DE2701168A1 - PROCEDURE FOR DETERMINING THE AETHANOL CONCENTRATION IN BODY FLUIDS - Google Patents
PROCEDURE FOR DETERMINING THE AETHANOL CONCENTRATION IN BODY FLUIDSInfo
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VON KREISLER SCHONWALD MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTINGFROM KREISLER SCHONWALD MEYER EISHOLD FUES FROM KREISLER KELLER SELTING
PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler "J" 1973PATENT LAWYERS Dr.-Ing. by Kreisler "J" 1973
Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, KölnDr.-Ing. K. Schönwald, Cologne Dr.-Ing. Th. Meyer, Cologne Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Cologne Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Cologne
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105 Quartz Street, Hillbrow, Johannesburg (Südafrika)105 Quartz Street, Hillbrow, Johannesburg (South Africa)
Verfahren zur Bestimmung der Äthanolkonzentration in KörperflüssigkeitenMethod for determining the concentration of ethanol in body fluids
Die Erfindung betrifft eine verbesserte Methode zur Bestimmung des Alkoholspiegels, d.h. zur Bestimmung des Äthanolgehalts in Körperflüssigkeiten und Reagentien für die Verwendung bei dieser Methode. Die Alkoholbestimmung in Körperflüssigkeiten, insbesondere im Blut, ist ein allgemein anerkannter und eingeführter Routinetest, der in der ganzen Welt für medizinische und rechtliche Zwecke durchgeführt wird.The invention relates to an improved method for determining the alcohol level, i.e. for determining the alcohol level Ethanol content in body fluids and reagents for use in this method. The alcohol determination in body fluids, especially in blood, is a widely recognized and established routine test used throughout the world for medical and legal Purposes.
Zahlreiche chemische Methoden werden zur Alkoholbestimmung aus dem Blut angewendet. Die meisten Methoden beruhen auf der Oxydation des Äthanols und der volumetrischen oder kolorimetrischen Bestimmung der erforderlichen Menge des Oxydationsmittels (F.Landquist, Methods of Bio-chemical Analysis 7 (1959) 217). Allen diesen Methoden ist ein großer Mangel an Genauigkeit und Spezifität gemeinsam, da alle verwendeten Oxydationsmittel nicht nur mit Äthanol, sondern auch mit verschiedenen anderen flüchtigen Substanzen reaktionssind. Numerous chemical methods are used to determine alcohol in the blood. Most of the methods are based on the oxidation of ethanol and the volumetric or colorimetric determination of the required Amount of oxidizing agent (F. Landquist, Methods of Bio-chemical Analysis 7 (1959) 217). All these methods share a great lack of accuracy and specificity, as all oxidants are used are reactive not only with ethanol but also with various other volatile substances.
Telefon: (02 21) 23 45 41-4 ■ Tc-Ie«: 8 2307 dopa d Tc-Iufjrainni: Dompcjlcnt KölnTelephone: (02 21) 23 45 41-4 ■ Tc-Ie «: 8 2307 dopa d Tc-Iufjrainni: Dompcjlcnt Cologne
Die Extraktion von Äthanol aus Blut, aus dem die Eiweiß· körper entfernt worden sind,und der Nachweis durch Gas-Flüssigkeitschromatographie ist äußerst spezifisch und genau, jedoch sehr zeitraubend. Die enzymatische Bestimmung von Äthanol unter Verwendung von Alleoholdehydrogenase wird in vielen Laboratorien wegen der hohen Spezifität und Empfindlichkeit der Methode weitgehend angewendet ( R.Bonnichsen, H.Theorell, Scand.J.Clin.Lab. and Invest. 3 (1951) 58). Da jedoch die NADHp-Bildung bei 340 nm gemessen wird, ist ein Spektrophotometer erforderlich. Ferner kann die Analyse nicht am ganzen Blut durchgeführt werden.The extraction of ethanol from blood from which the protein bodies have been removed and the detection by Gas-liquid chromatography is extremely specific and accurate, but very time consuming. The enzymatic Determination of ethanol using Alleohol dehydrogenase is due in many laboratories largely applied due to the high specificity and sensitivity of the method (R. Bonnichsen, H. Theorell, Scand.J.Clin.Lab. and Invest. 3 (1951) 58). However, since NADHp formation is measured at 340 nm, a Spectrophotometer required. Furthermore, the analysis cannot be carried out on the whole blood.
