JP2002544522A5 - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- JP2002544522A5 JP2002544522A5 JP2000618735A JP2000618735A JP2002544522A5 JP 2002544522 A5 JP2002544522 A5 JP 2002544522A5 JP 2000618735 A JP2000618735 A JP 2000618735A JP 2000618735 A JP2000618735 A JP 2000618735A JP 2002544522 A5 JP2002544522 A5 JP 2002544522A5
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- proteins
- binding
- peptide
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 405
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 405
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 401
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 132
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 104
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 90
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 84
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 77
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 77
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 65
- 101700002015 ABCB1 Proteins 0.000 description 44
- 102100014001 ABCB1 Human genes 0.000 description 44
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 42
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 42
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 40
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 39
- 102100003811 P3H3 Human genes 0.000 description 32
- 108060005016 mobA Proteins 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 31
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 29
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 24
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 23
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- -1 fluorophores Substances 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 17
- 101700065476 mdr Proteins 0.000 description 17
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 16
- 102000018075 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 16
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 15
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 15
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 14
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 14
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 13
- 102000004145 Annexin A1 Human genes 0.000 description 12
- 108090000663 Annexin A1 Proteins 0.000 description 12
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 12
- 230000000865 phosphorylative Effects 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 11
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 11
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 9
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N methylene dichloride Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 8
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 8
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 7
- 102000000132 Alpha tubulin Human genes 0.000 description 7
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 7
- 102000024070 binding proteins Human genes 0.000 description 7
- 108091007650 binding proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 108050008484 Alpha tubulin Proteins 0.000 description 6
- 108050008483 Beta tubulin Proteins 0.000 description 6
- 102000000131 Beta tubulin Human genes 0.000 description 6
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 6
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 6
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 101710044921 A1G_03605 Proteins 0.000 description 5
- 229920000453 Consensus sequence Polymers 0.000 description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 5
- 101710016786 P/C Proteins 0.000 description 5
- 101700068398 PABT Proteins 0.000 description 5
- 101710045114 PX Proteins 0.000 description 5
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 5
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 5
- 101700028070 VPX Proteins 0.000 description 5
- 101700085341 YTSF Proteins 0.000 description 5
- 230000001808 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 102000000412 Annexins Human genes 0.000 description 4
- 108050008874 Annexins Proteins 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- LOUPRKONTZGTKE-LHHVKLHASA-N Quinidine Chemical compound C([C@H]([C@H](C1)C=C)C2)C[N@@]1[C@H]2[C@@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-LHHVKLHASA-N 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 4
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 4
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N (3S,6S,9S,12R,15S,18S,21S,24S,30S,33S)-30-ethyl-33-[(E,1R,2R)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17 Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 3
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000028664 Microtubules Human genes 0.000 description 3
- 108091022031 Microtubules Proteins 0.000 description 3
- 210000004688 Microtubules Anatomy 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000009114 investigational therapy Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 3
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 3
- 230000036678 protein binding Effects 0.000 description 3
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101700045737 ABCB3 Proteins 0.000 description 2
- 101700085131 ABCB4 Proteins 0.000 description 2
- 102100014002 ABCB4 Human genes 0.000 description 2
- 102100004600 ANXA2 Human genes 0.000 description 2
- 101700001858 ANXA2 Proteins 0.000 description 2
- 101710031220 Abcb1a Proteins 0.000 description 2
- 101710031223 Abcb1b Proteins 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 210000004100 Adrenal Glands Anatomy 0.000 description 2
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 2
- 102000011045 Chloride Channels Human genes 0.000 description 2
