DE4040385C1

DE4040385C1 - Determn. of organic cpds. e.g. glucose, fructose or sorbitol - comprises enzymatic oxidn. or redn. in presence of associated adenine di:nucleotide(s) in a flow reactor

Info

Publication number: DE4040385C1
Application number: DE19904040385
Authority: DE
Inventors: Oliver Thordsen; Thomas Dr. 3000 Hannover De Scheper; Bert Dr. 6233 Kelkheim De Rehr; Hermann Prof. 5170 Juelich De Sahm
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1990-12-17
Filing date: 1990-12-17
Publication date: 1992-07-09
Anticipated expiration: 2010-12-18

Abstract

Determin. of organic cpds. comprises enzymatic oxidn. or redn. in the presence of associated adenine dinucleotides in a flow reactor. The enzyme and corresp. coenzyme are immobilised and retained by a filtration membrane, and the change in fluorescence intensity as the coenzyme is reduced or oxidised is measured. USE - For the determn. of glucose, fructose and sorbitol with a glucose-fructose oxidoreductase and NADP-coenzyme complex, or the determn. of pyruvate, lactate, malate and oxaloacetate using a malate-lactate transhydrogenase and the NAD-coenzyme complex.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von enzymatisch oxidier baren bzw. reduzierbaren organischen Verbindungen durch adenin-dinukleotid-abhängige enzymatische Um setzung in einem Durchflußreaktor, in dem Enzym und Coenzym durch eine entsprechende Filtrationsmem bran zurückgehalten werden und Messung der Fluores zenzänderung aufgrund der die Umsetzung begleiten den Umwandlung des Coenzyms in die reduzierte bzw. oxidierte Form.The invention relates to a method for quantitative determination of enzymatically oxidized baren or reducible organic compounds by adenine-dinucleotide-dependent enzymatic changes settlement in a flow reactor, in the enzyme and coenzyme through an appropriate filtration membrane bran are held back and measurement of fluorescence change due to accompanying the implementation the conversion of the coenzyme into the reduced or oxidized form.

Adenin-Dinukleotide, wie NAD und NADP (Nicotinamid-adenin-dinukleotid und Nicotinamid-adenin-dinukleotidphosphat) zeigen in ihrer reduzierten Form (NADH und NADPH) als biologische Fluorophore bei einem Anre gungslicht der Wellenlänge 360 nm ein Fluoreszenz maximum bei 450 nm. Diese Eigenschaft kann für die quantitative Bestimmung von Verbindungen ausge nutzt werden, die enzymatisch, insbesondere mittels Dehydrogenasen unter Mitwirkung dieser Coenzyme um setzbar sind.Adenine dinucleotides, such as NAD and NADP (nicotinamide adenine dinucleotide and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) show in their reduced form (NADH and NADPH) as biological fluorophores on arrival light of the wavelength 360 nm fluorescence maximum at 450 nm. This property can be used for the quantitative determination of compounds are used, the enzymatic, in particular by means of Dehydrogenases with the participation of these coenzymes are settable.

Neben Einzel- und Serienanalysen kennt man bereits Bestimmungen, nach dem Flow-Injection-Analysenprin zip (FIA-Pinzip), bei dem Probe und Coenzym in einen Trägerstrom eingebracht werden, der einer Einheit mit trägerfixiertem Enzym zugeleitet wird, in der die enzymatische Umsetzung erfolgt. Mit einem ange schlossenen Detektor wird schließlich die Konzen tration der enzymatisch zu bestimmenden Sustanz fluorimetrisch ermittelt.In addition to individual and series analyzes, you are already familiar with Determinations, according to the flow injection analytical principle zip (FIA principle), in which the sample and coenzyme in one Carrier current can be introduced, that of a unit is supplied with carrier-fixed enzyme in which the enzymatic conversion takes place. With an ange closed detector will eventually the conc tration of the enzyme to be determined enzymatically determined fluorometrically.

Da diese Analysen einen erheblichen Verbrauch an teurem Coenzym bedingen, wurde bereits ein FIA-Ver fahren entwickelt, bei dem das Enzym und das mole kulargewichtsvergrößerte Coenzym in einer Durch flußzelle mittels einer Membran mit entsprechendem Cut-off festgehalten werden (WO 90/03 425). Speziell werden dabei Enzym und das an Polyethylenglycol ge koppelte Coenzym in einem Enzymmembranreaktor "ein gesperrt", in den ein Fluorosensor einbezogen ist.Because these analyzes involve significant consumption expensive coenzyme, an FIA Ver drive developed in which the enzyme and the mole increased coenzyme in one go flow cell by means of a membrane with the corresponding Cut-off can be held (WO 90/03 425). Specifically are enzyme and the ge on polyethylene glycol coupled coenzyme in an enzyme membrane reactor " locked ", which includes a fluorosensor.

