DE2514638A1 - Verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung enzymkatalysierter redoxreaktionen - Google Patents

Description

• Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung enzymkatalysierter Redoxreaktionen In der biochemischen Analytik und medizinischen Labordiagnostik ist es bekannt, die quantitative Bestimmung oxydierbarer oder reduzierbarer Stoffe, wie beispielsweise die Bestimmung von Glucose, von organischen Säuren oder von Alkoholen, mit Hilfe biochemischer Reaktionen durchzuführen, die durch Enzyme katalysiert werden. Eine bestimmte Gruppe von Enzymen, die auch als Oxydoreduktasen bezeichnet werden, führt den umzusetzenden Substanzen mit Hilfe von Cosubstraten Wasserstoff zu oder eliminiert mit Hilfe dieser Cosubstrate Wasserstoff aus diesen Substraten. Dabei gibt das Cosubstrat entweder ein Wasserstoffatom ab oder nimmt ein solches auf. Bekannte Cosubstrate für derartige enzymkatalysierte Redoxreaktionen in fluider Phase sind beispielsweise Nikotinamid-adenin-dinucleotid und Nikotinamid-adenindinucleotid -phosphat in der oxydierten Form (abgekürzt NAD und NADP) bzw. in der reduzierten Form (abgekürzt NADH und NADPH). Die Menge der zu bestimmenden Verbindung wurde anhand der Menge des in der Reaktion oxydierten oder reduzierten Cosubstrats ermittelt.
• Weiterhin ist es aus "Z.Anal.Chem.", 1972, Seiten 333 bis 336, bekannt, Glucose mit Hilfe eines geschlossenen Kreislaufsystems quantitativ zu bestimmen, wobei eine Behandlungslösung, in welche die zu bestimmende Probe eingeführt wird, von einem Vorratsbehälter über trägerfixierte Enzyme, die die Redoxreaktion katalysieren, anschließend über einen Elektrodendetektor und zurück zum Vorratsbehälter geführt wird. Das trägerfixierte Enzym ist in diesem Fall Glucose-Oxydase, die die Reaktion von Glucose mit Sauerstoff zu Gluconat katalysiert, und der Elektrodendedektor bestimmt in d8sem Fall die Sauerstoffabnahme in der Behandlungslösung unmittelbar nach dem Durchgang durch die trägerfixierten Enzyme.
• Bei den bisherigen Verfahren war es üblich, die Cosubstrate nach der Reaktion mit dem fluidenSystem wegzuwerfen, was im Hinblick auf die hohen Gewinnungskosten. dieser Cosubstrate das Verfahren bereits in der analytischen Chemie unwirtschaftlich macht und seine Anwendung in der präparativen Chemie völlig ausschließt.
• Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Wirtschaftlichkeit enzymkatalysierter Redoxreaktionen unter Verwendung von Cosubstraten zu erhöhen und ein geschlossenes Kreislaufsystem zu bekommen, das für eine möglichst große Vielzahl katalytischer Bestimmungen oder sogar für die präparative Chemie verwendet werden kann. Ein weiteres Ziel besteht darin, die analytische Bestimmung mit Hilfe derartigerenzymkatalysierter Redoxreaktionen zu dptimieren und den Zeitbedarf für derartige Bestimmungen soweit wie möglich zu verkürzen. Noch ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu bekommen, mit Hilfe derer in einem einzigen geschlossenen Kreislauf-System gleicnzeitig verschiedene Bestandteile einer zu untersuchenden Probe durch enzymkatalysierte Redoxreaktionen quantitativ bestimmt werden können.
• Das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung enzymkatalysierter Redoxreaktionen durch Kreislaufführung einer wäßrigen Behandlungslösung, die ein Wasserstoff aufnehmendes oder abgebendes Cosubstrat enthält, von einem Vorratsbehälter über wenigstens ein trägerfixiertes, die Redoxreaktion katalysierendes Enzym und zurück zu dem Vorratsbehälter und Einführung der umzusetzenden Substanz in die Behandlungslösung vor den trägerfixierten Enzymen ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlungslösung nach dem Durchgang durch die trägerfixierten, die Redoxreaktion katalysierenden Enzyme und vor der Rückführung zu dem Vorratsbehälter mit wenigstens einem trägerfixierten, das Cosubstrat regenerierenden Enzym in Kontakt bringt und der Behandlungslösung ein dem regenerierenden Enzym homologes, Wasserstoff aufnehmendes oder abgehendes wasserlösliches Substrat zusetzt.