- 108010062745 Chloride Channels Proteins 0.000 description 2
- 229940119017 Cyclosporine Drugs 0.000 description 2
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 2
- 230000035695 Efflux Effects 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione Transferase family Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione Transferase family Proteins 0.000 description 2
- 101700086738 IORF Proteins 0.000 description 2
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 2
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase family Proteins 0.000 description 2
- 229920002521 Macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 101710033747 S6 Proteins 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N Verapamil Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 2
- 150000002634 lipophilic molecules Chemical class 0.000 description 2
- 108091022076 maltose binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 2
- 238000005020 pharmaceutical industry Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 229960001404 quinidine Drugs 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 2
- 125000003616 serine group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229960001722 verapamil Drugs 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N β-Alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N (2S)-2-acetamido-N-[(2S)-1-[[(2S)-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]-4-methylpentanamide Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700021108 41KD Proteins 0.000 description 1
- 101700063348 ABCB5 Proteins 0.000 description 1
- 102100017808 ABCB5 Human genes 0.000 description 1
- 102100011550 ACTB Human genes 0.000 description 1
- 101700033661 ACTB Proteins 0.000 description 1
- 101710032514 ACTI Proteins 0.000 description 1
- 102000005416 ATP-Binding Cassette Transporters Human genes 0.000 description 1
- 108010006533 ATP-Binding Cassette Transporters Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 Adenine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Natural products NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003767 Alanine Drugs 0.000 description 1
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101710002767 BACOVA_02645 Proteins 0.000 description 1
- 102000024678 Bcl-2 family Human genes 0.000 description 1
- 108091011726 Bcl-2 family Proteins 0.000 description 1
- 210000001218 Blood-Brain Barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 1
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 Breast Anatomy 0.000 description 1
- 208000000409 Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 1
- 210000001072 Colon Anatomy 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 1
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 229940104302 Cytosine Drugs 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N Cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004292 Cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptors Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 101700039191 EGFR Proteins 0.000 description 1
- 102100010782 EGFR Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular protein Proteins 0.000 description 1
- 101700043280 FST Proteins 0.000 description 1
- IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)Cl)C3=CC=CC=C3C2=C1 IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001650 Focal Adhesions Anatomy 0.000 description 1
- 102100000917 GCNT2 Human genes 0.000 description 1
- 101700024680 GCNT2 Proteins 0.000 description 1
- 101700014779 GLB1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 1
- 210000003958 Hematopoietic Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004408 Hybridomas Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N Iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102100005748 KRT18 Human genes 0.000 description 1
- 108010066327 Keratin-18 Proteins 0.000 description 1
- 102000005712 Keratin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108010070511 Keratin-8 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010024324 Leukaemias Diseases 0.000 description 1
- 208000007046 Leukemia, Myeloid, Acute Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710006307 MVA110L Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 1
- 108090000743 Multidrug resistance protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004233 Multidrug resistance protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 description 1
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N PMSF Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N Pepstatin Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 229940072417 Peroxidase Drugs 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000437 Peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 229940067631 Phospholipids Drugs 0.000 description 1
- 229920002319 Poly(methyl acrylate) Polymers 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108060006633 Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 229920001785 Response element Polymers 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102000014400 SH2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050003452 SH2 domains Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101710043164 Segment-4 Proteins 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M Sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229940113082 Thymine Drugs 0.000 description 1
- 102000002142 Trans-Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010040939 Trans-Activators Proteins 0.000 description 1
- 229920002969 Transcription factor Polymers 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710042748 UL80 Proteins 0.000 description 1
- 101700069611 US9 Proteins 0.000 description 1
