DE4321033A1 - Apparatur zur vorteilhaften Durchführung histochemischer und immunhistochemischer Methoden sowie ein Verfahren zur Quantifizierung dieser Methoden - Google Patents
Apparatur zur vorteilhaften Durchführung histochemischer und immunhistochemischer Methoden sowie ein Verfahren zur Quantifizierung dieser MethodenInfo
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Description
Antigene, Enzyme, mRNA oder DNA werden in Gewebeschnitten
mittels immunhistochemischer oder
histochemischer Reaktionen nachgewiesen. Hierbei
werden Dünnschnitte von fixierten Geweben oder
kryopräservierten Geweben auf Objektträger aufgebracht
und mittels selektiver Reagenzien die
nachzuweisende Struktur (Antigene, Enzyme, mRNA,
DNA usw.) markiert. Die so markierten Strukturen
können durch Verwendung bestimmter
Amplifikationssysteme (Enzym-markierte Zweit
antikörper kombiniert mit Farbstoffen, die nach
enzymatischer Spaltung wasserunlöslich werden;
Antikörper-Gold-Konjugate etc.) mikroskopisch
sichtbar gemacht und semiquantitativ ausgewertet
werden.
Bei der Durchführung dieser Methodiken treten eine
Vielzahl technischer Schwierigkeiten auf, die im
folgenden kurz dargestellt sind:
- - Während der Durchführung immunhistochemischer
oder histochemischer Reaktionen treten zwischen
den verschiedenen Reaktionsschritten sehr häufig
unerwünschte Verwaschungseffekte auf, bei denen
Reagenzien, die für Gewebe 1 vorgesehen sind,
auf Gewebe 2 und/oder Gewebe 3 desselben
Objektträgers überdiffundieren.
Dieser unerwünschte Nebeneffekt kann nur dadurch vermieden werden, daß pro Objektträger nur eine Struktur nachgewiesen wird bzw. nur ein Gewebeschnitt aufgetragen wird. - - Die Nachweisempfindlichkeit für ein funktionell
aktives Enzym wird in der Histochemie durch die
Umsatzrate des Enzyms sowie seine
Michaeliskonstante bestimmt. Um diese
Enzymcharakteristika optimal zu nutzen, sollte
das umzusetzende Substrat möglichst in
Konzentrationen angeboten werden, die
mindestens der Michaeliskonstanten entsprechen.
Viele histochemische Substrate haben eine
unzureichende Wasserlöslichkeit, so daß es
nicht möglich ist, eine Substratkonzentration
herzustellen, die der Michaeliskonstanten des
Enzyms entspricht. Die Konsequenz hiervon
ist eine suboptimale Substratkatalyse durch das
Enzym, gefolgt von unzureichender
Nachweisempfindlichkeit.
Dieser Nachteil läßt sich nur durch wiederholte Farbreaktion mit neuen Substratlösungen bzw. extrem langen Inkubationszeiten teilweise verbessern. - - Die Durchführung der Substratreaktion bei
immunhistochemischen oder histochemischen
Verfahren wird standardmäßig in Küvetten
durchgeführt, die große Substratvolumina (<20
ml) und mehrere Objektträger fassen.
Experimente, die verschiedene Substratreaktionen erfordern und unter Verwendung weniger Gewebeschnitte (Objektträger) durchzuführen wären, können somit nur ineffizient unter Verschwendung teuren Substrats durchgeführt werden.
Eine Vorrichtung, die die oben beschriebenen
Unzulänglichkeiten behebt, ist zur Zeit kommerziell
nicht erhältlich.
Im Rahmen unserer Arbeiten zur Verbesserung der
Nachweisempfindlichkeit histochemischer Reaktionen
ist es uns überraschenderweise gelungen, eine
Apparatur zu finden, welche alle oben erwähnten
Nachteile immunhistochemischer und histochemischer
Verfahren behebt und zusätzlich die Möglichkeit
eröffnet, immunhistochemische und histochemische
Reaktionen unter Verwendung geeigneter Substrate
zu quantifizieren.