Guilbault (G.G.Gilbault und S.H. Sadar, Anal.Lett. 2 (1969) 41) schlugen die Verwendung einer Alkoholoxydase von Basidiomyceten bei einer fluorometrischen Bestimmung von Äthanol vor, da diese Oxydase eine größere Spezifität als Alkoholdehydrogenase hat, obwohl es auch Methanol nachweist. Eine amperometrische Enzymelektrode unter Verwendung des gleichen Enzyms wurde ebenfalls von Guilbault vorgeschlagen (G.GGuilbault und G.J. Lubrano, Analytica Chimica Acta 69 (1974) 189). Bei dieser Methode wird das bei der enzymatischen Reaktion gebildete Wasserstoffperoxyd amperometrisch überwacht. Die Alkoholoxidase aus Basidiomyceten verbraucht Äthanol nur njit 28% der Geschwindigkeit, mit der es Methanol verbraucht.Guilbault (G.G. Gilbault and S.H. Sadar, Anal.Lett. 2 (1969) 41) suggested the use of an alcohol oxidase from Basidiomycetes in a fluorometric determination of ethanol, as this oxidase has a greater specificity than alcohol dehydrogenase, although it does too Detects methanol. An amperometric enzyme electrode using the same enzyme was also used suggested by Guilbault (G.GGuilbault and G.J. Lubrano, Analytica Chimica Acta 69 (1974) 189). In this method, this is done with the enzymatic reaction Hydrogen peroxide formed is monitored amperometrically. The alcohol oxidase from Basidiomycetes consumes ethanol only njit 28% of the rate at which it consumes methanol consumed.
Gegenstand der Erfindung ist eine Alkoholbestimmungsmethode aus Körperflüssigkeiten, bei der man ein vorbestimmtes Volumen der Körperflüssigkeit beschafft, das Äthanol in der Körperflüssigkeit durch Einwirkung von Alkoholoxydase in einem geeigneten Puffer in Gegenwart von überschüssigem molekularem Sauerstoff oxydiert und die Geschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs mißt, wobei die Oxydation in Gegenwart eines Mittels stattfindet,The invention relates to an alcohol determination method from body fluids in which a predetermined Volume of body fluid procured by exposure to the ethanol in the body fluid Alcohol oxidase is oxidized in a suitable buffer in the presence of excess molecular oxygen and measures the rate of oxygen consumption, where the oxidation takes place in the presence of an agent,
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das die Bildung von Sauerstoff durch Zersetzung von Peroxyd zu unterdrücken vermag.which can suppress the formation of oxygen by decomposing peroxide.
Die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs ist direkt proportional der Konzentration des Äthanols in der Körperflüssigkeit. Die Äthanolkonzentration in der Körperflüssigkeit läßt sich somit leicht beispielsweise durch Ablesen der Äthanolkonzentration von einer geeigneten graphischen Darstellung der Äthanolkonzentration in Abhängigkeit vom Sauerstoffverbrauch oder durch Vergleich der für eine gegebene Probe bestimmten Geschwindigkeit mit einer Bezugsprobe bestimmen.The rate of oxygen consumption is direct proportional to the concentration of ethanol in the body fluid. The ethanol concentration in the Body fluid can thus be easily extracted, for example by reading the ethanol concentration from an appropriate ethanol concentration graph as a function of oxygen consumption or by comparing the speed determined for a given sample determine with a reference sample.
