DE60023489T2 - Struktur- und sequenzbestimmung von polysacchariden - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet der strukturellen Analyse von Saccharidketten wie denjenigen, die entweder an Proteine (Proteoglycane, Glycoproteine) oder Lipide gebunden oder als freie Saccharide vorkommen.
  • Einführung
  • Oligosaccharide und Polysaccharide bestehen aus Monosaccharid-(Zucker-) Einheiten, die über glycosidische Bindungen miteinander verbunden sind. Die Saccharidkette hat, wie eine DNA- oder Protein-Kette, zwei ungleiche Enden. Im Falle von Saccharidketten sind diese das reduzierende Ende (entsprechend der Aldehyd-Gruppe des linearen Zuckermoleküls) und das nicht-reduzierende Ende. Anders als Proteine und DNA können Saccharide jedoch auch verzweigt sein, wobei im Wesentlichen jede der Zuckereinheiten in dem Saccharid als ein optionaler Verzweigungspunkt dient.
  • Es gibt eine Anzahl von Proteinen, die an Saccharide binden. Viele dieser Proteine binden spezifisch an eine bestimmte kurze Oligosaccharid-Sequenz. Lectine sind aus Pflanzen isolierte Proteine, die Saccharide binden. Zum Zwecke dieser Anmeldung umfasst der Begriff "Lectin" auch Saccharid-bindende Proteine von tierischen Spezies (z.B. "Säugetier-Lectine"). Antikörper sind Proteine, die spezifisch bestimmte molekulare Strukturen erkennen. Antikörper können auch Saccharidstrukturen erkennen, wie es Lectine tun. Glycosidasen sind Enzyme, die glycosidische Bindungen in der Saccharidkette spalten. Glycosidasen können auch bestimmte Oligosaccharid-Sequenzen spezifisch erkennen. Glycosyltransferasen sind Enzyme, die die Saccharidkette spalten, aber außerdem eine Zuckereinheit auf eines der neu erzeugten Enden übertragen.
  • Das Gebiet der Strukturbestimmung von Polysacchariden hat sich nicht so schnell entwickelt wie das Gebiet der Proteinanalyse und der DNA-Analyse. Dies liegt an der Tatsache, dass im Kielwasser grundlegender Entdeckungen auf dem Gebiet der DNA-bezogenen Forschung erkannt wurde, dass die Wichtigkeit von DNA maßlos unterschätzt worden war. Dies führte in mehreren Jahrzehnten intensiver Forschung zu DNA-Analyseverfahren und zu DNA selbst. Darüber hinaus begann mit dem Aufkommen immer weiter verbesserter und immer weiter vereinfachter DNA-Analyseverfahren das Gebiet der Protein-Strukturanalyse und -Funktionsanalyse mehr und mehr aus der DNA-Technologie abgeleitete Hilfsmittel zu verwenden. Beispielsweise wird die Strukturbestimmung eines Proteins üblicherweise durch reverse genetische Techniken ausgeführt, z.B. durch Beschaffen eines kleinen Bruchteils der Proteinsequenz und Ableiten der verbleibenden Protein-Aminosäure-Sequenz aus der entsprechenden mRNA-Sequenz, die heute in den meisten Fällen leicht verfügbar ist, da ein großer Teil der mRNA-Sequenzen einer Anzahl von Spezies, einschließlich des Menschen, in Datenbanken erhältlich sind.
  • Die Analyse eines sehr wichtigen Teils der meisten Säugetier-Proteine, d.h. der an sie gebundenen Saccharide und Glycane, war im Allgemeinen langsamer im Vergleich zu dem Fortschritt, der in der Technologie der DNA- und Protein-Analyse gemacht wurde.
  • Die Wichtigkeit von Glycomolekülen wird hervorgehoben durch die Entdeckung von Penicillin, ein Hemmstoff der Glycomolekül-Synthese in der Bakterien-Zellwand und möglicherweise das erfolgreichste Antibiotikum, das bisher entdeckt wurde.
  • Ein anderes Beispiel ist die medizinische Verwendung von Heparin, ein Glycan, das die Blutgerinnung hemmt und heute in der Medizin in breitem Umfang verwendet wird. Weitere Beispiele für medizinisch wichtige Glycomoleküle umfassen: Glycosaminoglycane (GAGs), Heparansulfat, Cytokine (z.B. IL-8, TNF), Chemokine (z.B. saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor) und verschiedene Wachstumsfaktoren. Die vorgenannten Cytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren sind ebenfalls in der Lage, an GAGs und andere Polysaccharide zu binden, und daher können sie ebenfalls als Lectine betrachtet werden.
  • Die Strukturbestimmung von Polysacchariden ist für die Entwicklung der Glycobiologie von fundamentaler Wichtigkeit. Die Forschung in der Glycobiologie be trifft so unterschiedliche Gegenstände wie die oben erwähnten Bakterien-Zellwände, Blut-Glycane, Wachstumsfaktoren und Zelloberflächen-Rezeptorstrukturen, die an Viruserkrankungen wie einer HIV-Infektion, Autoimmunkrankheiten wie insulinabhängiger Diabetes und rheumatoider Arthritis, beteiligt sind, und abnormes Zellwachstum, wie es bei Krebs auftritt.
  • Auf anderen Gebieten der Medizin, wie der Bereitstellung von Kontaktlinsen, künstlicher Haut, der Entwicklung von Prothesen, sind Polysaccharide gute Kandidatenmaterialien. Außerdem werden Polysaccharide auf einer Anzahl nicht-medizinischer Gebiete wie der Papierindustrie verwendet. Zusätzlich verwendet natürlich die Nahrungs- und Arzneimittelindustrie große Mengen verschiedener Polysaccharide und Oligosaccharide.
  • Auf allen der obigen Gebiete gibt es einen Bedarf an verbesserten Saccharid-Analysetechnologien zu den Zwecken der Qualitätskontrolle, der Strukturbestimmung in der Forschung und zur Durchführung von Struktur-Funktions-Analysen.
  • Vor einer Anzahl von Jahren wurden auf den Gebieten der Protein- und DNA-Sequenzierung fortschrittliche Analyseverfahren eingeführt. Die Komponenten, die DNA und Proteine aufbauen, sind miteinander nur durch eine Art von Verbindung (der 5'- zu 3'-Phosphorsäure-Brücke in DNA und der Peptid-Bindung in Proteinen) verbunden. DNA enthält nur vier verschiedene Komponenten (die Nucleinsäuren), während Proteine etwa 20 verschiedene Komponenten (die Aminosäuren) enthalten. Obwohl es modifizierte Aminosäuren gibt, muss ein Protein zuerst unter Verwendung einer DNA-Matrize nach dem genetischen Code synthetisiert werden. Daher ist die Anzahl und Art von Aminosäuren, die in einem neu synthetisierten Protein vorliegen, auf das begrenzte Repertoire von Aminosäuren, die in dem genetischen Code dargestellt werden, eingeschränkt. Dieser Code ist, mit nur kleineren Unterschieden, für alle Lebensformen universell.
  • Wegen der obigen strukturellen Gründe ist die Strukturanalyse von Proteinen und von DNA heute ein einfaches, schnelles und relativ preiswertes Verfahren, das kein hochgradig kenntnisreiches Personal erfordert.
  • Im Gegensatz dazu wurde eine Vielzahl von Verfahren zur Analyse von Saccharidstrukturen entwickelt, jedes mit seinen eigenen Nachteilen. Unabhängig vom Grad der Ausgeklügeltheit des verwendeten Verfahrens ist es heute nicht möglich, unter Verwendung einer einzigen Technik die gesamte Sequenz eines Polysaccharids oder selbst eines Oligosaccharids zu bestimmen. Es gibt mehrere Gründe für diese Schwierigkeit. Erstens werden Saccharide Matrizen-unabhängig synthetisiert. In Abwesenheit von Strukturinformation muss der Forscher daher davon ausgehen, dass die Aufbaueinheiten aus irgendwelchen der heute bekannten Saccharideinheiten ausgewählt sind. Zusätzlich können diese Einheiten während der Synthese modifiziert worden sein, z.B. durch die Addition von Sulfatgruppen.
  • Zweitens sind die Verbindungen zwischen Saccharideinheiten vielfältig. Ein Saccharid kann an irgendeines der Atome C1, C2, C3, C4 oder C6 gebunden sein, wenn die Zuckereinheit, an die es gebunden ist, eine Hexose ist. Darüber hinaus kann die Verbindung mit dem C1-Atom entweder α- oder β-Konfiguration haben.
  • Drittens können Saccharide verzweigt sein, was ihre Struktur und die Anzahl möglicher Strukturen, die eine identische Anzahl und Art von Zuckereinheiten haben, weiter kompliziert.
  • Eine vierte Schwierigkeit stellt die Tatsache dar, dass der Strukturunterschied zwischen vielen Zuckern winzig ist, da sich eine Zuckereinheit von einer anderen lediglich durch die Stellung der Hydroxylgruppen unterscheiden kann (Epimere).
  • Der Stand der Technik
  • Es wurde eine Anzahl von Verfahren zur strukturellen Analyse von Sacchariden entwickelt.
  • WO 93/24503 offenbart ein Verfahren, bei dem Monosaccharid-Einheiten nacheinander von dem reduzierenden Ende eines Oligosaccharids entfernt werden, indem das Monosaccharid an dem reduzierenden Ende in seine Keto- oder Aldehyd-Form überführt wird und dann die glycosidische Bindung zwischen dem Monosaccharid und dem nächsten Monosaccharid in der Oligosaccharid-Kette unter Verwendung von Hydrazin gespalten wird. Die freien Monosaccharide werden von der Oligosaccharid-Kette abgetrennt und durch chromatografische Verfahren identifiziert. Das Verfahren wird dann wiederholt, bis alle Monosaccharide abgespalten wurden.
  • WO 93/22678 offenbart ein Verfahren zur Sequenzierung eines unbekannten Oligosaccharids, wobei Annahmen bezüglich seiner Grundstruktur gemacht werden und dann aus einer Anzahl von Sequenzierungshilfsmitteln (wie Glycosidasen) eines ausgewählt wird, das voraussichtlich das höchste Ausmaß an Strukturinformation ergeben wird. Dieses Verfahren erfordert eine gewisse Grundinformation hinsichtlich der Oligosaccharid-Struktur (üblicherweise die Monosaccharid-Zusammensetzung). Das Verfahren veranschaulicht auch die Tatsache, dass Reaktionen mit Sequenzierungsreagenzien kostspielig und zeitaufwändig sind, und daher besteht ein Bedarf für ein Verfahren, das diese Ausgaben verringert.
  • WO 93/22678 offenbart ein Verfahren zum Nachweisen von Molekülen durch Untersuchen einer monolithischen Anordnung von Sonden, wie Oligodeoxynucleotiden, die auf einem VLSI-Chip immobilisiert sind. Diese Veröffentlichung lehrt, dass eine große Anzahl von Sonden an einer immobilisierten Oberfläche gebunden werden kann, und lehrt ihre Reaktion mit einem Analyten, die unter Verwendung einer logischen Schaltung auf dem VLSI-Chip durch eine Vielfalt von Verfahren nachgewiesen wird.
  • EP 421 972 offenbart ein Verfahren zur Sequenzierung von Oligosacchariden durch Markieren eines ihrer Enden, Aufteilen des markierten Oligosaccharids in Aliquots und Behandeln jedes Aliquots mit einem unterschiedlichen Reagenzgemisch (z.B. aus Glycosidasen), Sammeln der verschiedenen Reaktionsgemische und dann Analysieren der Reaktionsprodukte, wobei chromatografische Verfahren verwendet werden. Dieses Verfahren ist nur für N-verbundene Glycane brauchbar, da sie an dem Punkt, an dem die Saccharidkette an das Protein gebunden ist, eine gemeinsame Struktur haben. O-verbundene Glycane sind vielfältiger, und das Verfahren wurde noch nicht an solche Oligosaccharide mit einer größeren Vielfalt in ihrer Grundstruktur angepasst.
  • EP-A-0 166 623 offenbart ein Verfahren zum Nachweisen von Glycoproteinen, Glycopeptiden, Kohlehydraten oder Glycolipiden mit Zuckerresten. Nur eine einzige immunologisch spezifische Komponente ist für diesen Nachweis der Anwesenheit oder des Fehlens von Zuckerresten erforderlich.
  • P. Laidler und A. Litynska (Int. J. Biochemistry & Cell Biology, vol. 29, 1997, Seiten 475–483) studierten die Kohlehydrat-Baueinheiten menschlicher Placenta-Arylsulfatase A durch sequenzielle Lectin-Affinitätschromatografie nach enzymatischer Spaltung und Markierung mit tritiummarkiertem Natriumborhydrid.
  • D. F.Smith et al. (J. Biological Chemistry, vol. 262(25), 1987, Seiten 12040–12047) identifizierten ein neues Oligosaccharid in menschlicher Milch. Die Struktur des Oligosaccharids wurde bestimmt durch Verdau des radioaktiv markierten Oligosaccharids durch Exoglycosidase, Bindung durch spezifische Anti-Kohlehydrat-Antikörper und Analyse des 3H-markierten Glucitol-Derivats, das nach Permethylierung und Hydrolyse erhalten wurde.
  • A. M. Hutchinson (Analytical Biochemistry, vol. 220, 1994, Seiten 303–307) charakterisierte die Kohlehydrat-Baueinheiten von Rinder-Fetuin durch Oberflächen-Plasmonresonanz. Die Anwesenheit oder das Fehlen spezifischer Oligosaccharid-Strukturen wurde durch Bindung einer Gruppe unmarkierter Lectine bestimmt. Die Monosaccharid-Reihenfolge und -Verknüpfungen wurden durch sequenziellen Verdau unter Verwendung einer Reihe spezifischer Exoglycosidasen bestimmt.
  • K. Yamashita et al. (Biochemistry, vol. 27, 1988, Seiten 5565–5573) verglich die Asparagin-verknüpften Zuckerketten zweier Rattennieren-Peptidasen. Die Struktur der Oligosaccharide wurde vorausgesetzt aufgrund ihrer effektiven Molekülgrößen und ihres Verhaltens auf vier Lectinsäulen und dann durch sequenziellen Exoglycosidase-Verdau und Methylierungsanalyse bestätigt.
  • K. Yamashita et al. (Biochemistry, vol. 29, 1990, Seiten 3030–3039) verglich die Asparagin-verknüpften Zuckerketten von SAP-1, aus normaler menschlicher Leber in reiner Form gewonnen, und von SAP-1, aus GM1-Gangliosidose-Leber in reiner Form gewonnen. Die Struktur der Oligosaccharide wurde aus Daten ihrer effektiven Molekülgrößen, ihres Verhaltens auf immobilisierten Lectinsäulen mit unterschiedlichen Kohlehydrat-Bindungsspezifitäten, Ergebnissen des sequenziellen Verdaus durch Exoglycosidase mit unterschiedlichen Aglyconspezifitäten und Methylierungsanalyse abgeschätzt.
  • Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur strukturellen Analyse von Sacchariden bereitzustellen, das alle Probleme, die mit den obigen Verfahren des Stands der Technik verbunden sind, löst.
