DE2905708A1 - Verfahren zur photometrischen bestimmung von zwei oder mehr bestandteilen einer fluessigkeitsprobe sowie reagenzsatz zur durchfuehrung dieser photometrischen bestimmung - Google Patents

Verfahren zur photometrischen bestimmung von zwei oder mehr bestandteilen einer fluessigkeitsprobe sowie reagenzsatz zur durchfuehrung dieser photometrischen bestimmung

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Description

  • Verfahren zur photometrischen Bestimmung von zwei oder
  • mehr Bestandteilen einer Flüssigkeitsprobe sowie Reagenzsatz zur Durchführung dieser photometrischen Bestimmung.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur photometrischen Bestimmung von zwei oder mehr Bestandteilen einer Flüssigkeitsprobe, bei welchem der Probe Reagenzien für die verschiedenen Bestandteile zugesetzt werden und in einer Meßeinrichtung die Lichtabsorption der betreffenden Reaktionsprodukte gemessen wird. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Reagenzsatz ztr Durchführung dieser photometrischen Bestimmung.
  • Photometrische Bestimmungen von Bestandteilen einer Flüssigkeitsprobe werden in vielen Laboratorien in großen Umfange durchgeführt. Dabei wird durch Zusatz eines Reagenz, möglicherweise zusammen mit einer Anzahl von Hilfsverbindungen, eine Reaktion zwischen dem Reagenz und einem der Bestandteile der Flüssigkeitsprobe, für welchen das Reagenz spezifisch ist, durchgeführt. Anschließend wird die Menge des erhaltenen Reaktionsproduktes durch eine photometrische Route bestimmt, indem die Lichtabsorption in einem vorgegebenen ellenlängen-Bereich, in welchem das Reaktionsprodukt eine Absorptionsspitze zeigt, gemessen wird.
  • Zur Bestimmung eines zweiten Bestandteiles in der Probe wird eine neue Flüssigkeitsmenge einem weiteren Reagenz zugesetzt, möglicherweise mit Hilfsverbindungen, und das Reaktionsprodukt wird in der gleichen Weise wie bei dem ersten Bestandteil durch Messung der Absorption bestimmt.
  • Es wurde nun festgestellt, daß es in den Fällen, in denen die Absorptionsspitzen der Indikatorprodukte einander nicht überlappen, möglich ist, zwei oder mehr Bestimmungen miteinander zu kombinieren, indem die verschiedenen Reagenzien ein und derselben Probe zugesetzt werden.
  • Ein erfindungsgemäßes Verfahren der eingangs genannten Art zur photometrischen Bestimmung von zwei oder mehr Bestandteilen einer Flüssigkeitsprobe ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien ür die verschiedenen Bestandteile ein und derselben Probe zugesetzt werden und die Zusammensetzung der Reagenzien derart gewählt wird, daß die separaten Bestandteile die verschiedenen Bestimmungen einander nicht stören, und daß die Absorptionskurven der betreffenden Reaktionsprodukte gleichzeitig in dieser Probe gemessen werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren eignet stich insbesondere zur Bestimmung von Bestandteilen, die in Körperflüssigkeiten eines Menschen oder eines Tieres vorhanden sind, wie beispielsweise von Enzymen, Substraten, anorganischen Bestandteilen und Elektrolyten, verabreichten Medikamenten und ihrer Stoffwechselprodukte und von biologischen, organischen und anorganischen Bestandteilen in anderen Flüssigkeiten, welche nicht von einem menschlichen oder tierischen Körper herrühren.
  • Die zu verwendenden Wellenlängen liegen im allgemeinen zwischen 200 und 900 nm. Die Absorptionsspitzen der Indikatorprodukte sollten so unterschiedlich sein, daß eine klare Trennung erreiahbar ist, d.h. daß die Absorptionskurven im oberen Bereich einander nicht überlappen. Dabei kann naturgemäß eine gewisse Uberlappung im Bereich der nIedrigen Extinktion vorhanden sein, doch sollten die Spitzen deutlich erkennbar sein.
  • Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Beispiele im einzelnen erläutert.
  • Beispiel 1 In einer Human-Serum-Probe sollten Triglyzeride und Cholesterol bestimmt werden. Durch 45-minütige Inkubation bei 350C einer vorläufigen Lösung, bestehend aus: 0,055 M tris(hydroxymethyl)aminomethan, 0,033 M Salzsäure, 0,0037 M Magnesiumnitrat, 0,15 M Ammoniumsulphat, 0,55 M Ammoniumchlorid, 1,60 M Methanol, 0,021 M Acetyl-azeton, und )1300 U/ml Katalase (EC 1.11.1.6) in Wasser wurde ein Reagenz hergestellt, indem der vorstehenden Lösung #100 U/1 Cholesteroloxydase (EC 1.1.3.6), ) 600 U/1 Cholesterolesterase (EC 3.1.1.13), )w 6 U»1 Lactatdehydrogenase (EC 1.1.1.27), 1 U/ml Pyruvatkinase (EC 2.7.1.40), 80 U/ml Lipase (EC 3.1.1.3), 0,2 mM Nikotinamid Adenin Dinukleotid (in reduzierter Form, NADH), 0,44 m.M Adenosintriphosphat, 0,36 mM Phosphoenolpyruvat, und 0,1 ffi Hydroxypolyethoxydodecan zugesetzt werden und die Flüssigkeit 10 min lang bei 35°C bebrütet wird. Dieses Reagenz wird zweckmäßigerweise als Reagenz A bezeichnet. Anschließend wird eine Lösung von 30 U/ml Glycerolkinase (EC 2.7.1.30) in einer 1 M Ammoniumsulfatlösung hergestellt. Dies ist das Ausgangsreagenz für die Bestimmung der Triglyzeride und wird zweckmäßigerweise als Reagenz B bezeichnet.