Die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs wird vorzugsweise unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode gemessen. Die Verwendung einer Sauerstoffelektrode bietet eine Reihe besonderer Vorteile. Eine Sauerstoffelektrode ist verhältnismäßig billig. Sie ermöglicht eine schnelle Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs/ In sehr trüben oder farbigen Lösungen. Die Sauerstoffelektrode ist eine polarographische Vorrichtung zur Messung der Konzentration des in einem gegebenen Medium gelösten Sauerstoffs. Der Messung liegt die Elektrolyse von gelöstem Sauerstoff an einer schwach negativen Elektrode zu Grunde. Die Sauerstoffelektrode ist seit den Anfängen dieses Jahrhunderts bekannt. 1956 verbesserte »Clark die Elektrode wesentlich durch Verwendung einer für Sauerstoff durchlässigen, nicht leitenden Membran zur Isolierung der Elektrolysenzelle von der Meßprobe. (L.C. Clark, Trans. Am. Soc. Art. Int.Org. (1956) 41). Sauerstoffclektroden sind im Handel erhältlich. Die Sauerstoffelektrode kann in bekannter Weise mit einem üblichen Registriergerät, z.B. einem "Cimatic Clmapot T5 Recorder" gekoppelt werden, um die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs zu verfolgen und zu registrieren.The rate of oxygen consumption becomes preferable measured using an oxygen electrode. The use of an oxygen electrode offers a number of special advantages. An oxygen electrode is relatively cheap. It enables a quick determination of the oxygen consumption / In very cloudy or colored solutions. The oxygen electrode is a polarographic device for Measurement of the concentration of dissolved oxygen in a given medium. The measurement is the electrolysis of dissolved oxygen on a weakly negative electrode. The oxygen electrode has been since known at the beginning of this century. In 1956, »Clark significantly improved the electrode by using it an oxygen-permeable, non-conductive membrane to isolate the electrolysis cell from the Measurement sample. (L.C. Clark, Trans. Am. Soc. Art. Int.Org. (1956) 41). Oxygen electrodes are commercially available. The oxygen electrode can be used in a known manner with a conventional recording device, for example a "Cimatic Clmapot T5 Recorder "can be coupled to the speed to track and register oxygen consumption.
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Wie bereits erwähnt, wird die Oxydation in Gegenwart von überschüssigem Sauerstoff durchgeführt, d.h. der Sauerstoff darf kein geschwindigkeitsbegrenzender Reaktant sein. Da der Bereich wahrscheinlicher Äthanolkonzentrationen in den Körperflüssigkeiten bekannt ist, läßt sich in einfacher Weise sicherstellen, daß überschüssiger Sauerstoff vorhanden ist. Im allgemeinen wird die Oxydation in luftgesättigten Lösungen durchgeführt. In diesem Fall ist es einfach erforderlich, sicherzustellen, daß genügend luftgesättigte Lösung vorhanden ist, damit molekularer Sauerstoff im Überschuß vorliegt. Dies läßt sich für jeden gegebenen Fall leicht berechnen.As already mentioned, the oxidation is carried out in the presence of excess oxygen, i.e. the Oxygen must not be a rate limiting reactant. As the range of likely ethanol concentrations is known in the body fluids, can be ensured in a simple manner that excess Oxygen is present. In general, the oxidation is carried out in air-saturated solutions. In this case it is simply necessary to ensure that there is enough air-saturated solution is present so that molecular oxygen is in excess. This can be done for any given case easily calculate.
Die Methode gemäß der Erfindung dient im allgemeinen zur Alkoholbestimmung aus dem Blut, kann jedoch auch zur Messung des Äthanolgehalts in anderen Körperflüssigkeiten, z.B. im Plasma und Serum, angewendet werden.The method according to the invention is generally used for determining alcohol from the blood, but it can also can be used to measure the ethanol content in other body fluids, e.g. in plasma and serum.
Die Alkoholoxydase muß die Oxydation des Äthanols zu katalysieren vermögen. Eine Reihe solcher Oxydasen ist bekannt. Bevorzugt wird die Oxydase, die aus einem Stamm der von Prof. K. Ogata, Abteilung für landwirtschaftliche Chemie der Universität Kyoto, Japan, beschafften Kloecke-· ra-Hefe isoliert wurde. Die Oxydase wurde aus der Hefe extrahiert und nach üblichen Methoden der Proteinreinigung bis zur Homogenität gereinigt. Diese Methode wird nachstehend kurz beschrieben. Eine Schicht der Hefe wurde von Professor Ogata beschafft und auf Methanol als Kohlenstoffquelle gezüchtet. Die Zellen der Hefe wurden durch Ultraschallwellen zerrissen. Der Überstand aus dieser Stufe wurde der Ausfällung mit Ammoniumsulfat, der Ionenaustauschchromatographie an DEAE-CeIlulose und der Gelfiltration am Ionenaustauscherharz "G 200 Sephadex" unterworfen, worauf das Produkt gebrauchsfertig war. Das Enzym hatte in dieser Stufe eine Aktivität zwischen 90 und 100 Einheiten/ml. EineThe alcohol oxidase has to catalyze the oxidation of the ethanol capital. A number of such oxidases are known. The oxidase derived from one strain is preferred the Kloecke acquired by Prof. K. Ogata, Department of Agricultural Chemistry, University of Kyoto, Japan - ra yeast has been isolated. The oxidase was extracted from the yeast and purified by conventional protein purification methods cleaned to homogeneity. This method is briefly described below. One layer of the Yeast was obtained from Professor Ogata and grown on methanol as a carbon source. The cells of the Yeast was disrupted by ultrasonic waves. The supernatant from this stage was subject to precipitation Ammonium sulfate, ion exchange chromatography on DEAE cellulose and gel filtration on ion exchange resin "G 200 Sephadex" subjected, whereupon the product was ready for use. The enzyme had at this stage an activity between 90 and 100 units / ml. One
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Einheit der Enzymaktivität wird definiert als die Enzymmenge, die den Verbrauch von 1 mMol Sauerstoff/Min. bei 37°C mit Äthanol als Substrat verursacht.Unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that consumes 1 mmol of oxygen / min. caused at 37 ° C with ethanol as substrate.
