JP4462687B2 - 糖脂質に結合するペプチドの選別方法 - Google Patents
糖脂質に結合するペプチドの選別方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガングリオシドに対して結合性を示すアミノ酸配列を選別する方法に関する。更に本発明は、該方法によって得られるガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドに関する。
【０００２】
当該ペプチドはガングリオシドに特異的に結合するため、生体タンパク質及びウイルス等のガングリオシドへの結合を競合的に阻害することができる。このため、該ペプチドはそれ自身ガングリオシド−タンパク結合阻害剤として有用であるとともに、ガングリオシドとタンパクとの相互作用並びにタンパク結合を介したガングリオシドの機能メカニズムを解明するための研究ツールとして有用である。さらに、そのアミノ酸配列の解明により既知のＤＮＡやアミノ酸配列のデータベースを検索することにより、ガングリオシドによって活性制御をうけるタンパク質が推定でき、ガングリオシドの機能解析のための重要な糸口となり得る。また、特定のガングリオシドに結合するアミノ酸配列の解明により、標的細胞に薬理物質を運搬するドラッグデリバリーシステムのプローブとしての応用も期待される。本発明の方法は、かかる医学上有用なペプチド又は蛋白質を選択的に取得する方法として有用である。
【０００３】
【従来技術】
シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドは、細胞膜表面に存在して多様な細胞機能並びに生命現象に関与していることが知られている。特にガングリオシドは、糖鎖を認識するレクチンや種々の毒素、インフルエンザウイルスの受容体として働くほかに、細胞間相互作用や細胞の分化・増殖にも関与していることが分かっている。
【０００４】
このようなガングリオシドの機能はタンパク質によって制御されていることから、機能発現の過程で細胞内のタンパク質がガングリオシドの糖鎖部分等を認識して結合する段階が存在すると考えられるが、そのメカニズムの全容については未だ解明されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のことから、ガングリオシドに結合するタンパク質のアミノ酸配列がわかれば、タンパク質のガングリオシド認識機構の解明に極めて有用であり、これにより種々の疾患のメカニズムが解明され、その予防薬や治療薬の開発が期待できる。
【０００６】
本発明は、ガングリオシドの糖鎖部分を認識し結合するアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に選択し、取得する方法を提供することを目的とするものである。更に本発明は、かかる方法によって得られるガングリオシドに結合性を有するアミノ酸配列、特にガングリオシドＧM1に対して結合性を有するアミノ酸配列を提供することをも目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねていたところ、ガングリオシドに結合するアミノ酸配列を有するペプチドの選別に際してファージディスプレイ法を用い、更にこの方法においてペプチドと反応させる固定化ガングリオシドとしてガングリオシド単分子膜を用いることにより、ガングリオシドに結合するアミノ酸配列を有する所望のペプチドを特異的にセレクションできることを見いだした。
【０００８】
固定化ガングリオシドとして、上記ガングリオシド単分子膜に代えて、脂肪酸が一つ欠けたガングリオシドのリゾ体をビーズに結合させたもの、又はガングリオシドを疎水性膜にキャスティングして固定化させたものを使用すると、固定化させるガングリオシドの構造がコントロールできず、その結果、不規則なコンホメーションのガングリオシドの任意の部位に結合する種々のペプチドが選択されてしまうという欠点がある。
【０００９】
本発明の方法によれば、ガングリオシドを単分子膜状に固定化することにより全てのガングリオシド分子の構造を一定に保つことができ、その結果、ガングリオシドの特定部位（特に糖鎖部位）を特異的に認識して結合するペプチドが選択的に選別取得できることが確認された。また、またかかる方法によれば、より生理的な態様で結合ペプチド（タンパク）が選択できるため、得られるペプチド（タンパク）は、体内におけるガングリオシドの機能メカニズムを解明するツールとしてより好ましいものであると思われる。
【００１０】
本発明は、かかる知見に基づいて開発されたものである。
すなわち、本発明は、ファージディスプレイ法によってガングリオシドに結合するペプチドを選別する方法であって、ガングリオシド単分子膜を用いてパニングを行うことを特徴とする方法である。
【００１１】
さらに本発明は、上記方法によって取得し得るペプチドであり、具体的にはガングリオシドＧM1に結合することを特徴とする配列番号１〜３で示されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００１２】
なお、以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、ガングリオシドに結合するアミノ酸配列を有するペプチド若しくはタンパクの選別取得方法である。
【００１４】
以下、ガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドの選別方法ならびに該方法で得られるペプチドにつき詳述する。
【００１５】
本発明の方法には、分子ライブラリーのスクリーニング手法を採用でき、上記ライブラリーとしては、例えばファージディスプレイライブラリーを好ましく用いることができる。
【００１６】
かかるライブラリーとしては、市販のものを用いることができる。該ライブラリー中のランダムペプチドディスプレイファージは、標的とする分子又は細胞に特異的に結合するペプチドを同定するために、特定の標的分子又は目的の細胞を用いてインビトロでスクリーニングされ得る多数のペプチドを発現するのに利用される。該ファージディスプレイライブラリーを用いるスクリーニングは、ファージディスプレイ法と呼ばれ、従来から種々の細胞表面レセプターと特異的に結合するリガンドや種々の抗体を同定するために使用されている。これらファージディスプレイライブラリーの作成方法及びインビトロスクリーニング法については、スコット及びスミスらの方法が参照される(Scott, J. M. and Smith, G. P., Science, 249, 386-390 (1990); Smith, G. P. and Scott, J. K., Methodｓin Enzymology, 217, 228-257 (1993))。
【００１７】
本発明の方法は、上記ファージディスプレイ法によりガングリオシドに結合するペプチドをインビトロでスクリーニングする方法であり、具体的には以下の方法によって行うことができる。
【００１８】
すなわち、まず、公知のファージライブラリーにランダムなＤＮＡ配列を挿入して、ファージの外殻表面にランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを発現し得るように構築したランダムペプチドディスプレイファージを用いて、これを固定化したガングリオシドと反応させて、ガングリオシドと特異的に結合するファージを回収する（バイオパンイング）。得られたファージを大腸菌に感染させて大量培養し、分離、精製して、ガングリオシドと特異的に結合するペプチド発現ファージを得る。かくして得られたファージは、再び上記と同様に、固定化ガングリオシドと反応させてガングリオシドと特異的に結合するファージをスクリーニングするパニング（panning）操作を行う。かかるパニング操作を数回、好ましくは４〜６回程度繰り返すことによりガングリオシドと特異的に結合するペプチドを発現し得るファージを選別し、濃縮することができる。
【００１９】
次いで、選択されたファージからＤＮＡを抽出しその配列を決定することにより、ファージが発現するペプチド、すなわちガングリオシドと特異的に結合するペプチドを同定することができる。
【００２０】
上記ＤＮＡの配列決定は、当業界で公知の方法により容易に行うことができ、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463-5467 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Method in Enzymology, 65, 499 (1980)〕等を挙げることができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いても容易に行うことができる。
【００２１】
上記ファージディスプレイ法において用いられるファージライブラリーは、通常この方法で用いられる公知のファージライブラリーのいずれであってもよいが、例えば実施例に掲げるような繊維状ファージであって、ファージのコートタンパク質ｐIII遺伝子にランダムなＤＮＡが挿入されて、ファージ外殻表面にランダムな１５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドが発現し得るように構築されたランダムペプチドディスプレイファージを好適に例示することができる。
【００２２】
また本発明が対象とするガングリオシドは、ガングリオシドと総称されるものであればよく特に限定されないが、通常ヒト又は動物の生体に存在するガングリオシドを挙げることができる。よく知られているガングリオシドとして、Svennerholmの命名法に従えば、ＧM4、ＧM3、ＧM2、ＧM1、ＧM1b、ＧD3、ＧD1a、ＧD2、ＧD1b、ＧT1a、ＧT1b、ＧQ1b、ＧG1c、ＧP1c、ＧD1a-GalNAc、ＧD1b-Fucを挙げることができる。尚、ここでＧM1及びＧM1bは、正式にはそれぞれＧM1a及びＧM1と命名されるものであるが、本発明においては常法に従ってＧM1及びＧM1bとして表記する（「脳機能とガングリオシド」、安藤進、共立出版(1997）、 第16-17頁）。
【００２３】
本発明の方法は、上記ファージディスプレイ法におけるパニング（panning）をガングリオシドの単分子膜を用いて行うこと、すなわち固定化ガングリオシドとしてガングリオシド単分子膜を用いることを特徴とする。
【００２４】
実施例に記載するように、発明者らは固定化ガングリオシドとして、疎水性膜であるポリビニルイリデンジフルオライド膜（ＰＶＤＦ膜）にガングリオシドをキャストしたもの、並びにガングリオシドを単分子膜状に形成したものの二種類を用いてパニングを行ったところ、前者の方法で得られたファージからは一定の規則性はあるものの互いに相同性のない多種多様のアミノ酸配列を有する３１種類のペプチドが得られたのに対し、後者の方法で得られたファージから発現されるペプチドはいずれも相同性が高く、わずか３種類に分類することができた。更に、得られたファージについて、ガングリオシド全てが一定の分子構造に並列してなるガングリオシド単分子膜に対する結合性を評価したところ、パニング前のランダムなファージライブラリーでは殆ど結合しないのに対して、後者の方法で得られたファージはかかる単分子膜に有意に結合することが観察された。
【００２５】
これらのことは、ファージディスプレイ法において、固定化ガングリオシドとしてガングリオシドの単分子膜を用いてパニングすると、ガングリオシドの特定部位、好ましくは糖鎖部位を特異的に認識して結合する所望のペプチドが選択的に取得できることを示す。
【００２６】
ガングリオシドの単分子膜は、上記に記載するいずれかのガングリオシドを用いて、例えば、佐藤智典ら、”Quantitative measurement of the interaction between ganglioside monolayers and wheat germ agglutinin (WGA) by a quartz-crystal microbalance” Biochim. Biophys. Acta, 1138, 82-92 (1998) または佐藤智典ら、”Binding o Influenza Virus to Monosialoganglioside (GM3) Reconstituted in Glucosylceramide and Sphingomyelin Membranes” Biochim. Biophys. Acta, 1285, 14-20 (1996) に記載される方法に従って調製することができる。具体的には、後述する実施例において記載する方法を挙げることができるが、これに限定されない。