- 101700038759 VP1 Proteins 0.000 description 1
- YJDYDFNKCBANTM-QCWCSKBGSA-N Valspodar Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)C(=O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC1=O YJDYDFNKCBANTM-QCWCSKBGSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 description 1
- 230000001388 anti-tubulin Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 229940000635 beta-Alanine Drugs 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006452 cellular component assembly Effects 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000739 chaotic Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 201000002797 childhood leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals Protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003107 drug analog Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000007878 drug screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 101710019483 ebgA Proteins 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 210000002375 erythropoietic cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 102000034448 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006088 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic Effects 0.000 description 1
- 101700005460 hemA Proteins 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatoms Chemical group 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppresant Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000001665 lethal Effects 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000000873 masking Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M methanoate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive Effects 0.000 description 1
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 125000000538 pentafluorophenyl group Chemical class FC1=C(F)C(F)=C(*)C(F)=C1F 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JSPCTNUQYWIIOT-UHFFFAOYSA-N piperidine-1-carboxamide Chemical compound NC(=O)N1CCCCC1 JSPCTNUQYWIIOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive Effects 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000002940 repellent Effects 0.000 description 1
- 239000005871 repellent Substances 0.000 description 1
- 230000001846 repelling Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 239000012313 reversal agent Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 231100000197 serious side effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 102000009076 src-Family Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010087686 src-Family Kinases Proteins 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained Effects 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical class [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 102000035402 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005683 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004642 transportation engineering Methods 0.000 description 1
- 239000000225 tumor suppressor protein Substances 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 230000028973 vesicle-mediated transport Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710002666 yfdG Proteins 0.000 description 1
- 239000002888 zwitterionic surfactant Substances 0.000 description 1
Description
【特許請求の範囲】
【請求項1】 選択されたタンパク質におけるペプチド領域に高い親和性で結合するポリペプチドを同定するための方法であって、該ペプチド領域が該選択されたタンパク質の反発ペプチド領域と隣接しており、
a)該選択されたタンパク質の少なくともドメインの全長配列にわたる、短いオーバーラップ(overlapping)ペプチドのセットを提供することであって、該短いオーバーラップペプチドのセットは支持体に共有結合しており;
b)該オーバーラップペプチドが共有結合している該支持体と、ポリペプチドの混合物とを、該支持体上の該ペプチドと該混合物中のポリペプチドとの間の結合が可能な条件下で接触させること;
c)該混合物中の結合しなかったポリペプチドを該支持体から洗い流すこと;
d)ポリペプチドが結合した連続したオーバーラップペプチドの第1のセットを同定することであって、該第1のセットは高い親和性でポリペプチドと結合する第1領域を含んでなり、
e)ポリペプチドが結合した連続したオーバーラップペプチドの第2のセットを同定することであって、該第2のセットは高い親和性でポリペプチドと結合する第2領域を含んでなり、該第2のセットは第1のセットと連続して存在してはおらず、
f)該第1のセットと第2のセットの間のセグメントを同定することであって、該セグメントは選択されたタンパク質の反発ペプチド領域を含んでなり、該反発ペプチド領域は高親和性ペプチド領域に隣接しており、
第一ペプチド領域および第二ペプチド領域に結合するポリペプチドは選択されたタンパク質の反発ペプチド領域に隣接するペプチド領域に高い親和性で結合するポリペプチドである、方法。
【請求項2】 支持体が、チップ、ビーズおよびプレートからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項3】 支持体に結合したオーバーラップペプチドが、選択されたタンパク質のアミノ酸配列を用いて合成される、請求項1記載の方法。
【請求項4】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜15アミノ酸である、請求項1記載の方法。
【請求項5】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜12アミノ酸である、請求項1記載の方法。
【請求項6】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜10アミノ酸である、請求項1記載の方法。
【請求項7】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜7アミノ酸である、請求項1記載の方法。
【請求項8】 ポリペプチドの混合物が細胞リゼートを含んでなる、請求項1記載の方法。
【請求項9】 選択されたタンパク質がヒトP−糖タンパク質1である、請求項1記載の方法。
【請求項10】 ポリペプチドがチューブリンである、請求項9記載の方法。
【請求項11】 選択されたタンパク質がヒトP−糖タンパク質3である、請求項1記載の方法。
【請求項12】 支持体上に保持されるポリペプチドの同定が、ウェスタン・ブロット、該ポリペプチドの標識およびその標識されたポリペプチドの同定、質量分析、2Dゲル電気泳動、並びにそれらの組合せからなる群から選択される方法によって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項13】 ポリペプチドに高い親和性で結合し、選択されたタンパク質の反発ペプチド領域に隣接する、選択されたタンパク質におけるペプチド領域を同定するための方法であって、
a)該選択されたタンパク質の少なくともドメインの全長配列にわたる、短いオーバーラップ(overlapping)ペプチドのセットを提供することであって、該短いオーバーラップペプチドのセットは支持体に共有結合しており;
b)該オーバーラップペプチドが結合している該支持体と、ポリペプチドとを、該支持体に結合したペプチドと該ポリペプチドとの間の結合が可能な条件下で接触させること;
c)結合しなかったポリペプチドを該支持体から洗い流すこと;
d)ポリペプチドが結合した連続したオーバーラップペプチドの第1のセットを同定することであって、該第1のセットは高い親和性でポリペプチドと結合する第1領域を含んでなり、
e)ポリペプチドが結合した連続したオーバーラップペプチドの第2のセットを同定することであって、該第2のセットは高い親和性でポリペプチドと結合する第2領域を含んでなり、該第2のセットは第1のセットと連続して存在してはおらず、
f)該第1のセットと第2のセットの間のセグメントを同定することであって、該セグメントは選択されたタンパク質の反発ペプチド領域を含んでなり、該反発ペプチド領域は高親和性ペプチド領域に隣接しており、
それにより、ポリペプチドに高い親和性で結合し反発ペプチド領域に隣接する選択されたタンパク質におけるペプチド領域が同定される、方法。
【請求項14】 支持体が、チップ、ビーズおよびプレートからなる群から選択される、請求項13記載の方法。
【請求項15】 支持体に結合したオーバーラップペプチドが、選択されたタンパク質のアミノ酸配列を用いて合成される、請求項13記載の方法。
【請求項16】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜15アミノ酸である、請求項13記載の方法。
【請求項17】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜12アミノ酸である、請求項13記載の方法。