Gegenstand der Erfindung ist also eine Apparatur
zur vorteilhafteren Durchführung semiquantitativer
immunhistochemischer bzw. histochemischer Verfahren
sowie ein Verfahren, basierend auf der
erfindungsgemäßen Apparatur zur Quantifizierung
immunhistochemischer und histochemischer Nach
weisverfahren.
Im folgenden wird beispielhaft eine
erfindungsgemäße Apparatur genauer beschrieben.
Sie besteht aus folgenden Bestandteilen
(Abb. 1):
- 1. untere Komponente des Fixierungsteiles:
Polycarbonatplatte mit genau passender Aussparung für einen Klarsichtfeldobjektträger und mit vier eingelassenen Senkkopfschrauben, - 2. Klarsichtfeldobjektträger (G. Menzel, Braunschweig),
- 3. Reservoirteil:
Silikondichtung mit zwölf ausgestanzten Reaktionsfeldern und zwei Orientierungsbohrungen, - 4. obere Komponente des Fixierungsteiles:
Polycarbonatplatte mit zwölf Bohrungen, die einen Zugang zum Reservoirteil ermöglichen, vier Schraubbohrungen und zwei kurzen Orientierungsstäben, - 5. Unterlegscheiben und Flügelmuttern.
Die oben genannten Bestandteile der beispielhaften
Apparatur werden folgendermaßen zusammengesetzt
(Abb. 2):
- 1. Der mit Gewebeschnitten bestückte Klarsichtfeldobjektträger wird mit der den Gewebeschnitten abgewandten Seite in die Aussparung auf der unteren Polycarbonatplatte (untere Komponente des Fixierungsteiles) gelegt (= untere Einheit).
- 2. Die Silikondichtung (Reservoirteil) wird mit Hilfe der Orientierungsbohrung im Reservoirteil sowie der Orientierungsstäbe in der oberen Komponente des Fixierungsteiles so auf die obere Polycarbonatplatte (obere Komponente des Fixierungsteiles) gelegt, daß die zwölf Bohrungen beider Teile genau übereinander passen (= obere Einheit).
- 3. Nun werden die untere Einheit und die obere Einheit mit Hilfe der eingelassenen Senkkopfschrauben der unteren Polycarbonatplatte sowie der entsprechenden Schraubbohrungen in der oberen Polycarbonatplatte so aufeinander gelegt, daß die Silikondichtung auf der mit den Gewebeschnitten bestückten Seite des Klarsichtfeldobjektträgers liegt und die Gewebeschnitte auf den zwölf Reaktionsfelder des Objektträgers durch die entsprechenden zwölf Bohrungen der oberen Einheit zugänglich sind.
- 4. Zur Fixierung werden abschließend auf die vier Senkkopfschrauben der unteren Polycarbonatplatte, die nun durch die Schraubbohrungen der oberen Polycarbonatplatte reichen, Unterlegscheiben gelegt und die Apparatur mit vier Flügelmuttern fest angezogen, so daß das System flüssigkeitsundurchlässig wird.
In den Rahmen der Erfindung gehören ferner
- - Apparaturen mit der Möglichkeit, auf einer Matrix mehr oder weniger als zwölf Gewebeschnitte zu bearbeiten.
- - Dabei kann als Matrix für den oder die Gewebeschnitte außer einem Klarsichtfeldobjektträger auch eine Membran, z. B. aus Nitrozellulose, Polyvinylidendifluorid oder positiv geladenem Nylon in die erfindungsgemäße Apparatur eingebaut werden.
- - Die Anzahl der in die erfindungsgemäße Apparatur einzubauenden Matrizes ist nicht auf eins beschränkt: Je nach Anfertigung der Apparatur können beliebig viele Matrizes in einer Apparatur parallel getestet werden. Dies ist besonders für Labore mit hohem Probendurchsatz in der Histo- und Immunhistochemie vorteilhaft.
Die erfindungsgemäße Apparatur bietet folgende
Vorteile:
- -Die Apparatur ist leicht zusammenbaubar und zerlegbar.
- - Die Apparatur ist leicht zu handhaben und leicht zu reinigen.
- - Die Apparatur ist nach der Reinigung wiederholt verwendbar.
- - Gefrierschnitte können wie bisher leicht auf eine geeignete Matrix aufgebracht werden.