【００２７】
パニングは、上記のようにして水面にガングリオシドの単分子膜が形成された水槽に、選択されるべきファージを添加して一定時間放置し、単分子膜にファージを結合させることなどによって行うことができる。詳細には後述する実施例において記載する。放置時間（反応時間）は、単分子膜とファージとが反応して結合する時間であればよいが、好ましくは結合が飽和に達する時間である。
【００２８】
ガングリオシド単分子膜の下層水は、特に制限されないが、好ましくは中性域に緩衝能を有する緩衝液であり、例えばｐＨ７〜７．５のＴＢＳを挙げることができる。
【００２９】
かかるパニング工程において、ガングリオシド単分子膜にファージ粒子が結合していく過程を経時的にモニタリングすることもできる。かかるモニタリングによれば、ファージ粒子のガングリオシド単分子膜に対する結合性並びに結合挙動を検出することができ、これにより所望のペプチドを発現するファージの選別をより有利に簡便に行うことができ、更に得られた所望のファージの評価に有用である。更に、かかるモニタリングによってパニングの為の反応時間を決定することもできる。
【００３０】
モニタリング方法としては、マイクロバランスとして知られる水晶発振子を用いる方法を例示することができる。これは、ファージの結合に応じて生じる水晶発振子金電極表面の重量変化を周波数の変化として検出するというものである。具体的には、例えば上記文献（Biochim. Biophys. Acta, 1138, 82-92 (1998)、Biochim. Biophys. Acta, 1285, 14-20 (1996)）に記載されるように、ＴＢＳを下層水としてトラフに作製した単分子膜の表面に発振子電極表面を水平付着させ、発振させて、安定したところでファージライブラリー溶液を加え、ファージの結合に応じた発振子の振動数を計測し、モニタリングする方法を挙げることができる。
【００３１】
本発明の方法の一例として、ガングリオシドとしてＧM1を用いてそれに特異的に結合するアミノ酸配列を有するペプチドを選択し、同定する方法を後記実施例に記載する。
【００３２】
かかる方法によって選別され、同定されたペプチドは、配列番号１から３に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するものであり、これらはいずれもガングリオシドＧM1、特にその糖鎖部位に結合性を有することにより特徴づけられる。実施例において示すように、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド１は、ガングリオシドの主にシアル酸と相互作用していると考えられ、また配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド３はガングリオシドのシアル酸と末端Ｇａｌと相互作用していると考えられる。また、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド２は、どのＧＳＬ（glycosphingolipids）にもある程度の結合を示すもののGlcCerとは全く結合しないことから、上記ペプチド１及びペプチド３とは異なる結合様式を有するものと考えられる。
【００３３】
本発明のペプチドには、上記配列番号１から３に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドの他に、該アミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つガングリオシド、特にガングリオシドＧM1に結合性を有するペプチド並びに蛋白質が包含される。
【００３４】
ここで、アミノ酸の「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチド若しくは蛋白質が、配列番号１から３で示されるアミノ酸配列のいずれかからなるペプチドと同様にガングリオシド、特にＧM1に対して結合性を有する同効物であれば特に制限されない。アミノ酸配列の改変（変異）は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変ペプチドを包含する。
【００３５】
本発明のガングリオシド結合性ペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明のペプチドの合成は、そのいずれによることもできる。
【００３６】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ(ジフェニルホスホリルアジド)法、ＤＣＣ＋添加物(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、N−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド等)、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えば ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００３７】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばTyrの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばArgのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。
【００３８】
かくして得られる本発明のガングリオシド結合性ポリペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００３９】
本発明の方法によって、選別され同定されるペプチド（タンパク質）は、ガングリオシドを特異的に認識して結合するアミノ酸配列を有するものであり、それ自身、in vivoにおいて、ガングリオシドを認識するタンパク質やウイルス等の結合を競合的に妨げることのできる、すなわちガングリオシド結合阻害剤として用いることができる。当該ガングリオシド結合阻害剤によれば、ガングリオシドと蛋白質との結合若しくは相互作用を介して生じる、種々の細胞機能や生命現象を解明するのためのツールとしての応用、またはタンパク質やウイルス等がガングリオシドに作用して生じる種々の疾患の予防・治療薬としての応用、アフィニティカラムとしての利用が期待される。また、同定されたガングリオシド結合性ペプチドのアミノ酸配列をデータベース検索にかけることにより、公知のヒト又は動物のタンパク質の中で従来知られていなかった糖脂質結合活性部位を見いだせるものと期待される。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ ガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドの選別及びその同定
（１）ファージディスプレイライブラリーの調製
西、佐谷らの報告（Nishi T., Satani H., et al., FEBS Lett, 399, 237-240 (1996)）に従ってファージディスプレイライブラリーを作成した（２．５×１０8クローン）。該ファージディスプレイライブラリーは図１に示すように、具体的にはＮＮＫ（ＮはＡ,Ｃ,Ｇ,Ｔのいずれかを示し、ＫはＧ又はＴを示す。）が１５回繰り返された配列を含むＤＮＡが遺伝子工学的に挿入された繊維状ファージｆｄであって、更に外殻タンパク質ｐIII遺伝子のＮ末端部分に１５残基のランダムなアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡが挿入されてファージ外殻表面にランダムな１５残基のアミノ酸配列を有するペプチドが発現できるように構築されている。上記のファージディスプレイライブラリーは、スコットら(Scott,J.K. and Smith, G.P., Science, 249, 386-390 (1990))により報告されている特徴を有している。
【００４１】
（２）ガングリオシド結合性ペプチドの選択
（ｉ）ガングリオシドの固定化
ガングリオシドの固定化するための方法としては、脂肪酸が一つ欠けたリゾ体ガングリオシドをビーズに結合させる方法及びガングリオシドをＰＶＤＦ膜のような疎水性膜にキャストする方法が挙げられる（図２、Ｉ)及びII)参照）。しかしながら、このような方法では、ガングリオシドの構造がコントロールできず、不規則なコンフォメーションのガングリオシドに対してペプチドをセレクションしてしまうおそれがある。
【００４２】
このため、本発明ではガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドのセレクション方法として、水面にガングリオシドからなる単分子膜を形成させ、該単分子膜に対して上記ファージを反応させる方法を採用した（図２、III)）。
【００４３】
なお、当該実施例においては、ガングリオシドの例としてガングリオシド系列でシアル酸を一つ含む糖脂質ＧM1を用いて、これに結合するアミノ酸配列を有するペプチドをセレクションした。なお、ＧM1はコレラトキシンの受容体として知られており、図３に示すように、GlcCerにガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトース、ガラクトースがつながった骨格にシアル酸が１つ結合している構造を有している。
【００４４】
（ii）ＧM1単分子膜の作製
ＧM1単分子膜をＴＢＳ（ｐＨ７．５）を下層水として、トラフ（ラングミュアー型トラフFSD-110、USI社製）を用いて作製した（Biochim. Biophys. Acta, 1138, 82-92 (1998) またはBiochim. Biophys. Acta, 1285, 14-20 (1996)参照）。
【００４５】
具体的には、ガングリオシドＧM1のクロロホルム−エタノール（4:1 v/v）溶液を所定量、マイクロシリンジを用いて水面上に展開し、乾燥させた。なお、下層水の温度は、水循環式恒温槽ＣＣＭ−２（池田理化社製）で２０℃に制御した。１０分以上乾燥させた後、１０００mm2/minのバリアー速度で脂質単分子膜を圧縮した。なお、単分子膜の累積は、単分子膜が表面圧３０ｍＮ／ｍに保持されるようにした。ついで該値に表面圧を保持した脂質単分子膜上に、超純水で十分に洗浄した水晶発振子（９ＭＨｚ：Φ13.5mm、住友ベークライト社製）の金電極表面をリフトコントローラーを用いて水平に押さえつけるように付着させて、該水晶発振子に脂質単分子膜を移し、それを空気に曝されないようにしながら、バイオパニング用のウエルに移した。空気の暴露を避けるのは、脂質単分子膜は気相に曝されると剥離乃至は脂質分子の反転が起こる可能性があるためである。
【００４６】
（iii）ＧM1単分子膜に対するパニング（panning）（図４参照）
ＧM1単分子膜へのファージの結合過程をモニタリングするためにマイクロバランスとして知られる水晶発振子を用いた。これは単分子膜にファージが結合することによって生じる水晶発振子の金電極表面の重量変化を周波数変化として検知するものである。
【００４７】
上記と同様にして単分子膜を９ＭＨｚ発振子電極表面に水平付着し、１ｍＬ ＴＢＳ中で発振させ、安定したところで、ファージライブラリー溶液１０μＬ（5.5×１０10ＴＵ、2.5×１０8クローン）を加えた。１５分後、結合が飽和に達したことを確認して水晶発振子を引き上げた。
【００４８】
なお、単分子膜へのファージの結合過程は、発振子の振動数の変化をSC-7201 UNIVERSAL COUNTER（岩崎通信機社製）で計測し、コンピューターに取り込んでモニタリングすることによって追跡した
発振子の金電極をＴＢＳ５０μＬで３回洗浄した後、elution buffer（Glycine,HCl. pH2.2）２０μＬで１５分間室温に放置してファージを溶出させた（ＧM1単分子膜結合ファージ、ＧM1−ｎ）。溶出液を遠心濃縮用チューブに移し、７．５μＬ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和し、その後ＴＢＳを加えて総容量２ｍＬにメスアップした。チューブを遠心し（５０００ｒｐｍ、２０分間）、再び約２ｍＬのＴＢＳを加え、再度遠心（５０００ｒｐｍ、２０分間）することによりbuffer交換とファージ溶液の濃縮を同時に行った。
【００４９】