Geeignet ist ferner die von Guilbault verwendete Alkoholoxydase (G.G.Guilbault und G.J. Lubrano, Anal. Chim. Acta 69 (1974) 189), die von einem Basidiomyzet isoliert wurde.The alcohol oxidase used by Guilbault is also suitable (G.G. Guilbault and G.J. Lubrano, Anal. Chim. Acta 69 (1974) 189), which was isolated from a basidiomycete.
Der Puffer muß so beschaffen sein, daß er die Oxydation nicht hemmt. Bevorzugt wird ein Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 9, vorzugsweise von 7,8. Geeignet als Puffer sind beispielsweise Kaliumphosphatpuffer, Boratpuffer und Trisihydroxymethyl)aminomethanpuffer. Vorzugsweise wird als Puffer ein Kaliumphosphatpuffer mit einer Molarität von 0,01 bis 2 und einem pH-Wert von 7 bis 9 verwendet. Bevorzugt wird eine Molarität von 1 und ein pH-Wert von 7,8.The buffer must be designed so that it does not inhibit the oxidation. A buffer with a pH from 7 to 9, preferably from 7.8. Potassium phosphate buffers, for example, are suitable as buffers, Borate buffer and tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer. A potassium phosphate buffer with a molarity of 0.01 to 2 and a pH value is preferably used as the buffer used from 7 to 9. A molarity of 1 and a pH of 7.8 are preferred.
Die Oxydation wird vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 45°C durchgeführt. Zweckmäßig wird bei etwa 37°C gearbeitet.The oxidation is preferably carried out at a temperature in the range from 20 to 45 ° C. Appropriate is worked at about 37 ° C.
Während der Oxydation des Äthanols wird Wasserstoffperoxyd gebildet. Das Wasserstoffperoxyd zersetzt sich unter Bildung von Sauerstoff. Diese Zersetzung wird durch Verunreinigungen, die zuweilen in der Alkohol— oxydase vorhanden sind, katalysiert. Daher muß ein Mittel vorhanden sein, das die Sauerstoffbildung durch die Zersetzung des Peroxyds unterdrückt. VorzugsweiseHydrogen peroxide is formed during the oxidation of ethanol. The hydrogen peroxide decomposes with the formation of oxygen. This decomposition is caused by impurities which are sometimes present in the alcohol. oxidase are present, catalyzed. Therefore, a means must be available that the oxygen formation by suppresses the decomposition of the peroxide. Preferably
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werden zu diesem Zweck ein Peroxydase/ und ein geeignetes Donatormolkül, d.h. ein Molekül, das durch das Wasserstoffperoxyd in Gegenwart das PeroxydaseToxy— dierbar ist, verwendet. Geeignete Donatormoleküle sind bekannt. Als Beispiele sind o-Tolidin (4,4f-Diamino-3,3*-dimethyldiphenyl), o-Dianisidin und Aminoantipyrin zu nennen. Geeignet sind ferner Verbindungen, die die Katalase inhibieren, die bekanntlich die ZersetzungFor this purpose, a peroxidase and a suitable donor molecule, ie a molecule which can be oxidized by the hydrogen peroxide in the presence of the peroxidase, are used. Suitable donor molecules are known. Examples are o-tolidine (4,4 f -diamino-3,3 * -dimethyldiphenyl), o-dianisidine and aminoantipyrine. Compounds which inhibit catalase, which is known to cause decomposition, are also suitable
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von Wasserstoffperoxyd katalysiert· Als Beispiel einer solchen Verbindung kann Natriumazid genannt werden.catalyzed by hydrogen peroxide · As an example one such compound can be called sodium azide.