【請求項18】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜10アミノ酸である、請求項13記載の方法。
【請求項19】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜7アミノ酸である、請求項13記載の方法。
【請求項20】 選択されたタンパク質がヒトP−糖タンパク質1である、請求項13記載の方法。
【請求項21】 ポリペプチドがチューブリンである、請求項20記載の方法。
【請求項22】 選択されたタンパク質がヒトP−糖タンパク質3である、請求項13記載の方法。
【請求項23】 ポリペプチドが選択されたタンパク質と結合する、選択されたタンパク質におけるペプチドを同定することをさらに含んでなる、請求項13記載の方法。
【請求項24】 ポリペプチドと結合する、選択されたタンパク質におけるペプチドが、支持体上のその位置によって同定される、請求項23記載の方法。
【請求項25】 支持体に共有結合した、選択されたタンパク質の全長配列、そのドメインまたはその一部にわたるオーバーラップペプチドのセットと、細胞タンパク質の混合物であるタンパク質の混合物との間の、高親和性ドメイン間の相互作用を調節する試薬を同定するための方法であって、
a)該オーバーラップペプチドのセットと該混合物とを、少なくとも1つの試薬の存在下、該セットのペプチドにおける高親和性相互作用ドメインと、該混合物の1またはそれ以上のタンパク質またはペプチドとの間の結合が可能な条件下でインキュベーションすること;
b)(a)の高親和性相互作用でないタンパク質−タンパク質相互作用を洗い流すこと;および
c)その試薬の非存在下と比較して、該試薬の存在下で高い親和性でもって該混合物のタンパク質またはペプチドと相互作用する(a)のペプチドを同定すること
を含んでなり、
それにより、該相互作用について該試薬の存在下と非存在下との差が測定可能であるとき、該試薬が該高親和性相互作用の調節物質として同定される、方法。
【請求項26】 タンパク質の混合物および/またはペプチドの混合物が標識を含む、請求項25記載の方法。
【請求項27】 該オーバーラップペプチドのセットが選択されたタンパク質の配列を用いて合成される、請求項25または26記載の方法。
【請求項28】 支持体が、チップ、ビーズおよびプレートから選択される、請求項25、26または27記載の方法。
【請求項1】 選択されたタンパク質におけるペプチド領域に高い親和性で結合するポリペプチドを同定するための方法であって、該ペプチド領域が該選択されたタンパク質の反発ペプチド領域と隣接しており、
a)該選択されたタンパク質の少なくともドメインの全長配列にわたる、短いオーバーラップ(overlapping)ペプチドのセットを提供することであって、該短いオーバーラップペプチドのセットは支持体に共有結合しており;
b)該オーバーラップペプチドが共有結合している該支持体と、ポリペプチドの混合物とを、該支持体上の該ペプチドと該混合物中のポリペプチドとの間の結合が可能な条件下で接触させること;
c)該混合物中の結合しなかったポリペプチドを該支持体から洗い流すこと;
d)ポリペプチドが結合した連続したオーバーラップペプチドの第1のセットを同定することであって、該第1のセットは高い親和性でポリペプチドと結合する第1領域を含んでなり、
e)ポリペプチドが結合した連続したオーバーラップペプチドの第2のセットを同定することであって、該第2のセットは高い親和性でポリペプチドと結合する第2領域を含んでなり、該第2のセットは第1のセットと連続して存在してはおらず、
f)該第1のセットと第2のセットの間のセグメントを同定することであって、該セグメントは選択されたタンパク質の反発ペプチド領域を含んでなり、該反発ペプチド領域は高親和性ペプチド領域に隣接しており、
第一ペプチド領域および第二ペプチド領域に結合するポリペプチドは選択されたタンパク質の反発ペプチド領域に隣接するペプチド領域に高い親和性で結合するポリペプチドである、方法。
【請求項2】 支持体が、チップ、ビーズおよびプレートからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項3】 支持体に結合したオーバーラップペプチドが、選択されたタンパク質のアミノ酸配列を用いて合成される、請求項1記載の方法。
【請求項4】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜15アミノ酸である、請求項1記載の方法。
【請求項5】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜12アミノ酸である、請求項1記載の方法。
【請求項6】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜10アミノ酸である、請求項1記載の方法。
【請求項7】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜7アミノ酸である、請求項1記載の方法。
【請求項8】 ポリペプチドの混合物が細胞リゼートを含んでなる、請求項1記載の方法。
【請求項9】 選択されたタンパク質がヒトP−糖タンパク質1である、請求項1記載の方法。
【請求項10】 ポリペプチドがチューブリンである、請求項9記載の方法。
【請求項11】 選択されたタンパク質がヒトP−糖タンパク質3である、請求項1記載の方法。
【請求項12】 支持体上に保持されるポリペプチドの同定が、ウェスタン・ブロット、該ポリペプチドの標識およびその標識されたポリペプチドの同定、質量分析、2Dゲル電気泳動、並びにそれらの組合せからなる群から選択される方法によって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項13】 ポリペプチドに高い親和性で結合し、選択されたタンパク質の反発ペプチド領域に隣接する、選択されたタンパク質におけるペプチド領域を同定するための方法であって、
a)該選択されたタンパク質の少なくともドメインの全長配列にわたる、短いオーバーラップ(overlapping)ペプチドのセットを提供することであって、該短いオーバーラップペプチドのセットは支持体に共有結合しており;
b)該オーバーラップペプチドが結合している該支持体と、ポリペプチドとを、該支持体に結合したペプチドと該ポリペプチドとの間の結合が可能な条件下で接触させること;
c)結合しなかったポリペプチドを該支持体から洗い流すこと;
d)ポリペプチドが結合した連続したオーバーラップペプチドの第1のセットを同定することであって、該第1のセットは高い親和性でポリペプチドと結合する第1領域を含んでなり、
e)ポリペプチドが結合した連続したオーバーラップペプチドの第2のセットを同定することであって、該第2のセットは高い親和性でポリペプチドと結合する第2領域を含んでなり、該第2のセットは第1のセットと連続して存在してはおらず、
f)該第1のセットと第2のセットの間のセグメントを同定することであって、該セグメントは選択されたタンパク質の反発ペプチド領域を含んでなり、該反発ペプチド領域は高親和性ペプチド領域に隣接しており、
それにより、ポリペプチドに高い親和性で結合し反発ペプチド領域に隣接する選択されたタンパク質におけるペプチド領域が同定される、方法。
【請求項14】 支持体が、チップ、ビーズおよびプレートからなる群から選択される、請求項13記載の方法。
【請求項15】 支持体に結合したオーバーラップペプチドが、選択されたタンパク質のアミノ酸配列を用いて合成される、請求項13記載の方法。
【請求項16】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜15アミノ酸である、請求項13記載の方法。
【請求項17】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜12アミノ酸である、請求項13記載の方法。
【請求項18】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜10アミノ酸である、請求項13記載の方法。
【請求項19】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが5アミノ酸〜7アミノ酸である、請求項13記載の方法。
【請求項20】 選択されたタンパク質がヒトP−糖タンパク質1である、請求項13記載の方法。
【請求項21】 ポリペプチドがチューブリンである、請求項20記載の方法。
【請求項22】 選択されたタンパク質がヒトP−糖タンパク質3である、請求項13記載の方法。
【請求項23】 ポリペプチドが選択されたタンパク質と結合する、選択されたタンパク質におけるペプチドを同定することをさらに含んでなる、請求項13記載の方法。
【請求項24】 ポリペプチドと結合する、選択されたタンパク質におけるペプチドが、支持体上のその位置によって同定される、請求項23記載の方法。
【請求項25】 支持体に共有結合した、選択されたタンパク質の全長配列、そのドメインまたはその一部にわたるオーバーラップペプチドのセットと、細胞タンパク質の混合物であるタンパク質の混合物との間の、高親和性ドメイン間の相互作用を調節する試薬を同定するための方法であって、
a)該オーバーラップペプチドのセットと該混合物とを、少なくとも1つの試薬の存在下、該セットのペプチドにおける高親和性相互作用ドメインと、該混合物の1またはそれ以上のタンパク質またはペプチドとの間の結合が可能な条件下でインキュベーションすること;
b)(a)の高親和性相互作用でないタンパク質−タンパク質相互作用を洗い流すこと;および
c)その試薬の非存在下と比較して、該試薬の存在下で高い親和性でもって該混合物のタンパク質またはペプチドと相互作用する(a)のペプチドを同定すること
を含んでなり、
それにより、該相互作用について該試薬の存在下と非存在下との差が測定可能であるとき、該試薬が該高親和性相互作用の調節物質として同定される、方法。
【請求項26】 タンパク質の混合物および/またはペプチドの混合物が標識を含む、請求項25記載の方法。
【請求項27】 該オーバーラップペプチドのセットが選択されたタンパク質の配列を用いて合成される、請求項25または26記載の方法。
【請求項28】 支持体が、チップ、ビーズおよびプレートから選択される、請求項25、26または27記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【0001】
(発明の分野)
本発明は、プロテオノミクス(proteonomics)に関する。さらに具体的には、本発明は、タンパク質間相互作用、並びに相互作用するタンパク質および相互作用部位のアミノ酸配列を同定するための方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
特異的なタンパク質間相互作用は、生物学的過程において非常に重要な事象である。細胞の情報の流れを処理し細胞の決定をコントロールする生物学的過程は、タンパク質間相互作用に支配される(例えば、情報伝達、細胞周期の調節および細胞構造の組み立て)。細胞のタンパク質間相互作用の全ネットワークは、生体内の活動および外部の情報に対するその生体の応答を調節する機能的な事象の生物学的なチャートである。この生物学的な相互作用のチャートの完成に欠くことのできない工程は、ある特定の生体におけるすべての遺伝子配列に関する知識である。ホモサピエンスゲノムの全DNA配列は、少なくとも2003年までには完成するであろう(112)。あいにく、遺伝子の配列は、その生物学的機能も生物学的なチャートにおけるその位置付けも明らかにするものではない。ヒトゲノムにおけるタンパク質の数は予想されており(80,000〜120,000)、タンパク質間相互作用の生物学的なチャートのマッピングは途方もない事業ではあるがやり甲斐はある。
【0003】
過去20〜30年の間に、タンパク質間相互作用を測定するための技術がいくつか開発されている(参考として(82)参照)。これらの技術には、i)相互作用するタンパク質を選択し検出する物理的な方法[例えばタンパク質アフィニティークロマトグラフィー、共免疫沈降、架橋、およびアフィニティーブロッティング]、ii)ライブラリーに基づく方法[例えば、ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステム];およびiii)遺伝的方法[例えば過剰産生表現型、合成的致死効果(synthetic lethal effects)および同一連鎖群に属さない非相補性(unlinked noncomplementaion)]が含まれる。タンパク質間相互作用を検出する上記の方法のうち、ツーハイブリッドシステムが最も一般的で、最も広く使用されている。古典的なツーハイブリッドシステム(30)では、リポーター遺伝子の転写が、DNAが結合した“おとり”タンパク質と、活性化ドメインを含む“捕獲”タンパク質との間の相互作用に依存する。あいにく、ツーハイブリッドシステムは多くの欠点に悩まされることがある。例えば、タンパク質の相互作用は、大部分のタンパク質が存在する細胞質ではなく核周囲で観察され、2つの相互作用するタンパク質の間の正確なアミノ酸配列が同時に同定できず、異なる相互作用するタンパク質が発現し得る異なる細胞種または組織に対して容易に応用することができない。