得られたファージ溶液に調製済みＫ９１−Ｋａｎ溶液１００μＬを加え、１５分間室温で感染させた。１５分後、あらかじめ３７℃で保温しておいた、０．２μｇ／ｍｌテトラサイクリン（シグマ社製：以下ＴＣという）を含むＮＺＹ培地２０ｍＬにこの感染溶液を加えて、３７℃で４０分間振盪培養した。
【００５０】
４０分後、ＴＣのストック溶液（20mg/mL）２０μＬを加え（終濃度２０μｇ／ｍＬ）、３７℃で一晩振盪培養した。得られた培養液を３０００rpmで１０分間遠心して大腸菌を除去した。上清を再度１２０００rpmで１０分間遠心して更に大腸菌を除去した。上清にＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液３ｍＬ（0.15 v/v）を加え、１００回穏やかに攪拌した後、４時間以上４℃で静置した。１２０００rpmで１０分間遠心して上清を除去し、沈殿したファージペレットに１ｍＬ ＴＢＳを加えて完全に溶解した。得られたファージ溶液を１．５ｍＬ容Ｅｐチューブに移し、１５０００rpmで１０分間遠心して不溶物を除去した。この中に再びＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液１５０μＬを加え、数回穏やかに攪拌した後、１時間以上４℃で静置した。１５０００rpmで１０分間遠心してペレットを回収し、０．０２％ ＮａＮ3／ＴＢＳ（２００μＬ）に溶解した。１５０００rpmで１０分間遠心して、不溶物を除去し、上清のファージ溶液（２００μＬ）を０．６ｍＬ容Ｅｐチューブに移した。こうして得られたファージ溶液の半分を次のパニングに、また２μＬをtiteringに使用し、残りを保存した。
【００５１】
上記パニング操作によって得られた結果を図５及び表１に示す。
【００５２】
図５は、１〜５回のそれぞれのパニング操作におけるＧM1単分子膜へのファージ粒子の結合挙動を示す図である。横軸がパニング時間（反応時間）で縦軸が重量変化、すなわちファージ粒子の単分子膜への結合を示す。縦軸の△Ｆ／Ｈｚ値が低くなるほど、ファージ粒子が単分子膜に結合していることを示す。結果から分かるように１回目のラウンドは殆ど結合しなかったが、ラウンドが進むにつれて、ファージの結合量と初期結合速度が増加し、このことからパニングがうまく進行していることが確認できた。
【００５３】
表１は、１〜５回目のパニングによって得られたファージの回収率を示すものである。表に示されるように用いたファージ数に対する単分子膜に結合したファージ数の比（Yield）を％で示したファージ回収率は、パニングの回数を重ねる度に４回目の０．０４３％（１回目に比して１１０倍の濃縮）を最高に上昇した。なお、５回目で回収率が低下したのはファージが単分子膜に覆い尽くされ、それ以上結合できなかったためであり、回収されたファージの絶対量は増加していた。
【００５４】
【表１】
【００５５】
このことから、上記の方法により、ガングリオシドＧM1に特異的に結合するペプチドを発現しているファージが回収されていることが確認された。
（３）ガングリオシドＧM1結合性アミノ酸配列の配列決定
上記（２）で得られたファージ（１８クローン）から、発現しているペプチドのアミノ酸配列決定を以下のとおり行った。
【００５６】
即ち、５回目のパニングの後のタイター測定で得られたプレート上のコロニーをそれぞれ５０コロニーずつ、無作為に拾い上げ、新しいＮＺＹプレートに、植菌し直し、一晩３７℃にて培養し、これをマスタープレートとして４℃で保存した。マスタープレートのコロニーを各々２０ｍＬのＮＺＹ培地（２０μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有）の入った５０ｍＬ遠心チューブに懸濁し、３７℃で一晩２００ｒｐｍ／分で振盪培養した。ついで３０００ｒｐｍ／分、１０分間遠心分離を行った後、上清をオーク・リッジ遠心チューブに移し、１２０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し、大腸菌を除菌した。更に上清をオーク・リッジ遠心チューブに移し、３ｍＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００：ナカライテスク社製）／ＮａＣｌを加え、よく撹拌した後、４℃に４時間静置した。１２０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し、ファージを沈殿させた。ついで上清を除去し、沈殿したファージを１ｍＬのＴＢＳ（トリス緩衝塩溶液）に懸濁させた。１．５ｍＬのエッペンドルフ・チューブに移し、１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し、不溶性物質を除去後、上清を別のエッペンドルフ・チューブに移し、１５０μＬのポリエチレングリコール／ＮａＣｌを加え、よく撹拌した後、４℃に１時間静置した。次いで１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し、ファージを再沈殿させた。ついで上清を除去し、沈殿したファージを２００μｌのＴＢＳで再度懸濁した。１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し、不溶性物質を沈殿させた後、該沈澱物を０．５ｍｌのエッペンドルフ・チューブに移し、ファージクローンを４℃で保存した。
【００５７】
上記で得られたファージクローンからのＤＮＡの抽出は、１．５ｍＬのエッペンドルフ・チューブにファージクローン１００μｌに対してＴＢＳ１００μｌ及びＴＥ飽和フェノール（ニッポジーン社製）２００μｌを加えて、１０分間激しく撹拌後、１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離した。次いで、上清（水相）２００μｌに対してＴＥ飽和フェノール２００μｌ及びクロロホルム２００μｌを加えて、前記同様１０分間激しく撹拌後、１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離した。更に、上清（水相）１５０μｌに対してＴＥ２５０μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム４０μｌ、２０ｍｇ／ｍＬグリコ−ゲン（ベーリンガー・マインハイム社製）１μｌ及びエタノール１ｍＬを加えて、１．５ｍＬのエッペンドルフ・チューブにて−２０℃で、一時間放置した後、１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離した。上清を取り除き、１ｍＬの８０％エタノール（−２０℃）を緩やかに加えて、１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し残存する塩を除いた。上清を除去後、チューブ内の水分を蒸発させ、沈殿しているＤＮＡを１０μｌの滅菌蒸留水に溶解し、４℃にて保存した。かくして得られた個々のファージＤＮＡをペプチドの配列決定のために使用した。
【００５８】
ファージＤＮＡによりコードされるペプチドの配列決定は、ジデオキシ法（Proc.Natl.Acad.Sci., USA., 74, 5463-5467(1977)）により、アマシャム社のＴＨＥＲＭＯ配列キット（Amersham Life Sciene, Code; US79765, Lot番号; 201503）を用いて機器の使用説明書に従い実施した。ＤＮＡの伸長反応は、９６℃、３０秒、４５℃、１５秒、６０℃、４分を１サイクルとして、３０サイクル行い、ＤＮＡの配列は、ＡＢＩ社製のＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ３７７ＤＮＡシーケンサー）を用いて行った。
【００５９】
その結果、５回のパニングによって得られたファージ１８クローンはいずれも配列番号１〜３に示すアミノ酸配列を有する３種類のペプチドのいずれかを発現していた。特に配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチド（ペプチド１）を発現するファージは１３クローンと一番数が多く、全体の７２％の割合を占めていた（ファージ１）。配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチド（ペプチド２）を発現するファージは４クローンと全体の２２％で（ファージ２）、また配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチド（ペプチド３）を発現するファージは１クローンであった（ファージ３）（図６参照）。
【００６０】
（４）ＧM1結合性ペプチドのハイドロパシー
上記でアミノ酸配列が決定されたファージ１〜３についてhydropathyを調べた（Eisenberg,D.,Tweiss,R.M.,Terwilliger,T.C.,Wilcox,W.,Faraday Symp.Chem.Soc.,17,109-120 (1982)）。ファージ１及び２についての結果をそれぞれ図７（Ａ）及び図７（Ｂ）に示す。図中、横軸はアミノ酸残基番号を示し、縦軸は疎水性度を示す。
【００６１】
図７から分かるように、一番クローン数が多かったファージ１ではＮ端側の３〜４残基並びにＣ端側の１３残基にカチオンを持つＡｒｇが見られた。これらＡｒｇは、糖の糖水酸基と２価で水素結合しているか、シアル酸のカルボキシル基と２価で水素結合しているか、シアル酸のカルボキシル基と静電結合している可能性が考えられた。また、その間に挟まれるように、turn構造（折り返し構造）を取りやすいＰｒｏ−Ｇｌｙ配列が見られたことから、糖鎖部分をＡｒｇで挟み込んで糖と相互作用している可能性が推測された。また、図には示さないが、ファージ３のhydropathyパターンはこのファージ１のパターンとよく似ていた。ファージでは、中央付近にＬｙｓ、Ａｒｇのカチオンをもつ３つの塩基性アミノ酸が見られた。
【００６２】
（５）ＧM1結合性ペプチド発現ファージの膜への選択性
５回のパニングによって得られたファージが本当にセレクションされた所望のファージであるかを調べるために、下記の実験を行った。
（ｉ）ＧM1単分子膜に対するファージ１の結合挙動
パニングする前のランダムなファージライブラリー及びパニング後のファージ１を用いて、ＧM1単分子膜に対する結合挙動を調べた。結合挙動のモニタリングは、ファージディスプレイ法におけるパニング時のモニタリングと同様に、水晶発振子を用いて行った。
【００６３】
結果を図８（Ａ）に示す。図から分かるように、パニング前のランダムなライブラリーでは殆どＧM1単分子膜と結合しなかったが、パニング後に単離したファージ１では１４Ｈｚ程度の結合が観察された。
【００６４】
（ii）脂質混合単分子膜に対するファージ１の結合挙動
パニングする前のランダムなファージライブラリー及びパニング後のファージ１を用いて、脂質混合単分子膜（PC/PE/PS/SM(モル比、20:20:10:15)）に対する結合挙動を調べた。結果を図８（Ｂ）に示す。図から分かるように、パニング前のランダムなライブラリーでは脂質混合単分子膜と結合するが、パニング後に単離したファージ１では結合しなかった。
【００６５】
この実験の結果から、ファージディスプレイ法において固定化ガングリオシドとしてＧM1単分子膜を用いて該膜に対してパニングすることにより、ＧM1単分子膜、すなわちガングリオシドの特定部位に特異的に結合性を示すアミノ酸配列を有するペプチドを発現するファージが選別取得できることが確認された。
【００６６】
実施例２ コレラトキシン−ＧM1結合阻害試験
実施例１で得られたガングリオシドＧM1単分子膜に特異的結合性を示すアミノ酸配列を有するペプチド１、２及び３（配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するペプチド）を常法の化学合成法に従って製造し、これらのペプチドのＧM1単分子膜への結合能を、コレラトキシンとＧM1単分子膜の結合への阻害活性により試験した。具体的には、ＧM1単分子膜を３０ｍＮ／ｍでセルデスクに写し取り、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ（０.５ｍＬ）の入った２４ウエルに移して、４℃で一夜、ブロッキングを行った。ＴＢＳ（０.５ｍＬ）で３回洗浄した後、これにＨＲＰ標識コレラトキシンＢサブユニット（２００μＬの０.５％ＢＳＡ／ＴＢＳで５０００倍希釈：C-4672、シグマ社）と合成ペプチド（１０-7〜１０-3Ｍ）を加え、４℃で一夜インキュベートした。これをＴＢＳ（０.５ｍＬ）で３回洗浄した後、基質溶液（ｏ−フェニレンジアミン）を０.５ｍＬ加え、１０〜１５分発色させて、３Ｎ Ｈ2ＳＯ4（１００μＬ）を加えて反応を停止し、２００μＬを９６ウエルに移して４９２ｎｍにおける吸光度を検出した。