  • Daher stellt die Erfindung die obige strukturelle Analyse von Sacchariden mittels einer einzigen Technik bereit, ohne das Erfordernis, mit unterschiedlichen Techniken erhaltene Ergebnisse zu kombinieren, um ein Endergebnis zu erhalten.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zur strukturellen Analyse von Oligosacchariden wie auch von Polysacchariden geeignet.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist außerdem zur Automatisierung geeignet und stellt daher eine einfache und schnelle Analyse bereit, die im Wesentlichen genug Information liefert, um ein gegebenes Oligo- oder Polysaccharid eindeutig zu identifizieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Identifizieren der Sequenz eines gegebenen Oligo- oder Polysaccharids bereit.
  • Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden mit dem Fortgang der Beschreibung deutlich.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Verfahren zur strukturellen Analyse eines Saccharids, aufweisend:
    • a) Bereitstellen auf einer Oberfläche eines Substrats einer Mehrzahl von unterschiedlichen im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Bindungsmitteln mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten, wobei eine Anzahl der Mehrzahl der im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Mittel auf derselben Oberfläche des Substrats immobilisiert ist;
    • b) Inkontaktbringen der Oberfläche mit einem zu analysierenden Saccharid oder mit einer Mischung, die eine Mehrzahl von Fragmenten des Saccharids aufweist;
    • c) Waschen oder anderweitiges Entfernen ungebundener Saccharide oder Saccharidfragmente;
    • d) Hinzufügen zu der in Schritt c) erhaltenen Oberfläche eines im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markers oder einer Mischung von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern;
    • e) Erfassen eines oder mehrerer Bilder der Marker, die an die Oberfläche gebunden sind; und
    • f) Ableiten von Information bezüglich der Identität des zu analysierenden Saccharids von dem Bild.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur strukturellen Analyse eines Saccharids bereit, aufweisend:
    • a) Bereitstellen auf Kügelchen einer Mehrzahl von unterschiedlichen im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Bindungsmitteln mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten, wobei eine Anzahl der Mehrzahl der im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Mittel auf den Kügelchen immobilisiert ist;
    • b) Inkontaktbringen der Kügelchen mit einem zu analysierenden Saccharid oder mit einer Mischung, die eine Mehrzahl von Fragmenten des Saccharids aufweist;
    • c) Waschen oder anderweitiges Entfernen von ungebundenem Saccharid oder ungebundenen Saccharidfragmenten;
    • d) Hinzufügen zu den in Schritt c) erhaltenen Kügelchen eines im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markers oder einer Mischung von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern;
    • e) Erfassen von einem oder mehreren Bildern der Marker, die an die Kügelchen gebunden sind; und
    • f) Ableiten von Information bezüglich der Identität des zu analysierenden Saccharids von dem Bild.
  • Bevorzugt weisen die Kügelchen eine Mehrzahl von Aliquots von Kügelchen auf, wobei jedes Aliquot ein unterschiedliches erstes im Wesentlichen Sequenz und/oder Stellen-spezifisches Mittel trägt, und sind außerdem dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt (b) die Aliquots von Kügelchen separat in Kontakt mit dem Saccharid oder den Saccharidfragmenten gebracht werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung sind im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Marker chromogene Bindungsmittel. Der Begriff "chromogenes Bindungsmittel", wie er hierin verwendet wird, umfasst alle Mittel, die an Saccharide binden und die eine charakteristische Farbe oder ein in anderer Weise nachweisbares Merkmal haben, so dass nach der Bindung an ein Saccharid das Saccharid die Farbe oder das andere Merkmal annimmt. Zusätzlich zu chemischen Strukturen mit intrinsischen, leicht beobachtbaren Farben im sichtbaren Bereich, gehören zu anderen verwendeten Markern fluoreszierende Gruppen, Biotin-Kennzeichnungen, Enzyme (die in einer Reaktion verwendet werden können, die zur Bildung eines farbigen Produkts führt), magnetische Marker und Isotopenmarker, usw. Die vorstehende Liste nachweisbarer Marker ist nur zu Veranschaulichungszwecken, und sie ist in keiner Weise begrenzend oder erschöpfend gedacht. In ähnlicher Weise umfasst der Begriff "Farbe", wie er hierin verwendet wird (z.B. im Zusammenhang mit Schritt (c) des oben beschriebenen Verfahrens) auch ein beliebiges nachweisbares Merkmal.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird die Strukturinformation durch einfache visuelle Betrachtung der Oberfläche und Vergleich mit einem Standard erhalten. In einer anderen bevorzugten Ausführungs form umfasst alternativ Schritt (f) die Verwendung optischer Filter. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Bild der Farben, die sich auf der Oberfläche entwickeln, fotografisch festgehalten und dann digitalisiert.
  • Obwohl das Verfahren der Erfindung unter Verwendung irgendeines geeigneten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Bindungsmittels durchgeführt werden kann, betrifft die Erfindung insbesondere die Verwendung von Lectinen als im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifische Bindungsmittel. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Bindungsmittel Antikörper.
  • Irgendeine geeignete farbige (oder in anderer Weise nachweisbare) Substanz, die an Saccharide in einer im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Weise bindet, kann als ein im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifisches chromogenes Bindungsmittel verwendet werden. Im Allgemeinen ist das im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifische chromogene Bindungsmittel jedoch ein chromogenes Lectin oder ein chromogener Antikörper. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das chromogene Bindungsmittel ein gefärbtes Lectin. Weitere bevorzugte Ausführungsformen verlangen die Verwendung fluoreszierender oder Biotin-markierter Lectine oder Antikörper. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das im Wesentlichen Sequenz-spezifische chromogene Bindungsmittel ein Enzymmarkierter Antikörper.
  • Gemäß einem anderen Aspekt weist das Verfahren der Erfindung außerdem eine Behandlung des Saccharids mit einem im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel auf, das in der Lage ist, die Saccharidkette nach Bindung daran zu spalten. Diese Behandlung kann durchgeführt werden, bevor das Saccharid mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird. Alternativ kann die Behandlung nach der Entfernung von gebundenem Saccharid durchgeführt werden, aber vor dem Hinzufügen der im Wesentlichen Sequenz-spezifischen chromogenen Bindungsmittel.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist die Oberfläche ein Filterpapier, und die im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel sind in einer vordefinierten Ordnung auf dem Filterpapier angeordnet.
  • Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zum Konstruieren einer Glycomolekül-Identitäts(GMID)-Karte, die Saccharid-Strukturanalysedaten, die gemäß der unmittelbar vorhergehenden bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung erhalten wurden, auflistet. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die verwendeten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Reagenzien auf der GMID-Karte durch Code-Nummern dargestellt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind Kombinationen im Wesentlichen Sequenz-spezifischer Reagenzien, die bei der Analyse verwendet wurden, durch eindeutige Code-Nummern dargestellt.
  • Die Erfindung betrifft auch einen festen Träger, aufweisend in einer vordefinierten Ordnung eine Mehrzahl von visuell oder in anderer Weise detektierbaren Markern, die repräsentativ für ein Saccharid oder eine Saccharidsequenz oder ein Saccharidfragment sind, wobei der feste Träger erhältlich ist durch:
    • a) Bereitstellen auf einer Oberfläche eines Substrats einer Mehrzahl von unterschiedlichen im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Bindungsmitteln mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten, wobei eine Anzahl der Mehrzahl der im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Mittel auf derselben Oberfläche des Substrats immobilisiert ist;
    • b) Inkontaktbringen der Oberfläche mit einem zu analysierenden Saccharid oder mit einer Mischung, die eine Mehrzahl von Fragmenten des Saccharids aufweist;
    • c) Waschen oder anderweitiges Entfernen von ungebundenem Saccharid oder ungebundenen Saccharidfragmenten; und
    • d) Hinzufügen zu der in Schritt c) erhaltenen Oberfläche eines im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markers oder einer Mischung von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern.
  • Gemäß einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zum Wählen eines Satzes von im Wesentlichen Sequenz-spezifischen chromogenen Bindungsmitteln zur Verwendung in dem oben beschriebenen Verfahren, folgende Schritte aufweisend:
    • a) Beschaffen der vollständigen oder teilweisen Monosaccharid-Zusammensetzung (MC – monosaccharide composition) des zu analysierenden Saccharids;
    • b) Wählen eines Satzes von n im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern, die in der Lage sind, an die in dem Saccharid vorliegenden Monosaccharide zu binden;
    • c) Revidieren des Satzes von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern, die in Schritt b) erhalten wurden, um zu gewährleisten, dass keine zwei Marker in dem Satz dieselbe Farbe oder dasselbe in anderer Weise nachweisbare Merkmal haben;
    • d) Revidieren des Satzes von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern, die in Schritt c) gewählt wurden, um die Kreuzreaktivität mit entweder den im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Bindungsmitteln oder mit anderen im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern zu verringern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird die MC des zu analysierenden Saccharids aus der MC eines verwandten Saccharids abgeschätzt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die MC des zu analysierenden Saccharids durch Durchführung einer vollständigen MC-Analyse des Saccharids erhalten. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens hat n einen Wert zwischen 1 und 4.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Software zum Wählen eines Satzes von im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Markern zur Verwendung in dem oben beschriebenen Verfahren zur Saccharid-Strukturanalyse, aufweisend:
    • a) Input zum Bereitstellen der Monosaccharid-Zusammensetzung (MC);
    • b) Abgleich-Subprogramm, um n im Wesentlichen Sequenz- oder Stellen-spezifische Marker, die in der Lage sind, an die in dem Saccharid vorhandenen Monosaccharide zu binden, zum Abgleich zu bringen;
    • c) Revisions-Subprogramm zum Revidieren eines Satzes von im Wesentlichen Sequenz- oder Stellen-spezifischen Markern, die durch das Subprogramm b) abgeglichen wurden, wobei das Subprogramm in der Lage ist, die Marker auf der Basis einer verringerten Kreuzreaktivität mit entweder den im Wesentlichen Sequenz- oder Stellen-spezifischen Bindungsmitteln oder mit anderen im Wesentlichen Sequenz- oder Stellen-spezifischen Markern auszuwählen;
    • d) zweites Revisions-Subprogramm, das in der Lage ist, zu gewährleisten, dass keine zwei Marker in dem Satz die gleiche Farbe oder dasselbe anderweitig detektierbare Merkmal haben.
  • Die Verfahren der Erfindung können verwendet werden, um die Struktur von Oligo- oder Polysacchariden zu ermitteln. Sie können auch verwendet werden, wenn solche Oligo- oder Polysaccharide an andere Moleküle gekoppelt sind, z.B. Peptide, Proteine oder Lipide. Speziell kann das Verfahren der Erfindung zur Strukturermittlung von Glycosaminoglycanen (GAGs), wozu Heparin, Heparansulfat, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und dergleichen gehören, verwendet werden.
  • Alle obigen und andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus den folgenden veranschaulichenden und nicht-begrenzenden Beispielen bevorzugter Ausführungsformen davon besser verstanden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die vorliegende Erfindung wird deutlicher verstanden aus der genauen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und aus den angefügten Zeichnungen, in denen:
  • 1 eine Veranschaulichung der Glycomolekül-Identitäts(GMID)-Karten ist, die für pasteurisierte Ziegenmilch (A und B), nicht-pasteurisierte Ziegenmilch (C und D) und Kuhmilch (E) erhalten wurden.
  • 2 ein Abdruck der GMID-Karten ist, die für verschiedene Lipopolysaccharid-Proben erhalten wurden. Die Karten A bis E entsprechen den Lipopolysaccharid-Proben (LPS) #1, 7, 10, 15 bzw. 16.
  • 3 ein hoch entwickeltes Logik-Ablaufdiagramm ist, das einen Algorithmus zum Wählen eines Satzes gefärbter Lectine veranschaulicht.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Zum Zwecke der Klarstellung werden einige der hierin verwendeten Begriffe hierin unten beschrieben:
    "Im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel" bedeutet ein Mittel, das in der Lage ist, an ein Saccharid zu binden, wobei die Bindung üblicherweise Sequenz-spezifisch ist, d.h. das Mittel bindet nur an eine bestimmte Sequenz von Monosaccharid-Einheiten. Diese Sequenzspezifität ist jedoch möglicherweise nicht absolut, da das Mittel an andere verwandte Sequenzen (wie Monosaccharid-Sequenzen, in denen eines oder mehrere der Saccharide entfernt, geändert oder eingefügt wurden) binden kann. Das Mittel kann auch, zusätzlich zu einer gegebenen Sequenz von Monosacchariden, eine oder mehrere nicht-verwandte Sequenzen, oder Monosaccharide, binden. Das im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel ist üblicherweise ein Protein, wie ein Lectin, ein Saccharid-spezifischer Antikörper oder eine Glycosidase oder eine Glycosyltransferase. Beispiele von Lectinen umfassen Lectine, die aus den folgenden Pflanzen isoliert wurden:
    Conavalia ensiformis
    Anguilla anguilla
    Triticum vulgaris
    Datura stramonium
    Galanthus nivalis
    Maackia amurensis
    Arachis hypogaea
    Sambucus nigra
    Erythrina cristagalli
    Lens culinaris
    Glycine max
    Phaseolus vulgaris
    Allomyrina dichotoma
    Dolichos biflorus
    Lotus tetragonolobus
    Ulex europaeus
    Ricinus communis
  • Zusätzlich zu den vorgenannten Beispielen von Lectinen besitzen auch andere biologisch aktive Verbindungen wie Cytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren die Fähigkeit, GAGs und andere Polysaccharide zu binden, und daher werden sie für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als Lectine betrachtet.
  • Beispiele für Glycosidasen umfassen α-Galactosidase, β-Galactosidase, N-Acetylhexosaminidase, α-Mannosidase, β-Mannosidase, α-Fucosidase und dergleichen. Manche dieser Enzyme können, in Abhängigkeit von der Quelle ihrer Isolierung, eine unterschiedliche Spezifität haben.
  • Die obigen Enzyme sind im Handel erhältlich, z.B. von Oxford Glycosystems Ltd., Abingdon, OX14 1RG, UK, Sigma Chemical Co., St. Lois, Mo., USA, oder Pierce, POB. 117, Rockford, 61105 USA.
  • "Spaltungsmittel" ist ein im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel, das die Saccharidkette an ihrer Erkennungssequenz spaltet. Typische Spaltungsmittel sind Glycosidasen, wozu Exo- und Endoglycosidasen gehören, und Glycosyltransferasen. Es können jedoch auch chemische Reagenzien, die zur Spaltung einer glycosidischen Bindung in der Lage sind, als Spaltungsmittel dienen, solange sie im Wesentlichen Sequenz-spezifisch sind. Der Begriff "Spaltungsmittel" oder "Spaltmittel" ist im Zusammenhang mit dieser Beschreibung synonym mit dem Begriff "im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel, das zu einer Spaltung in der Lage ist".
  • "Erkennungssequenz" ist die Sequenz von Monosacchariden, die von einem im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel erkannt wird. Erkennungssequenzen weisen üblicherweise 2 bis 4 Monosaccharid-Einheiten auf. Ein Beispiel einer Erkennungssequenz ist Galβ1-3 GalNac, die von einem Lectin erkannt wird, das aus Arachis hypogaea in reiner Form gewonnen wurde. Einzelne Monosaccharide können, wenn sie von einem im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel spezifisch erkannt werden, für die Zwecke dieser Offenbarung als Erkennungssequenzen definiert werden.