• Die Art der trägerfixierten Enzyme für die Regenerierung des-Cosubstrates hängt von dem Cosubstrat ab, da Enzyme in ihrer katalytischen Wirkung spezifisch sind. Wenn beispielweise als Cosubstrat NADP verwendet wird, welches in der enzymkatalysierten Redoxreaktion zu NADPH reduziert wird, muß für die Regenerierung ein Enzym oder Enzymgemisch ausgewählt werden, das das NADPH zu NADPzurückoxydiert.
• Allgemein können für die Regenerierung einzelne trägerfixierte Enzyme oder im Gemisch miteinander auf einem Träger fixierte Enzymgemische oder mehrere jeweils einzeln auf einem Träger fixierte, hintereinander angeordnete Enzynikombinationen verwendet werden oder erforderlich sein.
• Bei Verwendung von NADP als Cosubstrat ist es zweckmäßig, als regenerierendes Enzym Glutathion-Reductase oder bevorzugt L-Xylulose-Reductase zu verwenden. Im ersteren Falle wird der aeandlugslsung als homologes Substrat Glutathion zugesetzt,' das das Wasserstoffatom von dem zu regenerierenden NADPH aufnimmt, im letzteren Fall wird zu diesem Zweck L-Xylulose zugegeben.
• Die Verwendung von L-Xylulose-Reductase als regenerierendes trägerfixiertes Enzym ist beSonders zweckmäßig, da auf diese Weise die Regenerierung beschleunigt wird und auch bei kleineren Säulengrößen eine vollständige Regenerierung gewährleistet.
• Verwendet man als Cosubstrat NAD, so benützt man als regenerierendes Enzym vorzugsweise trägerfixierte Aldolase und trägerfixierte Glyc-in-3-phosphat-Dehydrogenase, die wiederum im Gemisch auf einem Träger fixiert oder auf getrennten Trägern einzeln fixiert und hintereinander, etwa in einer Säule, angeordnet sein können. Diese Enzymkombination regeneriert das in der Redoxreaktion entstandene NADH zu NAD.
• 1 Im Falle der Verwendung von NADH als Cosubstrat, welches in der Redoxreaktion zu NAD oxydiert wird, benützt man zweckmäßig als regenerierendes Enzym trägerfixierte Alkohol-Dehydrogenase, wobei der Behandlungslösung in diesem Fall als homologes Substrat Äthanol zugesetzt wird. Im Falle der Verwendung von NADPH als Cosubstrat ist für die Regenerierung des in der Redoxreaktion gebildeten NADP trägerfixierte Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase geeignet.
• Das vorliegende Verfahren ist jedoch nicht auf die oben aufgezeigten Enzymsysteme beschränkt, sondern je nach dem verwendeten Cosubstrat können auch andere, zum Teil in der Literatur beschriebene Enzyme und Enzymsysteme zur Regenerierung herangezogen werden.
• Die regenerierenden Enzyme werden ebenso wie die Enzyme, die die Redoxreaktion katalysieren, auf an sich bekannten Enzymträgern fixiert, wie beispielsweise auf rleaktionsfähigen Polymeren, wie vernetztem Maleinsäureanhydrid, anorganischen Trägern, wie porösem Glas, und Naturstoffen, wie Cellulose, Agarose, Chitin und quervernetzten Dextrangelen, sowie auch auf 5ischpolymerisaten von Polystyrol und Polyacrylamid.
• Besonders geeignet als Enzymträger für das vorliegende Verfahren ist Agarose, die gegebenenfalls modifiziert sein kann, wie beispielsweise durch CNBr oder durch sogenannte "Spacer, d.h. organische Reste, wie durch Succinylierung oder Umsetzung mit 1,6-Diaminohexan oder 5-Aminohexancarbonsäure in die Agarose eingeführte Reste.
• Das erfindungsgemäße Verfahren kann, da die gesamten Enzyme in dem Kreislauf regeneriert werden und daher erhalten bleiben, auch in der präparativen Chemie eingesetzt werden, indem man die durch Redoxreaktion umzusetzende Substanz nach dem Durchgang dumhdie die Redoxreaktion katalysierenden trägerfixierten Enzyme aus der Behandlungslösung isoliert und die Behandlungslösung sodann aber die das Cosubstrat regenerierenden trägerfixierten Enzymen zu dem Vorratsbehälter zurückführt. Die Isolierung der durch die Redoxreaktion umgesetzten Substanz kann in üblicher Weise, je nach der speziellen Substanz, erfolgen, wie beispielsweise durch Auskristallisieren, Ausfällung oder Extrahieren.
