserstoff ,wird dem System vorzugsweise automatisch in Mengen, die dem Ammoni-.umhydroxydniveau proportional sind, zugegeben; er kann jedoch auch absatzweise zugefügt werden, um zu bestimmten Zeitpunkten während der Fermentation, wenn das im Reaktor anwesende Substrat ver-, braucht ist, vorherbestimmte Mengen zu ergeben.

Die Fermentation erfolgt in Anwesenheit eines Nährmediums, das eine Stickstoffquelle, eine Phosphatquelle und verschiedene Spurenmetalle einschließlich Zink, vorzugsweise in Form von Zinksulfat, enthält. Das Zink kann jedoch auch als irgendein lösliches, nicht-toxisches Salz, wie Zinkacetat, Zinkacetylacetonat, Zinkchlorid, Zinkeitrat, Zinktartrat usw., anwesend sein; Auch die Spurenmetalle sind vorzugsweise als Sulfat oder

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Chlorid anwesend und können in jeder Form vorliegen, die löslich und gegenüber dem im System anwesenden Organismus nicht-toxisch ist. ·\

Unter diesen Bedingungen lagen die Fermentationszeiten um oder über 30 Stunden. Die optimalen Fermentationszeiten werden durch Verfolgen der Wachstumsgeschwindigkeit bestimmt. Anfänjlch ist das Wachstum verhältnismäßig langsam. Dann erhöht sich die Wachstumsgeschwindigkeit auf einen höheren, als "exponentiale Wachstumgsphase" bekannten Wert, und schließlich wird die cellulare Dichte im System konstant, wenn sich die Wachstumsgeschwindigkeit vermindert. Die Hefezellen werden gewöhnlich bei oder um das Ende der exponentialen Wachstumgsphase geerntet.

Unter diesen Wachstumsbedingungen wurden unter Anwendung bekannter Verfaren, insbesondere des Verfahrens von Miller (s o.), Rohproteinausbeuten von etwa 30 % erhalten.

Nun wurde jedoch gefunden, daß durch Erhöhung der Zinkkonzentration im Nährmedium um etwa das Fünfzigfache im Vergleich zum Zinkgehalt im Nährmedium von Miller die Fermentationszeit bei einer^ wes-entlichen Erhöhung der Rohproteinausbeute vermindert werden kann. Gemäß Miller trat z.B. ein befriedigendes Wachstum und Proteinproduktion auf, wenn das Nährmedium 800 Mikrogramm ZnSO^.7HgO enthielt, was etwa 183 Mikrogramm Zink pro 1 entsprach. Im Gegensatz dazu wurde nun jedoch gefunden, daß eine fünfzigfache Erhöhung des Zinkgehaltes, d.h. 4 χ 10 Mikrogramm ZnSO^.7H₂O .(912O Mikrogramm Zink) pro 1 im Nährmedium Die Wachstumsgeschwindigkeit sowie den Proteingehalt der gebildeten Hefe wesentlich erhöht.

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Dieses überraschende Ergebnis wird durch die folgenden Vergleichsversuche deutlich gemacht. Es wurden zwei Nährmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

KH₂PO₄
NH₄Cl

CaCl₂.2H₂O MgSO₄.7H₂O CuSO₄.5H₂O K.J

FeCl₅.6H₂O MnSO₄.H₂O
Na₂MoO₄.H₂O ZnSO₄.7H₂O dest. Wasser

Nach Einstellung des pH-Wertes der-Medien auf 5,5 vurden die Lösungen 55 Minuten bei 120⁰C. und 1,0$ atü sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde 1 1 Medium I in einen sterilen 5-1-Fermentor eingeführt. Das System wurde mit 11 einer 48-stündigen Kultur von im obigen Medium gezüchteten Candida intermedia beimpft; dann wurden 2,8 ecm einer n-Alkanmischung, die normale Alkane unterschiedlicher Kettenlänge von Cjg bis C₂₂ enthielt, eingeführt. Dem System wurde Sauerstoff mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Vol/Vol/min zugeführt, und die flüssige Phase wurde durch einen Propellerrührer bei 750 Umdr./min gerührt« Der pH-Wert wurde durch stündliche Zugaben von NH₄OH in Mengen von 1,1-3,5 ccm/std auf eine Gesamtmenge von 63,1 ecm zwischen 5,5-5,7 gehalten. Gleichzeitig mit dem