  • "Saccharid" ist jedes beliebige Oligo- oder Polysaccharid, linear oder verzweigt. Dieser Begriff wird hierin oben und hierin unten insofern abweichend von seiner allgemeinen Bedeutung in der Technik verwendet, als er auch Polysaccharide und die Zuckerstrukturen von Glycanen und dergleichen umfasst.
  • "Kartierung" bedeutet ein Definieren einer Reihenfolge bestimmter vordefinierter Muster auf der Polysaccharidkette, ein Prozess, der schließlich zur Erhaltung der Sequenz eines Saccharids, d.h. zur vollständigen Bestimmung aller Aufbaublöcke des Saccharids, führt.
  • "Sequenzkarte" ist eine geordnete Aufeinanderfolge von Erkennungsstellen, wie sie auf dem Saccharid vorkommen.
  • "Monosaccharid" ist eine einzige Zuckereinheit, wie beispielsweise eine Hexose, Tetrose oder Pentose. Spezifische Beispiele von Monosacchariden umfassen Galactose (Gal), N-Acetyl-Galactosamin (GalNAc), Mannose (Man), Glucose (Glc), und dergleichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die hierin oben beschriebenen und hierin unten veranschaulichten Verfahren zum Screening therapeutischer Mittel verwendet werden, indem die Struktur therapeutisch aktiver Mittel oder aktiver Fragmente davon bestimmt wird. Die Erfindung betrifft daher die Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens beim Screening therapeutisch aktiver Mittel.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die analytischen und die Kartierungsverfahren der Erfindung außerdem insoweit bei der Optimierung therapeutisch aktiver Mittel brauchbar, als sie die Beurteilung des Glycosylierungsgrads verschiedener therapeutisch aktiver Mittel und den Vergleich unter ihnen erlauben. Beispielsweise ist es in der Technik wohl bekannt, dass Galactose am nicht-reduzierenden Ende der Glycankette mit einer schnellen Beseitigung des Glycoproteins, dessen integraler Bestandteil die Kette ist, aus dem Kreislaufsystem verbunden sein kann. Dies wiederum kann die pharmakokinetischen Parameter, die mit diesen Glycoproteinen verbunden sind, wenn sie als therapeutisch aktive Mittel verwendet werden, dramatisch beeinflussen. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der hierin oben beschriebenen Verfahren bei der Entwicklung und Optimierung therapeutisch aktiver Mittel.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren bei der Krankheitsdiagnose. Ein Beispiel für die diagnostische Verwendung der analytischen Verfahren der Erfindung ist der Vergleich und/oder die Identifizierung von aus Bakterien isolierten Lipopolysacchariden (LPSs), um die Identität mikrobieller Pathogene zu bestimmen. Der Vergleich unterschiedlicher mikrobieller LPS-Proben durch Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist hierin unten in Beispiel 6 veranschaulicht.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der Verfahren der Erfindung bei der Nahrungsmittel- und/oder Getränke-Analyse. Eine derartige Analyse kann die Verwendung des GMID-Verfahrens zum Vergleichen von Nahrungsmittel- oder Getränkproben mit bekannten Standards aufweisen, um ihre Spezies-Herkunft zu bestimmen. Als Beispiel ist die GMID-Analyse von Milchproben unterschiedlicher Herkunft in Beispiel 5 hierin unten veranschaulicht. Ein weiteres Beispiel ist der Nachweis und die Identifizierung bakterieller Verunreinigungen in Nahrungsmittel- und Getränkzubereitungen, wie die hierin unten in Beispiel 6 beschriebene LPS-Analyse.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung der hierin oben beschriebenen Verfahren bei der Analyse genetisch modifizierter (GM) landwirtschaftlicher pflanzlicher Erzeugnisse und der davon stammenden Produkte bereit. Beispiele für pflanzliche GM-Erzeugnisse umfassen jene, die humanisierte Antikörper (wobei die Antikörper Glycoproteine sind) erzeugen, sowie pflanzliche Erzeugnisse, die modifizierte Stärke oder andere Polysaccharide erzeugen.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Analyse von Saccharidketten bereit. Die Erfindung verwendet biologische Reaktionsmechanismen, beispielsweise jene, die Mittel einbeziehen, die zur Erkennung kurzer Oligosaccharid-Sequenzen in der Lage sind, sowie Enzyme. Im Gegensatz zu Verfahren des Stands der Technik verwendet die Erfindung eine Vielzahl von Reaktionen (d.h. eine informationsreiche Analyse). Dies befähigt das Verfahren der Erfindung, die Verwendung der kostspieligen Technologien, die in den meisten Verfahren des Stands der Technik verwendet werden, wie z.B. Post Source Decay matrixunterstützte Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (PSD MALDI-MS), HPLC-MS, oder mit Massenspektrometrie gekoppelten schnellen Atombeschuss, vollständig zu vermeiden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nach der Reaktion eines Saccharids (am reduzierenden Ende markiert) mit einem ersten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel ein Detektionsschritt ausgeführt. Die Anwesenheit der Markierung zeigt die Anwesenheit der Erkennungsstelle a für das erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel in dem Saccharid an. Es ist wichtig festzustellen, dass dieser Schritt den Verwender mit Information dazu, welche der Lectin-Bindungsstellen in dem Saccharid vorhanden sind, versorgt. Nach einer Reaktion mit einem zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel, das das Saccharid an seiner Erkennungssequenz b spaltet, wird der Detektionsschritt wiederholt. Fehlen der Markierung zeigt, dass die Sequenz der ersten und der zweiten Erkennungsstelle a-b-reduzierendes Ende ist.
  • Zur weiteren Veranschaulichung des Verfahrens der Erfindung nehmen wir nun an, dass das erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel ein Lectin ist, mit einer Erkennungsstelle a. Das zu analysierende Saccharid ist unmarkiert. In einem zweiten Schritt wird ein markierter Antikörper, der eine bestimmte Saccharidsequenz b erkennt, hinzugefügt. Nun wird ein Detektionsschritt ausgeführt, der zeigt, ob der Antikörper das Saccharid erkannt hat. In dem Fall sind alle Reaktionen, unabhängig von dem verwendeten Lectin, positiv. Nach dem Abwaschen von ungebundenem Antikörper wird eine Glycosidase zugegeben. Die Glycosidase hat die Erkennungssequenz c. Ein zweiter Detektionsschritt wird ausgeführt. Bei allen Reaktionen, in denen das Signal verloren gegangen ist, muss die Sequenz der Erkennungsstellen entweder b-c-a oder a-c-b sein. Andererseits kann, wenn das Signal bleibt, die Sequenz der Erkennungsstellen entweder c-b-a, a-b-c, b-a-c oder c-a-b sein.
  • In der obigen Ausführungsform der Erfindung wird die Beziehung dieser Stellen zum reduzierenden Ende nicht festgestellt. Eine Kombination der ersten oben beschriebenen Ausführungsform, in der das Saccharid markiert ist, und der direkt oben beschriebenen Ausführungsform, in der das zweite im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel markiert ist, liefert jedoch leicht jene Information. Daher wird in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung das Saccharid an seinem reduzierenden Ende markiert. Es wird dann in einem ersten Schritt an die verschiedenen Lectine gebunden. In einem zweiten Schritt wird der markierte Antikörper gebunden. Das Lectin und der Antikörper sind mit verschiedenen Markierungen markiert, die unabhängig voneinander nachgewiesen werden können. Daher können nun beide Markierungen in einem ersten und einem zweiten Detektionsschritt unabhängig voneinander nachgewiesen werden. In einem dritten Schritt wird eine Glycosidase zugegeben. Nun wird ein dritter und ein vierter Detektionsschritt ausgeführt, um die Anwesenheit beider Markierungen in jeder Reaktion zu verifizieren. Wenn vor der Zugabe der Glycosidase beide Markierungen anwesend waren, gibt es eine Anzahl von Möglichkeiten. Erstens, wenn beide Markierungen nach Zugabe der Glycosidase bleiben, ist die Sequenz der Erkennungsstellen c-a-b-reduzierendes Ende. Zweitens, wenn beide nach Zugabe der Glycosidase verloren gehen, dann muss die Sequenz der Erkennungsstellen a-c-b-reduzierendes Ende sein. Drittens, wenn die Saccharid-Markierung bleibt und die Antikörper-Markierung verloren geht, muss die Sequenz der Erkennungsstellen b-c-a-reduzierendes Ende sein. Viertens, wenn die Antikörper-Markierung bleibt und die Saccharid-Markierung verloren geht, kann die Sequenz der Erkennungsstellen entweder a-b-c-reduzierendes Ende oder b-a-c-reduzierendes Ende sein.
  • Es kann ein analoger Satz von Reaktionen ausgeführt werden, indem das Saccharid zuerst mit einem Spaltungsmittel verdaut wird und in nachfolgenden Schritten mit Bindungsmitteln zur Reaktion gebracht wird.
  • Beispielsweise wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein am reduzierenden Ende markiertes Saccharid mit einem ersten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel, das eine Glycosidase mit der Erkennungssequenz a sein kann, zur Reaktion gebracht. In einer Kontrollreaktion wird das markierte Saccharid unbehandelt gelassen. Die Reaktionen werden dann unabhängig weiter mit einem immobilisierten, zweiten, im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel, das ein Lec tin mit der Erkennungssequenz b sein kann, zur Reaktion gebracht. Nach dem Abwaschen von ungebundenem Saccharid wird ein Detektionsschritt ausgeführt. Die Anwesenheit der Markierung zeigt an, dass die Stelle b in dem Saccharid vorhanden ist. Durch Vergleichen von Reaktionen, bei denen das erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel anwesend war, mit unabhängigen Kontrollreaktionen, bei denen das erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische Reagenz fehlte, kann die Auswirkung der Glycosidase auf die Anwesenheit der Markierung bestimmt werden. Beispielsweise ist, wenn die Markierung in der Kontrollreaktion nach Bindung an das Lectin mit der Erkennungssequenz b nachgewiesen wird, aber nicht in einer Reaktion, in der das erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel eine Glycosidase mit der Erkennungssequenz a ist, die Sequenz der Erkennungsstellen b-a-reduzierendes Ende. Wenn andererseits die Markierung in beiden Reaktionen, der Kontrollreaktion und der Glycosidase-Reaktion, vorhanden ist, zeigt dies an, dass die Sequenz der Erkennungsstellen a-b-reduzierendes Ende ist. Die Erkennungsstelle a kann möglicherweise nicht in dem Saccharid geortet werden, d.h. sie kann möglicherweise in der Saccharidsequenz nicht vorhanden sein.
  • Die obige Ausführungsform der Erfindung kann mit vielen ersten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mitteln verwendet werden. Diese werden üblicherweise in unabhängigen Reaktionen, zusammen mit einer Kontrollreaktion, verwendet. Es ist auch möglich, mehr als ein erstes im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel in einer Reaktion zu verwenden. Die Vielzahl von Reaktionen vergrößert die Menge an gewonnener strukturbezogener Information.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein unmarkiertes Saccharid verwendet. Nach Verdau mit einer Glycosidase mit der Erkennungssequenz a wird das Saccharid mit einem immobilisierten Lectin zur Reaktion gebracht. Nach Abwaschen von ungebundenem Saccharid wird ein markierter Antikörper mit der Erkennungsstelle c mit dem gebundenen Saccharidfragment zur Reaktion gebracht. Der Nachweis der Markierung nach dem Abwaschen von ungebundenem Antikörper zeigt an, dass c auf dem Saccharidfragment, das das Lectin bindet, liegt. Die Sequenz der Bindungsstellen kann entweder c-b-a oder b-c-a sein. Die Lage des reduzierenden Endes bezüglich der Sequenz der Erkennungsstellen kann mit dieser Reaktion nicht bestimmt werden. Der Nachweis der Markierung in der Kontrollreaktion (ohne Glycosidase), aber nicht in der Reaktion mit Glycosida se, zeigt an, dass die Sequenz der Erkennungsstellen b-a-c ist. Auch in dieser Ausführungsform erhöhen weitere unabhängige Reaktionen unter Verwendung unterschiedlicher Glycosidasen, alleine und/oder in Kombination, unterschiedlicher Lectine und/oder unterschiedlicher Antikörper die Menge an gewonnener Information.
  • Es ist klar, dass die weiter oben beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung, in denen das dritte im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel für den Spaltungsschritt sorgt, und die direkt oben beschriebenen Ausführungsformen, in denen das erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel für den Spaltungsschritt sorgt, im Wesentlichen äquivalent sind. Ein Unterschied zwischen beiden Ausführungsformen der Erfindung ist, dass, während in den weiter oben beschriebenen Ausführungsformen die Wirkung des Spaltungsmittels durch Nachweisen der Anwesenheit der Markierung vor der Reaktion mit dem dritten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel beobachtet werden kann, in den direkt oben beschriebenen Ausführungsformen eine Kontrollreaktion ohne Spaltungsmittel verwendet werden muss, um die Wirkung des Spaltungsreagenz zu bestimmen. Dennoch ist das Ausmaß an Information, das mit den unterschiedlichen Ausführungsformen gewonnen wird, im Wesentlichen gleich, wie die Verfahren zur Ordnung der Information und der Sequenzen der Erkennungsstellen, d.h. Triplets, daraus.
  • Die obigen Beispiele basieren auf der Annahme, dass das Saccharid linear ist und die Glycosidase eine Erkennungsstelle in der Saccharidsequenz hat. Die Anwesenheit einer Erkennungsstelle für die Glycosidase in dem Saccharid ist jedoch üblicherweise leicht durch die Analyse von Reaktionen mit anderen Lectinen verifizierbar. Wenn irgendeine der zwei Markierungen in irgendeiner Reaktion mit einem Lectin nach Zugabe der Glycosidase verloren geht, dann muss die Glycosidase eine Erkennungsstelle in dem Saccharid haben.
  • Als im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel kann eine Glycosyltransferase verwendet werden. Eine Glycosyltransferase fügt an einem bestimmten Punkt in der Saccharidfrequenz, gemäß einem spezifischen Sequenzmuster (Erkennungssequenz), eine Zuckereinheit hinzu. Daher kann, wenn das in der Reaktion verwendete Monosaccharid markiert ist, eine neue Markierung in die Saccharidkette eingeführt werden, was die Anwesenheit der Erkennungsstelle für Glycosyl transferase anzeigt. Natürlich sollte die durch die Glycosyltransferase eingeführte Markierung von den anderen verwendeten Markierungen unterscheidbar sein.
  • Bei der Ausführung eines Satzes von Reaktionen mit einem markierten Antikörper, wie oben beschrieben, kann der Antikörper in den meisten der Reaktionen binden, aber es kann sehr wenige Ausnahmen geben. Dies liegt an der Möglichkeit einer Überlappung zwischen Saccharid-Erkennungssequenzen von Lectin und Antikörper. In einem solchen Fall wäre die Reaktion mit einem bestimmten Lectin negativ. Diese Information könnte dann verwendet werden, um eine Spanne von 3 bis 7 Zuckereinheiten abzuleiten, da die Erkennungssequenzen von Lectin und Antikörper jeweils 2 bis 4 Zuckereinheiten sind.
  • Die oben beschriebenen ersten und zweiten Detektionsschritte können alternativ gleichzeitig ausgeführt werden, wenn es keine Beeinflussung zwischen den zwei Detektionen gibt.