• Besondere Bedeutung wird das erfindungsgemäße Verfahren aber für die quantitative analytische Bestimmung von durch Redoxreaktionen umsetzbaren Substanzen sein, wie beispielsweise zur quantitativen Bestimmung von Glucose, Fructose, Äthanol, Zitronensäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Weinsäure oder Harnstoff. Für die quantitative analytische Bestimmung solcher Verbindungen stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine starke Vereinfachung dar, da durch das Kreislaufsystem unter vollständiger Regenerierung aller Enzyme erst nach sehr langer Zeit ein Austausch der Behandlungslösung und eventuell der trägerfixierten Enzyme erforderlich wird, wie beispielsweise nach mehr als 10 000 analytischen Bestimmungen, da für die allmähliche Deaktivierung der träger fixierten Enzyme im vorliegenden Verfahren einzig und allein die unvermeidbare, in geringem Umfang nach und nach auftretende Eiweiß-Denaturierung verantwortlich ist.
• Für die quantitative analytische Bestimmung der durch eine Redoxreaktion umsetzbaren Substanz an Hand der Menge des umgesetzten Cosubstrates geht man so vor, daß man in dem oben - .hSebenen erfindungsgemäßen Verfahren die Cosubstratkonzentration der Behandlungslösung nach dem Durchgang der Behandlungslösung durch die die Redoxreaktion katalysierenden trägerfixierten Enzyme, aber vor der Regenerierung des Cosubstrates, bestimmt. Diese Bestimmung kann in an sich bekannter Weise beispielsweise mit einem Fotometer erfolgen.
• Es sind aber auch andere Meßinstrumente denkbar.
• Besonders zweckmäßig ist es, die Cosubstratkonzentration der Behandlungslösung zusätzlich noch vor dem Durchgang durch die die Redoxreaktion katalysierenden trägerfixierten Enzyme zu bestimmen, um durch Vergleich der Werte vor und nach dem Durchgang durch die trägerfixierten Enzyme, die die die Redoxreaktion katalysieren, genau Veränderung der Cosubstratkonzentration zu bekommen.
• Für die Durchführung des analytischen Verfahrens nach dieser Ausführungsform wählt man zweckmäßig eine Vorrichtung nach der Erfindung, die in Reihe hintereinander geschaltet aus einem Vorratsbehälter mit Behandlungslösung, einer Einführvorrichtung für die umzusetzenden Substanzen, wenigstens einer Säule mit trägerfixiertem, die Redoxreaktion katalysierendem Enzym, einer Meßeinrichtung zur Bestimmung der Cosubstratkonzentration in der Behandlungslösung, wenigstens einer Säule mit trägerfixiertem, das Cosubstrat regenerierendem Enzym und einer Verbindung von der letzten Regeneriersäule zu dem Vorratsbehälter mit Behandlungslösung besteht.
• Vorzugsweise ist zusätzlich vor der Säule oder den Säulen mit trägerfixiertem, die Redoxreaktion katalysierendem Enzym eine weitere Meßeinrichtung zur Bestimmung der Cosubstratkonzentration in der Behandlungslösung eingeschaltet. In jedem Fall bekommt ma'n also einen geschlossenen Kreislauf, bei dem mit Hilfe einer Pumpe die Behandlungslösung von dem Vorratsbehälter über die verschiedenen Säulen mit trägerfixiertem Enzym und zurück zum Vorratsbehälter gepumpt wird, wobei in Fließrichtung hinter dem Vorratsbehälter und vor den Säulen mit trägerfixiertem Enzym Proben der zu katalysierenden Substanz etwa mit Pipetten oder, gegebenenfalls automatischen, Probenventilen, eingegeben werden.
• In vielen Fällen kann es erforderlich oder zweckmäßig sein, mehrere in der zu untersuchenden Substanz vorliegende Stoffe oder Komponenten nebeneinander zu bestimmen, und für eine solche Analyse eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch besonders. In diesem Fall wird die Behandlungslösung über voneinander getrennte, in Reihe hintereinandergeschaltete trägerfixierte Enzyme oder Enzymkombinationen geleitet, die jeweils spezifisch für die Redoxreaktion einer Komponente in der zu untersuchenden Substanz sind, und jeweils hinter einem solchen für sich getrennten trägerfixierten Enzym bzw. einer solchen trägerfixierten Enzymkombination wird dann die Cosubstratkonzentration mit Hilfe einer üblichen Einrichtung, wie eines Fotometers, bestimmt.