【００６７】
なお、対照ペプチドとしてコレステロール結合性ペプチド（ＡＲＥＹＧＴＲＦＳＬＴＧＧＹＲ）を用いて同様に試験を行った。上記各試験はそれぞれ３回ずつ実施した。
【００６８】
上記の試験からＩＣ50（コレラトキシンの結合を５０％阻害するペプチド濃度：平均値）を求めた結果を表２に示す。
【００６９】
【表２】
【００７０】
この結果から、ペプチド１、２及び３はＧＭ１に結合し、コレラトキシンの結合を阻害できることが示され、特にペプチド３は１μＭという低濃度で阻害活性を有していることが確認できた。
【００７１】
実施例３ 各種糖脂質単分子膜に対する選択性
前記合成ペプチド（ペプチド１〜３）の各種糖脂質単分子膜に対する結合性選択性を、前記したパニング時のモニタリングと同様にして、水晶発振子（ＱＣＭ；２７ＭＨｚ）を用いて試験した。糖脂質として、ＧM1，ＧM2，ＧM3，asＧM1，ＧDla及びGlcCerを用い、合成ペプチドのこれら糖脂質単分子膜への結合の見かけ上の飽和結合量（△ｍmax）と解離定数（Kd）を求めた。
【００７２】
具体的には、２７ＭＨｚ水晶発振子の電極表面に糖脂質単分子膜を吸着させ、測定用セルに移動した。２０℃で発振が安定になるのを確認した後、ペプチド溶液（３〜１０μｌ、０.１〜１０ｍＭ、ＴＢＳ中）をインジェクトし、結合が平衡に達した後、更にペプチド溶液を打ち込むことでセル内の濃度を変化させ、振動数変化量を測定した（図９）。セル内のペプチド終濃度は、０.１〜４０μＭの範囲内で行った。同じ操作を２〜６回程度繰り返し、それぞれの濃度における結合量の平均（△ｍ）と標準偏差を求めた。各ペプチドの結合量をペプチド濃度に対してプロットし、結合曲線を描いた。これを図１０に示す逆数プロットから解離定数（Kd）と飽和結合量（△ｍmax）を求めた。
【００７３】
[peptide]0／△ｍ＝（[peptide]0／△ｍmax）＋（Kd／△ｍmax）
その結果、ペプチド３はＧM1＞ＧDla＝ＧM3＝asＧM1＞ＧM2＞GlcCerの順で結合した。このようにシアル酸と末端Ｇａｌが存在すると結合することから、このペプチドはシアル酸と末端Ｇａｌと相互作用していると考えられる。ペプチド１は、ＧM3＞ＧDla＞ＧM2＞＞ＧM1＞asＧM1＞GlcCerの順で結合した。このことから、このペプチドは主に非還元末端のシアル酸と相互作用していると考えられる。ペプチド２はＧM1≧ＧDla≧asＧM1＝ＧM2≧ＧM3の順で結合し、GlcCerには全く結合しなかった。このことから、ペプチド２は結合量は低いものの、どのＧＳＬ（glycosphingolipids）にもある程度の結合を示し、このことからペプチド１及びペプチド３とは異なる結合様式で結合するものと考えられる。
【００７４】
実施例４ 変異ペプチドのＧM1単分子膜への結合能
配列番号１及び３のアミノ酸配列においてはモチーフが認められる。このため、このモチーフが糖脂質単分子膜との結合にどのように寄与しているかを検討した。具体的には、モチーフ部分（ｘｘＰｘＬＰｘｘＦｘｘｘＲｘＰ）の各Ｒ、Ｆ及びＰをそれぞれＥ、Ｖ及びＡに置換したものを含む次の変異体ペプチドを常法に従って合成して、これらペプチドのＧM1単分子膜への結合能を実施例２で行ったコレラトキシン−ＧＭ１結合阻害試験に従って試験した。
＜変異ペプチド＞
下記に示すアミノ酸配列のうち下線部が変異部である。
【００７５】
ペプチド１／Ｒ→Ｅ置換 ：ＤＦＥＲＬＰＧＡＦＷＱＬＥＱＰ
ペプチド１／Ｐ→Ａ置換 ：ＤＦＲＲＬＡＧＡＦＷＱＬＲＱＡ
ペプチド１／Ｆ→Ｖ置換 ：ＤＦＲＲＬＰＧＡＶＷＱＬＲＱＰ
ペプチド３／Ｒ→Ｅ置換 ：ＶＷＥＬＬＡＰＰＦＳＮＥＬＬＰ
ペプチド３／Ｐ→Ａ置換 ：ＶＷＲＬＬＡＡＡＦＳＮＲＬＬＡ
ペプチド３／Ｆ→Ｖ置換 ：ＶＷＲＬＬＡＰＰＶＳＮＲＬＬＰ
ペプチド３／ＲＦ→ＥＧ置換：ＶＷＥＬＬＡＰＰＧＳＮＲＬＬＰ
ペプチド３／ＷＲ→ＧＥ置換：ＶＧＲＬＬＡＰＰＦＳＮＥＬＬＰ
ペプチド３／ＷＦ→ＧＧ置換：ＶＧＲＬＬＡＰＰＧＳＮＲＬＬＰ。
【００７６】
なお、上記各ペプチドの変異は、シアル酸と静電相互作用すると予想されるＲ（Arg、＋）をＥ（Glu、−）に変え、末端Galとのスタッキングが予想されるＦ（Phe）を同じ疎水性のＶ（Val）に変え、ペプチドをターン構造にさせると予想されるＰ（Pro）をヘリックスを取り扱い易いＡ（Ala）に変えるものであり、このモチーフがＧM1との結合に重要な役割を果たしているとすれば、これらの変異体ペプチドによればＧM1単分子膜への結合能が低下すると予想される。
【００７７】
かかる予想のもと、上記各変異体ペプチドについて、ＧＭ１単分子膜への結合能を試験した結果、ペプチド３の変異体ペプチドに関して「ペプチド３／Ｐ→Ａ置換」のＩＣ50はペプチド３のそれと変わらず略同等の結合能が認められ、また、「ペプチド３／Ｒ→Ｅ置換」においては全く阻害がかからず結合能のないものと考えられた。ペプチド１の変異体ペプチドに関しては、「ペプチド１／Ｒ→Ｅ置換」は全く阻害がかからず結合能が認められなかったが、「ペプチド１／Ｆ→Ｖ置換」及び「ペプチド１／Ｐ→Ａ置換」については阻害能の上昇、すなわち結合能の上昇が認められた。また、「ペプチド３／ＲＦ→ＥＧ置換」では阻害能が低下し、「ペプチド３／ＷＲ→ＧＥ置換」や「ペプチド３／ＷＦ→ＧＧ置換」では有意な阻害活性が認められなかった。
【００７８】
これらの結果から、２番目のＷと１２番目のＲ（Ｗ2−Ｒ12）及び３番目のＲと９番目のＦ（Ｒ3−Ｆ9）のアミノ酸は、対で、ＧＭ１と相互作用しており、（Ｗ2−Ｒ12）の対が（Ｒ3−Ｆ9）の対に比べて高いＧＭ１結合性を有しているものと考えられる。
【００７９】
比較例 ガングリオシドをキャストさせたＰＶＤＦ膜を用いた、ガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドの選別
パニングに用いる固定化ガングリオシドとして、上記ガングリオシド単分子膜に代えて、ガングリオシドをＰＶＤＦ（ポリビニルイリデンジフルオライド）膜のキャストして固定化させたものを用いてファージディスプレイ法を行い、ガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドを選別した。かかる選別方法の概略を図１１に示す。
【００８０】
具体的には、実施例１で用いたのと同じファージライブラリー（１０10〜１０11ＴＵ、２．５×１０8クローン、ＴＢＳ）をまずＰＶＤＦ膜に反応させて上澄みをとって、ＰＶＤＦ膜と非特異的に結合するものを除いた。次いで該上澄みを、同様にしてリン脂質混合物をキャストさせたＰＶＤＦ膜と反応させて上澄みをとって、リン脂質混合物と非特異的に結合するものを除いた。このsubtructionした上澄みに含まれるファージについて、ガングリオシドＧM1をキャストしたＰＶＤＦ膜と反応させた（室温、１時間）。
【００８１】
反応後、ＴＢＳで膜を洗浄して膜に結合していないファージを除去し、次いでｐＨ２の溶出緩衝液で膜に結合しているファージを回収した。得られたファージは、実施例１の方法と同様にして大腸菌に感染させ、増殖させて次のラウンドに使用した。また、溶出されたファージは回収率を求め、パニング操作がうまくできているかを評価した。
【００８２】
かかるサイクルを４回行った後、ファージクローン（３１クローン）を単離して、実施例１と同様にしてランダムペプチド相当部分のＤＮＡの塩基配列を解析することにより、ＧM1キャスティングＰＶＤＦ膜に結合性を示したペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【００８３】
ＧM1キャスト膜に対してパニングした結果を表３に示す。
【００８４】
【表３】
【００８５】
ファージ回収率をラウンドに対して対数でプロットした図が図１２である。この図から分かるように、ラウンドが進むにつれて回収率が増加し、目的のファージが濃縮されるのが分かる。
【００８６】
３１クローンのランダムペプチド部分のアミノ酸配列の結果を図１３に示す。Ａｒｇをもとに分類すると、Ａｒｇが隣接して見られるモチーフＡ、Ａｒｇが少し離れて見られるモチーフＢ、Ａｒｇを一つ含むモチーフＣ、Ａｒｇを含まないモチーフＤに分けられた。しかしながら、このキャスト膜を用いて得られた結果では、アミノ酸配列の相同性が認められなかった。
【００８７】
【発明の効果】
本発明によれば、ガングリオシド、特にその糖鎖部位に結合するアミノ酸配列を有するペプチド又は蛋白質を特異的に選別し、同定する方法を提供することができる。かかる方法によって得られたペプチド又は蛋白質は、ガングリオシドに特異的に結合することから、ペプチド又は蛋白質を介して機能するガングリオシドの作用メカニズムを解明する研究ツールとして有用である。また、ガングリオシドが結合するアミノ酸配列が明らかになることにより、既知のＤＮＡやアミノ酸配列のデーターベースを検索することでガングリオシドによって活性制御をうける生体蛋白質を推定することができ、これはガングリオシドの機能の解析に重要な糸口とあるものと思われる。
【００８８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で用いた、ランダム１５アミノ酸を融合したｐIIIコートタンパク質を有するファージの概略を示す図である。
【図２】ガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドのセレクションのためのファージディスプレイ法に用いられる各種パニング法を示す図である。図中Ｉ）は、固定化ガングリオシドとしてビーズにリゾ−ガングリオシドを化学的に結合させたものを用いてファージとパニングする方法、II)はＰＶＤＦ等の疎水性膜にガングリオシドをキャストし固定化してファージとパニングする方法、及びIII）はガングリオシドを単分子膜状に整列させて固定化してファージとパニングする方法を示す。
【図３】ガングリオシドＧM1の構造を示す図である。
【図４】実施例１において行った、ＧM1単分子膜に結合するペプチドを発現するファージを選択するためのバイオパニングの方法を概略した図である。なお、図中、ＱＣＭは水晶発振子（Quartz-Crystal Microbalance）を示す。
【図５】実施例１において、１〜５回のそれぞれのパニング操作におけるＧM1単分子膜へのファージ粒子の結合挙動を示す図である。横軸にパニング時間（反応時間）、及び縦軸に金電極表面の重量変化（周波数変化）を示す。
【図６】ガングリオシドＧM1に結合したファージ（１８クローン）のランダム１５アミノ酸の配列を示す図である（実施例１）。
【図７】実施例１で得られたファージ１及び２のペプチドについてhydropathy Indexを示す図（(Ａ)はファージ１、(Ｂ)はファージ２）である。図中、横軸はアミノ酸残基番号を示し、縦軸は疎水性度を示す。
【図８】（Ａ）はＧM1単分子膜に対するファージの結合挙動を示す図である。図中、（イ）はパニングする前のランダムなファージライブラリーについての結合挙動、（ロ）はパニング後のファージ１についての結合挙動である。（Ｂ）は脂質混合単分子膜（PC/PE/PS/SM(20:20:10:15)）に対するファージの結合挙動を示す図である。図中、（ハ）はパニング後のファージ１についての結合挙動、（ニ）はパニング前のランダムなファージライブラリーについての結合挙動である。
【図９】糖脂質単分子膜に対する合成ペプチドの結合挙動の測定の概念図を示す図である。
【図１０】糖脂質単分子膜に対する合成ペプチドの結合挙動の解析のための図である。なお図中、[peptide]はペプチドの濃度（μＭ）を、△ｍはペプチドの各濃度における結合量の平均（ｎ＝２〜６）を、Kdは解離定数を、並びに△ｍmaxは飽和結合量を示す。
【図１１】比較例において行った、ＧM1キャスト膜に結合するペプチドを発現するファージを選択するためのバイオパニングの方法を概略した図である。
【図１２】ＧM1キャスト膜に対してパニングし、回収されたファージの収率を示す図である。図中の表の左からサイクルの数（ラウンド数）、反応させたファージ量、溶出させたファージ量、回収率（反応させたファージ量分の溶出させたファージ量）、サイクルの繰り返しによってファージの濃縮度を示す。下図はこの回収率をラウンドに対して対数でプロットしたものである。
【図１３】比較例においてＧM1キャスト膜に結合したファージののランダム１５アミノ酸の配列を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガングリオシドに対して結合性を示すアミノ酸配列を選別する方法に関する。更に本発明は、該方法によって得られるガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドに関する。