Da allerdings Enzyme zu molekulargewichtsvergrößer tem NAD-Coenzym und NADP-Coenzym geringere Affinitäten aufweisen können als zu den nativen nichtvergrößerten Coen zymen, ist in solchen Fällen ein erhöhter Einsatz an Coenzym notwendig, was wiederum das Verfahren verteuert und die Nachweisempfindlichkeit beein trächtigt.However, because enzymes increase molecular weight NAD coenzyme and NADP coenzyme have lower affinities can as to the native non-enlarged Coen Zymen is an increased stake in such cases of coenzyme necessary, which in turn is the process more expensive and affects the sensitivity of detection is pregnant.

Ziel der Erfindung ist daher ein Verfahren, bei dem weder ständige Coenzymverluste auftreten, noch die Nachweisempfindlichkeit gemindert ist.The aim of the invention is therefore a method in which neither permanent coenzyme losses occur, nor the Detection sensitivity is reduced.

Das zu diesem Zweck entwickelte erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß das Coen zym in an das Enzym fest gebundener Form verwendet wird.The invented for this purpose developed The process is characterized in that the Coen zym used in a form firmly bound to the enzyme becomes.

Beispiele für solche Enzym-Coenzym-Komelexe sind Glucose-Fructose-Oxidoreduktase-NADP-Coenzym die aus Zymo monas mobilis isoliert werden kann (M. Zachariou u. a., J. Bactcriol. 167 (1986) 863-896) und für die Bestimmung von Glucose, Fructose bzw. Sorbit geeignet ist oder Malat-Lactat-Transhydrogenase mit daran gebundenem NAD-Coenzym, die aus Micrococcus lactolyticus isoliert werden kann (SHG Allen im J. Biol. Chem 241 (1966) 5266-5275) und für den Nachweis von Pyruvat, Malat und Oxalacetat geeignet ist.Examples of such enzyme-coenzyme comelexes are Glucose-fructose-oxidoreductase-NADP-coenzyme derived from Zymo monas mobilis can be isolated (M. Zachariou u. a., J. Bactcriol. 167 (1986) 863-896) and for the determination of glucose, fructose or sorbitol is suitable or with malate lactate transhydrogenase attached NAD coenzyme, which comes from Micrococcus lactolyticus can be isolated (SHG Allen in J. Biol. Chem 241 (1966) 5266-5275) and for the detection of Pyruvate, malate and oxaloacetate is suitable.

Die Coenzyme, NAD bzw. NADP, können dabei in üblicher Weise - je nach gewünschter Umsetzung - von einem ihrer beiden Redoxzustände NAD/NADH bzw. NADP⁺/NADPH, in den anderen übergehen.The coenzymes, NAD or NADP, can be in usual way - depending on the desired implementation - from one of their two redox states NAD / NADH or NADP⁺ / NADPH, pass into the others.

Die (Enzym-Coenzym)-Komplexe können auch in Form von permeabiliserten Zellen verwendet werden, deren Membran für niedermolekulare Substanzen ausreichend durchlässig ist, jedoch Substanzen von Enzymgröße zurückhält. Ein Beispiel für eine solche Permeabilisierung ist für den Fall der (GFOR)-NADP-Coenzym enthaltenden Zellen von Zymomonas mobilis in der DE-Patentanmeldung P 39 36 757.6 bechrieben. Anschließend an die Permeabilisierung werden störende Verbindungen, insbesondere isolierte ("freie") Coenzyme NAD und NADP, aus der Zelle ausgewaschen, die dann noch den Enzym-Coenzym-Komplex enthält, der auch in dieser Form für die fluorimetrischen Messungen geeignet ist.The (enzyme-coenzyme) complexes can also be in the form of permeabilized cells, the Membrane sufficient for low molecular substances is permeable, but substances of enzyme size holds back. An example of such a permeabilization is in the case of the (GFOR) -NADP coenzyme containing Zymomonas mobilis cells in the DE patent application P 39 36 757.6 described. Subsequently permeabilization become disruptive Compounds, especially isolated ("free") coenzymes NAD and NADP, washed out of the cell, which then still contains the enzyme-coenzyme complex, which is also in this Form suitable for fluorometric measurements is.