- - Es können, je nach Ausführung der Apparatur,
problemlos mehrere Gefrierschnitte auf derselben
Matrix separat und gleichzeitig getestet
werden:
Jede Kammer des Reservoirteiles um einen Gewebeschnitt ist flüssigkeitsundurchlässig (es findet kein Austausch von flüssigem Medium zwischen den Kammern statt). In der oben beispielhaft beschriebenen Apparatur z. B. können zwölf Gewebeschnitte parallel getestet werden. - - Das Reaktionsvolumen über dem Gewebeschnitt wird durch das Einspannen der Matrix in die Apparatur vergrößert.
- - Der Verbrauch an Reaktionslösungen ist geringer (im Vergleich zu 20-ml-Küvetten).
- - Reaktionslösungen können problemlos auch mit automatischen Mehrkanalpipetten aufgetragen und wieder entnommen werden.
- - Die Erhöhung der Substratmenge durch das vergrößerte Volumen führt unerwarteterweise zu einer erhöhten Nachweisempfindlichkeit in histochemischen Tests.
- - Die Verwendung der Apparatur ermöglicht, immunhistochemische und histochemische Nachweisverfahren zu quantifizieren.
Im folgenden soll an Beispielen die Überlegenheit
der erfindungsgemäßen Apparatur gegenüber den
herkömmlichen immunhistochemischen und
histochemischen Techniken gezeigt werden.
Die erfindungsgemäße Apparatur entsprach bei
diesen Versuchen der in Abb. 1 gezeigten
Version.
Gefrierschnitte der humanen Normalgewebe (Leber,
Niere, Milz und Colon) wurden mit einem Kryostat
(LEITZ, Wetzlar, Fabrikat 1720, Best.-Nr. 2530599)
hergestellt. Die jeweils 6 µm dicken Schnitte
wurden auf die Reaktionsfelder der vorbehandelten
Klarsichtfeldobjektträger (G. Menzel, Braunschweig)
aufgebracht. Vor Gebrauch wurden die
Gefrierschnitte ca. eine Stunde bei Raumtemperatur
getrocknet.
Der histochemische Nachweis der humanen β-
Glucuronidase in den Gewebeschnitten erfolgte nach
der etablierten Methode von Murray et al. (Murray
et al., J. histochem. cytochem., 1989, 37:
643-652):
Hexazotiertes Neufuchsin wurde hergestellt, indem
5 g Neufuchsin (SERVA, Heidelberg, Best.-Nr.
30293) in 100 ml 2N Salzsäure und 4 g Natriumnitrit
in Aqua dest. gelöst wurden. Beide Lösungen
wurden kurz vor Gebrauch jeweils im gleichen
Verhältnis gemischt und filtriert. 0,2 M
Natriumacetatpuffer, pH 5, wurde durch Mischen von
7 Teilen 0,2 M Natriumacetat mit 3 Teilen 0,2 M
Essigsäure hergestellt. Für die Substratlösung,
die auf die Schnitte aufgetragen wurde, wurden 2,8
mg Naphthol-AS-Bi-β-D-Glucuronid (SIGMA, München,
Best.-Nr. 1875) in 10 ml 0,2 M
Natriumacetatpuffer, pH 5, gelöst und anschließend
10 ml Aqua dest. sowie 0,6 ml frisch angesetztes
hexazotiertes Neufuchsin dazugegeben.
Die histochemische Nachweisreaktion auf Kryogewebe
wurde durchgeführt, nachdem die Gefrierschnitte
ca. 60 min bei Raumtemperatur getrocknet waren.
Die Substratlösung wurde aufgetragen (15 µl pro
Feld eines Klarsichtfeldobjektträgers, 100-300 µl
pro Feld bei Verwendung der erfindungsgemäßen
Apparatur nach Abb. 1) und 90 min bei 37°C
in einer feuchten Kammer inkubiert. Danach wurden
die Schnitte für ca. 10 min in Aqua dest. gewaschen,
bevor sie mit Hämalaun (MERCK, Darmstadt,
Best.-Nr. 9249) gegengefärbt und/oder
luftgetrocknet mit Aquatex (MERCK, Darmstadt,
Best.-Nr. 8562) eingedeckelt wurden. Die so
behandelten Gefrierschnitte wurden nun unter dem
Lichtmikroskop (LEITZ, Wetzlar, Laborlux S) auf
ihre β-Glucuronidase-Aktivität untersucht.