【０００２】
当該ペプチドはガングリオシドに特異的に結合するため、生体タンパク質及びウイルス等のガングリオシドへの結合を競合的に阻害することができる。このため、該ペプチドはそれ自身ガングリオシド−タンパク結合阻害剤として有用であるとともに、ガングリオシドとタンパクとの相互作用並びにタンパク結合を介したガングリオシドの機能メカニズムを解明するための研究ツールとして有用である。さらに、そのアミノ酸配列の解明により既知のＤＮＡやアミノ酸配列のデータベースを検索することにより、ガングリオシドによって活性制御をうけるタンパク質が推定でき、ガングリオシドの機能解析のための重要な糸口となり得る。また、特定のガングリオシドに結合するアミノ酸配列の解明により、標的細胞に薬理物質を運搬するドラッグデリバリーシステムのプローブとしての応用も期待される。本発明の方法は、かかる医学上有用なペプチド又は蛋白質を選択的に取得する方法として有用である。
【０００３】
【従来技術】
シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドは、細胞膜表面に存在して多様な細胞機能並びに生命現象に関与していることが知られている。特にガングリオシドは、糖鎖を認識するレクチンや種々の毒素、インフルエンザウイルスの受容体として働くほかに、細胞間相互作用や細胞の分化・増殖にも関与していることが分かっている。
【０００４】
このようなガングリオシドの機能はタンパク質によって制御されていることから、機能発現の過程で細胞内のタンパク質がガングリオシドの糖鎖部分等を認識して結合する段階が存在すると考えられるが、そのメカニズムの全容については未だ解明されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のことから、ガングリオシドに結合するタンパク質のアミノ酸配列がわかれば、タンパク質のガングリオシド認識機構の解明に極めて有用であり、これにより種々の疾患のメカニズムが解明され、その予防薬や治療薬の開発が期待できる。
【０００６】
本発明は、ガングリオシドの糖鎖部分を認識し結合するアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に選択し、取得する方法を提供することを目的とするものである。更に本発明は、かかる方法によって得られるガングリオシドに結合性を有するアミノ酸配列、特にガングリオシドＧM1に対して結合性を有するアミノ酸配列を提供することをも目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねていたところ、ガングリオシドに結合するアミノ酸配列を有するペプチドの選別に際してファージディスプレイ法を用い、更にこの方法においてペプチドと反応させる固定化ガングリオシドとしてガングリオシド単分子膜を用いることにより、ガングリオシドに結合するアミノ酸配列を有する所望のペプチドを特異的にセレクションできることを見いだした。
【０００８】
固定化ガングリオシドとして、上記ガングリオシド単分子膜に代えて、脂肪酸が一つ欠けたガングリオシドのリゾ体をビーズに結合させたもの、又はガングリオシドを疎水性膜にキャスティングして固定化させたものを使用すると、固定化させるガングリオシドの構造がコントロールできず、その結果、不規則なコンホメーションのガングリオシドの任意の部位に結合する種々のペプチドが選択されてしまうという欠点がある。
【０００９】
本発明の方法によれば、ガングリオシドを単分子膜状に固定化することにより全てのガングリオシド分子の構造を一定に保つことができ、その結果、ガングリオシドの特定部位（特に糖鎖部位）を特異的に認識して結合するペプチドが選択的に選別取得できることが確認された。また、またかかる方法によれば、より生理的な態様で結合ペプチド（タンパク）が選択できるため、得られるペプチド（タンパク）は、体内におけるガングリオシドの機能メカニズムを解明するツールとしてより好ましいものであると思われる。
【００１０】
本発明は、かかる知見に基づいて開発されたものである。
すなわち、本発明は、ファージディスプレイ法によってガングリオシドに結合するペプチドを選別する方法であって、ガングリオシド単分子膜を用いてパニングを行うことを特徴とする方法である。
【００１１】
さらに本発明は、上記方法によって取得し得るペプチドであり、具体的にはガングリオシドＧM1に結合することを特徴とする配列番号１〜３で示されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００１２】
なお、以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、ガングリオシドに結合するアミノ酸配列を有するペプチド若しくはタンパクの選別取得方法である。
【００１４】
以下、ガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドの選別方法ならびに該方法で得られるペプチドにつき詳述する。
【００１５】
本発明の方法には、分子ライブラリーのスクリーニング手法を採用でき、上記ライブラリーとしては、例えばファージディスプレイライブラリーを好ましく用いることができる。
【００１６】
かかるライブラリーとしては、市販のものを用いることができる。該ライブラリー中のランダムペプチドディスプレイファージは、標的とする分子又は細胞に特異的に結合するペプチドを同定するために、特定の標的分子又は目的の細胞を用いてインビトロでスクリーニングされ得る多数のペプチドを発現するのに利用される。該ファージディスプレイライブラリーを用いるスクリーニングは、ファージディスプレイ法と呼ばれ、従来から種々の細胞表面レセプターと特異的に結合するリガンドや種々の抗体を同定するために使用されている。これらファージディスプレイライブラリーの作成方法及びインビトロスクリーニング法については、スコット及びスミスらの方法が参照される(Scott, J. M. and Smith, G. P., Science, 249, 386-390 (1990); Smith, G. P. and Scott, J. K., Methodｓin Enzymology, 217, 228-257 (1993))。
【００１７】
本発明の方法は、上記ファージディスプレイ法によりガングリオシドに結合するペプチドをインビトロでスクリーニングする方法であり、具体的には以下の方法によって行うことができる。
【００１８】
すなわち、まず、公知のファージライブラリーにランダムなＤＮＡ配列を挿入して、ファージの外殻表面にランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを発現し得るように構築したランダムペプチドディスプレイファージを用いて、これを固定化したガングリオシドと反応させて、ガングリオシドと特異的に結合するファージを回収する（バイオパンイング）。得られたファージを大腸菌に感染させて大量培養し、分離、精製して、ガングリオシドと特異的に結合するペプチド発現ファージを得る。かくして得られたファージは、再び上記と同様に、固定化ガングリオシドと反応させてガングリオシドと特異的に結合するファージをスクリーニングするパニング（panning）操作を行う。かかるパニング操作を数回、好ましくは４〜６回程度繰り返すことによりガングリオシドと特異的に結合するペプチドを発現し得るファージを選別し、濃縮することができる。
【００１９】
次いで、選択されたファージからＤＮＡを抽出しその配列を決定することにより、ファージが発現するペプチド、すなわちガングリオシドと特異的に結合するペプチドを同定することができる。
【００２０】
上記ＤＮＡの配列決定は、当業界で公知の方法により容易に行うことができ、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463-5467 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Method in Enzymology, 65, 499 (1980)〕等を挙げることができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いても容易に行うことができる。
【００２１】
上記ファージディスプレイ法において用いられるファージライブラリーは、通常この方法で用いられる公知のファージライブラリーのいずれであってもよいが、例えば実施例に掲げるような繊維状ファージであって、ファージのコートタンパク質ｐIII遺伝子にランダムなＤＮＡが挿入されて、ファージ外殻表面にランダムな１５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドが発現し得るように構築されたランダムペプチドディスプレイファージを好適に例示することができる。
【００２２】
また本発明が対象とするガングリオシドは、ガングリオシドと総称されるものであればよく特に限定されないが、通常ヒト又は動物の生体に存在するガングリオシドを挙げることができる。よく知られているガングリオシドとして、Svennerholmの命名法に従えば、ＧM4、ＧM3、ＧM2、ＧM1、ＧM1b、ＧD3、ＧD1a、ＧD2、ＧD1b、ＧT1a、ＧT1b、ＧQ1b、ＧG1c、ＧP1c、ＧD1a-GalNAc、ＧD1b-Fucを挙げることができる。尚、ここでＧM1及びＧM1bは、正式にはそれぞれＧM1a及びＧM1と命名されるものであるが、本発明においては常法に従ってＧM1及びＧM1bとして表記する（「脳機能とガングリオシド」、安藤進、共立出版(1997）、 第16-17頁）。
【００２３】
本発明の方法は、上記ファージディスプレイ法におけるパニング（panning）をガングリオシドの単分子膜を用いて行うこと、すなわち固定化ガングリオシドとしてガングリオシド単分子膜を用いることを特徴とする。
【００２４】
実施例に記載するように、発明者らは固定化ガングリオシドとして、疎水性膜であるポリビニルイリデンジフルオライド膜（ＰＶＤＦ膜）にガングリオシドをキャストしたもの、並びにガングリオシドを単分子膜状に形成したものの二種類を用いてパニングを行ったところ、前者の方法で得られたファージからは一定の規則性はあるものの互いに相同性のない多種多様のアミノ酸配列を有する３１種類のペプチドが得られたのに対し、後者の方法で得られたファージから発現されるペプチドはいずれも相同性が高く、わずか３種類に分類することができた。更に、得られたファージについて、ガングリオシド全てが一定の分子構造に並列してなるガングリオシド単分子膜に対する結合性を評価したところ、パニング前のランダムなファージライブラリーでは殆ど結合しないのに対して、後者の方法で得られたファージはかかる単分子膜に有意に結合することが観察された。
【００２５】
これらのことは、ファージディスプレイ法において、固定化ガングリオシドとしてガングリオシドの単分子膜を用いてパニングすると、ガングリオシドの特定部位、好ましくは糖鎖部位を特異的に認識して結合する所望のペプチドが選択的に取得できることを示す。
【００２６】
ガングリオシドの単分子膜は、上記に記載するいずれかのガングリオシドを用いて、例えば、佐藤智典ら、”Quantitative measurement of the interaction between ganglioside monolayers and wheat germ agglutinin (WGA) by a quartz-crystal microbalance” Biochim. Biophys. Acta, 1138, 82-92 (1998) または佐藤智典ら、”Binding o Influenza Virus to Monosialoganglioside (GM3) Reconstituted in Glucosylceramide and Sphingomyelin Membranes” Biochim. Biophys. Acta, 1285, 14-20 (1996) に記載される方法に従って調製することができる。具体的には、後述する実施例において記載する方法を挙げることができるが、これに限定されない。
【００２７】
パニングは、上記のようにして水面にガングリオシドの単分子膜が形成された水槽に、選択されるべきファージを添加して一定時間放置し、単分子膜にファージを結合させることなどによって行うことができる。詳細には後述する実施例において記載する。放置時間（反応時間）は、単分子膜とファージとが反応して結合する時間であればよいが、好ましくは結合が飽和に達する時間である。