Die Erfindung umfaßt ferner einen Reagentiensatz für die Verwendung bei der erfindungsgemäßen Methode. Dieser Satz umfaßtThe invention also includes a kit of reagents for use in the method of the invention. This sentence includes
a) ein Gefäß, das eine Alkoholoxydase, deren Aktivität im Bereich von 1 bis 1000 Einheiten/ml, vorzugsweise etwa 100 Einheiten/ml beträgt, in einem der oben genannten geeigneten Puffer enthält, unda) a vessel containing an alcohol oxidase, the activity of which is in the range from 1 to 1000 units / ml, preferably is about 100 units / ml, in one of the above-mentioned suitable buffers, and
b) ein Gefäß, das das Mittel, das die Bildung von Sauerstoff durch Zersetzung des Peroxyds zu unterdrücken vermag, in einem geeigneten Puffer enthält, der im allgemeinen der gleiche Puffer wie für die Alkoholoxydase ist.b) a vessel containing the means to suppress the formation of oxygen by decomposition of the peroxide able to contain in a suitable buffer, which is generally the same buffer as for the Is alcohol oxidase.
Als Mittel zur Unterdrückung der Sauerstoffbildung wird vorzugsweise eine Perox"ydase mit einer Aktivität von 1 bis 50 Einheiten/ml und ein geeignetes Donatormolekül in einer Konzentration von 0,01 bis 2% (Gew./ Vol.), vorzugsweise 0,2% (Gew./Vol.) verwendet. Die Aktivitätseinheiten werden später definiert.As an agent for suppressing the formation of oxygen, a peroxydase having an activity is preferably used from 1 to 50 units / ml and a suitable donor molecule in a concentration of 0.01 to 2% (wt / Vol.), Preferably 0.2% (w / v) is used. The units of activity will be defined later.
Jedes Gefäß kann außerdem eine Substanz enthalten, die zur Komplexbildung mit Metallionen, die die Alkohol— oxydase,inhibieren, enthalten. Als Komplexbildner wird vorzugsweise EDTA-Na2 in einer Menge von 10 uMol bis 10 tnMol, vorzugsweise etwa 100 uMol, verwendet.Each vessel may also contain a substance capable of complexing with metal ions that inhibit alcohol oxidase. The complexing agent used is preferably EDTA-Na 2 in an amount of 10 µmol to 10 nmol, preferably about 100 µmol.
Die Erfindung wird nachstehend an Hand eines Beispiels beschrieben. Bei diesem Versuch wurden die folgenden Reagentien verwendet:The invention is described below by means of an example. In this attempt the following were found Reagents used:
1) Alkoholoxydase, hergestellt aus Klockera-Hefe in der oben beschriebenen Weise.1) Alcohol oxidase prepared from Klockera yeast in the manner described above.
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2) Meerrettich-Peroxydase: Dieses Enzym (Donator: Wasserstoffperoxydoxidcfeduktase E.C.Nr. 1.11.1.7) mit einer Aktivität von 60 Einheiten/mg wurde von Miles-Seravac, Kapstadt, bezogen. Eine Einheit wird vom Hersteller als Enzymmenge definiert, die in2) Horseradish peroxidase: This enzyme (donor: hydrogen peroxide oxide reductase E.C. No. 1.11.1.7) with an activity of 60 units / mg was purchased from Miles-Seravac, Cape Town. Becomes a unit defined by the manufacturer as the amount of enzyme contained in
20 Sekunden bei 20°C 1 mg Purpurogallin aus Pyro-'gallol bildet.20 seconds at 20 ° C 1 mg of purpurogallin from pyro-gallol forms.