Eine Kontrolle auf unspezifische Substratkomplex-
Fällung wurde mit 10 mM pro Ansatz D-
Saccharo-1,4-lacton (ALDRICH, Steinheim, Best.-Nr.
22.293-3), einem kompetitiven Inhibitor der β-
Glucuronidase, durchgeführt.
Der Einfluß der Substratlösungsmenge auf die
Nachweisempfindlichkeit wurde in parallelen
Versuchsansätzen untersucht. Bei einer Sub
stratkonzentration von 0,25 mM wurde die Substrat
lösungsmenge variiert. Sie betrug:
- 1. 15 µl pro Feld eines Klarsichtfeldobjektträgers,
Versuchsdurchführung auf dem Objektträger - 2. 100 µl pro Feld eines Klarsichtfeldobjektträgers,
Versuchsdurchführung in erfindungsgemäßer Apparatur - 3. 300 µl pro Feld eines Klarsichtfeldobjektträgers,
Versuchsdurchführung in erfindungsgemäßer Apparatur - 4. <300 µl pro Feld eines Klarsichtfeldobjektträgers,
Versuchsdurchführung in einer 100-ml-Waschküvette.
Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
Eine Erhöhung der Substratlösungsmenge unter
Verwendung der erfindungsgemäßen Apparatur führt
zu einer deutlich sichtbaren Empfindlichkeitssteigerung
des histochemischen Enzymnachweises:
mit der Vergrößerung des Reaktionsvolumens steigt
die Farbintensität.
Durch eine Verlängerung der Inkubationszeit oder
eine Erhöhung der Substratkonzentration konnte
eine weitere Optimierung des Nachweises nicht
erzielt werden, da im ersten Fall eine störende
Hintergrundfärbung auftrat (Background) und im
zweiten Fall das Substrat bei höheren Konzentrationen
(0,5-1 mM) nicht in Lösung blieb, sondern
ausfiel.
Bei der Verwendung von geeigneten Substraten ist
es möglich, mit Hilfe der erfindungsgemäßen
Apparatur histochemische und immunhistochemische
Nachweisreaktionen zu quantifizieren. Voraussetzung
für diesen Reaktionstyp ist ein
wasserlösliches Endprodukt, das in einem be
stimmten Meßsystem nachweisbar und meßbar ist.
Als nachzuweisende Strukturen kommen unter anderem
tumorassoziierte Antigene, Rezeptoren und andere
diagnostisch interessante Moleküle in Frage, wie
z. B. CEA, Cytokeratin oder Östrogen-Rezeptor. Als
Amplifikationsenzyme eignen sich z. B. alkalische
Phosphatase, Peroxidase oder Katalase.
Das Prinzip ist folgendes:
Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Apparatur
kann das im Gewebeschnitt nachzuweisende Molekül
mit den literaturbekannten histochemischen oder
immunhistochemischen Nachweisreaktionen nach
gewiesen werden. Wichtig ist nur, daß nach der
Amplifikation statt eines wasserunlöslichen
Produktes (Fällungsreaktion) ein wasserlösliches
Endprodukt im Überstand entsteht, das eine meßbare
chemische oder physikochemische Eigenschaft
besitzt. Das konstante und bekannte Reaktions
volumen über dem Gewebeschnitt, das die
erfindungsgemäße Apparatur gewährleistet, ermöglicht
es nun, das entstandene Endprodukt zu
quantifizieren. Als Meßsysteme eignen sich je nach
eingesetztem Substrat z. B. Fluorometer,
Photometer, Chemilumineszenz- oder
Elektrochemilumineszenzmeßgeräte etc.
Die universelle Verwendbarkeit soll an einigen
ausgewählten Beispielen gezeigt werden. Dabei wird
zur Verdeutlichung die jeweilige Fällungsreaktion
(qualitativer, mikroskopisch sichtbarer Nachweis)
der entsprechenden quantifizierten Reaktion
gegenübergestellt.