  • Als ein weiteres Beispiel, wenn in einer ersten Folge von Reaktionen die erste Reaktion mit einem Lectin an der Stelle a auf einer am Ende markierten Polysaccharidkette stattfindet, und die zweite Reaktion mit einer Glycosidase an der Stelle b auf der Polysaccharidkette stattfindet, dann führt die Reaktion mit dem dritten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel, an der Stelle c, eine zweite Markierung ein, die von der ersten Markierung unterschieden werden kann. Die Anwesenheit beider Markierungen würde daher anzeigen, dass die Sequenz der drei Stellen entweder b-a-c-reduzierendes Ende oder b-c-a-reduzierendes Ende ist.
  • Andererseits gibt es dann, wenn nur die erste Markierung nachgewiesen wird, zwei Möglichkeiten: (1) Die Erkennungsstelle für das dritte im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel fehlt in dem Polysaccharid, oder (2) der Teil des Polysaccharids, der die Erkennungsstelle enthält, wurde durch das zweite im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel abgespalten.
  • Dies kann durch eine zweite Folge von Reaktionen, in denen das zweite im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel weggelassen wird oder unter Pufferbedingungen verwendet wird, die keine Spaltung erlauben, verifiziert werden. Wenn in der zweiten Folge von Reaktionen die zweite Markierung nach der Reaktion mit dem dritten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel nicht nachgewiesen wird, zeigt dies an, dass das dritte im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel keine Bindungsstelle auf dem Saccharid hat. Andererseits zeigt die Anwesenheit der zweiten Markierung an, dass die Spaltungsstelle zwischen der Stelle für das erste und das dritte im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel liegt, d.h. die Folge der Stellen auf dem Saccharid ist c-b-a-reduzierendes Ende.
  • Bei dem Verfahren der Erfindung ist es nicht notwendig, diese Reaktionen eine nach der anderen auszuführen, wobei die letztere von den Ergebnissen der vorigen abhängt. Vielmehr stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, durch das eine Vielzahl von Reaktionen dergestalt ausgeführt wird, dass die obigen Ableitungen in einem einzigen Satz von Reaktionen möglich sind. Beispielsweise werden in einem Satz von Reaktionen unterschiedliche erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel zusammen mit zweiten und dritten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mitteln, die für jede Reaktion identisch sind, verwendet. Parallel wird ein zweiter Satz von Reaktionen durchgeführt, wobei die Reaktionen mit den Reaktionen in dem ersten Satz identisch sind mit der Ausnahme des zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittels, das weggelassen oder inaktiviert wird.
  • Die in einem Zwischen-Detektionsschritt erhaltene Information kann jedoch vorteilhaft verwendet werden, um in den folgenden Schritten bestimmte Wahlen von im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mitteln auszuschließen. Es ist klar, dass ein im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel, das auf dem zu analysierenden Saccharid keine Erkennungsstelle hat, keine Information liefern würde, wenn es als ein zweites oder drittes im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel verwendet würde. In einer Ausführungsform der Erfindung, in der das Saccharid markiert ist, können daher die Ergebnisse eines Nachweises, der nach der Bindung des Saccharids an das erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel ausgeführt wurde, verwendet werden, um aus der Anzahl von ersten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mitteln, die Saccharid gebunden haben, das zweite im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel zu wählen.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Zugabe eines dritten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittels mit einem unterschiedlichen Mittel wiederholt, nachdem die Detektionsschritte abgeschlossen wurden und Information erhalten wurde, wie oben beschrieben. Für Reaktionen, bei denen beide Markierungen anwesend blieben, nachdem das dritte Mittel erstmalig zugegeben wurde, treffen dieselben Überlegungen zur Interpretation der Ergebnisse zu, wie oben beschrieben. In dem Fall, in dem nur eine der Markierungen blieb, kann dennoch abgeleitet werden, ob das Spaltungsmittel zwischen der Erkennungsstelle des ersten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittels und der Erkennungsstelle des im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittels, das die Markierung trägt (oder dem reduzierenden Ende), schneidet. In dem Fall geht die verbleibende Markierung nach der Reaktion mit einem unterschiedlichen dritten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel ebenfalls verloren.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann ein unterschiedliches zweites im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel zugegeben werden, das eine Markierung tragen kann, die sich von der Markierung des zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittels, das in dem ersten Satz von Reaktionen zugegeben wurde, unterscheidet oder mit ihr identisch ist. Die Zugabe eines anderen dritten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittels, das die Saccharidkette spaltet, liefert dann weitere Information.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden zwei oder mehr unterschiedliche zweite im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel zugegeben, jedes mit seiner eigenen Markierung, die unabhängig von irgendeiner anderen verwendeten Markierung nachweisbar ist. Die Art der nach der Zugabe des Spaltungsmittels verloren gegangenen Markierung liefert dann Information zur Position der Bindungsstellen des zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittels, ähnlich den oben beschriebenen Überlegungen zu Experimenten, in denen nur ein einziges zweites im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel verwendet wird.
  • Wie für Fachleute offenkundig ist, kann durch Durchführung einer ausreichend großen Anzahl von Reaktionen, wie oben dargelegt, ein Fingerabdruck von Reaktionen erhalten werden, der für ein bestimmtes Saccharid spezifisch ist. Darüber hinaus ist es möglich, die teilweise Sequenzinformation, die erhalten wurde wie oben dargelegt, zu einer vollständigen Sequenz des Saccharids "zusammenzulegen". Da die Anzahl von Reaktionen sehr groß sein kann (wie unten genau beschrieben), ist das Verfahren der Erfindung nicht, wie Verfahren des Stands der Technik, auf die Analyse von Oligosacchariden beschränkt. Es kann auch zur Bestimmung der Struktur von Polysacchariden, d.h. großer Saccharide mit vielen Zuckereinheiten, verwendet werden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist das erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische ein Lectin. Das erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel kann auch ein Antikörper oder ein anderes Sequenz-spezifisches Mittel sein.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt eine Vielfalt von Lectinen oder Saccharid-spezifischen Antikörpern mit unterschiedlichen Sequenz-Spezifitäten bereit, die in einer Anordnung auf einem Substrat wie einem sehr großmaßstabigen integrierten Schaltungs-Chip (very large scale integrated (VLSI) circuit chip), ähnlich den gegenwärtig zur Herstellung von Oligonucleotid-Anordnungen verwendeten Chips, immobilisiert werden. Verfahren zur Herstellung solcher Chips und zur Bindung von Reagenzien daran sind z.B. in WO 93/22678 beschrieben.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Quasi-Anordnung (virual array) von immobilisierten ersten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mitteln bereit. Ein Beispiel für eine derartige Quasi-Anordnung, die MASDA-Partikel verwendet, ist in einer PCT-Anmeldung des Erfinders der vorliegenden Erfindung, IL-97/00105, veröffentlicht als WO 97/35201, beschrieben: Die ersten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel werden in getrennten Reaktionen auf MASDA-Partikeln immobilisiert, z.B. in 25 unterschiedlichen Reaktionen. Jeder Teil der Quasi-Anordnung kann dann mit entweder demselben zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel zur Reaktion gebracht werden, wobei dies bevorzugt durch Entfernen eines Aliquots von jeder MASDA-Reaktion, Mischen der Aliquots, und Zur-Reaktion-Bringen der Mischung mit dem zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel durchgeführt wird. Wenn es erwünscht ist, Teile der Quasi-Anordnung mit unterschiedlichen zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mitteln zur Reaktion zu bringen, dann kann die gesamte MASDA-Reaktion separat gelassen werden, oder es kann ein Teil der Quasi-Anordnung in einem Gemisch vereinigt werden, zur Reaktion mit einem einzigen zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel, während andere Teile der Quasi-Anordnung separat gelassen werden, zur Reaktion mit charakteristischen zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mitteln. In der gleichen Weise können die Teile der Quasi-Anordnung auch zur Reaktion mit dem dritten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel kombiniert oder separat gelassen werden.
  • Alternativ können Kügelchen als Immobilisierungsmittel verwendet werden. In der Technik wurde eine Vielzahl unterschiedlicher Kügelchen zum Zweck der Bindung von Peptiden und Proteinen beschrieben, siehe z.B. den Pierce-Katalog, S. O-222 bis O-231, und T-155 bis T-200. Das erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel, das bevorzugt ein Lectin ist, kann an Kügelchen gebunden werden. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass die Kügelchen später in Aliquots aufgeteilt und mit unterschiedlichen zweiten und/oder dritten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mitteln zur Reaktion gebracht werden können, wodurch die Menge an Information, die durch das Verfahren der Erfindung geliefert wird, weiter erhöht wird.
  • Die Reaktionsbedingungen für die verschiedenen im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel sind in der Technik bekannt. Alternativ kann der Fachmann leicht mit jedem im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel eine Reihe von Tests unter verschiedenen Reaktionsbedingungen durchführen, wobei dessen Bindungsaktivität gemessen wird. Vorteilhafterweise können Kenntnisse von Reaktionsbedingungen, unter denen ein bestimmtes im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel reagiert, und von Bedingungen, unter denen es inaktiv bleibt, zur Kontrolle von Reaktionen, in denen mehrere im Wesentlichen Sequenz-spezifische Reagenzien anwesend sind, verwendet werden. Beispielsweise können das zweite und das dritte Sequenz-spezifische Reagens gleichzeitig zu der Reaktion zugegeben werden, aber mittels einer Veränderung der Reaktionsbedingungen kann es nur dem zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel erlaubt werden, aktiv zu sein. Eine weitere Veränderung der Reaktionsbedingungen kann dann gewählt werden, um das zweite im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel zu inaktivieren und das dritte im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel zu aktivieren. Einige veranschaulichende Beispiele für Reaktionsbedingungen sind in der Tabelle 1 unten aufgelistet. Zusätzlich zu den pH- und Temperatur-Daten, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, können andere Faktoren, z.B. die Anwesenheit von Metallen wie Zn, oder Salzen von Kationen wie Mn, Ca, Na, wie Natriumchlorid-Salz, untersucht werden, um optimale Reaktionsbedingungen oder Bedingungen, unter denen ein bestimmtes im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel aktiv ist, während andere inaktiv sind, zu finden.
  • Tabelle 1: Reaktionsbedingungen für einige im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel
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    • • Die Symbole stehen für Enzymgruppen, die durch äußere Bedingungen trennbar sind.
    • • Diversa Corp. produziert thermophile Endo/Exo-Glycosidasen mit einer breiten Vielfalt an Aktivität bei verschiedenem pH und verschiedenen Temperaturen.
    • • Ebenfalls mögliche Bedingungen könnten Metalle und andere, Zn, Mn, Ca, NaCl, sein.
  • Die Immobilisierung des ersten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittels kann funktionelle Gruppen des Proteins, wie Amino-, Carboxy-, Hydroxy- oder Thiol-Gruppen, benutzen. Beispielsweise kann ein Glasträger durch Reaktion mit Epoxysilan mit einer Epoxid-Gruppe funktionalisiert werden, wie in der obigen PCT-Veröffentlichung beschrieben. Die Epoxid-Gruppe reagiert mit Amino-Gruppen wie den freien ε-Amino-Gruppen von Lysin-Resten. Ein anderer Me chanismus besteht darin, eine Oberfläche mit Elektrometallmaterialien wie Gold zu bedecken, wie ebenfalls in der PCT-Veröffentlichung beschrieben. Da derartige Materialien stabile Konjugate mit Thiol-Gruppen bilden, kann ein Protein direkt durch freie Thiol-Gruppen von Cystein-Resten an derartige Materialien gebunden werden. Alternativ können Thiol-Gruppen durch konventionelle Chemie oder durch Reaktion mit einem Molekül, das eine oder mehrere Thiol-Gruppen und eine mit freien Amino-Gruppen reagierende Gruppe enthält, wie der N-Hydroxy-succinimidylester von Cystein, in das Protein eingeführt werden. Auch Thiolspaltbare Vernetzer, wie Dithiobis(succinimidyl-propionat), können mit Amino-Gruppen eines Proteins zur Reaktion gebracht werden. Eine Reduktion mit einer Sulfhydryl-Verbindung exponiert dann freie Thiol-Gruppen des Vernetzers.
  • Die Markierung kann durch konventionelle Mittel in ein im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel oder Saccharid eingeführt werden. Markierungen umfassen jegliche an das Saccharid oder das im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel gebundene nachweisbare Gruppe, die seine Funktion nicht beeinflusst. Markierungen können Enzyme sein, wie Peroxidase und Phosphatase. Im Prinzip könnten auch Enzyme wie Glucose-Oxidase und β-Galactosidase verwendet werden. Es muss dann berücksichtigt werden, dass das Saccharid modifiziert werden kann, wenn es die Monosaccharid-Einheiten enthält, die mit solchen Enzymen reagieren. Weitere Markierungen, die verwendet werden können, umfassen fluoreszierende Markierungen, wie Fluorescein, Texasrot, Lucifergelb, Rhodamin, Nilrot, Tetramethyl-rhodamin-5-isothiocyanat, 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien, cis-Parinarsäure, Phycoerythrin, Allophycocyanin, 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), Hoechst 33258, 2-Aminobenzamid, und dergleichen. Weitere Markierungen umfassen elektronendichte Metalle, wie Gold, Liganden, Haptene, wie Biotin, radioaktive Markierungen, und dergleichen.
  • Beispiele zur Markierung von Sacchariden umfassen:
    • 1. die Verwendung von Farbmarkierungen für das reduzierende Ende (z.B. Coumarin-120)
    • 2. die Verwendung von 14C-radioaktiv markiertem Zucker + Glycosidase (Sequenz-spezifische Zuckersynthese)
    • 3. die Verwendung von 3H-radioaktiv markiertem Zucker + Glycosidase (Sequenz-spezifische Zuckersynthese)
    • 4. die Verwendung von fluoreszierend markiertem Zucker + Glycosidase (Sequenz-spezifische Zuckersynthese)
    • 5. die Verwendung von fluoreszierend markiertem Lectin oder mAbs
    • 6. die Verwendung von fluoreszierend markierer Färbung oder Enzym, an mAbs gebunden
    • 7. die Verwendung von Biotin-Endmarkierung
    • 8. Erzeugen einer speziellen Zuckersequenz und Verwenden von Antikörpern oder Lectinen, die sie spezifisch erkennen.
  • Der Nachweis enzymatischer Markierungen ist in der ELISA-Technik und anderen Techniken, wo ein enzymatischer Nachweis routinemäßig verwendet wird, wohl bekannt. Die Enzyme sind im Handel erhältlich, z.B. von Firmen wie Pierce.
  • Fluoreszierende Markierungen erfordern eine Anregung bei einer bestimmten Wellenlänge und einen Nachweis bei einer unterschiedlichen Wellenlänge. Die Verfahren zum Fluoreszenznachweis sind in der Technik wohl bekannt und wurden in vielen Artikeln und Lehrbüchern veröffentlicht. Eine Auswahl von Veröffentlichungen zu diesem Thema ist auf S. O-124 bis O-126 in dem Katalog von Pierce von 1994 zu finden. Fluoreszierende Markierungen sind im Handel erhältlich von Firmen wie SIGMA oder der oben angegebenen Firma Pierce.
  • Die Kopplung von Markierungen an Proteine und Zucker sind in der Technik wohl bekannte Techniken. Beispielsweise sind kommerzielle Kits zur Markierung von Sacchariden mit fluoreszierenden oder radioaktiven Markierungen von Oxford Glycosystems, Abingdon, UK, erhältlich. Reagenzien und Anweisungen zu ihrer Verwendung zur Markierung von Proteinen sind von der oben angegebenen Pierce erhältlich.