  • 1 ml des Reagenz A wird 20/ul der Probe zugesetzt und nach 14 min werden 50/ul der Glyzerolkinaselösung (Reagenz B) der erhaltenen Lösung zugesetzt.
  • Die Bestimmung der Triglyzeride wird durch Messung der NADH-Maximal-Absorption (abnehmender Extinktionswert) bei 340 nm durchgeführt.
  • Die Cholesterol-Bestimmung erfolgt durch Messung der Maximal-Absorption (zunehmender Extinktionswert) bei 405 nm von 3.5-diacetyl-1,4-dihydrolutidin, welches durch Reaktion des Reagenz mit Cholesterol entsteht.
  • Die verwendeten organischen und anorganischen Verbindungen entsprechen in ihrer Qualität den bei einer Analyse zu stellenden Anforderungen. Die verwendeten Enzyme sollten den höchsten Reinheitsgrad besitzen, welcher möglich ist.
  • Beispiel 2 In einer Human-Serum-Probe sollen Kalzium und Magnesium bestimmt werden.
  • Ein Reagenz wird durch eine Lösung herltestellt, welche aus: 0,156 mM Xylidylblau 1, 25,0 mM Borsäure, 25,0 mM Kaliumchlorld 21,95 mM Natriumhydroxid, und 0,23 mM Methylthymolblau in einer Wasser-Athanol-Mischung besteht (50 Vol. - äthanol, 50 Vol.-% Wasser). 1 ml dieses Reagenz wurde genommen und die Extinktion bei 505 nm und bei 618 nm bestimmt. Alsdann wurden 10/ul der Probe dem Reagenz zugesetzt und 5 min lang gewartet.
  • Alsdann wurde die Extinktion erneut bestimmt. Der Wert dE, welcher durch den Magnesium-Xylidyl-Blau-Komplex bei 505 nm verursacht wird, ist ein Maß für die Magnesium-Konzentration.
  • Der gebildete Kalzium-Thymol-Blau-Komplex wird bei 618 nm bestimmt.
  • Beispiel 3 In einer Human-Serum-Probe sollten Glukose und Harnstoff bestimmt werden.
  • Zu diesem Zweck wurde ein Reagenz A aus einer Lösung hergestellt, welche aus: 0,11 mM Phenolrot (gepuffert, Harleco art.no.81350 A) 600 U/1 Glukosedehydrogenase (EC 1.1.1.47), und 12,6 U/1 Mutarotase (EC 5.1.3.3) bestand.
  • Anschließend wurde ein Reagenz B aus einer Lösung hergestellt, welche aus: 23,3 kU/l Urease (EC 3.5.1.5), 0,65 mM Nikotinamidadenindinukleotid (NAD), und 154 mM Natriumchlorid bestand.
  • 30/ul der Probe wurden 1 ml des Reagenz A zugesetzt. Naoh einer Inkubationszeit von 4 min und 40 sec bei 250C wurden 50/ul des Reagenz B zugesetzt.
  • Die Glukose-Bestimmung erfolgt durch Messung der Maximal-Absorption von NADH (zunehmender Extinktionswert) bei 340 nm. Die Harnstofr-Bestimmung errolgt durch Messung der Maximal-Absorption von Phenolrot (zunehmender Extinktionswert) bei 546 nm.
  • Beispiel 4 In einer Human-Serum-Probe sollten Albumin und die gesamten Proteine bestimmt werden.
  • Aus einer Lösung, bestehend aus: 0,3 mM/l von 2-(4'-Hydroxybenzen azo)-Benzoesäure (C110N2-03), 0,1 M/1 von Natriumhydroxid (NaOH), 41 mM/l von Kalium-Natriumtartrat (KNaC4H406.4H20)' 9 mM/l von Kupfersulfat (CuS04 5H20), und 15 mM/l von KaliumJodid (KI) wurde ein Reagenz hergestellt. Mit 1 ml dieses Reagenz wurde die Extinktion bei 482 nm und 560 nm gemessen. Zu 40/ul der Probe wurde dieses Reagenz zugesetzt und die Mischung 50 min lang bei einer Temperatur von 37 0C stehengelassen. Alsdann wurde die Extinktion erneut gemessen. Der durch den Albumin-Azo-Komplex bei 482 nm verursachte # E-Wert ist ein Maß ftlr die Albumin-Konzentration. Der gebildete Protein-Kupfer-Komplex wird bei 560 nm gemessen und ist ein Maß für die gesamte Protein-Konzentrat ion.
  • Beispiel 5 In einer Human-Serum-Probe sollen γ-Glutamyl-Transferase (EC 2.
  • 3.2.2) sowie Harnshure bestimmt werden.
  • Aus einer Lösung, bestehend aus: 100 mM/l tris-bufrer (pH 8,25), 100 mM/l Glyoylglycin, 9 mM/l Phenol, 3000 U/1 Peroxidase (EC 1.11.1.7), 180 U/1 Urlcase (EC 1.7.3.3), 25µ M/1 4-Aminophenazon wurde ein Reagenz hergestellt und von 1 ml dieses Reagenz die Extinktion bei 505 nm gemessen. Dann wurden 100/ul der Probe zugesetzt und die Mischung 7 min lang bei 37°C stehengelassen.
  • Alsdann wurden 100/ul einer 45 mM/1-Lösung von L-G/-Glutamyl-3-Carboxy-4-Nitroanilid zugesetzt. Es wurde erneut die Extinktion bei 505 nm gemessen. Alsdann wurde die 4E/min bei 405 nm gemessen. Die Extinktions-Differenz bei 505 nm ist ein Maß für die Hanrsäure-Konzentration. Der #E/min-Wert bei 405 nm ist ein Maß für die k-alutamyl~Transferase-Aktivität. Für die Harnsäure-Bestimmung sollte ein9Serum-Blindprobe berücksichtigt werden.