β-Glucuronidase wurde unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Apparatur sowohl histochemisch
als auch fluorometrisch in humanen Normalgeweben
(Leber, Milz, Niere, Plazenta und Nebenhoden)
nachgewiesen.
Der histochemische Nachweis erfolgte wie unter
Beispiel 1 bereits beschrieben.
Bei der Quantifizierungsreaktion wurden die
Gewebestückchen vor dem Schneiden der 6 µm
Schnitte auf ein quadratisches Format mit 5 mm
Seitenlänge gebracht und statt des Fällungs
substrates Naphthol-AS-Bi-β-D-Glucoronid ein
fluorogenes Substrat benutzt: 4-
Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronsäure (4-MUG)
(SIGMA, München, Best.-Nr. 9130).
Es wurden nach dem Lufttrocknen und Einspannen der
Gewebeschnitte in die erfindungsgemäße Apparatur
je 100 µl 2,5 mM 4-Methylumbelliferyl-β-D-
Glucuronid, das in 200 mA Na-Acetat plus 0,01%
BSA, pH 4,5, gelöst war, in die Reaktionsfelder
pipettiert und für 2 Stunden bei 37°C in einer
feuchten Kammer inkubiert. Nach der exakten
Inkubationszeit wurde die Reaktion mit je 150 µl
Stopplösung (0,2 M Glycin plus 0,2% SDS, pH 11,7)
pro Reaktionsfeld abgebrochen. Anschließend wurden
200 µl pro Reaktionsfeld in eine 96-well-
Mikrotiterplatte (RENNER, Dannstadt, Best.-Nr.
12058) übertragen und im Fluoroskan II (FLOW
LABORATORIES, Meckenheim, Best.-Nr. 78-611-00)
gemessen.
Von allen Geweben wurden jeweils 6 Schnitte
getestet.
Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Wie der Tabelle 2 deutlich zu entnehmen ist,
besteht eine gute Korrelation zwischen dem
histochemischen und dem fluorometrischen β-
Glucuronidase-Nachweis auf Normalgewebe: starke,
mikroskopisch sichtbare Färbung entspricht hohen
gemessenen fluorogenen Einheiten, während Gewebeschnitte
mit schwacher Färbung mit entsprechenden
niedrigen Werten korrelieren.
Die erfindungsgemäße Apparatur ermöglicht es
somit, histochemische Nachweisreaktionen zu
quantifizieren.
Vergleichbare Ergebnisse werden mit
erfindungsgemäßen Apparaturen erhalten, bei denen
z. B. nur 3 Reaktionen pro Objektträger möglich
sind oder mit erfindungsgemäßen Apparaturen, bei
denen mehrere Objektträger pro Apparatur verwendet
werden.
Glykoproteine der Zellmembran lassen sich
immunhistochemisch mit spezifischen monoklonalen
Antikörpern differenziert lokalisieren und nachweisen.
Normalerweise kann allerdings nur anhand
der Farbintensität des Gewebeschnittes auf die
Molekülanzahl zurückgeschlossen werden. Wenn aber
das Endprodukt des Amplifikationssystems anstatt
einer Fällungsreaktion und eines Farbniederschlages
ein wasserlösliches Molekül mit einer
meßbaren physikochemischen Eigenschaft ist, kann
bei Verwendung der erfindungsgemäßen Apparatur
eine immunhistochemische Nachweisreaktion quanti
fiziert werden.
Im folgenden Beispiel wurden die Glykoproteine
CEA, PEM und NCAM in parallelen Ansätzen
immunhistochemisch und fluorometrisch in der
erfindungsgemäßen Apparatur in Tumorgewebeschnitten
von Colonkarzinom, Mammakarzinom und
kleinzelligem Lungenkarzinom nachgewiesen und
quantifiziert.
Der immunhistochemische Nachweis wurde entsprechend
der Methode von Cordell et al. (Cordell et
al., 1984, J. histochem. cytochem., 32: 219-229)
durchgeführt. Dabei wurden die 1. Antikörper in
einer Konzentration von 1 µg/ml eingesetzt. Als
Zweitantikörper wurden anti-Maus-Ig-Antikörper,
markiert mit alkalischer Phosphatase (SOUTHERN),
in einer Verdünnung von 1 : 400 benutzt. Die Farb
entwicklung erfolgte mit dem Substrat Naphthyl-
AS-Phosphat plus hexazotiertem Pararosanilin.