• Die Vorrichtung nach der Erfindung zur Durchführung einer solchen Variante des erfindungsgemaßen Verfahrens besitzt mehrere in Reihe hintereinandergeschaltete Säulen mit unterschiedlichen trägerfixierten, die Redoxreaktion jeweils einer Komponente des zu untersuchenden Gemisches katalysierenden Enzymen oder Enzymkombinationen sowie jeweils eine jeder dieser Säulen nachgeschaltete Meßeinrichtung zur Bestimmung der Cosubstratkonzentration in der Behandlungslösung, wie eine Durchflußküvette eines Fotometers.
• Bei dieser Verfahrensvariante läßt sich beispielsweise Glucose und Fructose nebeneinander bestimmen, wobei die Extinktion des Fotometers für den Fructosewert mit der Extinktion des Glucosewertes addiert wird. Auf diese Weise lassen sich aber auch beispielsweise Zitronensäure, Milchsäure, Äpfelsäure und Weinsäure in einem System nebeneinander bestimmen.
• Nach diesem Grundsystem der Einzelbestimmungen nebeneinander läßt sich eine universell verwendbare analytische Apparatur herstellen, die eine Reihe von Säulen mit unterschiedlichen, jeweils für eine spezielle Substanz spezifischen trägerfixierten Enzymen oder Enzymkombinationen sowie Umschaltmöglichkeiten für den Kreislauffluß für die Behandlungslösung derart aufweist, daß eine beliebige Zahl und Kombination dieser Säulen in den Kreislauffluß der Behandlungslösung eingeschaltet werden kann. Auf diese Weise läßt sich mit einer universell verwendbaren analytischen Apparatur für jeden Einzelfall bestimmen, welche Komponenten in dem Ausgangssubstanzgemisch quantitativ analysiert werden sollen.
• In einer solchen Vorrichtung sind alle Säulen mit trägerfixierten Enzymen in Reihe hintereinandergeschaltet, wobei jedoch jeweils eine Umgehungsleitung vorgesehen ist, die es gestattet, etwa durch eingeschaltete Absperrhähne, jede der Säulen mit trägerfixiertem Enzym in den Kreislauffluß der Behandlungslösung einzuschalten oder aus diesem Kreislauf auszuschalten.
• Die Zeichnung zeigt an Hand dreier Beispiele einige Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und in schematischer Darstellung hierfür verwendbarer Vorrichtungen.
• Fig.l zeigt in schematischer Darstellung Vorrichtung und Fließschema des Verfahrens nach der Erfindung für die analytische Bestimmung einer einzelnen Substanz oder eines Komponentengemisches ohne Auftrennung.
• Fig.2 zeigt in schematischer Darstellung ein anderes Verfahrens schema und eine hierfür verwendbare Vorrichtung nach der Erfindung zur Bestimmung zweier Komponenten nebeneinander in einem Substanzgemisch.
• Fig.3 zeigt'schließlich ein Verfahrensschema und eine Vorrichtung für eine Variante nach der Erfindung, bei der nebeneinander vier Substanzen bestimmt werden.
• In Fig.l besteht die verwendete Vorrichtung aus dem Vorratsbehälter 1 für eine kreislaufgeführte Behandlungslösungf einem Probenventil 2, einer ersten Durchflußküvette 3 eines nicht gezeigten Fotometers, einer Säule 4 mit einer Kombination von trägerfixierten Enzymen, die die Redoxreaktion katalysieren, einer zweiten Durchflußküvette 5 eines nicht gezeigten Fotometers und einer Regeneriersäule 6.
• Wenn man mit diesem System beispielsweise die Gesamtmenge von Saccharose, Glucose und Fructose bestimmen will, verwendet man beispielsweise eine im Kreislauf zu führende wäßrige Behandlungslösung mit folgenden Komponenten je 500 ml : 400 mg NADP-Na2, 1,0 g Adenosintriphosphat, 0,5 g Natriumazid, 0,5 g Magnesiumsulfat, 1,3 g Glutathion und 0,3 m Triäthanolaminpuffer vom pH 7,&. In der Säule 4 wurde eine trägerfixierte Enzymkombination aus einem Gemisch von ß-Eructosidase, Hexokinase, Phosphoglucose-Isomerase (PGI) und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6P-DH) auf mit CNBr aktivierter Agarose verwendet. In der Regeneriersäule wurde auf dem gleichen Träger fixierte Glutathion-Reductase verwendet. Von dem Vorratsbehälter 1 wurde die Behandlungslösung mit einer nicht gezeigten Pumpe an dem Probenventil 2 vorbei durch die Durchflußküvette 3 über die Säule 4 geschickt, in der die Redoxreaktion mit den Zuckern stattfand und gleichzeitig das Cosubstrat NADP zu NADPH reduziert wurde.