【0004】
小さい合成ペプチドがタンパク質に結合することができることは以前に実証されている(1、18、55、102)。しかし、相互作用するタンパク質ドメインおよび配列を同定する系統的手法における合成ペプチドの使用は提唱も提供もされていない。ある特定のシグネイチャードメインは、特定のペプチド配列に高い親和性で結合することが示されている(例えば、SrcファミリーキナーゼのSrcホモロジー−2またはSH2ドメインは、上皮成長因子受容体およびフォーカルアドヒージョンキナーゼにおいてみられるリン酸化されたチロシン(Y*−EEI)配列に強固に結合する)(61)。
【0005】
したがって、i)相互作用するタンパク質間の少なくとも1つの結合パートナーの正確なアミノ酸配列;ii)異なる細胞または組織における、多くの、恐らくはすべての相互作用するタンパク質;およびiii)リード薬物の単離の標的としての、2つの相互作用するタンパク質間の特定のドメイン(または配列)の同定を可能にする方法を提供する必要がある。さらに、従来の方式よりも著しく速い(例えば、数か月ではなく数日)、タンパク質の相互作用ドメインの正確なアミノ酸配列の同定を可能にする方法および分析を提供する必要がある。
【0006】
本発明は、これらおよび他の必要性を満たすことを目的とする。
【0007】
本記載は、数多くの文献を参考のために引用し、その全内容が本明細書の一部を構成する。
【0008】
(発明の要約)
本発明は、従来技術の欠点を克服することを目的とする。より具体的には、本発明は、従来技術と異なるタンパク質間相互作用ドメインを同定するための方法に関する。さらに、本発明の1つの方法は、タンパク質間相互作用を支配する原理についての理解に基づいている。したがって、そのような理解は、いくつかの方法の使用を可能にする。以下に、次のものを同定するためのそのような方法が詳細に例示される:i)相互作用するタンパク質間の少なくとも1つの正確なアミノ酸配列;ii)異なる細胞または組織における、多くの、恐らくはすべての相互作用するタンパク質;およびiii)リード薬物の単離の標的としての、2つの相互作用するタンパク質間の特定のドメイン(または配列)。好ましくは、本発明の方法および分析は、i)、ii)およびiii)の測定を可能にする。さらに、従来技術の手法と異なり、本明細書に記載の方法は、相互作用するタンパク質および相互作用の正確なアミノ酸配列の同定が数か月ではなく数日で可能である。
【0009】
ある遺伝子産物といくつかのパートナーその他との間の相互作用をブロックするタンパク質(あるいはその他の分子)を選択する能力は、ヒト細胞や他の現在取り扱いが難しい系における、細胞情報伝達または細胞代謝の高度な調節を可能にする。実際、治療上重要なタンパク質と相互作用するタンパク質の同定、および相互作用部位の同定は、“ノックアウト”などの他の遺伝的手法(71)よりも医薬品開発に適しているかもしれない。これは、多量体の複合体における1つのタンパク質(すべてではなく、せいぜい2、3個のタンパク質)の相互作用を阻害するのとは異なり、ある特定のタンパク質が関与するすべての相互作用を破壊することによる、表現型における帰結を取り扱うものである。
【0010】
本発明はさらに、薬物の発見における新規の手法に関する。疾患を処置するための薬物の開発における主な障害は、標的タンパク質とその機能部位の同定であった。事実、製薬会社における大部分の研究開発(R&D)事業は、有効な標的タンパク質を同定するまでに数年を要する。結合してこれらのタンパク質の機能を阻害する薬物の選択には数年を要し、一般的にこれは非特異的で無秩序なものである。さらに、現在の手法によって同定される薬物は、タンパク質の活性部位を標的としていることが多い。つまり、そのような薬物は重大な副作用につながることが多い。したがって、多くのR&D事業が徹底的な研究努力を3〜5年続けても具体的な薬物の開発に決してつながらないというのは、驚くべきことではない。本発明のタンパク質間相互作用を同定するための方法および分析は、薬物の開発における次の3つの重要な工程を扱うものである:
1)標的タンパク質における相互作用するすべてのドメインのアミノ酸配列の同定;
2)薬物開発のための、相互作用するタンパク質(好ましくは相互作用するすべてのタンパク質)のセットの同定;および
3)標的タンパク質において相互作用するドメインの各々に対して特異的な薬物のスクリーニング。
【0011】
P−糖タンパク質(P−gp)は、親油性の抗癌剤で選択された腫瘍細胞系において多剤耐性を引き起こすことが示されている。P−gpアミノ酸配列の解析は、約90アミノ酸の高度に荷電した領域、即ちリンカードメイン、によって連結された2つの疎水性と親水性のドメインを有する二重分子の提唱モデルが導かれた。同じように荷電したドメインがP−gpスーパーファミリーの他の分子において見つかっているが、このドメインの機能はわかっていない。本発明の方法を用いて、このドメインが他の細胞タンパク質と結合することをここに実証する。ヒトのP−糖タンパク質遺伝子1および3(HP−gp1およびHP−gp3)のリンカードメインの全アミノ酸配列にわたる、オーバーラップへキサペプチドを用いて、HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインと細胞内タンパク質との間の直接的且つ特異的な結合がここに示される。リンカードメインにおける3つの異なる鎖(HP−gp1に対しては617EKGIYFKLVTM627 (配列番号1), 658SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA677 (配列番号2)および694PVSFWRIMKLNLT706 (配列番号3)そしてHP−gp3に対しては618LMKKEGVYFKLVNM631 (配列番号4), 648KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS674 (配列番号5)および695PVSFLKVLKLNKT677 (配列番号6))が、みかけの分子量約80kDa、57kDaおよび30kDaを有するタンパク質と特異的に結合する。興味深いことに57kDaのタンパク質だけが、リンカードメインの3つの異なる配列に、変化する程度でもって結合した。リンカー配列をコードするオーバーラップペプチドと57kDaのタンパク質との間の結合は、両イオン性界面活性剤であるCHAPSに対して耐性であったが、SDSには感受性であった。57kDaのタンパク質の精製と部分的なN−末端アミノ酸配列の分析は、それがαおよびβチューブリンのN−末端をコードしていることを示した。さらに、αおよびβチューブリンに結合するモノクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティング分析によって、57kDaのタンパク質との同一性が確認された。これらをまとめると、これは、P−gpリンカードメインとのタンパク質相互作用を示す最初の例である。もちろん、これはP−gpの全体の機能に重要かもしれない。より重要なことに、この研究の結果は、高い反発性の結合エネルギーを有する少数のアミノ酸の鎖が2つのタンパク質間の相互作用に関わるという、新しい概念を実証するものである。
【0012】
本発明の1つの態様に従えば、選択されたタンパク質、そのドメインまたはその一部における、高い親和性で相互作用するドメインおよびそのアミノ酸配列を同定するための方法であって、
a)選択されたタンパク質、そのドメインまたはその一部の配列の全長にわたる、共有結合により支持体に結合したオーバーラップペプチドのセットを用意すること;
b)タンパク質の混合物および/またはペプチドの混合物を用意すること;
c)(a)記載のオーバーラップペプチドのセットと(b)記載の混合物とを、そのセットのペプチドにおける高い親和性で相互作用するドメインと(b)記載のタンパク質またはペプチドの1またはそれ以上との間の結合を可能にする条件下でインキュベーションすること;
d)(c)の高い親和性の相互作用でないタンパク質間相互作用を洗い流すこと;および
e)(a)記載のどのペプチドが、(b)記載のタンパク質またはペプチドと高い親和性で相互作用するかを同定すること
を含み、それによって(e)のペプチドおよびその配列が高い親和性で相互作用するドメインとして同定される、方法が提供される。
【0013】
本発明の別の態様によれば、選択されたタンパク質、そのドメインまたはその一部の配列の全長にわたる、共有結合により支持体に結合したオーバーラップペプチドのセットと、タンパク質の混合物および/またはペプチドの混合物との間の、高い親和性で相互作用するドメイン間の相互作用を調節する物質を同定するための方法であって、
a)そのオーバーラップペプチドのセットと、その混合物とを、そのセットのペプチドにおける高い親和性で相互作用するドメインと、その混合物のタンパク質またはペプチドの1またはそれ以上との間の結合を可能にする条件下、少なくとも1つの物質の存在下でインキュベーションすること;
b)(b)の高い親和性の相互作用でないタンパク質間相互作用を洗い流すこと;および
c)(a)記載のどのペプチドが、その混合物のタンパク質またはペプチドと、その物質の存在下で、その物質の非存在下と比較して高い親和性で相互作用するかを同定すること
を含み、それによって、その物質の存在下での相互作用に、その物質の非存在下での相互作用に対する測定できる差異があるとき、その物質が高い親和性の相互作用の調節物質として同定される、方法が提供される。
【0014】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の高い親和性のタンパク質の相互作用の調節物質として同定された物質が提供される。
【0015】
本発明において、次の略語および用語を以下に定義する。
【0016】
定義
用語「ペプチド配列にわたるオーバーラップペプチド」(例えばドメイン、完全長のタンパク質配列またはその一部)などは、そのタンパク質(またはその一部)の配列に基づく、選択された大きさのペプチドを意味する。好ましくは、これらのペプチドは合成ペプチドである。
【0017】
以下に説明されるように、オーバーラップペプチドの大きさは本発明の作用に重要な影響を及ぼし得る。例えば、隣接する4個のアミノ酸のペプチドは、それに対するタンパク質の低い親和性の結合を有意に増加させるようである。さらに、例えば20アミノ酸以上の、より大きなペプチドの使用は、高い親和性のアミノ酸に対する反発性のアミノ酸の比率を増加させると予想され、そのために、そのペプチドに特異的なタンパク質の結合がマスキングされるかまたは全体的に阻害される。したがって、より大きなペプチドではなく、小さいペプチドの選択に関して交換条件が存在すると当業者は理解するであろうが、本発明のオーバーラップペプチドに好ましい大きさは、5〜15アミノ酸、より好ましくは5〜12アミノ酸、さらに特に好ましくは5〜10アミノ酸である。
【0018】
本発明のオーバーラップペプチドが共有結合している支持体に関して、用語「支持体」は、当分野において得られる多数の支持体から選択することができる。そのような支持体には、チップ、プレート(例えば96ウェルプレート)、ガラスビーズなどが含まれる。チップ法は当分野ではよく知られている(10、19、24、26、85、97)。
【0019】
タンパク質配列は、IUPAC−IUBの生化学命名委員会の推奨に従って、当分野において一般的に使用されるような1文字または3文字のアミノ酸表記を用いて本明細書において示す。
【0020】
特記しないかぎり、本明細書において使用される学術用語および技術用語および命名法は、本発明に関係する当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学的方法などの手順は、当分野において用いられている一般的な方法である。そのような標準的な技術は、 レファレンスマニュアルに見ることができる(4、96)。
【0021】
本明細書の記載は、 主としてタンパク質、または組み換えDNA(rDNA)技術の用語に言及するものである。選択された例示は、明瞭かつ一貫させるために記載するものである。
【0022】
本明細書において用いられているように、「核酸分子」は、ヌクレオチドのポリマーを意味する。その非限定的な例には、DNA(例えばゲノムDNA、cDNA)およびRNA分子(例えばmRNA)が含まれる。核酸分子はクローニング技術によって得るかあるいは合成することができる。DNAは二本鎖でも一本鎖でもよい(コード鎖または非コード鎖[アンチセンス])。
【0023】