  • Die Kopplung wird üblicherweise unter Verwendung funktioneller Gruppen, wie Hydroxy-, Aldehyd-, Keto-, Amino-, Sulfhydryl-, Carbonsäure- oder derartigen Gruppen, ausgeführt. Eine Anzahl von Markierungen, wie fluoreszierende Markierungen, die mit diesen Gruppen reagieren, sind im Handel erhältlich. Zusätzlich können bifunktionelle Vernetzer, die mit der Markierung einerseits und mit dem Protein oder Saccharid andererseits reagieren, eingesetzt werden. Die Verwendung von Vernetzern kann vorteilhaft sein, um einen Funktionsverlust des Proteins oder Saccharids zu vermeiden. Es kann jedoch gleichermaßen irgendeine andere geeignete Kopplungstechnik, die eine Aufrechterhaltung der natürlichen Funktion des Proteins oder Saccharids erlaubt, eingesetzt werden.
  • Für den Fachmann ist es jedoch offensichtlich, dass eine große Vielfalt veröffentlichter Verfahren verwendet werden kann, um ein Protein an einen gegebenen Träger zu koppeln oder um eine Markierung an ein Protein oder Saccharid zu koppeln.
  • Der Nachweis der Markierung kann durch irgendein geeignetes Mittel, wie es in der Technik bekannt ist, ausgeführt werden. Einige Nachweisverfahren sind in der oben angegebenen WO 93/22678 beschrieben. Besonders geeignet für das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist das in der Veröffentlichung beschriebene CCD-Nachweisverfahren. Dieses Verfahren kann in Kombination mit Markierungen verwendet werden, die Licht von bestimmten Frequenzen absorbieren und so den Weg einer Testlichtquelle zur VLSI-Oberfläche blockieren, so dass die CCD-Sensoren in dem Bereich, an den das markierte Mittel gebunden hat, eine verringerte Lichtmenge nachweisen. Das Verfahren kann auch mit fluoreszierenden Markierungen verwendet werden, wobei es von der Tatsache Gebrauch macht, dass derartige Markierungen Licht bei der Anregungsfrequenz absorbieren. Alternativ können die CCD-Sensoren verwendet werden, um die Emission der fluoreszierenden Markierung nach der Anregung nachzuweisen. Die Trennung des Emissions-Signals von dem Anregungslicht kann entweder durch Verwendung von Sensoren mit unterschiedlichen Empfindlichkeiten für die unterschiedlichen Wellenlängen oder durch zeitliche Auflösung oder eine Kombination von beidem erzielt werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
  • Beispiel 1
  • Glycomolekül-Analyse unter Verwendung von Antikörpern als erste und zweite Sequenz-spezifische Mittel
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Technik zur Analyse von Glycomolekülen gemäß der Erfindung weiter. Als ein erstes und zweites Sequenz-spezifisches Mittel werden Antikörper verwendet. Die folgenden Tabellen listen die Ergebnisse von Reaktionen mit zwei unterschiedlichen Sacchariden, die zu Veranschaulichungszwecken als HS und NS bezeichnet werden, auf.
  • Die Struktur der Zucker ist wie folgt:
  • MFLNH-II (HS):
    Figure 00310001
  • NS:
    Figure 00310002
  • Tabelle 2 listet die Ergebnisse der Reaktion zwischen dem Saccharid und dem ersten und dem zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel auf, die Antikörper gegen T-Antigen, Lewisx (Lex)- oder Lewisb (Leb)-Antigen sind. Das erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel wird auf einer Matrix, bevorzugt einem Festphasen-Mikropartikel, immobilisiert. Das zweite im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel wird mit einem fluoreszierenden Mittel, d.h. Nilrot oder grüner Farbe, markiert. Zusätzlich wird das reduzierende Ende des Saccharids markiert, wobei eine Markierung verwendet wird, die von der nilrot- oder grünfarbigen Markierung, die als Marker für die zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel dienen, klar unterscheidbar ist. Tabelle 2 listet die Reaktionen für das Saccharid HS auf, während Tabelle 3 die Reaktionen für das Saccharid NS auflistet.
  • Tabelle 2
    Figure 00320001
  • Tabelle 3
    Figure 00320002
  • Zusammenfassend sind die folgenden Signale nun in den Reaktionen der Saccharide HS oder NS (Reihen) nachweisbar, wenn die angegebenen Antikörper als erstes im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel verwendet werden (Spalten):
  • Tabelle 4
    Figure 00330001
  • Nachdem für jede Reaktion die Markierung nachgewiesen und das Ergebnis aufgezeichnet worden ist, wird ein drittes im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel zugegeben. In diesem Beispiel werden zwei unabhängige Reaktionen mit einem dritten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel verwendet. Die das Zuckermolekül tragende feste Phase kann nun vorteilhafterweise in Aliquots zur Reaktion mit entweder α1-2-Fucosidase oder Exo-β-Galactosidase (dritte im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel) aufgeteilt werden. Alternativ können drei Sätze von Reaktionen mit einem ersten und zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel ausgeführt werden.
  • Tabelle 5 Reaktionen nach Aufbringen von α-1-3,4-Fucosidase:
    Figure 00330002
  • Tabelle 6 Reaktion nach Aufbringung von Exo-β-Galactosidase aus D. pneumoniae (EC 3.2.1.23 Katalog-Nr. 1088718 von Boehringer Mannheim, 68298 Mannheim, Deutschland)
    Figure 00330003
  • Tabelle 7 Reaktionen nach Aufbringung von α1-2-Fucosidase:
    Figure 00340001
  • Aus den Daten, die wie oben erläutert gewonnen wurden, kann nun eine Glycomolekülidentitäts(GMID)-Karte erzeugt werden. Ein Beispiel für eine solche Information ist in Tabelle 8 für das Saccharid HS und in Tabelle 9 für das Saccharid NS aufgelistet.
  • Tabelle 8
    Figure 00340002
  • Tabelle 9
    Figure 00340003
  • Die Identität der zweiten und dritten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel braucht in einer solchen Datenliste nicht offenbart zu werden. Zu Vergleichszwecken ist es ausreichend, dass eine bestimmte Code-Nummer (1, 2 oder 3 in den obigen Tabellen) immer eine bestimmte Kombination von Reagenzien bezeichnet.
  • Beispiel 2
  • Ein Schema für die sequenzielle Markierung reduzierender Enden
  • Wie in der Beschreibung und dem Beispiel oben angegeben wurde, verwendet das Verfahren der Erfindung vorteilhafterweise ein Markieren des zu untersuchenden Saccharids an seinem reduzierenden Ende. Diese Markierungstechnik kann jedoch auf Stellen innerhalb des Saccharids ausgedehnt werden und so zu dem Verfahren der Erfindung beitragen, indem sie mehr Information liefert. Da es möglich ist, durch Spaltung unter Verwendung einer Endoglycosidase, gefolgt von Markierung des reduzierenden Endes, das Saccharid innerhalb der Kette zu markieren, ist es daher möglich, ein markiertes reduzierendes Ende innerhalb der Saccharidkette zu erhalten. Da jenes reduzierende Ende, verglichen mit dem ursprünglichen reduzierenden Ende, notwendigerweise den Bindungsstellen für das erste, zweite und dritte im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel näher ist, liefert die Verwendung eines intern erzeugten markierten reduzierenden Endes zusätzliche Information. Darüber hinaus ist es möglich, durch sequenzielles Markieren reduzierender Enden nach dem weiter unten beschriebenen Verfahren die Stellen für unterschiedliche Glycosidasen in ihrer Reihenfolge auf der Kette des zu untersuchenden Saccharids zu identifizieren.
  • Das Verfahren zur sequenziellen Markierung reduzierender Enden wird nun in den folgenden Schritten genauer beschrieben:
  • 1. Blockierung:
  • Ein Polysaccharid mit einem reduzierenden Ende wird in einer Lösung, die NaBH4/NaOH enthält, bei pH 11,5 inkubiert.
  • Diese Behandlung blockiert das reduzierende Ende, so dass das Polysaccharid nun frei von einem reduzierenden Ende (RE) ist.
  • 2. Exponierung:
  • Das Polysaccharid von Schritt 1 wird mit einer Endoglycosidase behandelt. Wenn die Erkennungsstelle für die Endoglycosidase innerhalb des Polysaccharids vorhanden ist, wird durch Spaltung des Polysaccharids ein neues reduzierendes Ende erzeugt. Die Lösung enthält nun zwei Saccharide: das Fragment mit dem neu exponierten RE in der Endoglycosidase-Stelle und das zweite Fragment, dessen RE blockiert ist.
  • 3. Markierung des reduzierenden Endes
  • Diese Reaktion kann unter Verwendung von z.B. 2-Aminobenzamid (im Handel erhältlich in Kit-Form zur Markierung von Sacchariden von Oxford Glycosystems Inc., Katalog 1994, S. 62) ausgeführt werden. Nach Abschluss der Reaktion unter den Bedingungen hoher Konzentrationen an Wasserstoff und hoher Temperatur (H+/T), gefolgt von Reduktion, enthält das Gemisch zwei Fragmente, von denen eines an seinem reduzierenden Ende markiert ist, während das andere aufgrund der Tatsache, dass sein reduzierendes Ende blockiert ist, unmarkiert bleibt.
  • Ein anderer Weg, reduzierende Enden zu markieren, ist durch reduktive Aminierung. Arylamin-Gruppen enthaltende fluoreszierende Verbindungen werden mit der Aldehyd-Funktionalität des reduzierenden Endes zur Reaktion gebracht. Die sich ergebende CH=N-Doppelbindung wird dann zu einer CH2-N-Einfachbindung reduziert, z.B. unter Verwendung von Natriumborhydrid. Diese Technologie ist Teil des FACE (Fluorophore assisted Carbohydrate Electrophoresis)-Kits, der erhältlich ist von Glyko, Inc., Novato, CA, USA, wie z.B. in dem Glyko, Inc. Katalog, S. 8–13, genau beschrieben.
  • 4. Reaktion mit einer zweiten Endoglycosidase
  • Eine zweite Endoglycosidase kann nun mit dem Saccharid-Gemisch zur Reaktion gebracht werden. Das neue Reaktionsgemisch hat nun drei Fragmente, eines mit einem intakten reduzierenden Ende, ein zweites mit einem reduzierenden Ende, das mit 2-Aminobenzimid markiert ist, und ein drittes mit einem blockierten reduzierenden Ende.
  • Beispiel 3
  • Herleitung von Strukturinformation aus einer Reihe von Reaktionen mit im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mitteln
  • Dieses Beispiel veranschaulicht weiter das Verfahren der Erfindung, d.h. die Erzeugung von Daten bezüglich der Struktur des Saccharids unter Verwendung eines Satzes von Reaktionen, wie weiter oben beschrieben. Das Beispiel zeigt weiterhin, dass aus dem Satz von Reaktionen Sequenzinformation abgeleitet werden kann.
  • In manchen Fällen reagieren die verwendeten Reagenzien möglicherweise nicht genauso, wie von veröffentlichten, z.B. aus Katalogen entnommenen, Daten vorausgesagt. Beispielsweise ist das Lectin Datura stramonium Agglutinin, wie es weiter unten beschrieben wird, in dem Sigma-Katalog als GlcNac-bindend aufgelistet. In den weiter unten genau beschriebenen Reaktionen wird jedoch gezeigt, dass DSA an Coumarin 120-derivatisierte Glc (Glc-AMC) bindet. Es scheint, dass Glc-AMC praktisch wie GlcNac wirkt wegen der Strukturähnlichkeit zwischen diesen Verbindungen. Außerdem spaltet die verwendete Endogalactosidase, wie aus den Ergebnissen unten offensichtlich ist, nicht nur an Galactose-Resten, sondern auch die Bindung, die die Glc-AMC-Gruppe mit dem Rest des Saccharids verbindet.
  • Es ist offensichtlich, dass die im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel, die bei der Ausführung der Erfindung verwendet werden, in einigen Fällen genaue Spezifitäten haben können, die von der Spezifität dieser Mittel, die in veröffentlichtem Material, z.B. Katalogen, angegeben ist, abweichen. Derartige Reaktionen können schnell durch Verwendung des Verfahrens der Erfindung mit Sacchariden bekannter Struktur identifiziert werden. Die gefundenen Ergebnisse können dann mit den erwarteten Ergebnissen verglichen werden, und die Unterschiede erlauben die Identifizierung abweichender Spezifitäten der verwendeten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel. Eine derartige Abweichung von veröffentlichten Daten der genauen Spezifitäten der im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel kann dann gespeichert werden für die zukünftige Analyse unbekannter Saccharidstrukturen unter Verwendung dieser Mittel.
  • Im Folgenden wird das Verfahren der Erfindung unter Verwendung eines End-markierten Pentasaccharids und verschiedener Lectine und Glycosidasen veranschaulicht. Das Pentasaccharid hat die Struktur Gal-β(1,4)(Fuc-α(1,3)]-GlcNAc-β(1,3)-Galβ(1,4)-Glc. Das Pentasaccharid ist an der GlcNAc-Position verzweigt, wobei Fucose und Galactose an den Positionen 3 bzw. 4 daran gebunden sind. Das Pentasaccharid ist an seinem reduzierenden Ende (Glc) mit Coumarin-120 (7-Amino-4-methyl-coumarin, erhältlich z.B. von Sigma, Katalog Nr. A 9891) markiert. Die Kopplungsreaktion kann wie oben für die Markierung reduzierender Enden unter Verwendung von Arylamin-Funktionalitäten beschrieben, ausgeführt werden. Coumarin-120 emittiert blaue Fluoreszenz, wenn es bei 312 nm angeregt wird. Als erstes und zweites im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel werden Endo-β-Galactosidase (EG, Boehringer Mannheim) und Exo-1,3-Fucosidase (FD, New England Biolabs) verwendet. Die Reaktionsbedingungen für beide Reagenzien sind wie in dem NEB-Katalog für Exo-1,3-Fucosidase beschrieben.
  • Es wurden drei Reaktionen ausgeführt. Die erste umfasste Fucosidase (FD) und Endo-Galactosidase (EG), die zweite nur FD, und die dritte nur EG. Eine vierte Reaktion ohne Enzyme diente als Kontrolle.
  • Um sicherzugehen, dass die Enzyme das Saccharid verdaut haben, werden die verschiedenen Reaktionen unter Verwendung von Dünnschichtchromatografie (TLC – thin-layer chromatography) der Größe nach aufgetrennt.
  • Nach der Trennung können die Saccharide auf der TLC-Platte nachgewiesen werden, indem die Platte Ultraviolettlicht ausgesetzt wird. Die Ergebnisse sind in der folgenden Darstellung gezeigt.
  • Figure 00390001
  • In Reaktion 4 wurde keine Glycosidase zugegeben, so ist das Saccharid intakt und bewegt sich auf der Platte nur eine kleine Strecke. Das Fragment von Reaktion 2 ist das zweite hinsichtlich Molekulargewicht, während die Fragmente der Reaktionen 1 und 3 gleich zu sein scheinen. Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass die Sequenz der Glycosidase-Stellen auf dem Saccharid FD-EG-reduzierendes Ende (Coumarin-Markierung) ist.