• Die t;ADPH-Konzentration wurde vor der Säule 4 beim Durchgang durch die Durchflußküvette 3 und nach der Säule 4 beim Durchgang durch die Durchflußküvette 5 fotometrisch bestimmt, wobei sich aus der Extinktionsdifferenz beider Bestimmungen der Gesamtzuckergehalt der untersuchten Probe ergibt. Von der Durchflußküvette 5 aus gelangt die Behandlungslösung in die Regeneriersäule 6, die sie von unten nach oben durch strömt. Dabei wird das in der Säule 4 gebildete NADPH zu NADP regeneriert und gelangt zurück in den Vorratsbehälter 1.
• Bei anderer Wahl der träger fixierten Enzyme können in diesem System selbstverständlich auch andere Bestimmungen vorgenommen und andere Cosubstrate verwendet werden.
• Fig.2 zeigt ein bevorzugtes Verfahrensschema nach der Erfindung zur gleichzeitigen Bestimmung von Glucose und Fructose nebeneinander in einem Verfahrenskreislauf. In diesem Fall gelangt die Behandlungslösung von dem Vorratsbehälter 11 über das Probenventil 12 zu vier in Reihe hintereinandergeschalteten Säulen 13 bis 16 mit den trägerfixierten, die Redoxreaktion katalysierenden Enzymen und danach über die Regeneriersäule 19 zurück zu dein Vorratsbehälter 11. Zwischen den Säulen 14 und 15 ist die Durchflußküvette 17 und zwischen den Säulen 16 und 19 die Durchflußküvette 18 eines Fotometers eingeschaltet.
• Die Behandlungslösung ist im wesentlichen die gleiche wie die in Fig.l verwendete, doch enthält sie statt Glutathion L-Xylulose und in der Regeneriersäulel9 statt Glutathion-Reductase L-Xylulose-Reductase. Die Säule 13 enthält trägerfixierte Hexocinase, die Säule 14 trägerfixiertes Enzym G6P-De, die Säule 15 trägerfixiertes Enzym PGI und die Säule 16 wiederum trägerfixiertes Enzym G6P-DH.
• Diese Verfahrensvariante hat gegenüber der in Fig.l gezeigten den Vorteil, daß in einem Verfahrensgang und mit einer Probeneinspritzung Fructose und Glucose nebeneinander quantitativ bestimmt werden, da im Hinblick auf die Verwendung der L-Xylulose-Reductase eine relativ kleine Regeneriersäule 19 verwendet werden kann.
• Das in Fig.3 gezeigte Verfahrensschema ist dazu bestimmt, gleichzeitig nebeneinander in einem Verfahrensgang und bei einer Probe Zitronensäure, Milchsäure, Äpfelsäure und Weinsäure zu bestimmen. Hierzu wird von einem Vorratsbehälter 21 aus Behandlungslösung über das Probenventil 22 zu vier in Reihe hintereinandergeschalteten Säulen 23 bis 26 geschickt, denen die Regeneriersäule 27 nachgeschaltet ist. Jeweils zwischen zwei der Säulen 23 bis 26 ist eine der Durchflußküvetten 28, 29 und 30 eingeschaltet, und zwischen die Säule 26 und die Regeneriersäule 27 ist die Durchflußküvette 31 eingeschaltet. Die Aufzeichnung der Extinktionen der Durchflußküvetten 29 und 30 erfolgt mit dem Schreiber 32, die der Durchflußküvetten 28 und 31 mit dem Schreiber 33.
• Die Säule 23 enthält auf Agarose fixierte Lactat-Dehydrogenase und Glutamat-Pyrovat-Transaminase, die Säule 24 auf Agarose fixierte Malat-Dehydrogenase und Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, die Säule 25 auf Agarose fixierte Oitrat-Lyase, Malat-Dehydrogenase, Glutamat-Pyruvat-Transaminase, Lactat-Dehydrogenase und Glutamat-Oxalacetat-Transaminase und die Säule 26 auf Agarose fixierte Tartrat-Dehydrogenase. Die Regeneriersäule enthält auf Agarose fixierte Aldolase und Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase.