当分野で知られている用語「組換えDNA」は、DNA断片の連結によって生じるDNA分子を意味する。これはしばしば遺伝子操作と呼ばれる。用語「DNA断片」は、ヌクレオチドの直鎖状の鎖または配列を含んでなるDNA分子を意味するために本明細書において用いられる。遺伝暗号に従って読まれれば、この配列は、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片などと呼ばれるアミノ酸の直鎖状の鎖または配列をコードすることができる。
【0024】
用語「増幅ペア」は本明細書において、本発明のオリゴヌクレオチド(オリゴ)のペアを意味し、これは多くのタイプの増幅方法うちの1つ、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応による、選択された核酸配列の増幅において一緒に使用されるために選択されるものである。他のタイプの増幅方法には、以下により詳細に説明されるように、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅または核酸配列に基づく増幅が含まれる。当分野において一般に知られているように、オリゴは、選択された条件下で相補的な配列に結合するように設計する。
【0025】
本発明を実施するための核酸(例えばDNAまたはRNA)は、よく知られた方法によって得ることができる。
【0026】
本明細書において用いられているように、用語「生理学上関連のある」は、1以上のタンパク質の自然環境における活性またはレベルを調節する効果をもたらす相互作用を記述することを意味する。
【0027】
用語「DNA」分子または配列(時として用語「オリゴヌクレオチド」も同様)は、デオキシリボヌクレオチドである、アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)および/またはシトシン(C)からなる二本鎖の形態の分子を意味し、本明細書において定義される用語として本発明の「調節エレメント」からなるかまたはそれを含む。用語「オリゴヌクレオチド」または「DNA」は、直鎖状のDNA分子または断片、ウィルス、プラスミド、ベクター、染色体または合成によって得られたDNAに見られる。本明細書において使用されるように、具体的な二本鎖DNA配列は、通常の規定にしたがい、5'から3'方向の配列のみで記述することができる。
【0028】
「核酸ハイブリダイゼーション」は、適当な条件下で熱力学的に有利な二本鎖構造を形成する相補的な塩基配列を有する2本の一本鎖核酸分子のハイブリッド形成を意味する。ハイブリダイゼーション条件の例は、上に引用した2つの実験マニュアルにみつけることができ(4,96)、当分野において一般的に知られている。ニトロセルロースフィルターへのハイブリダイゼーションの場合では、よく知られたサザンブロッティング法における例に関して、ニトロセルロースフィルターを、50%のホルムアミド、ハイソルト(5×SSCまたは5×SSPE)、5×Denhardt溶液、1%SDSおよび100のμg/mL変性キャリアーDNA(例えば、サケ精子DNA)を含む溶液中で標識プローブを用いて65℃で一晩インキュベーションすることができる。次いで、非特異的に結合したプローブを、2×SSC/0.1%SDS中、所期のストリンジェンシーを考慮して選択された温度、即ち、室温(低いストリンジェンシー)、42℃(中程度のストリンジェンシー)または65℃(高いストリンジェンシー)にて、数回洗浄することによりフィルターから洗い流すことができる。選択された温度は、DNAハイブリッドの融解温度(Tm)に基づく。もちろん、RNA−DNAハイブリッドも形成させ検出することができる。そのような場合、ハイブリダイゼーションと洗浄の条件を、当業者によく知られた方法にしたがって適合させることができる。ストリンジェントな条件が好ましく用いられるであろう(96)。
【0029】
核酸のためのプローブは、天然の糖リン酸骨格並びに、ホスホロチオエート、ジチオネート、アルキルホスホネート、およびα−ヌクレオチドなどを含む修飾された骨格を利用することができる。修飾された糖リン酸骨格は、 一般に教示されている(73,75)。本発明のプローブは、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)のいずれか、好ましくはDNAから構築することができる。
【0030】
本発明の利点は、タンパク質および/またはペプチド間の相互作用の検出が標識に依存するということである。そのような標識によって感度がもたらされ、自動化が可能になる。本発明の1つの態様では、チップ法を用いて自動化を行なう。例えば、タンパク質の選択された配列にわたるオーバーラップペプチドをチップに結合し、その後、タンパク質またはペプチドとの相互作用についての試験を自動化するためにそれを使用することができる。もちろん、選択されたタンパク質配列にわたるオーバーラップペプチドのセットの設計や合成に、本発明が厳密に依存するわけではないことは理解すべきである。実際、ペプチドのバンクが利用可能であり、そこからこのオーバーラップペプチドのセットを構築することができる。
【0031】
タンパク質の標識は当分野においてよく知られている。標識の非限定的な例は、3H、14C、32Pおよび35Sが含まれる。検出可能なマーカーの非限定的な例には、リガンド、蛍光体、化学発光剤、酵素および抗体が含まれる。特定の標識の選択によって、その標識のタンパク質に対する結合様式が決まるということは当業者には明らかであろう。
【0032】
例えば、この相互作用は、プロテオミクス的手法(例えば2Dゲルおよび質量分析法)を用いて評価することができるので、相互作用の同定は、タンパク質の標識には特に依存するものではない。
【0033】
一般に知られているように、放射性アミノ酸を、いくつかのよく知られ た方法によって本発明のペプチドまたはタンパク質に組み込むことができる。その非限定的な例には、35SMetを用いる、タンパク質のインビトロまたはインビボ標識が含まれる。
【0034】
用語「ベクター」は、当分野において一般に知られており、プラスミドDNA、ファージDNA、ウイルスDNAなどであり、これらは、本発明のDNAがそこへクローニングされるDNAビークルとしてはたらく。数多くのタイプのベクターが存在し、当分野においてよく知られている。
【0035】
用語「発現」は、遺伝子がmRNAへ転写され(転写)、次いでmRNAが1以上のポリペプチド(あるいはタンパク質)に翻訳される(翻訳)過程を定義するものである。
【0036】
用語「発現ベクター」は、上記のベクターまたはビークルであるが、宿主内への形質転換後に挿入された配列の発現を可能にするよう設計されたベクターまたはビークルとして定義される。クローニングされた遺伝子(挿入された配列)は、通常、プロモーター配列のような制御エレメントの制御下に置かれる。そのような制御配列下でのクローニングされる遺伝子の配置は、しばしば、制御エレメントまたは配列を制御するために作動可能なように連結された、と呼ばれる。
【0037】
作動可能なように連結された配列は、さらに同じRNA転写物に転写された2つの断片を含んでいる。即ち、プロモーターおよび「リポーター配列」のような2つの配列は、プロモーターにおける転写の開始によってレポーター配列のRNA転写物が産生されるならば、作動可能なように連結している。「作動可能なように連結され」るためには、2つの配列が互いに直接隣接していることは必要ではない。
【0038】
発現制御配列は、ベクターが原核生物または真核生物の宿主あるいはその両方(シャトルベクター)において作動可能なように遺伝子を発現するよう設計されているか否か、およびエンハンサーエレメント、終止配列、組織特異的エレメントおよび/または翻訳開始および終止部位などの転写要素をさらに含むことができるか否かに依存して変わるであろう。
【0039】
原核生物での発現は、目的のDNA配列によってコードされる大量のタンパク質の製造に有用である。このタンパク質は、大きさや電荷などのそのタンパク質固有の特性を利用した標準的なプロトコル(例えばSDSゲル電気泳動、ゲルろ過、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィーなど)にしたがって精製することができる。さらに、目的のタンパク質は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。精製されたタンパク質は、治療的適用のために使用することができる。
【0040】
DNA構築物は、本発明のオリゴヌクレオチド配列に作動可能なように連結されたプロモーターを含むベクターであり、本発明のオリゴヌクレオチド配列もまた、ルシフェラーゼリポーター分子の遺伝子などのヘテロローガスな遺伝子に作動可能なように連結されている。「プロモーター」は、細胞内のRNAポリメラーゼに直接的または間接的に結合することができ、下流の(3'方向)、コード配列の転写を開始することができるDNA調節領域を意味する。本発明において、プロモーターは転写開始部位とその3'末端で結合し、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要最小限の数の塩基またはエレメントを含むように上流に(5'方向)伸びる。プロモーター内では、転写開始部位(S1ヌクレアーゼによるマッピングにより便利に定義される)、並びにRNAポリメラーゼの結合をつかさどる結合ドメイン(コンセンサス配列)がみられる。真核生物のプロモーターは、常にではないが、「TATA」ボックスおよび「CCAT」ボックスを含んでいることが多い。原核生物のプロモーターは、−10および−35のコンセンサス配列に加えて、シャイン−ダルガノ配列を含んでいる。
【0041】
本明細書において用いられている表示「機能的誘導体」は、核酸配列かアミノ酸配列かにかかわらず配列の機能的誘導体という意味において、もとの配列の生物学的活性と実質的に同様である生物学的活性(機能または構造のいずれか)を保持している分子を意味する。この機能的誘導体または等価物は、天然の誘導体でも、あるいは合成によって製造されたものでのよい。そのような誘導体には、1またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列が含まれるが、但し、そのタンパク質の生物学的活性は保存されている。配列の生物学活性が一般に維持されるかぎり、同じことが、1またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有する核酸配列の誘導体にも当てはまる。タンパク質配列に関して、置換するアミノ酸は、置換されるアミノ酸の物理化学的性質と類似の物理化学的性質を有するものである。類似の物理化学的性質には、電荷、かさばり、疎水性、親水性などにおける類似が含まれる。用語「機能的誘導体」は、本発明の主題の「断片」、「部分」、「変異体」、「類縁体」または「化学的誘導体」が含まれる。
【0042】
当分野においてよく知られているように、アミノ酸の「保存的な突然変異または 置換」は、
1)ポリペプチドの骨格の構造(例えば、βシートまたはαヘリックス構造);
2)アミノ酸の電荷または疎水性;または
3)側鎖のかさばり
を維持する突然変異または置換を意味する。より具体的には、よく知られている用語「親水性残基」は、セリンまたはトレオニンを意味する。「疎水性残基」は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンを意味する。「正に荷電した残基」は、リジン、アルギニンまたはヒスチジンを意味する。「負に荷電した残基」は、アスパラギン酸またはグルタミン酸を意味する。「かさばった側鎖」を有する残基は、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンを意味する。
【0043】
本発明のペプチド、タンパク質断片などは、よく知られている方法に従って、その配列に依存してまたは無関係に修飾することができる。例えば、ペプチドは、1、2、3またはそれ以上の位置での保存的なアミノ酸置換を用いて、図面において例示された野生型の配列から得ることができる。用語「保存的なアミノ酸置換」は、当分野においてよく知られており、特定のアミノ酸を同様の特性を有するアミノ酸で置換すること(例えばグルタミン酸に対してアスパラギン酸、またはロイシンに対してイソロイシン)を意味する。もちろん、非保存的なアミノ酸置換、並びに欠失または挿入などのその他のタイプの修飾も行なうことができるが、但し、これらの修飾は、ペプチドを適当なやり方で(例えば、これが修飾によって意図するものであれば、そのペプチドの生物学的な活性に影響を及ぼすことなく)修飾するものである。典型的な保存的なアミノ酸置換の一覧を以下に示す。
【表1】
【0044】
この表からわかるように、これらの修飾のうちのいくつかをタンパク質分解により強いペプチドを得るために使用することができる。もちろん、ペプチドの修飾も、当分野においてよく知られているように、酵素または化学的な処理を用いて、その主要な配列に影響を及ぼすことなく行なうことができる。
【0045】
このように、本明細書において、用語「変異体」は、本発明のタンパク質または核酸に、構造および生物学的活性において本質的に類似しているタンパク質または核酸分子を意味する。