  • Das obige Pentasaccharid wird nun durch einen Satz von Reaktionen, wie weiter oben beschrieben, getestet. Als erste und zweite im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel wurden Lectine verwendet. Die Lectine (Anguilla Anguilla-Agglutinin (AAA), Katalog Nr. L4141, Arachis Hypogaea-Agglutinin (PNA), Katalog Nr. L0881, Ricinus communis-Agglutinin (RCA I), Katalog Nr. L9138, Lens Culinaris-Agglutinin (LCA), Katalog Nr. L9267, Arbus Precatorius-Agglutinin (APA), Katalog Nr. L9758) sind von Sigma erhältlich. Lectine sind auch von anderen Firmen erhältlich. Beispielsweise kann RCA I von Pierce, Katalog Nr. 39913, erhalten werden. Lectine werden durch Blotting auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert.
  • Der Reaktionspuffer ist Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS – phosphatebuffered saline) mit 1 mM CaCl und 1 mM MgCl. Nach Bindung der Lectine wurde der Filter mit 1% BSA in Reaktionspuffer blockiert. Als Kontrollen wurden Reaktionen ohne Lectin und mit 10 μg BSA als immobilisiertes Protein verwendet.
  • Die Ergebnisse der Reaktionen sind in Tabelle 9 angegeben. Ein Plus gibt das Vorliegen einer Fluoreszenz bei 312 nm an, was das Vorliegen des Coumarin-markierten reduzierendes Endes angibt. Die Ziffern 1 bis 4 in der Tabelle geben Reaktionen an, wie sie oben definiert sind.
  • Tabelle 10
    Figure 00400001
  • Aus den Ergebnissen, wie sie in Tabelle 9 aufgelistet sind (Reaktion 4-Kontrolle), ist offensichtlich, dass die Lectine AAA, PNA, DSA und RCA-I das Saccharid binden. Daher müssen Fucose, Gal(1-3)GlcNAc, GlcNAc und Galactose/GalNAc in dem Saccharid vorliegen, da diese die jeweiligen Saccharidstrukturen sind, die von AAA, PNA, DSA und RCA-I erkannt werden. Es ist außerdem offensichtlich, dass die oben beschriebenen Glycosidasen Fucosidase und Endo-β-Galactosidase Spaltungssequenzen in dem Saccharid erkennen. Diese Sequenzen sind Fuc(1-3/1-4) GlcNAc bzw. GlcNAcβ(1-3)Galβ(1-3/4)Glc/GlcNAc.
  • Es kann außerdem abgeleitet werden, dass beide Glycosidase-Stellen zwischen dem Fucose-Zucker und dem reduzierenden Ende liegen, da dieses Ende durch jede Glycosidase gespalten wird, wenn AAA (das an Fucose bindet) als immobilisiertes Lectin verwendet wird. Andererseits erlaubt die Reaktion mit DSA die Ableitung, dass entweder das GlcNAc-Monosaccharid zwischen den Glycosidase-Stellen und dem reduzierenden Ende liegt, oder dass Glc direkt an das Coumarin gebunden ist, da keine Glycosidase das reduzierende Ende abspaltet, wenn DSA als immobilisiertes Mittel verwendet wird.
  • Darüber hinaus zeigt die Reaktion mit PNA als immobilisiertes Mittel, dass das reduzierende Ende nur abgespalten wird, wenn Endo-β-Galactosidase verwendet wird (Reaktionen 1 und 3). Dies zeigt an, dass die Endo-β-Galactosidase-Stelle zwischen der Stelle für PNA und dem reduzierenden Ende liegt. Andererseits muss die Fucosidase-Stelle zwischen der PNA-Stelle und dem anderen Ende des Saccharids liegen.
  • Unter Berücksichtigung der obigen Daten ist es nun möglich, eine Sequenz des Saccharids wie folgt vorzuschlagen:
    Fucα(1-3,1-4)GlcNAc(1-3)Gal(1-4)Glc/GlcNAc-reduzierendes Ende
  • Das obige Experiment zeigt deutlich, dass das Verfahren der Erfindung auf der Basis relativ weniger Reaktionen eine Vielfalt von Daten erbringen kann, einschließlich Sequenzinformation. Einige Details in der Sequenzinformation können möglicherweise nicht vollständig sein, wie die (1-3)- oder (1-4)-Verbindung zwischen Fucose und GlcNAc in dem obigen Saccharid. Wäre die Monosaccharid-Zusammensetzung des Pentasaccharids bekannt gewesen, dann hätte die obige Analyse alle Details des Pentasaccharids erbracht. Dennoch ist die selbst ohne die Monosaccharid-Zusammensetzungsdaten gewonnene Information im Vergleich zu Verfahren des Stands der Technik sehr präzise.
  • Beispiel 4
  • Herleitung von teilweiser oder vollständiger Sequenzinformation
  • Das Verfahren der Erfindung ist zur Automatisierung geeignet. Daher können die oben, beispielsweise in den Beispielen 1 bis 3, beschriebenen Schritte unter Verwendung eines automatisierten Systems zum Mischen, Herstellen von Aliquots, zur Reaktion-Bringen und zum Nachweis ausgeführt werden. Die durch einen solchen automatisierten Prozess erhaltenen Daten können dann weiter verarbeitet werden, um die Kartierungsinformation zu teilweiser oder vollständiger Sequenzinformation "zusammenzulegen". Das Verfahren für eine solche Datenverarbeitung ist unten genauer beschrieben.
  • Nachdem alle Daten gesammelt wurden, wird ein Vergleich durchgeführt zwischen Detektionssignalen, die von Reaktionen vor der Zugabe von Glycosidase erhalten wurden, und Signalen, die nach der Zugabe von (und Reaktion mit) Glycosidase erhalten wurden. Jene Signale, die nach der Reaktion mit Glycosidase verschwinden, werden markiert. Dies kann vorteilhafterweise durch Erstellen einer Liste jener Signale, die hierin im Folgenden als eine erste Liste bezeichnet wird, gemacht werden. Die Identität von zwei Stellen auf dem Polysaccharid kann nun für jeden derartigen Dateneintrag festgestellt werden. Die Position in der (gewünschtenfalls virtuellen) Anordnung gibt das erste im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel an. Wenn ein Signal vor der Reaktion der Glycosidase nachgewiesen wurde, muss die Erkennungsstelle für das Mittel in dem Polysaccharid vorliegen. Das Verschwinden eines Signals, beispielsweise des mit dem zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel verbundenen Signals, gibt nun an, dass die Glycosidase zwischen den Erkennungsstellen des ersten und des zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittels spaltet. Die Sequenz der Erkennungsstellen ist daher (erstes im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel)-(Glycosidase)-(zweites im Wesentlichen Sequenz-spezifisches Mittel). Wenn das Signal für das reduzierende Ende nach Verdau mit der Glycosidase noch vorhanden ist, dann kann die relative Reihenfolge der Erkennungssequenzen bezüglich des reduzierenden Endes festgestellt werden; ansonsten müssen beide Möglichkeiten (a-b-c und c-b-a) berücksichtigt werden. Zum Zwecke der Veranschaulichung wird der Begriff "Erkennungsstelle des ersten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittels" im Folgenden als "erste Erkennungsstelle" bezeichnet, der Begriff "Erkennungsstelle für das zweite im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel" wird als "zweite Erkennungsstelle" bezeichnet, und der Begriff "Erkennungsstelle für Glycosidase" wird als "Glycosidase" bezeichnet.
  • Es ist nun möglich, eine zweite Liste von Tripletts von Erkennungsstellen des obigen Typs (Typ 1-Tripletts) zu erzeugen:
    (erste Erkennungsstelle)-(Glycosidase)-(zweite Erkennungsstelle).
  • Ebenso kann nun eine dritte Liste erzeugt werden, die (gewünschtenfalls virtuelle) Anordnungs-Orte betrifft, bei denen nach Zugabe von Glycosidase alle Signale bleiben (Typ 2-Tripletts):
    (Glycosidase)-(erste Erkennungsstelle)-(zweite Erkennungsstelle)
  • Offensichtlich definiert eine ausreichende Anzahl von Tripletts ein Molekül hinsichtlich seiner Sequenz, d.h. es kann nur eine Sequenz von Sacchariden geben, die alle gefundenen Tripletts enthält. Eine geringere Anzahl von Tripletts kann erforderlich sein, wenn Information zur Länge des Moleküls verfügbar ist. Die Anzahl an erforderlichen Tripletts kann sogar noch geringer sein, wenn der Gesamtzuckergehalt des Moleküls bekannt ist. Sowohl das Saccharid-Molekulargewicht als auch der Gesamt-Monosaccharid-Gehalt kann aus Verfahren des Stands der Technik, die Fachleuten wohl bekannt sind, hergeleitet werden.
  • Das Verfahren zur Beschaffung von Sequenzinformation, d.h. zum Zusammenlegen der Tripletts zu einer Karte von Erkennungsstellen, ist unten beschrieben.
  • Die zweite und die dritte Liste von Triplett-Erkennungsstellen wird hinsichtlich Identität (drei von drei Erkennungsstellen identisch), hoher Ähnlichkeit (zwei von drei Erkennungsstellen identisch) und geringer Ähnlichkeit (eine von drei Erkennungsstellen identisch) ausgewertet. Zum Zwecke der Veranschaulichung wird nun angenommen, dass das Polysaccharid ein lineares Polysaccharid ist, wie beispielsweise der Saccharid-Anteil des Glycans Heparin.
  • Die obige zweite und dritte Liste wird dann verwendet, um daraus einen Satz von Triplett-Listen herzustellen, wobei jede Liste in dem Satz von Listen Tripletts enthält, die dieselbe Glycosidase-Erkennungssequenz teilen. Durch Vergleichen aller Tripletts, die eine bestimmte Glycosidase-Erkennungssequenz enthalten, mit allen Tripletts, die eine zweite Glycosidase-Erkennungssequenz enthalten, ist es nun möglich, die Polysaccharid-Sequenz in vier Bereiche aufzuteilen, die von dem ersten Ende des Moleküls bis zu Glycosidase 1 (Fragment a), von Glycosidase 1 bis zu Glycosidase 2 (Fragment b) und von Glycosidase 2 bis zu dem zweiten Ende des Moleküls (Fragment c) reichen:
    [erstes Ende][Glycosidase 1][Glycosidase 2][zweites Ende]
  • Identische Erkennungsstellen in Tripletts vom Typ 2 mit unterschiedlichen Glycosidase-Stellen, wobei die Erkennungsstellen bezüglich der jeweiligen Glycosidase-Stelle in derselben Richtung liegen, sind Kandidaten für die Lage in entweder dem Bereich a oder c, abhängig von dem Ort. Identische Erkennungsstellen in Tripletts vom Typ 2 mit unterschiedlichen Glycosidase-Stellen, wobei die Erkennungsstellen in unterschiedlichen Richtungen liegen (z.B. eine in Richtung des reduzierenden Endes, in dem anderen Triplett in Richtung des nichtreduzierenden Endes), sind Kandidaten für die Lage in dem Bereich b, d.h. zwischen den zwei Glycosidase-Stellen.
  • Identische Erkennungsstellen in Tripletts vom Typ 1 mit unterschiedlichen Glycosidase-Stellen sind Kandidaten dafür, dass eine der ersten oder zweiten Erkennungsstellen im Bereich a (oder c) liegt und die andere der ersten oder zweiten Erkennungsstellen in dem Bereich c (oder a) liegt. Das heißt, wenn eine der ersten oder zweiten Erkennungsstellen im Bereich a liegt, dann muss die andere der ersten oder zweiten Erkennungsstellen im Bereich b liegen, und umgekehrt. Keine der ersten oder zweiten Erkennungsstellen kann im Bereich b liegen.
  • Identische Erkennungsstellen in Tripletts vom Typ 1 mit unterschiedlichen Glycosidase-Stellen, wobei eine gegebene Erkennungsstelle in einem der Tripletts in Richtung des reduzierenden Endes liegt und in dem anderen Triplett in Richtung des nicht-reduzierenden Endes liegt, sind Kandidaten für die Lage der Erkennungsstelle in dem Bereich b.
  • Wenn man die obigen Positions-Beziehungen für eine Anzahl von Erkennungsstellen in den Tripletts aufgestellt hat, kann nun die Gesamtheit der Erkennungssequenzen unter Anwendung logischer Folgerungen in einer bestimmten Reihenfolge angeordnet werden. Diese Stufe wird als eine Sequenzkarte bezeichnet. Wenn eine ausreichende Anzahl von Erkennungssequenzen angeordnet ist, kann daraus die volle Sequenz des Saccharids hergeleitet werden. Da das Verfahren nicht das Molekulargewicht des Saccharids bestimmt, ist die Kettenlänge unbekannt. Daher kann es, wenn der Grad der Überlappung zwischen den verschiedenen Erkennungsstellen unzureichend ist, Bereiche in der Sequenz geben, wo zusätzliche Saccharid-Einheiten vorhanden sein können. Derartige Saccharid-Einheiten können undetektiert sein, wenn sie nicht in eine Erkennungsstelle irgendeines der verwendeten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mittel fallen. Die gesamte Sequenzinformation kann jedoch auch in diesem Fall erhalten werden, indem man zuerst das Molekulargewicht des Saccharids, das seine Kettenlänge angibt, und zweitens seinen Gesamt-Monosaccharid-Gehalt beschafft.
  • Eine andere Möglichkeit zum Schließen von Lücken in der Sequenzkarte ist das Verfahren des Beispiels 2, bei dem ein sequenzieller Abbau durch Glycosidase eingesetzt wird, um Sequenzinformation herzuleiten.
  • Das Vorliegen von Verzweigungspunkten in dem Saccharid kann das Verfahren, wie es oben dargelegt ist, komplizieren. Eine Abhilfemöglichkeit dagegen ist, Glycosidasen zu verwenden, um Bruchstücke des Moleküls herzustellen, und diese Teilstrukturen zu analysieren. Das Ausmaß der Verzweigung in solchen Teilstrukturen ist offensichtlich geringer als in dem gesamten Molekül. Zusätzlich können Reagenzien eingesetzt werden, die Verzweigungspunkte spezifisch erkennen. Beispiele für solche Reagenzien sind z.B. die in Beispiel 1 oben eingesetzten Antikörper. Jeder dieser Antikörper bindet eine Saccharidsequenz, die mindestens einen Verzweigungspunkt enthält. Darüber hinaus sind bestimmte Enzyme und Lectine erhältlich, die verzweigte Saccharidstrukturen erkennen. Beispielsweise erkennt das Enzym Pullanase (EC 3.2.1.41) eine verzweigte Struktur. Zusätzlich können Antikörper erzeugt werden, indem man verzweigte Saccharidstrukturen als Antigene verwendet. Darüber hinaus ist es möglich, Peptide zu erzeugen, die bestimmte Saccharidstrukturen, einschließlich verzweigter Strukturen, binden (siehe z.B. Deng SJ, MacKenzie CR, Sadowska J, Michniewicz J, Young NM, Bundle DR, Narang; Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display; J. Biol. Chem. 269, 9533–38, 1994).
  • Zusätzlich sagt in vielen Fällen die Kenntnis der Struktur existierender Kohlenhydrate genau das Vorliegen von Verzweigungspunkten voraus. Beispielsweise besitzen N-verknüpfte Glycane eine begrenzte Anzahl von Strukturen, wie auf S. 6 des Katalogs von Oxford Glycosystems aufgelistet. Diese Strukturen reichen von monoantennar bis pentaantennar. Die komplizierteren Strukturen ähneln einfacheren Strukturen mit hinzugefügten zusätzlichen Saccharidresten. Daher ist es möglich, wenn die monoantennare Struktur identifiziert ist, alle der Verzweigungspunkte in einer komplizierteren Struktur einfach durch Identifizieren der zusätzlichen Reste und durch Vergleichen dieser Daten mit einer Bibliothek N-verknüpfter Glycanstrukturen vorherzusagen.