【００２８】
ガングリオシド単分子膜の下層水は、特に制限されないが、好ましくは中性域に緩衝能を有する緩衝液であり、例えばｐＨ７〜７．５のＴＢＳを挙げることができる。
【００２９】
かかるパニング工程において、ガングリオシド単分子膜にファージ粒子が結合していく過程を経時的にモニタリングすることもできる。かかるモニタリングによれば、ファージ粒子のガングリオシド単分子膜に対する結合性並びに結合挙動を検出することができ、これにより所望のペプチドを発現するファージの選別をより有利に簡便に行うことができ、更に得られた所望のファージの評価に有用である。更に、かかるモニタリングによってパニングの為の反応時間を決定することもできる。
【００３０】
モニタリング方法としては、マイクロバランスとして知られる水晶発振子を用いる方法を例示することができる。これは、ファージの結合に応じて生じる水晶発振子金電極表面の重量変化を周波数の変化として検出するというものである。具体的には、例えば上記文献（Biochim. Biophys. Acta, 1138, 82-92 (1998)、Biochim. Biophys. Acta, 1285, 14-20 (1996)）に記載されるように、ＴＢＳを下層水としてトラフに作製した単分子膜の表面に発振子電極表面を水平付着させ、発振させて、安定したところでファージライブラリー溶液を加え、ファージの結合に応じた発振子の振動数を計測し、モニタリングする方法を挙げることができる。
【００３１】
本発明の方法の一例として、ガングリオシドとしてＧM1を用いてそれに特異的に結合するアミノ酸配列を有するペプチドを選択し、同定する方法を後記実施例に記載する。
【００３２】
かかる方法によって選別され、同定されたペプチドは、配列番号１から３に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するものであり、これらはいずれもガングリオシドＧM1、特にその糖鎖部位に結合性を有することにより特徴づけられる。実施例において示すように、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド１は、ガングリオシドの主にシアル酸と相互作用していると考えられ、また配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド３はガングリオシドのシアル酸と末端Ｇａｌと相互作用していると考えられる。また、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド２は、どのＧＳＬ（glycosphingolipids）にもある程度の結合を示すもののGlcCerとは全く結合しないことから、上記ペプチド１及びペプチド３とは異なる結合様式を有するものと考えられる。
【００３３】
本発明のペプチドには、上記配列番号１から３に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドの他に、該アミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つガングリオシド、特にガングリオシドＧM1に結合性を有するペプチド並びに蛋白質が包含される。
【００３４】
ここで、アミノ酸の「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチド若しくは蛋白質が、配列番号１から３で示されるアミノ酸配列のいずれかからなるペプチドと同様にガングリオシド、特にＧM1に対して結合性を有する同効物であれば特に制限されない。アミノ酸配列の改変（変異）は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変ペプチドを包含する。
【００３５】
本発明のガングリオシド結合性ペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明のペプチドの合成は、そのいずれによることもできる。
【００３６】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ(ジフェニルホスホリルアジド)法、ＤＣＣ＋添加物(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、N−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド等)、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えば ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００３７】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばTyrの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばArgのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。
【００３８】
かくして得られる本発明のガングリオシド結合性ポリペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００３９】
本発明の方法によって、選別され同定されるペプチド（タンパク質）は、ガングリオシドを特異的に認識して結合するアミノ酸配列を有するものであり、それ自身、in vivoにおいて、ガングリオシドを認識するタンパク質やウイルス等の結合を競合的に妨げることのできる、すなわちガングリオシド結合阻害剤として用いることができる。当該ガングリオシド結合阻害剤によれば、ガングリオシドと蛋白質との結合若しくは相互作用を介して生じる、種々の細胞機能や生命現象を解明するのためのツールとしての応用、またはタンパク質やウイルス等がガングリオシドに作用して生じる種々の疾患の予防・治療薬としての応用、アフィニティカラムとしての利用が期待される。また、同定されたガングリオシド結合性ペプチドのアミノ酸配列をデータベース検索にかけることにより、公知のヒト又は動物のタンパク質の中で従来知られていなかった糖脂質結合活性部位を見いだせるものと期待される。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ ガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドの選別及びその同定
（１）ファージディスプレイライブラリーの調製
西、佐谷らの報告（Nishi T., Satani H., et al., FEBS Lett, 399, 237-240 (1996)）に従ってファージディスプレイライブラリーを作成した（２．５×１０8クローン）。該ファージディスプレイライブラリーは図１に示すように、具体的にはＮＮＫ（ＮはＡ,Ｃ,Ｇ,Ｔのいずれかを示し、ＫはＧ又はＴを示す。）が１５回繰り返された配列を含むＤＮＡが遺伝子工学的に挿入された繊維状ファージｆｄであって、更に外殻タンパク質ｐIII遺伝子のＮ末端部分に１５残基のランダムなアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡが挿入されてファージ外殻表面にランダムな１５残基のアミノ酸配列を有するペプチドが発現できるように構築されている。上記のファージディスプレイライブラリーは、スコットら(Scott,J.K. and Smith, G.P., Science, 249, 386-390 (1990))により報告されている特徴を有している。
【００４１】
（２）ガングリオシド結合性ペプチドの選択
（ｉ）ガングリオシドの固定化
ガングリオシドの固定化するための方法としては、脂肪酸が一つ欠けたリゾ体ガングリオシドをビーズに結合させる方法及びガングリオシドをＰＶＤＦ膜のような疎水性膜にキャストする方法が挙げられる（図２、Ｉ)及びII)参照）。しかしながら、このような方法では、ガングリオシドの構造がコントロールできず、不規則なコンフォメーションのガングリオシドに対してペプチドをセレクションしてしまうおそれがある。
【００４２】
このため、本発明ではガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドのセレクション方法として、水面にガングリオシドからなる単分子膜を形成させ、該単分子膜に対して上記ファージを反応させる方法を採用した（図２、III)）。
【００４３】
なお、当該実施例においては、ガングリオシドの例としてガングリオシド系列でシアル酸を一つ含む糖脂質ＧM1を用いて、これに結合するアミノ酸配列を有するペプチドをセレクションした。なお、ＧM1はコレラトキシンの受容体として知られており、図３に示すように、GlcCerにガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトース、ガラクトースがつながった骨格にシアル酸が１つ結合している構造を有している。
【００４４】
（ii）ＧM1単分子膜の作製
ＧM1単分子膜をＴＢＳ（ｐＨ７．５）を下層水として、トラフ（ラングミュアー型トラフFSD-110、USI社製）を用いて作製した（Biochim. Biophys. Acta, 1138, 82-92 (1998) またはBiochim. Biophys. Acta, 1285, 14-20 (1996)参照）。
【００４５】
具体的には、ガングリオシドＧM1のクロロホルム−エタノール（4:1 v/v）溶液を所定量、マイクロシリンジを用いて水面上に展開し、乾燥させた。なお、下層水の温度は、水循環式恒温槽ＣＣＭ−２（池田理化社製）で２０℃に制御した。１０分以上乾燥させた後、１０００mm2/minのバリアー速度で脂質単分子膜を圧縮した。なお、単分子膜の累積は、単分子膜が表面圧３０ｍＮ／ｍに保持されるようにした。ついで該値に表面圧を保持した脂質単分子膜上に、超純水で十分に洗浄した水晶発振子（９ＭＨｚ：Φ13.5mm、住友ベークライト社製）の金電極表面をリフトコントローラーを用いて水平に押さえつけるように付着させて、該水晶発振子に脂質単分子膜を移し、それを空気に曝されないようにしながら、バイオパニング用のウエルに移した。空気の暴露を避けるのは、脂質単分子膜は気相に曝されると剥離乃至は脂質分子の反転が起こる可能性があるためである。
【００４６】
（iii）ＧM1単分子膜に対するパニング（panning）（図４参照）
ＧM1単分子膜へのファージの結合過程をモニタリングするためにマイクロバランスとして知られる水晶発振子を用いた。これは単分子膜にファージが結合することによって生じる水晶発振子の金電極表面の重量変化を周波数変化として検知するものである。
【００４７】
上記と同様にして単分子膜を９ＭＨｚ発振子電極表面に水平付着し、１ｍＬ ＴＢＳ中で発振させ、安定したところで、ファージライブラリー溶液１０μＬ（5.5×１０10ＴＵ、2.5×１０8クローン）を加えた。１５分後、結合が飽和に達したことを確認して水晶発振子を引き上げた。
【００４８】
なお、単分子膜へのファージの結合過程は、発振子の振動数の変化をSC-7201 UNIVERSAL COUNTER（岩崎通信機社製）で計測し、コンピューターに取り込んでモニタリングすることによって追跡した
発振子の金電極をＴＢＳ５０μＬで３回洗浄した後、elution buffer（Glycine,HCl. pH2.2）２０μＬで１５分間室温に放置してファージを溶出させた（ＧM1単分子膜結合ファージ、ＧM1−ｎ）。溶出液を遠心濃縮用チューブに移し、７．５μＬ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和し、その後ＴＢＳを加えて総容量２ｍＬにメスアップした。チューブを遠心し（５０００ｒｐｍ、２０分間）、再び約２ｍＬのＴＢＳを加え、再度遠心（５０００ｒｐｍ、２０分間）することによりbuffer交換とファージ溶液の濃縮を同時に行った。
【００４９】
得られたファージ溶液に調製済みＫ９１−Ｋａｎ溶液１００μＬを加え、１５分間室温で感染させた。１５分後、あらかじめ３７℃で保温しておいた、０．２μｇ／ｍｌテトラサイクリン（シグマ社製：以下ＴＣという）を含むＮＺＹ培地２０ｍＬにこの感染溶液を加えて、３７℃で４０分間振盪培養した。
【００５０】