Nachfolgend wird die Erfindung mehr im einzelnen unter Bezugnahme auf das Beispiel [GFOR]-NADP-Coenzym erläutert.The invention will be described in more detail below with reference to the example [GFOR] -NADP coenzyme explained.

Im einzelnen laufen bei der Bestimmung mittels [GFOR]-NADP-Coenzym folgende Reaktionen ab:Specifically run in the determination using [GFOR] -NADP coenzyme following reactions:

1) Glucose is oxidized to gluconolactone and the emitted electrons are on the NADP⁺ transferred to form NADPH. The The amount of clucose to be determined can be determined using the increase in fluo due to NADPH resence can be quantified.
2) Fructose is reduced to sorbitol, the elec Trons are from (previously reduced e.g. by glucose) enzyme gene tied NADPH transferred to fructose; the one used The amount of fructose can be reduced by the decrease Fluorescence can be quantified.
3) Sorbitol is oxidized to fructose enzymatically; the enzyme-bound NADP⁺ is here again rum reduced and the fluorescence of the gebil measured NADPH.

Für die Erläuterung einer praktischen Realisierung wird auf die angefügten Zeichnungen Bezug genommen.For the explanation of a practical implementation reference is made to the attached drawings taken.

Es zeigenShow it

Fig. 1 und 2 Schematische Skizzen für den Meß aufbau und die Meßzelle für den erfindungsgemäßen fluorimetri schen Nachweis,Construction Fig. 1 and 2 are schematic diagrams for the measurement and the measurement cell for the inventive fluorimetri rule detection,

Fig. 3 bis 5 Eichkurven für den Nachweis von Glucose, Fructose, Sorbit mit permeabilisierten Zellen von Zymomonas mobilis und Fig. 3 to 5 calibration curves for the detection of glucose, fructose, sorbitol with permeabilized cells from Zymomonas mobilis and

Fig. 6 eine Eichkurve für den Nachweis von Glucose mit gereinigter Glucose- Fructose-Oxidoreduktase. Fig. 6 shows a calibration curve for the detection of glucose with purified glucose-fructose oxidoreductase.

Für die Messungen wurde ein Meßaufbau verwendet, wie er in Fig. 1 skizziert ist: In eine als En zymmembranreaktor ausgebildete Meßzelle 1 ragt als Sensor eine kommerziell erhältliche Fluores zenzsonde (Ingold-Fluorosensor) als Detektor. Durch die Meßzelle wird in kontinuierlichem Strom Pufferlösung mittels einer Peristaltikpumpe 2 geschickt, in den zu Beginn jeder Meßreihe das Enzym mit fest gebundenem NADP-Coenzym oder permeabili sierte Zellen von Zymomonas mobilis, die das Enzym GFOR mit fixiertem NADP-Coenzym enthalten, über die Enzyminjektion 3 gegeben wurde um so die Meß zelle zu beladen. Die Untersuchungsproben wurden über die Probeninjektion 4 in den Trägerstrom injiziert. Das resultierende Fluoreszenzsignal wurde vom Sensor empfangen und durch die Elek tronikeinheit verarbeitet und auf einen Schrei ber gegeben.A measurement setup was used for the measurements, as is sketched in FIG. 1: In a measuring cell 1 designed as an enzyme reactor, a commercially available fluorescence probe (Ingold fluorosensor ) protrudes as a sensor. Buffer solution is sent through the measuring cell in a continuous stream by means of a peristaltic pump 2 , into which the enzyme with firmly bound NADP-coenzyme or permeabilized cells from Zymomonas mobilis, which contain the enzyme GFOR with fixed NADP-coenzyme, at the beginning of each measurement series, via the enzyme injection 3 was given in order to load the measuring cell. The test samples were injected into the carrier stream via the sample injection 4 . The resulting fluorescence signal was received by the sensor and processed by the electronics unit and transferred to a recorder.