  • Darüber hinaus ist es durch Analysieren von Daten, die nach dem Verfahren der Erfindung gesammelt wurden, oft möglich, das Vorliegen und die Lage von Verzweigungspunkten logisch abzuleiten. Wenn beispielsweise zwei Erkennungsstellen, als a und b bezeichnet, auf unterschiedlichen Zweigen liegen, dann führt ein Verdau mit einer Glycosidase, deren Stelle zwischen dem reduzierenden Ende und dem Verzweigungspunkt liegt, zum Verlust des Markers des reduzierenden Endes. Die Marker für die beiden Erkennungsstellen a und b bleiben jedoch. Wenn eine zwischen dem Verzweigungspunkt und der Erkennungsstelle a liegende Glycosidase verwendet wird, dann werden der Marker für die Erkennungsstelle b und der Marker des reduzierenden Endes abgespalten. Wenn man die Möglichkeit von Verzweigungspunkten nicht berücksichtigt, würde dies anzeigen, dass die Erkennungsstelle b zwischen der Erkennungsstelle a und dem reduzierenden Ende liegt. Wenn jedoch eine zwischen der Erkennungsstelle b und dem Verzweigungspunkt liegende Glycosidase verwendet wird, werden der Marker des reduzierenden Endes und die Erkennungsstelle a abgespalten. Wenn man die Möglichkeit der Verzweigung wiederum nicht berücksichtigt, würde dies anzeigen, dass die Erkennungsstelle a zwischen dem reduzierenden Ende und der Erkennungsstelle b liegt. Diese Folgerungen sind offensichtlich unvereinbar miteinander und können nur gelöst werden, wenn man annimmt, dass die Erkennungsstellen a und b auf zwei unterschiedlichen Zweigen liegen. Der Verzweigungspunkt liegt zwischen den Erkennungsstellen a und b und der ersten der obigen Glycosidasen. Die anderen verwendeten obigen Glycosidasen liegen jede auf einem Zweig zwischen dem Verzweigungspunkt und der jeweiligen Erkennungsstelle (a oder b).
  • Daher ist es möglich, wenn in dem Verfahren der Erfindung Mittel, die verzweigte Strukturen erkennen, als im Wesentlichen Sequenz-spezifische Mittel verwendet werden, Information hinsichtlich Vorliegen und Lage von Verzweigungspunkten in dem Saccharid-Molekül herzuleiten. Diese Information kann dann verwendet werden, um Sequenzkarten jedes Zweigs der Struktur zu konstruieren, was eine Sequenzkarte der gesamten verzweigten Struktur ergibt. Die Lücken in einer solchen Struktur können dann gemäß der Erfindung wie in dem Fall von unverzweigten Sacchariden geschlossen werden, d.h. durch Verwendung zusätzlicher Reaktionen, durch Verdau mit Glycosidasen, wodurch die Bereiche des Moleküls, wo Lücken vorliegen, spezifisch zur weiteren Analyse gemäß dem Verfahren der Erfindung isoliert werden, und durch sequenziellen Glycosidase-Verdau, wie weiter oben beschrieben.
  • Zusammenfassend weist ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines Saccharids und/oder zur Kartierung der Struktur des Saccharids gemäß der Erfindung folgende Schritte auf:
    • 1. Sammeln von Tripletts des Typs 1 und des Typs 2
    • 2. Sortieren der Tripletts nach Ähnlichkeit
    • 3. Vergleichen von Tripletts mit unterschiedlichen Glycosidase-Erkennungsstellen
    • 4. Anordnen der Tripletts in der Reihenfolge des Auftretens auf dem Saccharid
    • 5. Anordnen der Glycosidase-Erkennungsstellen
    • 6. Prüfen der Kompatibilität mit den Tripletts
    • 7. Anordnen von Erkennungssequenzen von Glycosidasen und von ersten und zweiten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mitteln in einer einzigen Dateiordnung
    • 8. Konvertieren der Erkennungssequenzen (Stellen) in Polysaccharid-Sequenzen
    • 9. Korrigieren von "Überlappungs"-Problemen
    • 10. Ausgeben einer Sequenz
    • 11. Vergleichen aller verfügbaren Daten
  • Nach Ausführung des obigen Schritts 5 ist eine vorläufige Reihenfolge von Glycosidase-Stellen erstellt. in Schritt 6 wird nun für jedes Triplett geprüft, ob darauf basierende Voraussagen mit der Reihenfolge in Übereinstimmung sind. Dann wird auf der Basis von Widersprüchen in den Daten ein neues Modell erzeugt, das zu den Daten des Tripletts passt. Dieses Modell wird dann gegenüber den Daten aller Tripletts getestet. Darüber hinaus können zusätzliche Reaktionen ausgeführt werden, um zusätzliche vektorielle Information bezüglich der Erkennungsstellen, die das Triplett beinhalten, herauszuholen.
  • Nach dem obigen Schritt 8, in dem die sequenziell angeordneten Erkennungsstellen in eine Sequenz tatsächlicher Monosaccharid-Einheiten konvertiert werden, kann ein Modell der Saccharidsequenz vorgeschlagen werden. Um das Modell zu testen, muss eine Anzahl von Fragen beantwortet werden. Die erste davon ist: Was ist die minimale Sequenz, die noch dieselbe Sequenzkarte haben würde? Auf dieser Stufe wird Information zum Molekulargewicht und zur Monosaccharid-Zusammensetzung, falls verfügbar, nicht berücksichtigt. Dieser Schritt dient nur der Erzeugung einer Sequenz, die alle verfügbaren Daten mit so wenig Widersprüchen wie möglich enthält. In der Hinsicht ist die zweite Frage, die zu beantworten ist: Stimmt die minimale Sequenz noch mit allen an dem Punkt verfügbaren Daten überein (ausgeschlossen die optionalen Molekulargewicht- und Monosaccharid-Zusammensetzungs-Daten)? Die dritte zu beantwortende Frage ist: Gibt es andere Sequenzen, die zu der Sequenzkarte, wie sie erstellt wurde, passen würden? Wenn ja, dann können die zusätzlichen Sequenzen getestet werden unter Verwendung der Frage: Wie stimmt jedes Sequenzmodell überein mit der Triplett-Information und mit zusätzlichen optionalen Daten, wie Information zum Molekulargewicht, zur Monosaccharid-Zusammensetzung und zu aus der Biologie bekannten Modell-Saccharidstrukturen.
  • Schließlich wird dann das Sequenzmodell, das gemäß den oben beschriebenen Schritten 1 bis 10 als das beste befunden wurde, gegenüber allen Tripletts, der Monosaccharid-Zusammensetzung, vorheriger Kenntnis zum Molekulargewicht und zur strukturellen Zusammensetzung des Saccharids, und gegenüber Vorhersagen ausgehend von biologisch existenten ähnlichen Strukturen getestet. Durch ein derartiges wiederholtes Testen werden die Widersprüche zwischen den verfügbaren Daten und dem Sequenzmodell identifiziert, und wenn möglich, wird das Sequenzmodell angepasst, um die Daten besser zu repräsentieren.
  • Beispiel 5
  • Glycomolekül-Identitäts(GMID)-Analyse von Milchproben
  • Das Ziel dieses Beispiels ist, die Anwendung der GMID-Technik auf die Analyse und den Vergleich von Milchproben zu zeigen.
  • A. Membranen und Lectine der ersten Schicht:
  • Die in den hierin unten beschriebenen Experimenten verwendete Trägeroberfläche ist eine Nitrocellulose-Membran. Die Membranen wurden wie folgt hergestellt:
    • 1. Nitrocellulose-Membranen wurden ausgeschnitten und ihre obere Oberfläche in eine Anordnung von 9 × 6 Rechtecken (jedes Rechteck 3 mm2) abgegrenzt. Die Membranen wurden dann auf absorbierendes Papier gelegt und das obere linke Rechteck einer jeden mit einem Stift markiert.
    • 2. Lyophilisierte Lectine wurden erneut in Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml suspendiert. Die erneut suspendierten Lectine (und eine Kontroll-Lösung: 5% Rinderserumalbumin) wurden vortexgemischt und 1 μl jeder Lösung auf eines der 28 Rechtecke auf dem Blot, die in der folgenden veranschaulichenden Darstellung eines typischen Blots durch Dunkeltönung angegeben sind, aufgegeben.
  • Figure 00490001
  • Die in diesem Experiment verwendeten Lectine sind in Tabelle 11 aufgelistet.
  • Tabelle 11
    Figure 00500001
    • 3. Die hergestellten Blots wurden in 90 mm Petrischalen gebracht.
    • 4. Die Blots wurden blockiert, indem zu jeder Petrischale 10 ml irgendeiner geeigneten Blockierungslösung, die Fachleuten wohl bekannt ist (z.B. 5% Rinderserumalbumin), zugegeben wurden.
    • 5. Die Schalen, die die Blots in der Blockierungslösung enthielten, wurden durch Drehen auf einem Drehtisch (50 U/min) für 2 h bei Raumtemperatur (oder über Nacht bei 4°C, ohne Drehung) schonend bewegt.
    • 6. Die Blots wurden dann durch Zugabe von 10 ml Wasch-Lösung zu jeder Petrischale gewaschen. Irgendeine allgemein verfügbare gepufferte Lösung (z.B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) kann zur Durchführung der Wasch-Schritte verwendet werden. Die Schalen wurden durch 5 Minuten langes schonendes Drehen (50 U/min) gewachsen. Der Vorgang wurde insgesamt dreimal durchgeführt, wobei jedes Mal die alte Wasch-Lösung verworfen und durch eine frische Lösung ersetzt wurde.
  • B: Zugabe von Milchproben:
  • Die verwendeten Milchproben waren wie folgt:
    • 1. UHT-Kuhmilch mit langer Haltbarkeitsdauer (3% Fett), erhalten von Ramat haGolan dairies, Israel (Charge 522104);
    • 2. pasteurisierte Ziegenmilch, erhalten von Mechek dairies, Israel (Chargen 1 und 2);
    • 3. nicht pasteurisierte Ziegenmilch, erhalten wie in 2. (Chargen 3 und 4).
  • Die Milchproben wurden auf 10% v/v verdünnt, und näherungsweise 5 ml jeder Probe wurden auf separate Blots aufgebracht.
  • Duplikat-Blots wurden für jede der vorgenannten Milchproben hergestellt. Zusätzlich wurde ein weiteres Paar Blots ohne die Zugabe von Sacchariden hergestellt (negative Kontrolle).
  • Die Blots wurden dann bei Raumtemperatur eine Stunde lang unter Bewegung inkubiert.
  • C. Gefärbte Lectine:
  • Auf der Basis von vorheriger Kenntnis der Monosaccharid-Zusammensetzung der getesteten Milch und durch Anwendung eines Computerprogramms auf der Basis des hierin unten in Beispiel 7 beschriebenen Algorithmus wurden die folgenden gefärbten Lectine ausgewählt: Con A, VVA.
  • Eine Mischung dieser zwei Lectine wurde in Wasch-Lösung hergestellt, so dass die Konzentration jedes gefärbten Lectins 2 mg/ml betrug.
  • 500 μl jeder Lectin-Mischung wurden auf den wie oben beschrieben hergestellten Blots inkubiert. Jeder Blot wurde sowohl durch Messen der Fluoreszenz von Fluorescein bei 520 nm als auch, im Falle des biotinylierten Lectins, durch Messen des Signals der blauen TMB-Farbe, die nach Reaktion von Biotin mit einer HRP-Streptavidin-Lösung erzeugt wurde, gelesen.
  • Die für die FITC-markierten und Biotin-markierten Lectine erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 12 bzw. 13 angegeben. Die in diesen Tabellen vorgelegten Ergebnisse sind auf einer Skala von 0 bis 3 gemessen, wobei 0 ein Signal repräsentiert, das unterhalb des Rauschpegels liegt, und wobei Ergebnisse von 1 bis 3 positive Signale (über Rausch) nach Subtraktion der für die Kontrolle ohne Saccharid erhaltenen Ergebnisse repräsentieren.
  • Aus diesen Ergebnissen erhaltene Glycomolekül-Identitäts(GMID)-Karten für pasteurisierte Ziegenmilch (Chargen 1 und 2), nicht pasteurisierte Ziegenmilch (Chargen 3 und 4) und Kuhmilch sind in 1 (A bis E) gezeigt. Die Positionen der Lectine 1 bis 24 sind auf der Oberseite jeder Karte 1 in einer Reihe von links nach rechts gezeigt.
  • D. Interpretation der Ergebnisse:
  • Die Kuhmilchprobe ergab eine GMID, die anzeigte, dass das Polysaccharid in der Probe Saccharide enthält, die positive Ergebnisse für Lectine ergeben, die spezifisch sind für:
    • a. Glucose/Mannose (ConA, PSA und LCA);
    • b. GlcNac (WGA und DSA).
  • Die pasteurisierten Ziegenmilchproben ergaben positive Ergebnisse für:
    • a. Glucose/Mannose (conA, PSA und LCA);
    • b. GlcNac (DSA).
  • Es wurde kein Unterschied in der Lectin-Reaktivität zwischen den getesteten Chargen beobachtet.
  • Die nicht pasteurisierte Ziegenmilchprobe ergab eine positive Reaktion für:
    • a. Glucose/Mannose (ConA, PSA und LCA);
    • b. GlcNac (DSA).
  • Zusammenfassend unterschied sich die Kuhmilch von der Ziegenmilch dadurch, dass nur die erstere mit WGA reagierte. Es gab im Wesentlichen keinen Unterschied zwischen den pasteurisierten und den nicht pasteurisierten Ziegenmilchproben mit der Ausnahme, dass die Signalintensität in den pasteurisierten Proben signifikant niedriger war.
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Beispiel 6
  • Glycomolekül-Identitäts(GMID)-Analyse von Lipopolysacchariden
  • Eine GMID-Analyse wurde an fünf unterschiedlichen bakteriellen Lipopolysacchariden durchgeführt, die von Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA) (LPS#1, 7, 10, 15 und 16) erhalten wurden, wobei im Wesentlichen das Verfahren, wie es in Beispiel 5 oben beschrieben ist, verwendet wurde. Die verwendeten gefärbten Lectine waren ECL, WGA, VVA und SBA.
  • Die für die LPS-Proben #1, 7, 10, 15 und 16 erhaltenen GMID-Karten sind in 2 gezeigt (A bis E). Aus dieser Figur ist ersichtlich, dass die GMID-Karten charakteristische "Fingerabdrücke" für jedes der verschiedenen Lipopolysaccharide liefern, und zur Identifizierung der Anwesenheit dieser Verbindungen in Proben, die Bakterien oder Gemische ihrer Produkte enthalten, verwendet werden können.