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stellt: Medium I	Medium II
7,5 g	7,5 g.
7,0 g	. 7,0 g
• 0,5 g	0,5 g
3,8 g	3,8 g
80 /Ug	80 /Ug
200 /Ug	200 /Ug ·
400 /Ug	400 /Ug
800 zug	800 /Ug
400 /Ug	400/Ug
8'.CO /Ug	40000/Ug
1000 ecm	1000 ecm

ΝΗλΟΗ wurde Kohlenwasserstoffsubstrat in Mengen von 0,7-2,3 ccm/std auf eine Gesautmente von 44,6 ecm zugegeben.

Die. Fermentation wurde fortgesetzt, bis der NH^OH Verbrauch aufhörte. Dann wurden die Zellei>geerntet und einer gesamten Stickstoflanalyse unterworfen. Die Fermentation unter Verwendung von Medium Π erfolgt in derselben Weise. Die Daten aus den beiden Versuchen und die Ergebnisse der Sticlcstoffanalysen sind in Tabelle 1 aufgeführt»

Tabelle 1

Vers. Nr.	ZnSO^	Konzentr. /ug/l	Ferm. zeit	Zellenaus beute; %	Stickstoff insgesamt;%	Protein ausbeute
1 2	800 4 χ		27 20	82,3 81,3	6,00 7,58	30,8 38,5

Aus den Daten von Tabelle 1 ist ersichtlich, daß neben einer wesentlichen Verminderung der Fermentationszeit eine wesentr liehe Erhöhung der Rohproteiiiausbeirne erreicht wird^ Die Fermentationszeit wurde um 26 % vermindert, während sich die Rohproteinausbeute durch Verwendung von Medium II mit dem hohen Zinkgehalt im Vergleich zu Medium I, das im wesentlichen dem von Miller beschriebenen Medium entspricht, um 26 % erhöhte.

Obgleich diese Daten deutlich die unerwartete Erhöhung der Proteinausbeute sogar bei niedrigeren Fermentationszeiten für

C₁g bis Cg₂ n-Alkane zeigen, ist es klar, daß ähnliche Ergebnisse auch durch Verwendung der von Miller et al beschriebenen n-Alkane erzielt werden könnten. Daher werden .erfindungsgemäß · die n-Alkane im allgemeinen und n-Alkane mit einer Kettenlänge ■von etwa C₁₂ bis C₂₂ im besonderen umfaßt.

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Die verfügbaren Versuchsdaten zeigen, daß im Nährmedium der bevorzugte Zinkgehalt bei etwa 9000 Mikrogramm pro 1 liegt, vorteilhafte Ergebnisse könnnen jedoch auch mit Zinkgehalten von etwa 8000-10000 Mikrogramm pro 1 Natriumedium ersielt werden.

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Claims

1932U3 Patentansprüche

1.- Verfahren zum Züchten von Candida intermedia auf normalen Alkanen in Anwesenheit' einer Nährlösung zur Herstellung proteinhaltiger Nahrung, dadurch gekennzeichnet, daß man ein schnelleres Wachstum der Hefe und einen höheren Proteingehalt der Nahrung einleitet, indem man die Züchtung der Hefe- in Anwesenheit von etwa 8000-10000 Mikrogramm Zink pro 1 Nährmedium durchführt, wobei das Zink als wasserlösliches, nichttoxisches Zinksalz anwesend ist.

2,- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 25-40°C. und einem pH-Wert des Nährmediums von etwa 4,5-6,5 durchgeführt wird,

3.- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung der Hefe in Anwesenheit von ZnSO^.7HpO durchgeführt wird.

4,- Verfahren nach Anspruch 3_r dadurch gekennzeichnet, daß 40000 Mikrogramm ZnSO^.7HgO pro 1 Nährmedium anwesend sind.

Der Patentanwalt:

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