【0046】
本発明の機能的誘導体は、当分野においてよく知られている方法を用いて、化学的に合成するかまたは組換えDNA技術によって製造することができる。本発明の1つの具体的な態様では、本発明の変異体は本発明の方法によって同定することができる。さらに、それは、特定のアミノ酸の保存性について正式に試験するために設計することができる(例えば、変異体または突然変異ペプチドの合成によって)。これらの変異体は、相互作用を確認するために、タンパク質の完全長の配列の一部として試験することもできる。もちろん、当業者は、高い親和性のタンパク質相互作用に関与する領域として選択されたタンパク質の領域の同定が、この領域の構造と機能の関連を同定し分析するための、この領域のインビトロ突然変異誘発(または関連するペプチド配列の試験)を可能にすることを理解するであろう。そのような方法は当業者によく知られている。2つのタンパク質の相互作用するドメインが同定されれば、当業者は、相互作用するタンパク質に対し、修飾された親和性を有する変異体を同定および/または設計することが可能である。もちろん、相互作用する配列が両方ともわかっていれば、これらの間の高い親和性の相互作用を支配する構造と機能の関連性を分析することが強く求められるであろう。
【0047】
本明細書において用いられる、「化学的誘導体」は、通常、本発明の主要部ではないさらなる化学的部分を包含することを意味する。そのような部分は、その誘導体の物理化学的特性(例えば、可溶性、吸収、半減期など、毒性の減少)に影響するであろう。そのような部分は、Remington's Pharmaceutical Sciences (88)に例示されている。これらの物理化学的部分をポリペプチドにカップリングする方法は、当分野においてよく知られている。
【0048】
用語「対立遺伝子」は、染色体上のある特定の座を占める遺伝子の二者択一的形態を定義するものである。
【0049】
一般に知られているように、「突然変異」は、娘細胞へ伝達され得る遺伝物質における検出可能な変化である。よく知られているように、突然変異は、例えば1またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドにおける検出可能な変化である。例えば、ヌクレオチドは、付加、欠失または置換されているか、反転しているか、または新しい位置へ転位することがある。偶発的な突然変異および実験的に誘発された突然変異がある。核酸分子の突然変異の結果が突然変異核酸分子である。突然変異体ポリペプチドは、この突然変異核酸分子からコードされる。
【0050】
本明細書において用いられるように、用語「精製された」は、細胞成分から分離された分子を意味する。したがって、例えば、「精製されたタンパク質」は、自然界で見つからない程度まで精製されている。「実質的に純粋な」分子は、大部分の他の細胞成分を含まない分子である。
【0051】
本明細書において使用される用語「分子」、「化合物」または「リガンド」は天然の分子、合成分子または半合成分子、または化合物を意味するために、交換可能なようにそして広く用いられる。したがって、用語「分子」は、例えば、化学物質、巨大分子、細胞または組織の抽出物(植物または動物由来)などを意味する。分子の非制限的な例には、核酸分子、ペプチド、抗体、炭水化物および医薬的作用物質が含まれる。作用物質は、ランダムスクリーニング、合理的選択、例えばコンピュータモデリングのようなタンパク質またはリガンドのモデリングを用いた合理的設計によって、コンビナトリアルライブラリースクリーニングなどを含む様々な手段によって選択しスクリーニングすることができる。用語「合理的に選択された」または「合理的に設計された」は、本発明の相互作用領域の構造に基づいて選択された化合物を意味し定義するものである。当業者によって理解されるように、天然に存在しない修飾を有する巨大分子も、用語「分子」の範囲に含まれる。例えば、製薬産業においてよく知られ、ペプチド類縁体として一般に呼ばれているペプチド模擬体(peptidomimetics)は、上記のモデリングによって作製することができる。同様に、好ましい態様では、本発明のポリペプチドを、その安定性を高めるために修飾する。ほとんどの場合、この修飾は相互作用領域の生物学的活性に変化を及ぼすものではないと理解すべきである。本発明の教示に従って同定された分子は、細胞および/または組織の生理機能またはホメオスタシスが本発明に従って同定される高い親和性のタンパク質相互作用によって危険にさらされるような疾患または状態において治療上の価値を有する。あるいは、本発明の教示に従って同定された分子は、そのような相互作用を調節することができるより効果的な物質の開発に有用である。
【0052】
化合物のライブラリー(公に利用可能または商業的に利用可能の、例えばコンビナトリアルライブラリー)は、当分野においてよく知られている。ペプチドのライブラリーも利用可能である。そのようなライブラリーは、選択されたドメイン、タンパク質またはその一部にわたるオーバーラップペプチド配列のセットを構築するために使用することができる。
【0053】
本明細書において用いられるように、「指標細胞」は、1つの具体的な態様において、本発明の2つの相互作用するペプチドドメインを発現する細胞を意味し、ここで、これらのタンパク質または相互作用するそのドメイン間の相互作用が、その相互作用が評価または確認されるような同定可能か選択可能な表現型あるいは特性と結びついている。そのような指標細胞も、本発明のスクリーニング分析において使用することができる。ある態様では、指標細胞は、選択された誘導体、断片、相同体またはこれらの相互作用するドメインの突然変異体を発現するように処理を施されている。細胞は、酵母細胞または哺乳類細胞(WO96/41169)などの高等真核生物細胞でもよい。1つの具体的な態様では、指標細胞は、当分野においてよく知られた、ツーハイブリッドシステム法の使用を可能にするベクターを有する酵母細胞(4)であり、化合物またはそのライブラリーを試験するために使用することができる。1つの態様では、選択可能なマーカーまたは分析可能なタンパク質をコードするリポーター遺伝子を、その選択可能なマーカーまたは分析可能なタンパク質の発現がタンパク質Aおよびタンパク質Bドメインの相互作用に依存するように、制御エレメントと作動可能なように連結することができる。そのような指標細胞は膨大な分子の高速大量処理での迅速スクリーニングに使用することができる。具体的な態様では、リポーター遺伝子がルシフェラーゼまたはβ−Galである。
【0054】
1つの態様では、本発明の2つの相互作用するタンパク質またはドメインのうちの少なくとも1つが、融合タンパク質として提供されていてもよい。そのための構築物の設計、および融合タンパク質の発現と産生は当分野においてよく知られている(4,96)。具体的な態様では、両方の相互作用領域が融合タンパク質の一部である。そのような融合タンパク質の非限定的な例には、Lex−Aタンパク質A融合(DNA結合ドメイン−タンパク質A;おとり(bait))およびB42タンパク質B融合(トランス活性化因子ドメイン−タンパク質B;捕獲(prey))を含んでいる。さらに具体的な態様では、Lex−Aタンパク質A融合およびB42タンパク質B融合タンパク質を、LexAオペレーターおよび/またはLexA応答エレメントに作動可能なように連結されたリポーター遺伝子をさらに有する酵母細胞において発現させる。もちろん、その他の融合タンパク質をそのようなツーハイブリッドシステムにおいて使用することができることは認識されるであろう。さらに、融合タンパク質が完全長の相互作用するタンパク質を含む必要がないことは認識されよう。実際、これらのポリペプチドの断片は、それらが相互作用するドメインを含んでいるかぎり、本発明のペプチドスパンニング法で証拠づけられるように、本発明にしたがって使用することができる。
【0055】
そのような融合タンパク質の非限定的な例には、ヘマグルチニン融合物、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合物およびマルトース結合タンパク質(MBP)融合物が含まれる。ある態様では、融合させた2つのポリペプチド配列の間にプロテアーゼ開裂部位を導入することが有益であろう。2つのヘテロローガスに融合したポリペプチド間のそのようなプロテアーゼ開裂部位は当分野においてよく知られている。
【0056】
ある態様では、本発明の相互作用するドメインを、宿主細胞からの融合タンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチド配列に融合させることが有益であろう。種々の生物由来のシグナルペプチドが当分野においてよく知られている。バクテリアのOmpAおよび酵母Suc2は、シグナル配列を含んでいるタンパク質の2つの非限定的な例である。ある具体的な態様では、相互作用ドメインとヘテロローガスなポリペプチド部分の間の(一般に知られている)リンカーを導入することも有益であろう。そのような融合タンパク質は、本発明の分析並びに精製や検出などに有用である。
【0057】
もちろん、本発明を実施するのに有用な配列およびポリペプチドには、それらに限定されることなく、突然変異体、同族体、サブタイプ、対立遺伝子などが含まれる。一般に、本発明の配列は(不完全とはいえ)機能的な相互作用ドメインをコードすると理解すべきである。本発明の相互作用ドメイン、その変異体、誘導体または断片が、そのパートナーに対する結合における機能を保持するかどうかは当業者には明らかであり、本発明の教示および分析並びに当分野の一般的な教示を用いて容易に測定されるであろう。
【0058】
以下に例示されるように、本発明の相互作用ドメインを、例えばインビトロの突然変異誘発によって修飾し、その構造と機能の関連を分析し、調節化合物のより良い設計と同定を可能にすることができる。しかし、その各々の相互作用パートナーと相互作用するという生物学的機能を喪失した誘導体または類縁体は、例えば、抗体を惹起するために依然として有用であろう。そのような類縁体または誘導体は、例えば、本発明の相互作用ドメインに対する抗体を惹起するために使用することができる。これらの抗体は、検出または精製に使用することができるであろう。さらに、これらの抗体は、競争または非競争阻害剤としても作用し、本発明にしたがって同定される相互作用の調節物質が見つかるであろう。
【0059】
宿主細胞または指標細胞は、外因性またはヘテロローガスなDNA(例えば、DNA構築物)が細胞内部に導入されているとき、そのようなDNAによって「トランスフェクト」ている。トランスフェクトされるDNAは、細胞のゲノムを構築する染色体DNA内に組み込まれていても(共有結合で連結していても)、組み込まれていなくてもよい。例えば、原核生物、酵母および哺乳類細胞では、トランスフェクトするDNAは、プラスミドなどのエピゾームエレメントにおいて維持されていてもよい。真核細胞に関しては、安定にトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトされるDNAが、染色体複製を通じて娘細胞に受け継がれるように、染色体内へ組み込まれるようになったものである。この安定性は、トランスフェクトされたDNAを含んでいる娘細胞の集団からなる細胞系またはクローンを確立するその真核細胞の能力によって実証される。トランスフェクション法は、当分野においてよく知られている(4,96)。指標としての哺乳類細胞の使用は、試験される2つのポリペプチドの相互作用を可能にするかまたは調節する、下等な真核生物または原核生物には存在していないであろう介在因子が提供されるという利点をもたらすことができる。もちろん、試験されたポリペプチドの両方が直接相互作用するとしても利点はあるかどうかはまだわからない。例えば、具体的な態様において哺乳細胞からの抽出物を用いて、選択された指標細胞におけるある特定の因子の欠如を補うことができることは理解されるであろう。翻訳の領域は、異なるタイプの抽出物を調製し再構成する方法を十分教示するものであると認識されるであろう。
【0060】
一般に、抗体(モノクローナル抗体およびハイブリドーマを含む)を調製するための技術、および抗体を使用して抗原を検出するための技術は、当分野においてよく知られている(12)。本発明はさらに、それらの各々の相互作用ドメインを阻害または中和するおよび/またはそれら対して特異的である、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそのヒト化形態、キメラ抗体などを提供する。
【0061】
本明細書および添付した請求の範囲から、「治療剤」なる用語は、少なくとも2つのそのような治療剤の組合せも含むように広い意味に解されるべきである。さらに、本発明のDNA断片またはタンパク質は、多くの方法によって人に投与することができる。例えば、赤血球産生細胞を罹患者から単離し、本発明のDNA構築物で形質転換し、静脈注射を含む多くの方法により、その罹患者に再投与することができる。別法として、DNA構築物を、例えば骨髄における注入によって、罹患者に直接投与することができる。治療剤は、具体的なタイプの細胞を標的として設計し、種々の経路を通じて投与されるように処理を施すことができる、リポソームなどのビークルを通じて投与することもできる。