A) Detection of glucose, fructose and sorbitol with permeabilized cells from Zymomonas mobilis

Die Zellen wurden, wie in der DE-Patentanmeldung P 39 36 757.6 beschrieben, mit 0,1% CTAB (Cetyl trimethylammoniumbromid) permeabilisiert. Die permeabilisierten Zellen wurden in den Träger strom bei 3 injiziert und in die Meßzelle gela den. Die Biotrockenmasse-Konzentration betrug 20 g/l in der Meßzelle. Für die Messungen wur den Mikrofiltermembranen mit einem Porendurch messer von 0,3 µm (Filtron Typ Omega) verwendet. In den Trägerstrom wurden Substratpulse (Glucose, Fructose oder Sorbit) von 25 µl injiziert. The cells were, as described in DE patent application P 39 36 757.6, permeabilized with 0.1% CTAB (cetyl trimethylammonium bromide). The permeabilized cells were injected into the carrier stream at 3 and loaded into the measuring cell. The dry biomass concentration was 20 g / l in the measuring cell. Microfilter membranes with a pore diameter of 0.3 µm (Filtron type Omega) were used for the measurements. Substrate pulses (glucose, fructose or sorbitol) of 25 µl were injected into the carrier stream.

Die beigefügte Fig. 3 zeigt die Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Glucosekonzentration (Probenkonzentration).The attached FIG. 3 shows the dependence of the fluorescence on the glucose concentration (sample concentration).

Fig. 4 zeigt die Abnahme der relativen Fluores zenz in Abhängigkeit von der Fructosekonzentra tion (Probenkonzentration). Der (GFOR)-NADP-Coenzym Komplex in den permeabilisierten Zellen wurde vor jedem Fructosepuls durch einen Glucosepuls (25 µl einer Glucoselösung mit 100 g/l) in den redu zierten Zustand versetzt. Fig. 4 shows the decrease in the relative fluorescence as a function of the fructose concentration (sample concentration). The (GFOR) -NADP-coenzyme complex in the permeabilized cells was brought into the reduced state before each fructose pulse by a glucose pulse (25 ul of a glucose solution with 100 g / l).

Fig. 5 zeigt die Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Sorbitkonzentration (Probenkonzentra tion). Fig. 5 shows the dependence of the fluorescence on the sorbitol concentration (sample concentration).

Wie man sieht, ist die relative Fluoreszenzin tensität proportional zu den injizierten Sub stratkonzentrationen.As you can see, the relative fluorescence is intensity proportional to the injected sub strategic concentrations.

B) Detection of glucose with purified glucose Fructose oxidoreductase with bound NADP coenzyme

Das Enzym wurde, wie oben angegeben, aus Zymomo nas mobilis mittels proteinchemischer bzw. chro matographischer Methoden isoliert. Bei einem En zymgehalt in der Meßzelle entsprechend 40 U wur den in den Trägerstrom bei 4 Clucosepulse von je 25 µl mit steigender Konzentration (0,001 bis 0 1 g/l) injiziert. Für die Messungen wurden Ul trafiltrationsmembranen mit einem cut-off von 5000 und 10 000 Dalton eingesetzt (Filtron, Typ Omega).The enzyme was, as indicated above, from Zymomo nas mobilis using protein chemistry or chro matographic methods isolated. With an En zym content in the measuring cell corresponding to 40 U wur the in the carrier current at 4 clucose pulses of 25 µl each with increasing concentration (0.001 to 0 1 g / l) injected. Ul trafiltration membranes with a cut-off of 5000 and 10,000 Dalton used (Filtron, type Omega).

Fig. 6 zeigt die erhaltene Meßkurve: Wie man sieht, ist die relative Fluoreszenz direkt proportional zur injizierten Glucosekonzentration. Fig. 6 shows the trace obtained: As can be seen, the relative fluorescence is directly proportional to the injected glucose concentration.

Analoge Kurven können, wie oben für die permeabi lisierten Zellen angegeben für Fructose bzw. Sorbit ermittelt werden.Analog curves can, as above, for the permeabi cells specified for fructose or Sorbitol can be determined.

Claims

1. A method for the quantitative determination of enzymatically oxidizable or reducible organic compounds by adenine-dinucleotide-dependent enzymatic conversion in a flow reactor in which the enzyme and coenzyme are retained by a corresponding filtration membrane and measurement of the change in fluorescence due to the reaction accompanying conversion of the coenzyme into dia roduzierta or oxidized form, characterized in that the coenzyme is used in a form firmly bound to the enzyme.

2. The method according to claim 1, characterized, that for the detection of glucose, fructose and Sorbitol glucose-fructose oxidoreductase with it bound NADP coenzyme is used.

3. The method according to claim 1, characterized, that for the detection of pyruvate, lactate, malate and oxaloacetate with malate lactate transhydrogenase attached NAD.coenzyme is used.