• Als Cosubstrat wurde in diesem System NAD verwendet, das in den Säulen 23 bis 26 in NAUH umgewandelt wurde, welches letzteres in der Regeneriersnule 27 in NAD zurück verwandelt wurde.

Claims (11)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Durchführung enzymkatalysierter Redoxroaktionen durch Kreislaufführung einer wäßrigen Behandlungslösung, die ein Wasserstoff aufnehmendes oder abgebendes Cosubstrat enthält, von einem Vorratsbehälter über wenigstens ein trägerfixiertes, die Redoxreaktion katalysierendes Enzym und zurück zu dem Vorratsbehälter und Einführung einer umzusetzenden Substanz in die Behandlungslösung vor den trägerfixierten Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlungslösung nach dem Durchgang durch die trägerfixierten die Redoxreaktion katalysierenden Enzyme und vor der Rückführung zu dem Vorratsbehälter mit wenigstens einem trägerfixierten, das Cosubstrat regenerierenden Enzym in Kontakt bringt und der Behandlungslösung ein dem regenerierenden Enzym homologes, Wasserstoff aufnehmendes oder abgebendes wasserlösliches Substrat zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur quantitativen analytischen Bestimmung einer durch eine Redoxreaktion umsetzbaren Substanz an Hand der Menge des dabei umgesetzten Cosubstrates,dadurch gekennzeichnet, daß man die Cosubstratkonzentration der Behandlungslösung nach dem Durchgang der Behandlungslösung durch die die Redoxreaktion katalysierenden trägerfixierten Enzyme, aber vor der Regenerierung des Cosubstrates, bestimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Cosubstratkonzentration der Behandlungslösung zusätzlich vor dem Durchgang durch die die Redoxreaktion katalysierenden trägerfixierten Enzyme bestimmt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3 zur getrennten analytischen Bestimmung mehrerer miteinander vermischter Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlungslösang über voneinander getrennte, in Reihe hintereinandergeschaltete trägerfixierte Enzyme oder Enzymkombinationen leitet und hinter jedem trägerfixierten Enzym bzw. hinter jeder trägerfixierten Enzymkombination die Cosubstratkonzentration bestimmt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 zur präparativen Gewinnung der durch die Redoxreaktion umgesetzten Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß man die Substanz nach dem Durchgang durch die die Redoxreaktion katalysierenden träger fixierten Enzyme aus der Behandlungslösung isoliert und die Behandlungslösung sodann über die das Cosubstrat regenerierenden trägerfixierten Enzyme zu dem Vorratsbehälter zurückführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man auf ggf. modifizierter Agarose fixierte Enzyme verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cosubstrat Nikotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat und als regenerierendes trägerfixiertes Enzym Glutathion-Reductase oder L-Xylulose-Reductase verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cosubstrat Nikotinamid-adenin-dinucleotid und als regenerierende trägerfixierte Enzymkombination Aldolase und Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase verwendet.

9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 4 und 5 bis 8, gekennzeichnet durch in Reihe hintereinandergeschaltet einen Vorratsbehälter (1, 11, 21) mit Behandlungslösung, eine Einführvorrichtung (2, 12, 22) für die umzusetzenden Substanzen, wenigstens eine Säule (4, 13 bis 16, 23 bis 26) mit trägerfixiertem, die Redoxreaktion katalysierendem Enzym, eine Meßeinrichtung (5, 17 bis 18, 28 bis 31) zur Bestimmung der Cosubstratkonzentration in der Behandlungslösung, wenigstens eine Säule (6, 19, 27) mit trägerfixiertem, das Cosubstrat regenerierendem Enzym und eine Leitungsverbinuung von der letzten Regeneriersäule zv dem Vorratsbehälter (1, 11, 21) mit der Behandlungslösung.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch eine zusätzliche Meßeinrichtung (3) zur Bestimmung der Cosubstratkonzentration in der Behandlungslösung zwischen der Einführvorrichtung (2, 12, 22) und der ersten Säule (4, 13, 23) mit trägerfixiertem Enzym.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9 und 10, gekennzeichnet durch mehrere in Reihe hintereinandergeschaltete Säulen (13 bis 1o und 23 bis 26) mit unterschiedlichen trägerfix4erten, die Redoxreaktion katalysierenden Enzymen oder Enzymkombinationen und jeweils einer oder mehreren dieser Säulen nachgeschalteten Meßinstrumenten (17 bis 18, 28 bis 31) zur Bestimmung der Cosubstratkonzentration in der Behandlungslösung.