Claims (7)

  1. Patentansprüche: ; Verfahren zur photometrischen Bestimmung von zwei oder mehr Bestandteilen einer Flüssigkeitsprobe, bei welchem der Probe Reagenzien für die verschiedenen Bestandteile zugesetzt werden und in einer Meßeinrichtung die Lichtabsorption der betreffenden Reaktionsprodukte gemessen wird, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Reagenzien für die verschiedenen Bestandteile ein und derselben Probe zugesetzt werden und die Zusammensetzung der Reagenzien derart gewählt wird, daß die separaten Bestandteile für die verschiedenen Bestimmungen einander nicht stören, und daß die Absorptionskurven der betreffenden Reaktionsprodukte gleichzeitig in ieser Probe gemessen werden.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Flüssigkeitsprobe um eine Körperflüssigkeit eines Menschen oder eines Tieres handelt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Triglyceride und Cholesterol gleicilzeitig in Human- oder Veterinär-Serum gemessen werden.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Kalzium und Magnesiwn gleichzeitig in Human-Serum gemessen werden.
  5. 5. Verfahren nach einem der AnsprUche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dald Glukose und HarnstolS gleichzeitig iri llumarl-tierum gemessen werden.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Albumin und Gesamt-Protein gleichzeitig in Human-Serum gemessen werden.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß r-Glutamyl Transferase (EC 2.3.2.2) und Harnsäure gleichzeitig in Human-Serum gemessen werden.
    b. Reagenzsatz zur Durchführung einer photometrischen Bestimmung von zwei oder nehr Bestandteilen einer Flüssigkeitsprobe durch Messung der Lichtabsorption der Reaktionsprodukte der Reagenzien in einer Meßeinrichtung, dadurch gekennzeichnet, daß der Reagenzsatz zwei oder mehr Reagenzien oder Reagenzmischungen enthält und diese derart ausgewählt sind, daß die separaten Bestandteile für die verschiedenen Bestimmungen einander nicht stören.
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