3) Mittel zur Unterdrückung der Sauerstoffbildung durch die Zersetzung des Peroxyds: Eine 0,2%ige (Gew./ Vol.) Lösung von o-Tolidin.HCl wurde durch Auflösen des Salzes in 1-molarem Phosphatpuffer von pH 7,8, der 4 Einheiten der vorstehend beschriebenen Meerrettichperoxydase pro ml Lösung enthielt, hergestellt. Der Phosphatpuffer wurde durch Mischen geeigneter Mengen von wässriger 1,0-molarer Kaliumdihydrogenphosphatlösung und wässriger 1,0-molarer Dikaliumhydrogenphosphatlösung bis zum gewünschten pH-Wert hergestellt.3) Means to suppress the formation of oxygen through The decomposition of the peroxide: A 0.2% (w / v) solution of o-Tolidin.HCl was by dissolving of the salt in 1 molar phosphate buffer of pH 7.8, containing 4 units of the horseradish peroxidase described above per ml of solution. The phosphate buffer was made by mixing appropriate amounts of 1.0 molar aqueous potassium dihydrogen phosphate solution and aqueous 1.0 molar dipotassium hydrogen phosphate solution to the desired pH.
4) Standard-Äthanollösung: Eine wässrige Standard-Äthanol lösung (10 uMol/ml) wurde unter Verwendung von über Magnesium getrocknetem absolutem Äthanol hergestellt.4) Standard Ethanol Solution: A standard aqueous ethanol solution (10 µmoles / ml) was made using made from absolute ethanol dried over magnesium.
Die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs einer Anzahl von Äthanolproben von bekannter Konzentration wurde unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode und der oben genannten Reagentien gemessen. (Lieferant der Sauerstoffelektrode: Clinical Sciences and Manufacturing Laboratories, 'Johannesburg). Die Sauerstoffelektrode wurde an ein bei 37°C gehaltenes Bad von umgewälztem Wasser angeschlossen. Die Elektrode wurde mit einer 12,7 u dicken Membran aus Polytetrafluoräthylen bedeckt. Das Volumen der Zelle wurde bei etwa 1,0 ml gehalten. Das Ausgangssignal wurde mit einem Aufnahmegerät "Cimatic Cimapot T5»» registriert.The rate of oxygen consumption of a number of samples of ethanol of known concentration was measured using an oxygen electrode and the above reagents. (Supplier of the oxygen electrode: Clinical Sciences and Manufacturing Laboratories, 'Johannesburg). The oxygen electrode was connected to a bath of circulating water maintained at 37 ° C. The electrode was covered with a 12.7 µm thick polytetrafluoroethylene membrane. The volume of the cell was maintained at approximately 1.0 ml. The output signal was recorded with a "Cimatic Cimapot T5» »recording device.
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In die Reaktionszelle der Sauerstoffelektrode wurden 0,95 ml des Phosphat-Donator-Peroxydase-PuffersystemsIn the reaction cell of the oxygen electrode were 0.95 ml of the phosphate donor peroxidase buffer system
thermischen von pH 7,8 gegeben. Der Inhalt wurde der yGleichgewichtseinstellung bei 37°C überlassen. In die Reaktionszelle wurden dann 100 ul (9,3 Einheiten) der Alkoholoxydase gegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe unterschiedlicher Mengen (0 bis 50 ul) der Standard-Äthanollösung ausgelöst. Die Anfangsgeschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs wurde für jede verwendete Alkoholkonzentration registriert. In jedem Fall wurde die Geschwindigkeit nach Abzug einer Substratblindprobe in Abhängigkeit von der Konzentration der Äthanollösung graphisch dargestellt. Die erhaltene Kurve ist in der beigefügten Abbildung dargestellt. In dieser graphischen Darstellung ist die Anfangsgeschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs in uMol/Min. als Ordinate und die Menge der Äthanollösung als Abszisse aufgetragen.thermal of pH 7.8 given. The content was the y equilibrium setting left at 37 ° C. 100 µl (9.3 units) of the Alcohol oxidase given. The reaction was stopped by adding varying amounts (0 to 50 µl) of the Standard ethanol solution triggered. The initial speed the oxygen consumption was recorded for each alcohol concentration used. In each The case was the speed after subtracting a substrate blank sample as a function of the concentration the ethanol solution shown graphically. The curve obtained is shown in the attached figure. In this graph, the initial rate of oxygen consumption is in µmoles / min. plotted as the ordinate and the amount of the ethanol solution as the abscissa.
Die endogene Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs wurde in Abwesenheit der Äthanollösung vor Auslösung der Reaktion gemessen. Die Sauerstoffkonzentration in den verwendeten luftgesättigten Lösungen wurde nach der Methode von Glasstone berechnet (S.Glasstone, Elements of Physical Chemistry, I.Auflage 1946, Seite 343-344, D.Van Nostrand Co., Inc., New York). Das Registriergerät wurde unter Verwendung von luftgesättigtem Wasser geeicht.The endogenous rate of oxygen consumption was measured in the absence of the ethanol solution before triggering the reaction. The oxygen concentration in the air-saturated solutions used were calculated according to the Glasstone method (S.Glasstone, Elements of Physical Chemistry, 1st edition 1946, pages 343-344, D. Van Nostrand Co., Inc., New York). The recorder was made using air-saturated water calibrated.