Für die quantitative, immunhistochemische Nach
weisreaktion wurden Tumorgewebeschnitte wie in
Beispiel 2 beschrieben behandelt. Die Nachweis
reaktion entsprach der oben angeführten
immunhistochemischen Methode, allerdings wurde
statt des Fällungssubstrates ein wasserlösliches,
fluorogenes Substrat eingesetzt: 4-
Methylumbelliferyl-phosphat. Nach dem Abstoppen
der Reaktion wurden, wie in Beispiel 2 bereits
beschrieben, 200 µl Reaktionslösung in eine
96-well-Mikrotiterplatte übertragen und im
Fluoroskan II fluorometrisch ausgewertet.
Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 3 wieder
gegeben.
Die Daten in Tabelle 3 zeigen, daß eine gute
Korrelation zwischen dem mikroskopischen,
immunhistochemischen Nachweis und dem quanti
tativen, fluorometrischen Nachweis, erreicht durch
das erfindungsgemäße Verfahren, besteht.
Claims (8)
1. Apparatur, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus
minimal einem Bestandteil zur vorteilhafteren
Durchführung von Nachweisreaktionen auf
Gewebeschnitten besteht.
2. Apparatur nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß sie aus einem Fixierungsteil und
einem Reservoirteil besteht, wobei die Aufnahme
mindestens einer Matrix, auf der die
Gewebeschnitte fixiert sind, zwischen den
beiden Teilen vorgesehen ist.
3. Apparatur nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß der Fixierungsteil mindestens
eine Öffnung hat, die einen Zugang zum
Reservoirteil ermöglicht.
4. Apparatur nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß der Fixierungsteil aus harten,
inerten Materialien, wie z. B. Metall,
Kunststoff, vorzugsweise Polycarbonat und der
Reservoirteil aus weichen, inerten Materialien,
wie z. B. Gummi, Kautschuk, weiche Kunststoffe,
vorzugsweise Silikon, besteht.
5. Apparatur nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß sie aus den in Abb. 1
gezeigten Bestandteilen besteht.
6. Verfahren zur Quantifizierung von Nachweis
reaktionen auf Gewebeschnitten, dadurch
gekennzeichnet, daß die in Anspruch 1
beschriebene Apparatur verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Quantifizierung der
Nachweisreaktion mittels wasserlöslicher
Endprodukte, vorzugsweise fluorogenen
Substraten, erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 6 und 7, dadurch
gekennzeichnet, daß es wie in Beispiel 2
beschrieben durchgeführt wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19934321033 DE4321033A1 (de) | 1993-06-24 | 1993-06-24 | Apparatur zur vorteilhaften Durchführung histochemischer und immunhistochemischer Methoden sowie ein Verfahren zur Quantifizierung dieser Methoden |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19934321033 DE4321033A1 (de) | 1993-06-24 | 1993-06-24 | Apparatur zur vorteilhaften Durchführung histochemischer und immunhistochemischer Methoden sowie ein Verfahren zur Quantifizierung dieser Methoden |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4321033A1 true DE4321033A1 (de) | 1995-01-12 |
Family
ID=6491148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19934321033 Withdrawn DE4321033A1 (de) | 1993-06-24 | 1993-06-24 | Apparatur zur vorteilhaften Durchführung histochemischer und immunhistochemischer Methoden sowie ein Verfahren zur Quantifizierung dieser Methoden |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE4321033A1 (de) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US7347977B2 (en) | 2000-06-08 | 2008-03-25 | Eppendorf Ag | Microtitration plate |
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| DD231130A1 (de) * | 1984-09-24 | 1985-12-18 | Univ Berlin Humboldt | Mikrofiltrationsvorrichtung fuer praezipitate radioaktiv markierter makromolekuele und zellen |
-
1993
- 1993-06-24 DE DE19934321033 patent/DE4321033A1/de not_active Withdrawn
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| LUPPA, Hans: Grundlagen der Histochemie, Teil II, Vieweg Braunschweig, 1. Aufl., 1978, S. 209-215, 228-230 * |
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