４０分後、ＴＣのストック溶液（20mg/mL）２０μＬを加え（終濃度２０μｇ／ｍＬ）、３７℃で一晩振盪培養した。得られた培養液を３０００rpmで１０分間遠心して大腸菌を除去した。上清を再度１２０００rpmで１０分間遠心して更に大腸菌を除去した。上清にＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液３ｍＬ（0.15 v/v）を加え、１００回穏やかに攪拌した後、４時間以上４℃で静置した。１２０００rpmで１０分間遠心して上清を除去し、沈殿したファージペレットに１ｍＬ ＴＢＳを加えて完全に溶解した。得られたファージ溶液を１．５ｍＬ容Ｅｐチューブに移し、１５０００rpmで１０分間遠心して不溶物を除去した。この中に再びＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液１５０μＬを加え、数回穏やかに攪拌した後、１時間以上４℃で静置した。１５０００rpmで１０分間遠心してペレットを回収し、０．０２％ ＮａＮ3／ＴＢＳ（２００μＬ）に溶解した。１５０００rpmで１０分間遠心して、不溶物を除去し、上清のファージ溶液（２００μＬ）を０．６ｍＬ容Ｅｐチューブに移した。こうして得られたファージ溶液の半分を次のパニングに、また２μＬをtiteringに使用し、残りを保存した。
【００５１】
上記パニング操作によって得られた結果を図５及び表１に示す。
【００５２】
図５は、１〜５回のそれぞれのパニング操作におけるＧM1単分子膜へのファージ粒子の結合挙動を示す図である。横軸がパニング時間（反応時間）で縦軸が重量変化、すなわちファージ粒子の単分子膜への結合を示す。縦軸の△Ｆ／Ｈｚ値が低くなるほど、ファージ粒子が単分子膜に結合していることを示す。結果から分かるように１回目のラウンドは殆ど結合しなかったが、ラウンドが進むにつれて、ファージの結合量と初期結合速度が増加し、このことからパニングがうまく進行していることが確認できた。
【００５３】
表１は、１〜５回目のパニングによって得られたファージの回収率を示すものである。表に示されるように用いたファージ数に対する単分子膜に結合したファージ数の比（Yield）を％で示したファージ回収率は、パニングの回数を重ねる度に４回目の０．０４３％（１回目に比して１１０倍の濃縮）を最高に上昇した。なお、５回目で回収率が低下したのはファージが単分子膜に覆い尽くされ、それ以上結合できなかったためであり、回収されたファージの絶対量は増加していた。
【００５４】
【表１】
このことから、上記の方法により、ガングリオシドＧM1に特異的に結合するペプチドを発現しているファージが回収されていることが確認された。
（３）ガングリオシドＧM1結合性アミノ酸配列の配列決定
上記（２）で得られたファージ（１８クローン）から、発現しているペプチドのアミノ酸配列決定を以下のとおり行った。
【００５６】
即ち、５回目のパニングの後のタイター測定で得られたプレート上のコロニーをそれぞれ５０コロニーずつ、無作為に拾い上げ、新しいＮＺＹプレートに、植菌し直し、一晩３７℃にて培養し、これをマスタープレートとして４℃で保存した。マスタープレートのコロニーを各々２０ｍＬのＮＺＹ培地（２０μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有）の入った５０ｍＬ遠心チューブに懸濁し、３７℃で一晩２００ｒｐｍ／分で振盪培養した。ついで３０００ｒｐｍ／分、１０分間遠心分離を行った後、上清をオーク・リッジ遠心チューブに移し、１２０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し、大腸菌を除菌した。更に上清をオーク・リッジ遠心チューブに移し、３ｍＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００：ナカライテスク社製）／ＮａＣｌを加え、よく撹拌した後、４℃に４時間静置した。１２０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し、ファージを沈殿させた。ついで上清を除去し、沈殿したファージを１ｍＬのＴＢＳ（トリス緩衝塩溶液）に懸濁させた。１．５ｍＬのエッペンドルフ・チューブに移し、１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し、不溶性物質を除去後、上清を別のエッペンドルフ・チューブに移し、１５０μＬのポリエチレングリコール／ＮａＣｌを加え、よく撹拌した後、４℃に１時間静置した。次いで１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し、ファージを再沈殿させた。ついで上清を除去し、沈殿したファージを２００μｌのＴＢＳで再度懸濁した。１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し、不溶性物質を沈殿させた後、該沈澱物を０．５ｍｌのエッペンドルフ・チューブに移し、ファージクローンを４℃で保存した。
【００５７】
上記で得られたファージクローンからのＤＮＡの抽出は、１．５ｍＬのエッペンドルフ・チューブにファージクローン１００μｌに対してＴＢＳ１００μｌ及びＴＥ飽和フェノール（ニッポジーン社製）２００μｌを加えて、１０分間激しく撹拌後、１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離した。次いで、上清（水相）２００μｌに対してＴＥ飽和フェノール２００μｌ及びクロロホルム２００μｌを加えて、前記同様１０分間激しく撹拌後、１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離した。更に、上清（水相）１５０μｌに対してＴＥ２５０μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム４０μｌ、２０ｍｇ／ｍＬグリコ−ゲン（ベーリンガー・マインハイム社製）１μｌ及びエタノール１ｍＬを加えて、１．５ｍＬのエッペンドルフ・チューブにて−２０℃で、一時間放置した後、１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離した。上清を取り除き、１ｍＬの８０％エタノール（−２０℃）を緩やかに加えて、１５０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心分離し残存する塩を除いた。上清を除去後、チューブ内の水分を蒸発させ、沈殿しているＤＮＡを１０μｌの滅菌蒸留水に溶解し、４℃にて保存した。かくして得られた個々のファージＤＮＡをペプチドの配列決定のために使用した。
【００５８】
ファージＤＮＡによりコードされるペプチドの配列決定は、ジデオキシ法（Proc.Natl.Acad.Sci., USA., 74, 5463-5467(1977)）により、アマシャム社のＴＨＥＲＭＯ配列キット（Amersham Life Sciene, Code; US79765, Lot番号; 201503）を用いて機器の使用説明書に従い実施した。ＤＮＡの伸長反応は、９６℃、３０秒、４５℃、１５秒、６０℃、４分を１サイクルとして、３０サイクル行い、ＤＮＡの配列は、ＡＢＩ社製のＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ３７７ＤＮＡシーケンサー）を用いて行った。
【００５９】
その結果、５回のパニングによって得られたファージ１８クローンはいずれも配列番号１〜３に示すアミノ酸配列を有する３種類のペプチドのいずれかを発現していた。特に配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチド（ペプチド１）を発現するファージは１３クローンと一番数が多く、全体の７２％の割合を占めていた（ファージ１）。配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチド（ペプチド２）を発現するファージは４クローンと全体の２２％で（ファージ２）、また配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチド（ペプチド３）を発現するファージは１クローンであった（ファージ３）（図６参照）。
【００６０】
（４）ＧM1結合性ペプチドのハイドロパシー
上記でアミノ酸配列が決定されたファージ１〜３についてhydropathyを調べた（Eisenberg,D.,Tweiss,R.M.,Terwilliger,T.C.,Wilcox,W.,Faraday Symp.Chem.Soc.,17,109-120 (1982)）。ファージ１及び２についての結果をそれぞれ図７（Ａ）及び図７（Ｂ）に示す。図中、横軸はアミノ酸残基番号を示し、縦軸は疎水性度を示す。
【００６１】
図７から分かるように、一番クローン数が多かったファージ１ではＮ端側の３〜４残基並びにＣ端側の１３残基にカチオンを持つＡｒｇが見られた。これらＡｒｇは、糖の糖水酸基と２価で水素結合しているか、シアル酸のカルボキシル基と２価で水素結合しているか、シアル酸のカルボキシル基と静電結合している可能性が考えられた。また、その間に挟まれるように、turn構造（折り返し構造）を取りやすいＰｒｏ−Ｇｌｙ配列が見られたことから、糖鎖部分をＡｒｇで挟み込んで糖と相互作用している可能性が推測された。また、図には示さないが、ファージ３のhydropathyパターンはこのファージ１のパターンとよく似ていた。ファージでは、中央付近にＬｙｓ、Ａｒｇのカチオンをもつ３つの塩基性アミノ酸が見られた。
【００６２】
（５）ＧM1結合性ペプチド発現ファージの膜への選択性
５回のパニングによって得られたファージが本当にセレクションされた所望のファージであるかを調べるために、下記の実験を行った。
（ｉ）ＧM1単分子膜に対するファージ１の結合挙動
パニングする前のランダムなファージライブラリー及びパニング後のファージ１を用いて、ＧM1単分子膜に対する結合挙動を調べた。結合挙動のモニタリングは、ファージディスプレイ法におけるパニング時のモニタリングと同様に、水晶発振子を用いて行った。
【００６３】
結果を図８（Ａ）に示す。図から分かるように、パニング前のランダムなライブラリーでは殆どＧM1単分子膜と結合しなかったが、パニング後に単離したファージ１では１４Ｈｚ程度の結合が観察された。
【００６４】
（ii）脂質混合単分子膜に対するファージ１の結合挙動
パニングする前のランダムなファージライブラリー及びパニング後のファージ１を用いて、脂質混合単分子膜（PC/PE/PS/SM(モル比、20:20:10:15)）に対する結合挙動を調べた。結果を図８（Ｂ）に示す。図から分かるように、パニング前のランダムなライブラリーでは脂質混合単分子膜と結合するが、パニング後に単離したファージ１では結合しなかった。
【００６５】
この実験の結果から、ファージディスプレイ法において固定化ガングリオシドとしてＧM1単分子膜を用いて該膜に対してパニングすることにより、ＧM1単分子膜、すなわちガングリオシドの特定部位に特異的に結合性を示すアミノ酸配列を有するペプチドを発現するファージが選別取得できることが確認された。
【００６６】
実施例２ コレラトキシン−ＧM1結合阻害試験
実施例１で得られたガングリオシドＧM1単分子膜に特異的結合性を示すアミノ酸配列を有するペプチド１、２及び３（配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するペプチド）を常法の化学合成法に従って製造し、これらのペプチドのＧM1単分子膜への結合能を、コレラトキシンとＧM1単分子膜の結合への阻害活性により試験した。具体的には、ＧM1単分子膜を３０ｍＮ／ｍでセルデスクに写し取り、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ（０.５ｍＬ）の入った２４ウエルに移して、４℃で一夜、ブロッキングを行った。ＴＢＳ（０.５ｍＬ）で３回洗浄した後、これにＨＲＰ標識コレラトキシンＢサブユニット（２００μＬの０.５％ＢＳＡ／ＴＢＳで５０００倍希釈：C-4672、シグマ社）と合成ペプチド（１０-7〜１０-3Ｍ）を加え、４℃で一夜インキュベートした。これをＴＢＳ（０.５ｍＬ）で３回洗浄した後、基質溶液（ｏ−フェニレンジアミン）を０.５ｍＬ加え、１０〜１５分発色させて、３Ｎ Ｈ2ＳＯ4（１００μＬ）を加えて反応を停止し、２００μＬを９６ウエルに移して４９２ｎｍにおける吸光度を検出した。
【００６７】
なお、対照ペプチドとしてコレステロール結合性ペプチド（ＡＲＥＹＧＴＲＦＳＬＴＧＧＹＲ）を用いて同様に試験を行った。上記各試験はそれぞれ３回ずつ実施した。
【００６８】
上記の試験からＩＣ50（コレラトキシンの結合を５０％阻害するペプチド濃度：平均値）を求めた結果を表２に示す。
【００６９】