Bei einem weiteren Versuch wurden bekannte Äthanolmengen mit dem von Personen entnommenen Blut zugesetzt. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten;In another attempt, known amounts of ethanol were found added to the blood taken from people. Similar results were obtained;
10 ul frisch entnommenes Blut wurden zu 1,0 ml des Phosphat-Peroxydase-Donator-Puffersystems von pH 7,8 in der Reaktionszelle der Sauerstoffelektrode gegeben. Nach Zusatz von 9,3 Einheiten Alkoholoxydase wurde10 µl of freshly drawn blood became 1.0 ml of the phosphate peroxidase donor buffer system, pH 7.8 given in the reaction cell of the oxygen electrode. After adding 9.3 units of alcohol oxidase was
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das System der thermischen Gleichgewichtseinstellung (37°C) und der Oxydation von etwaigem Alkohol, der möglicherweise bereits im Blut vorhanden ist, überlassen. Unterschiedliche aliquote Teile (O bis 50 ul) der wässrigen Äthanollösung wurden dann zugesetzt und die Anfangsgeschwindigkeiten des Sauerstoffverbrauchs registriert. In jedem Fall waren die erhaltenen Werte mit den Werten identisch, die in Abwesenheit von Blut mit der gleichen Äthanolmenge registriert wurden. Die Anwesenheit von 10 ul ganzem Blut hat somit keinen Einfluß auf das Bestimmungsystem.the system of thermal equilibrium (37 ° C) and the oxidation of any alcohol, the may already be in the blood. Different aliquots (0 to 50 ul) the aqueous ethanol solution was then added and the initial rates of oxygen consumption registered. In each case the values obtained were identical to the values obtained in the absence of blood with the same amount of ethanol were registered. Has the presence of 10 µl of whole blood thus no influence on the determination system.
Aus Gründen der Genauigkeit bei Verwendung von ganzem Blut als Probenmaterial sollte das Blut dem Puffersystem zuerst zugesetzt und die Reaktion mit der Alkoholoxydase ausgelöst werden. In dieser Weise kann eine etwaige Aufnahme von endogenem Sauerstoff im Blut kompensiert werden.For reasons of accuracy when using whole blood as sample material, the blood should be added to the buffer system first added and the reaction with the alcohol oxidase triggered. In this way you can any uptake of endogenous oxygen in the blood can be compensated.
Der Methode gemäß der Erfindung liegt die Anfangsgeschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs zu Grunde. Demzufolge ist die Bestimmung sehr schnell. Sie kann in weniger als 1 Minute durchgeführt werden. Als Probe kann ganzes Blut verwendet werden. Für routinemäßige Alkoholbestimmungen sind nur 5 ul Blut erforderlich. Ein Fingerstich liefert somit ausreichend Material für die'Analyse. Eine gesonderte Probe für eine Blindbestimmung ist nicht erforderlich, da eine etwaige Aufnahme von endogenem Sauerstoff vor der Zugabe der Alkoholoxydase berücksichtigt wird. Die Methode ist spezifischer als die meisten heute verfügbaren Methoden. The method according to the invention is based on the initial rate of oxygen consumption. As a result, the determination is very quick. It can be done in less than 1 minute. Whole blood can be used as a sample. Only 5 µl of blood is required for routine alcohol determinations. A finger prick thus provides sufficient material for the analysis. A separate sample for a blank determination is not required, as any uptake of endogenous oxygen is taken into account before the alcohol oxidase is added. The method is more specific than most of the methods available today.
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Claims (14)
Stoffbildung ein Peroxydase/und ein geeignetes Donator-enzyme
Formation of a peroxidase / and a suitable donor
zeichnet, daß/eines der Gefäße außerdem eine Substanz enthält, die zur Komplexbildung mit Metallionen, die die Alkoholoxydase inhibieren, fähig ist.at least
draws that / one of the vessels also contains a substance that is capable of complexing with metal ions that inhibit alcohol oxidase.
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