  • Beispiel 7
  • Verfahren zum Auswählen gefärbter Lectine
  • Wenn gefärbte Lectine zur Verwendung in dem Verfahren der Polysaccharid-Analyse, das in den Beispielen 5 und 6 veranschaulicht ist, ausgewählt werden, muss eine Anzahl von Faktoren in Betracht gezogen werden. Unter diesen Erwägungen ist das Erfordernis, dass jedes der gewählten Lectine eine unterscheidbare Farbe oder ein anderes nachweisbares Merkmal hat, und das Erfordernis, Wechselwirkungen zwischen den Lectinen zu verringern. Ein Ablaufdiagramm, das einen Algorithmus zur Verwendung bei der Auswahl gefärbter Marker veranschaulicht, ist in 3 gezeigt. Der in 3 gezeigte Algorithmus beginnt mit der Auswahl von n gefärbten Lectinen (oder anderen nachweisbaren Markern) 101, wobei die anfängliche Auswahl gemäß Information, die über die teilweise oder vollständige Monosaccharid-Zusammensetzung des zu analysierenden Saccharids erhalten wurde, gemacht wird. In dem nächsten Schritt 102 werden die Farben der ausgewählten Lectine untersucht, um auf Identität/Nicht-Identität der ausgewählten Farben zu prüfen. Wenn es in der ausgewählten Gruppe identische Farben gibt, dann geht der Prozess mit Schritt 103 weiter, ansonsten geht der Ablauf mit Schritt 104 weiter. In Schritt 103 wird eines der Lectine, von dem gefunden wurde, dass es eine nicht-eindeutige Farbe hat, durch ein anderes Lectin ersetzt, das zur gleichen Bindungskategorie gehört (d.h. eines, das dieselbe Monosaccharid-Bindungsspezifität hat); der Ablauf geht mit Schritt 102 weiter. In Schritt 104 werden die n ausgewählten Lectine getestet, um irgendeine Kreuzreaktivität miteinander und mit den nicht-gefärbten Lectinen, die in der ersten Stufe des hierin oben in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens verwendet werden, nachzuweisen. Wenn Kreuzreaktivität gefunden wird, dann wird der Prozess mit Schritt 105 fortgesetzt, ansonsten geht der Ablauf mit Schritt 106 weiter, wo der Algorithmus endet. In Schritt 105 wird eines der Lectine, von dem festgestellt wurde, dass es mit einem anderen Lectin kreuzreagiert, durch ein Lectin ersetzt, das nicht kreuzreagiert; der Ablauf geht dann mit 102 weiter. Der Algorithmus endet mit Schritt 106.
  • Es muss betont werden, dass der oben beschriebene Algorithmus zwar für kleine Werte von n und für Saccharide mit einer einfachen Monosaccharid-Zusammensetzung von dem Operator selbst, der/die sich manuell durch jeden Schritt des Auswahlverfahrens hindurcharbeitet, angewendet werden kann. Alternativ (und insbesondere für Fälle, wo n eine größere Zahl ist oder die Monosaccharid-Zusammensetzung komplexer ist) kann der hierin oben beschriebene algorithmische Prozess von einem Computerprogramm durchgeführt werden, das zur Ausführung des Prozesses entworfen wurde.
  • Die obigen Beispiele haben die Brauchbarkeit des hierin beschriebenen Verfahrens gezeigt. Sie wurden jedoch nur zum Zwecke der Veranschaulichung hinzugefügt. Es ist für einen Fachmann klar, dass viele Abwandlungen bei den verwendeten im Wesentlichen Sequenz-spezifischen Mitteln, bei den Reaktionsbedingungen dafür, bei den Techniken zur Immobilisierung und bei der Abfolge der Markierungs-, Reaktions- und Nachweisschritte durchgeführt werden können, alles ohne über den Umfang der Erfindung hinauszugehen.

Claims (35)

  1. Verfahren zur strukturellen Analyse eines Saccharids, aufweisend: a) Bereitstellen auf einer Fläche eines Substrats einer Mehrzahl von unterschiedlichen im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Bindungsmitteln mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten, wobei eine Anzahl der Mehrzahl von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Mitteln auf der gleichen Fläche des Substrats immobilisiert sind; b) Inkontaktbringen der Fläche mit einem zu analysierenden Saccharid oder mit einer Mischung, aufweisend eine Mehrzahl von Fragmenten des Saccharids; c) Waschen oder anderweitiges Entfernen ungebundener Saccharide oder Saccharidfragmente; d) Hinzufügen zu der in Schritt c) erhaltenen Oberfläche eines im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markers oder einer Mischung von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern; e) Erfassen eines oder mehrerer Bilder der Marker, welche an die Fläche gebunden sind; und f) Ableiten von Information bezüglich der Identität des zu analysierenden Saccharids von dem Bild.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Marker chromogene Bindungsmittel sind und wobei die Bilder der Marker Farben sind, welche sich auf der Fläche entwickeln.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem die im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen chromogenen Bindungsmittel gefärbte Lectine, fluoreszente Lectine, Biotin-markierte Lectine, fluoreszente Antikörper, Biotin-markierte Antikörper oder Enzym-markierte Antikörper sind.
  4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem Schritt e) Fotografieren und/oder Digitalisieren des Bildes aufweist.
  5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem Schritt f) eine visuelle Untersuchung der Fläche und Vergleich mit einem Standard aufweist, oder bei welchem Schritt f) die Verwendung von optischen Filtern aufweist.
  6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Bindungsmittel Lectine oder Antikörper sind.
  7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das Saccharid an dem reduzierenden Ende markiert ist.
  8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, außerdem aufweisend Behandeln des Saccharids mit einem im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Mittel, welches in der Lage ist, die Saccharidkette zu spalten.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, bei welchem das Saccharid behandelt wird: a) vor In-Kontakt-Bringen mit der Fläche; oder b) nach Entfernen von ungebundenem Saccharid, aber vor Hinzufügen des im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markers.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, bei welchem das im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifische Mittel, welches zur Spaltung der Saccharidkette in der Lage ist, nach Schritt (e) hinzugefügt wird und wobei dann ein zweiter Detektionsschritt durchgeführt wird, um nachzuweisen, ob ein oder mehrere gebundene Marker verloren gegangen sind.
  11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die Schritte (d) bis (f) mit einem anderen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Marker wiederholt werden.
  12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, außerdem aufweisend das Behandeln des Saccharids oder der Saccharidfragmente mit einem im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Mittel, welches in der Lage ist, einen Verzweigungspunkt des Saccharids oder der Saccharidfragmente zu detektieren, um zu bestimmen, ob der Verzweigungspunkt vorhanden ist.
  13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die Oberfläche ein Filterpapier ist und die im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Mittel in einer vordefinierten Ordnung auf dem Filterpapier angeordnet sind.
  14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die Bindungsmittel keine absolute Sequenzspezifität für eine bestimmte Saccharidsequenz haben.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem die Bindungsmittel an eine oder mehrere verwandte Saccharidsequenzen binden und optional auch an eine oder mehrere nicht-verwandte Saccharidsequenzen binden.
  16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Mittel in einer vordefinierten Ordnung auf der Fläche angeordnet sind, wobei das Verfahren ferner aufweist: g) Konstruieren einer Glycomolekül-Identitäts(GMID)-Karte, welche die in Schritt (f) erhaltenen Strukturanalysedaten auflistet.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, bei welchem die verwendeten im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Mittel durch Code-Nummern repräsentiert werden, wobei vorzugsweise die Code-Nummern einzigartige Code-Nummern sind.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei welchem die im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Mittel in einer vordefinierten Ordnung auf der Fläche angeordnet sind, wobei das Verfahren ferner ausweist: g) Konstruieren einer Glycomolekül-Identitäts(GMID)-Karte, aufweisend ein Bindungsmuster des immobilisierten Mittels an das Saccharid oder die Saccharidfragmente und des Bindens der Marker an das Saccharid oder die Saccharidfragmente, wobei das Muster ein identifizierendes Merkmal des Saccharids oder der Saccharidfragmente ist.
  19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, aufweisend das Analysieren der Struktur des Saccharids durch sequenziellen Verdau unter Verwendung einer Glycosidase oder eines Äquivalents davon, wobei das Verfahren aufweist: a) Blockieren des reduzierenden Endes des Saccharids; b) Exponieren eines weiteren reduzierenden Endes durch Inkubation des Saccharids mit einer Glykosidase oder eines Äquivalents davon; c) Markieren des weiteren reduzierenden Endes; d) optional Wiederholen der Schritte a) bis c) unter Verwendung unterschiedlicher Glykosidasen oder Äquivalente davon.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, bei welchem Daten gemäß dem Verfahren nach Anspruch 19 erfasst werden und die Daten in Kombination verwendet werden, um davon strukturelle Information über das Saccharid abzuleiten.
  21. Verfahren zur strukturellen Analyse eines Saccharids, aufweisend: a) Bereitstellen auf Kügelchen einer Mehrzahl von unterschiedlichen im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Bindungsmitteln mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten, wobei eine Anzahl der Mehrzahl von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Mitteln auf den Kügelchen immobilisiert sind; b) Inkontaktbringen der Kügelchen mit einem zu analysierenden Saccharid oder mit einer Mischung, aufweisend eine Mehrzahl von Fragmenten des Saccharids; c) Waschen oder anderweitiges Entfernen von ungebundenem Saccharid oder Saccharidfragmenten; d) Hinzufügen zu den in Schritt c) erhaltenen Kügelchen eines im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markers oder einer Mischung von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern; e) Erfassen von einem oder mehreren Bildern der Marker, welche an die Kügelchen gebunden sind; und f) Ableiten von Information bezüglich der Identität des zu analysierenden Saccharids von dem Bild.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Kügelchen eine Mehrzahl von Aliquots von Kügelchen aufweisen, wobei jedes Aliquot ein unterschiedliches erstes im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifisches Mittel trägt; und ferner dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (b) die Aliquots der Kügelchen separat in Kontakt mit dem Saccharid oder den Saccharidfragmenten gebracht werden.
  23. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der vorangehenden Ansprüche bei: a) der Entwicklung von therapeutisch aktiven Mitteln; b) dem Screening von therapeutisch aktiven Mitteln; c) Krankheitsdiagnose; d) Nahrungsmittel- und/oder Getränkeanalyse; oder e) der Analyse von genetisch modifizierten (GM) landwirtschaftlichen pflanzlichen Erzeugnissen und/oder den davon abgeleiteten Produkten.
  24. Fester Träger, aufweisend in einer vordefinierten Ordnung eine Mehrzahl von visuellen oder anderweitig detektierbaren Markern, welche repräsentativ für ein Saccharid oder eine Saccharidsequenz oder ein -fragment sind, wobei der feste Träger erhältlich ist durch: a) Bereitstellen auf einer Oberfläche eines Substrats einer Mehrzahl von unterschiedlichen im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Bindungsmitteln mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten, wobei eine Anzahl der Mehrzahl von den im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Mitteln auf der gleichen Fläche des Substrats immobilisiert ist; b) Inkontaktbringen der Fläche mit einem zu analysierenden Saccharid oder mit einer Mischung, aufweisend eine Mehrzahl von Fragmenten des Saccharids; c) Waschen oder anderweitiges Entfernen ungebundener Saccharide oder Saccharidfragmente; und d) Hinzufügen zu der im Schritt c) erhaltenen Oberfläche eines im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markers oder einer Mi schung von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern.
  25. Fester Träger nach Anspruch 24, wobei die vordefinierte Ordnung ermöglicht, ein Bindungsmuster zu detektieren, welches bestimmt wird durch eine Interaktion der detektierbaren Marker mit dem Saccharid oder der Saccharidsequenz oder dem -fragment.
  26. Fester Träger nach Anspruch 25, bei welchem das Bindungsmuster bestimmt wird durch eine Kombination von Bindung von immobilisierten Bindungsmitteln an das/die Saccharid oder Saccharidsequenz oder -fragment und Bindung der Marker an das/die Saccharid oder Saccharidsequenz oder -fragment.
  27. Verfahren zum Wählen eines Satzes von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern zur Verwendung bei dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, aufweisend die folgenden Schritte: a) Beschaffen der vollständigen oder teilweisen Monosaccharid-Zusammensetzung des zu analysierenden Saccharids; b) Wählen eines Satzes von n im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern, welche in der Lage sind, an die in dem Saccharid vorliegenden Monosaccharide zu binden; c) Revidieren des Satzes von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern, welche in Schritt b) erhalten wurden, um zu gewährleisten, dass keine zwei Marker in dem Satz die gleiche Farbe oder ein gleiches anderweitiges detektierbares Merkmal haben; d) Revidieren des Satzes von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern, welche in Schritt c) gewählt wurden, um die Kreuzreaktivität mit entweder den im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Bindungsmitteln oder mit anderen im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern zu reduzieren.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, bei welchem die Monosaccharid-Zusammensetzung des zu analysierenden Saccharids von der Monosaccharid-Zusammensetzung eines verwandten Saccharids abgeschätzt wird.
  29. Verfahren nach Anspruch 27, bei welchem die Monosaccharid-Zusammensetzung des zu analysierenden Saccharids erhalten wird durch Durchführen einer vollständigen Monosaccharid-Analyse des Saccharids.
  30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei n zwischen 1 und 4 ist.
  31. Software zum Auswählen eines Satzes von im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern zur Verwendung in dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, aufweisend: a) Input zum Bereitstellen der Monosaccharid-Zusammensetzung; b) Abgleich-Sub-Programm, um n im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifische Marker zum Abgleich zu bringen, welche in der Lage sind, an die in dem Saccharid vorhandenen Monosaccharide zu binden; c) Revisions-Sub-Programm zum Revidieren des Satzes an im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern, welche durch das Sub-Programm b) abgeglichen wurden, wobei das Sub-Programm in der Lage ist, die Marker auf Basis der reduzierten Kreuzreaktivität mit entweder den im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Bindungsmitteln oder mit anderen im Wesentlichen Sequenz- und/oder Stellen-spezifischen Markern auszuwählen; d) zweites Revisions-Sub-Programm, welches in der Lage ist, zu gewährleisten, dass keine zwei Marker in dem Satz die gleiche Farbe oder ein gleiches anderweitig detektierbares Merkmal haben.
  32. Verfahren zum mindestens teilweisen Bestimmen der Sequenz eines Saccharids, aufweisend: a) Bestimmen der Bindungsmuster einer Mehrzahl von unterschiedlichen immobilisierten Bindungsmitteln mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten für Saccharide oder Saccharidfragmente und des Bindens einer Mehrzahl von Markern an das Saccharid oder die Saccharidfragmente, wobei die Muster gemäß dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 bestimmt werden; und b) Erzeugen einer mindestens teilweisen Sequenzinformation durch Kombinieren der Bindungsmuster.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, außerdem aufweisend: c) Beschaffen eines Fingerabdrucks des Saccharids oder der Saccharidfragmente.
  34. Automatisiertes System für das mindestens teilweise Bestimmen der Sequenz eines Saccharids, aufweisend automatische Datenverarbeitung für: a) Bestimmen von Bindungsmustern einer Mehrzahl von immobilisierten Bindungsmitteln an das Saccharid oder die Saccharidfragmente und der Bindung einer Mehrzahl von Markern an das Saccharid oder die Saccharidfragmente, wobei die Muster bestimmt werden gemäß dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22; und b) Erzeugen einer mindestens teilweisen Sequenzinformation durch Kombinieren der Bindungsmuster.
  35. Automatisiertes System nach Anspruch 34, außerdem aufweisend automatische Datenverarbeitung für: c) Beschaffen eines Fingerabdrucks des Saccharids oder der Saccharidfragmente.
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