【表２】
この結果から、ペプチド１、２及び３はＧＭ１に結合し、コレラトキシンの結合を阻害できることが示され、特にペプチド３は１μＭという低濃度で阻害活性を有していることが確認できた。
【００７１】
実施例３ 各種糖脂質単分子膜に対する選択性
前記合成ペプチド（ペプチド１〜３）の各種糖脂質単分子膜に対する結合性選択性を、前記したパニング時のモニタリングと同様にして、水晶発振子（ＱＣＭ；２７ＭＨｚ）を用いて試験した。糖脂質として、ＧM1，ＧM2，ＧM3，asＧM1，ＧDla及びGlcCerを用い、合成ペプチドのこれら糖脂質単分子膜への結合の見かけ上の飽和結合量（△ｍmax）と解離定数（Kd）を求めた。
【００７２】
具体的には、２７ＭＨｚ水晶発振子の電極表面に糖脂質単分子膜を吸着させ、測定用セルに移動した。２０℃で発振が安定になるのを確認した後、ペプチド溶液（３〜１０μｌ、０.１〜１０ｍＭ、ＴＢＳ中）をインジェクトし、結合が平衡に達した後、更にペプチド溶液を打ち込むことでセル内の濃度を変化させ、振動数変化量を測定した（図９）。セル内のペプチド終濃度は、０.１〜４０μＭの範囲内で行った。同じ操作を２〜６回程度繰り返し、それぞれの濃度における結合量の平均（△ｍ）と標準偏差を求めた。各ペプチドの結合量をペプチド濃度に対してプロットし、結合曲線を描いた。これを図１０に示す逆数プロットから解離定数（Kd）と飽和結合量（△ｍmax）を求めた。
【００７３】
[peptide]0／△ｍ＝（[peptide]0／△ｍmax）＋（Kd／△ｍmax）
その結果、ペプチド３はＧM1＞ＧDla＝ＧM3＝asＧM1＞ＧM2＞GlcCerの順で結合した。このようにシアル酸と末端Ｇａｌが存在すると結合することから、このペプチドはシアル酸と末端Ｇａｌと相互作用していると考えられる。ペプチド１は、ＧM3＞ＧDla＞ＧM2＞＞ＧM1＞asＧM1＞GlcCerの順で結合した。このことから、このペプチドは主に非還元末端のシアル酸と相互作用していると考えられる。ペプチド２はＧM1≧ＧDla≧asＧM1＝ＧM2≧ＧM3の順で結合し、GlcCerには全く結合しなかった。このことから、ペプチド２は結合量は低いものの、どのＧＳＬ（glycosphingolipids）にもある程度の結合を示し、このことからペプチド１及びペプチド３とは異なる結合様式で結合するものと考えられる。
【００７４】
実施例４ 変異ペプチドのＧM1単分子膜への結合能
配列番号１及び３のアミノ酸配列においてはモチーフが認められる。このため、このモチーフが糖脂質単分子膜との結合にどのように寄与しているかを検討した。具体的には、モチーフ部分（ｘｘＰｘＬＰｘｘＦｘｘｘＲｘＰ）の各Ｒ、Ｆ及びＰをそれぞれＥ、Ｖ及びＡに置換したものを含む次の変異体ペプチドを常法に従って合成して、これらペプチドのＧM1単分子膜への結合能を実施例２で行ったコレラトキシン−ＧＭ１結合阻害試験に従って試験した。
＜変異ペプチド＞
下記に示すアミノ酸配列のうち下線部が変異部である。
【００７５】
ペプチド１／Ｒ→Ｅ置換 ：ＤＦＥＲＬＰＧＡＦＷＱＬＥＱＰ
ペプチド１／Ｐ→Ａ置換 ：ＤＦＲＲＬＡＧＡＦＷＱＬＲＱＡ
ペプチド１／Ｆ→Ｖ置換 ：ＤＦＲＲＬＰＧＡＶＷＱＬＲＱＰ
ペプチド３／Ｒ→Ｅ置換 ：ＶＷＥＬＬＡＰＰＦＳＮＥＬＬＰ
ペプチド３／Ｐ→Ａ置換 ：ＶＷＲＬＬＡＡＡＦＳＮＲＬＬＡ
ペプチド３／Ｆ→Ｖ置換 ：ＶＷＲＬＬＡＰＰＶＳＮＲＬＬＰ
ペプチド３／ＲＦ→ＥＧ置換：ＶＷＥＬＬＡＰＰＧＳＮＲＬＬＰ
ペプチド３／ＷＲ→ＧＥ置換：ＶＧＲＬＬＡＰＰＦＳＮＥＬＬＰ
ペプチド３／ＷＦ→ＧＧ置換：ＶＧＲＬＬＡＰＰＧＳＮＲＬＬＰ。
【００７６】
なお、上記各ペプチドの変異は、シアル酸と静電相互作用すると予想されるＲ（Arg、＋）をＥ（Glu、−）に変え、末端Galとのスタッキングが予想されるＦ（Phe）を同じ疎水性のＶ（Val）に変え、ペプチドをターン構造にさせると予想されるＰ（Pro）をヘリックスを取り扱い易いＡ（Ala）に変えるものであり、このモチーフがＧM1との結合に重要な役割を果たしているとすれば、これらの変異体ペプチドによればＧM1単分子膜への結合能が低下すると予想される。
【００７７】
かかる予想のもと、上記各変異体ペプチドについて、ＧＭ１単分子膜への結合能を試験した結果、ペプチド３の変異体ペプチドに関して「ペプチド３／Ｐ→Ａ置換」のＩＣ50はペプチド３のそれと変わらず略同等の結合能が認められ、また、「ペプチド３／Ｒ→Ｅ置換」においては全く阻害がかからず結合能のないものと考えられた。ペプチド１の変異体ペプチドに関しては、「ペプチド１／Ｒ→Ｅ置換」は全く阻害がかからず結合能が認められなかったが、「ペプチド１／Ｆ→Ｖ置換」及び「ペプチド１／Ｐ→Ａ置換」については阻害能の上昇、すなわち結合能の上昇が認められた。また、「ペプチド３／ＲＦ→ＥＧ置換」では阻害能が低下し、「ペプチド３／ＷＲ→ＧＥ置換」や「ペプチド３／ＷＦ→ＧＧ置換」では有意な阻害活性が認められなかった。
【００７８】
これらの結果から、２番目のＷと１２番目のＲ（Ｗ2−Ｒ12）及び３番目のＲと９番目のＦ（Ｒ3−Ｆ9）のアミノ酸は、対で、ＧＭ１と相互作用しており、（Ｗ2−Ｒ12）の対が（Ｒ3−Ｆ9）の対に比べて高いＧＭ１結合性を有しているものと考えられる。
【００７９】
比較例 ガングリオシドをキャストさせたＰＶＤＦ膜を用いた、ガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドの選別
パニングに用いる固定化ガングリオシドとして、上記ガングリオシド単分子膜に代えて、ガングリオシドをＰＶＤＦ（ポリビニルイリデンジフルオライド）膜のキャストして固定化させたものを用いてファージディスプレイ法を行い、ガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドを選別した。かかる選別方法の概略を図１１に示す。
【００８０】
具体的には、実施例１で用いたのと同じファージライブラリー（１０10〜１０11ＴＵ、２．５×１０8クローン、ＴＢＳ）をまずＰＶＤＦ膜に反応させて上澄みをとって、ＰＶＤＦ膜と非特異的に結合するものを除いた。次いで該上澄みを、同様にしてリン脂質混合物をキャストさせたＰＶＤＦ膜と反応させて上澄みをとって、リン脂質混合物と非特異的に結合するものを除いた。このsubtructionした上澄みに含まれるファージについて、ガングリオシドＧM1をキャストしたＰＶＤＦ膜と反応させた（室温、１時間）。
【００８１】
反応後、ＴＢＳで膜を洗浄して膜に結合していないファージを除去し、次いでｐＨ２の溶出緩衝液で膜に結合しているファージを回収した。得られたファージは、実施例１の方法と同様にして大腸菌に感染させ、増殖させて次のラウンドに使用した。また、溶出されたファージは回収率を求め、パニング操作がうまくできているかを評価した。
【００８２】
かかるサイクルを４回行った後、ファージクローン（３１クローン）を単離して、実施例１と同様にしてランダムペプチド相当部分のＤＮＡの塩基配列を解析することにより、ＧM1キャスティングＰＶＤＦ膜に結合性を示したペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【００８３】
ＧM1キャスト膜に対してパニングした結果を表３に示す。
【００８４】
【表３】
ファージ回収率をラウンドに対して対数でプロットした図が図１２である。この図から分かるように、ラウンドが進むにつれて回収率が増加し、目的のファージが濃縮されるのが分かる。
【００８６】
３１クローンのランダムペプチド部分のアミノ酸配列の結果を図１３に示す。Ａｒｇをもとに分類すると、Ａｒｇが隣接して見られるモチーフＡ、Ａｒｇが少し離れて見られるモチーフＢ、Ａｒｇを一つ含むモチーフＣ、Ａｒｇを含まないモチーフＤに分けられた。しかしながら、このキャスト膜を用いて得られた結果では、アミノ酸配列の相同性が認められなかった。
【００８７】
【発明の効果】
本発明によれば、ガングリオシド、特にその糖鎖部位に結合するアミノ酸配列を有するペプチド又は蛋白質を特異的に選別し、同定する方法を提供することができる。かかる方法によって得られたペプチド又は蛋白質は、ガングリオシドに特異的に結合することから、ペプチド又は蛋白質を介して機能するガングリオシドの作用メカニズムを解明する研究ツールとして有用である。また、ガングリオシドが結合するアミノ酸配列が明らかになることにより、既知のＤＮＡやアミノ酸配列のデーターベースを検索することでガングリオシドによって活性制御をうける生体蛋白質を推定することができ、これはガングリオシドの機能の解析に重要な糸口とあるものと思われる。
【００８８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で用いた、ランダム１５アミノ酸を融合したｐIIIコートタンパク質を有するファージの概略を示す図である。
【図２】ガングリオシド結合性アミノ酸配列を有するペプチドのセレクションのためのファージディスプレイ法に用いられる各種パニング法を示す図である。図中Ｉ）は、固定化ガングリオシドとしてビーズにリゾ−ガングリオシドを化学的に結合させたものを用いてファージとパニングする方法、II)はＰＶＤＦ等の疎水性膜にガングリオシドをキャストし固定化してファージとパニングする方法、及びIII）はガングリオシドを単分子膜状に整列させて固定化してファージとパニングする方法を示す。
【図３】ガングリオシドＧM1の構造を示す図である。
【図４】実施例１において行った、ＧM1単分子膜に結合するペプチドを発現するファージを選択するためのバイオパニングの方法を概略した図である。なお、図中、ＱＣＭは水晶発振子（Quartz-Crystal Microbalance）を示す。
【図５】実施例１において、１〜５回のそれぞれのパニング操作におけるＧM1単分子膜へのファージ粒子の結合挙動を示す図である。横軸にパニング時間（反応時間）、及び縦軸に金電極表面の重量変化（周波数変化）を示す。
【図６】ガングリオシドＧM1に結合したファージ（１８クローン）のランダム１５アミノ酸の配列を示す図である（実施例１）。
【図７】実施例１で得られたファージ１及び２のペプチドについてhydropathy Indexを示す図（(Ａ)はファージ１、(Ｂ)はファージ２）である。図中、横軸はアミノ酸残基番号を示し、縦軸は疎水性度を示す。
【図８】（Ａ）はＧM1単分子膜に対するファージの結合挙動を示す図である。図中、（イ）はパニングする前のランダムなファージライブラリーについての結合挙動、（ロ）はパニング後のファージ１についての結合挙動である。（Ｂ）は脂質混合単分子膜（PC/PE/PS/SM(20:20:10:15)）に対するファージの結合挙動を示す図である。図中、（ハ）はパニング後のファージ１についての結合挙動、（ニ）はパニング前のランダムなファージライブラリーについての結合挙動である。
【図９】糖脂質単分子膜に対する合成ペプチドの結合挙動の測定の概念図を示す図である。
【図１０】糖脂質単分子膜に対する合成ペプチドの結合挙動の解析のための図である。なお図中、[peptide]はペプチドの濃度（μＭ）を、△ｍはペプチドの各濃度における結合量の平均（ｎ＝２〜６）を、Kdは解離定数を、並びに△ｍmaxは飽和結合量を示す。
【図１１】比較例において行った、ＧM1キャスト膜に結合するペプチドを発現するファージを選択するためのバイオパニングの方法を概略した図である。
【図１２】ＧM1キャスト膜に対してパニングし、回収されたファージの収率を示す図である。図中の表の左からサイクルの数（ラウンド数）、反応させたファージ量、溶出させたファージ量、回収率（反応させたファージ量分の溶出させたファージ量）、サイクルの繰り返しによってファージの濃縮度を示す。下図はこの回収率をラウンドに対して対数でプロットしたものである。
【図１３】比較例においてＧM1キャスト膜に結合したファージののランダム１５アミノ酸の配列を示す図である。
Claims (4)
- ファージディスプレイ法によってガングリオシドに結合するペプチドを選別する方法であって、ランダムペプチドディスプレイファージをガングリオシド単分子膜を用いてパニングすることを特徴とする方法。
- ガングリオシドがガングリオシドＧM1である請求項１記載の方法。
- パニング操作において、ガングリオシド単分子膜へのファージの結合挙動を水晶発振子を用いてモニタリングする請求項１記載の方法。
- ガングリオシドＧM1に結合することを特徴とする、配列番号１〜３で示されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド。
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