【0062】
ヒトへの投与に関しては、処方している医学専門家が、特定の患者に対して適切な剤型と用量を最終的に決定し、これは、選択された治療計画(例えば、DNA構築物、タンパク質、分子)、患者の応答および状態並びに疾患の重篤度によって変わるものと予想される。
【0063】
本発明の範囲に含まれる組成物は、所望の治療効果を達成するのに有効であり、有害な副作用を回避する量の活性成分(例えばタンパク質、核酸あるいは分子)を含有する。典型的には、本発明の核酸は、1日あたり、処置されるその哺乳動物の体重1kgあたり0.005〜1mgの用量で、哺乳動物(例えばヒト)に投与することができる。活性成分の製薬的に許容される調製物および塩は、本発明の範囲内に含まれ、当分野においてよく知られている(88)。ポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニストなどの投与に関しては、有害な副作用を回避するように投与量を選択する。用量は、患者の疾患の程度や種々のパラメータなどの慣用的な要因に従い、臨床医が調整する。典型的には、0.001〜50mg/kg/日を哺乳動物に投与する。
【0064】
本発明の方法および分析を、さらにアネキシンにより確認した。このタンパク質は、P−糖タンパク質と構造および機能の両方において有意に異なる。従って、タンパク質化学および分子生物学についての知識とともに、これらの確認によって、すべてのタンパク質(ウイルス、細胞、動物、植物由来などの)についての本分析および方法の有用性が裏付けられる。
【0065】
このように、本発明を概説したが、本発明の好ましい態様を説明する目的で図面を引用する。
【0066】
本発明の他の目的、利点および特徴は、例示的な添付の図面を参照して、以下の好ましい態様の非限定的な記載を読めばより明らかになるであろう。そして本発明の範囲を限定するものとして理解すべきではない。
【0067】
(好ましい態様の記載)
タンパク質の機能因子(functionor)または機能は、他の細胞または細胞外タンパク質徒の間のそのタンパク質の相互作用が関与している。これまで、2つのタンパク質間の相互作用には相補的なアミノ酸配列を有するポリペプチドの大きな断片が関与していると考えられていた。しかし、これらの相補的な配列が、タンパク質間の相互作用にどのように関与しているかはわからない。本願では、タンパク質間相互作用の原理を説明する新たな概念を提唱するものである。即ち、任意の2つ以上のタンパク質間相互作用は高い親和性の結合と高い反発力を有する不連続な配列の鎖が介在している[図1を参照]。タンパク質の露出された配列全体のこれらの力の合計は、タンパク質間の性質と程度を決定づける。これらの相互作用するドメインの大きさは、長さで5〜25アミノ酸の範囲で変わる。2つの小さい高親和性結合配列間の引力は、2つのタンパク質間のすべての高い親和性の結合力および反発力の合計よりも一般に大きい。したがって、本発明の手段を用いて、高親和性結合配列のみをコードする短いペプチド(およそ6アミノ酸)を用いて、タンパク質の混合物から相互作用するタンパク質を単離することが可能である。実際、想像してみれば、相互作用するタンパク質を単離する多くの試みがなぜ失敗に終わったのかを理解するのは、今や容易いことである。相互作用するタンパク質を単離するための大きな断片またはタンパク質の使用は、引力/反発力の合計が引力の鎖よりもずっと弱いので効果が低い。本明細書において提唱される原理はさらに、タンパク質間相互作用が、翻訳後修飾(例えばリン酸化(29)によって)および他の相互作用するタンパク質の存在(60)によって調節することができるという事実と一致する。従って、翻訳後修飾後の弱い相互作用の付加または喪失によって、タンパク質を会合した状態に保つかまたはそれらの会合を阻止する高い親和性の結合と高い反発力との間の非常に微妙なバランスを破壊することができる。2つの高親和性結合配列間の引力の大きさについての根拠は、抗原が2、3個のアミノ酸のみであり得る抗体抗原結合において実証される(36、37)。更に、 多くの例は、タンパク質間の細胞の相互作用が5〜10のアミノ酸の小さなコンセンサス配列の存在により生じる生物学において存在する。そのような小さなコンセンサスの非限定的な例には、ロイシン・ジッパー(63)、およびSH2およびSH3結合配列(63、80)が含まれる。2つ以上のタンパク質間の相互作用(上に示した)のドメインに加えて、タンパク質間相互作用は、例えば以下のもののような、多くの測定可能な作用を有することができる:i)一方または両方のタンパク質の動力学特性の変化(83、84);ii)新しい結合または機能的部位の形成(65、104);そしてiii)機能の不活性化(106、114)。言い換えれば、ある特定のタンパク質は、なんらかの相互作用するタンパク質の非存在下ではなく存在下で種々の機能的ドメインまたは配列を露出することができるであろう。したがって、タンパク質Bの存在下で、タンパク質Aは他のタンパク質に対して今まで露出されなかった他の配列を露出することができる(65、83、84、104、106、114)。後者の概念は、タンパク質の解明された結晶構造からの機能または表面に露出されたドメインの予測における構造的研究(即ち、X線およびNMR)の有効性に反論するものであるので非常に重要である。ある特定のタンパク質のすべての高い親和性の結合部位の測定と同定を可能にすることによって、本発明はそのような構造の研究から得られた結果の欠点を克服しようとするものである。
【0068】
タンパク質間相互作用の上記の例に加えてさらに、タンパク質間相互作用の部分集合は二量体化である。タンパク質間相互作用が、機能の活性化または阻害(59)にとって本質的であるような例が生物学にはたくさん存在する。ホモまたはヘテロ二量体の非限定的な例には、成長因子受容体(52);膜輸送タンパク質(9、36、76);腫瘍抑制タンパク質(72);およびアポトーシスに関与するタンパク質(87)が含まれる。実際、動的な二量体化は、情報伝達の調節における共通のテーマである。二量体化の機能上の帰結には、シングル膜貫通細胞表面受容体(例えばEGF受容体(52))の活性化に関する増大した近接性およびヘテロ二量体化による差異のある調節[例えば、BCL2ファミリーのタンパク質(87)]が含まれる。
【0069】
生細胞におけるタンパク質濃度は非常に高く、10〜30mg/mLの範囲にある。この高いタンパク質濃度で、すべてではないにしても大部分のタンパク質が、他の細胞タンパク質と精密にそして特異的に相互作用する。相互作用するタンパク質のいくつかが機能を阻害する物質として作用する一方、他のタンパク質は活性化因子になりうる[例えば、BCL2−BAXファミリーのタンパク質(87)]。さらに、活性化因子と阻害因子の会合との間のある特定のタンパク質の循環は、迅速に起こるような会合−解離過程が必要であろう。例えば、タンパク質Xが阻害タンパク質Iに会合しているとき、タンパク質Xとタンパク質Aとの会合に必要なそのドメイン(小さい配列)は、X−I複合体に容易には接近できないかもしれない。したがって、会合したタンパク質を同定するための本方法(即ち、ツーハイブリッドシステムおよび同様の手法)は、会合したタンパク質をすべて同定することができないかもしれない。言いかえれば、本方法は、成功すれば、それらの会合したタンパク質のすべてではないがいくつかの機能的なドメインのみを同定することができる。対照的に、ペプチドスキャンニングの手法を用いて、本発明の方法は、タンパク質Xおよびその関連タンパク質の機能的なドメインまたは高い親和性の相互作用ドメインをすべて同定することができる。一旦関連するタンパク質が同定されれば、標的タンパク質Xに関連しているその関連タンパク質の生物学の機能を試験することができる。したがって、ある特定の相互作用するタンパク質に関して、1または多くの可能性のある関連タンパク質による相互作用が機能にとって重要であると分かれば、(タンパク質Xとタンパク質IまたはAとの間の)高親和性結合配列を容易に同定することができ、高速大量処理薬物スクリーニング分析(以下参照)またはその他の分析の標的部位として使用することができる。
【0070】
本発明は、タンパク質間相互作用が、タンパク質の三次元配列の全体にわたって散在した不連続な高い親和性の結合と高い反発力からなり、これらの配列を本明細書において示された多くの可能な手段のうちの1つを使用して単離することができるという[図1A〜Dに記載された]概念を含んでいる。本発明では、オーバーラップペプチドの手段を例示するが、同様の結果をもたらす他の手段も想像することができる。本明細書に記載した手段は、タンパク質間相互作用を同定するための他の一般に使用される方法に影響を及ぼす、相互作用するタンパク質によって生じる立体配置の変化には影響されない(例えば、ツーハイブリッドシステム、アフィニティーブロッティング、および架橋)ことが強調される。ツーハイブリッドシステムでは、例えば、タンパク質Aを、別のタンパク質配列(DNAが結合した「おとり」タンパク質)に融合し、他方の相互作用するタンパク質を、活性化ドメイン含んでいる「捕獲」タンパク質に融合する。タンパク質Aへの相互作用するタンパク質の融合は、それらの相互作用に影響を及ぼす、自然状態の立体構造には見られる領域以外の領域を露出するであろう。更に、ツーハイブリッドシステムはいくつかの欠点を有しているが、それらのうちのいくつかを以下に記載する。
i.タンパク質の相互作用は、大部分のタンパク質が存在する細胞質ではなく、核周辺で観察される。
ii.タンパク質が異なる細胞または生物において表現すると毒性を示すことがある。
iii.ツーハイブリッドシステムでの複合体における2つのタンパク質間の相互作用は、他の相互作用するタンパク質の結合を立体的に排除することがある。
iv.1つのタンパク質の修飾後翻訳は、他のタンパク質との相互作用を排除することがある。
v.ツーハイブリッドシステムは、2つの相互作用するタンパク質間の正確なアミノ酸配列を同時に同定することはできない。
vi.ツーハイブリッドシステムの適用には、誤って陽性とされる高いパーセンテージを伴う。
vii.ツーハイブリッドシステムは、異なる相互作用するタンパク質が発現するかもしれない(これはこのシステムの重大な欠点である)異なる細胞または組織に容易に適用することができない。
【0071】
相互作用タンパク質およびタンパク質Aに対する相互作用部位を同定するための方法
2またはそれ以上の相互作用するタンパク質間の配列の不連続な鎖を同定するために使用される本手法および本方法論は、スキャンニングオーバーラップペプチド法である。この手法を用いて、ある特定のタンパク質の全アミノ酸配列を網羅する大量の短いオーバーラップペプチド、「おとり」を、不活発な固体支持体上で同時に合成する[図2参照]。不連続なペプチドライブラリーとは対照的に、大量のオーバーラップペプチドを合成する原理は、ある特定のタンパク質のどの正確な配列が高い親和性の結合部位と反発する配列を含んでいるかが推測によってはわからないという事実に基づいている。それゆえ、不連続なペプチド法は、同じペプチドにおいて高親和性結合配列と反発性配列の両方の存在を導くことが多い。そのようなペプチドは、可能性のある相互作用するタンパク質には高い親和性で結合しないであろう。さらに、オーバーラップペプチドの使用は、非特異的結合の内部対照をもたらす。例えば、オーバーラップペプチドを使用すると、高い親和性ドメイン内においてペプチドが高い親和性アミノ酸配列を有し反発力をもたらすアミノ酸を欠いている場合、シグナルはピークになる[実施例1の図6参照]。もちろん、本発明は、全ペプチド配列の長さには依存しないことは理解されるべきである。実際、タンパク質のサブ領域を使用することができる。さらに、オーバーラップペプチドは、タンパク質の選択されたドメインから得られる。また、第2のタンパク質のオーバーラップペプチドのセットによって第1のタンパク質のオーバーラップペプチドの副次的なセットが判明することは認識できるであろう。
【0072】
全細胞タンパク質の混合物から、相互作用するタンパク質である「捕獲」を単離するための「おとり」としてオーバーラップペプイドの手法をどのように使用できるかを実証するために、以下の実施例が考慮されよう。P−糖タンパク質は、抗癌剤に対する耐性をもたらす膜タンパク質(46)であり、それゆえ化学療法が失敗する要因となっている。しかし、P−糖タンパク質は、腫瘍細胞における化学治療剤の蓄積を阻止することによって機能することが示されている。このタンパク質がどのように機能するかの正確なメカニズム、および何がその機能を調節する関連しているタンパク質であるかはわかっていない。したがって、例えばP−糖タンパク質とその関連タンパク質との間の結合を阻害し、それによって耐性腫瘍細胞におけるその機能を強力に調節することを可能するための、P−糖タンパク質と相互作用するタンパク質を同定することが目的である。この実施例では、P−糖タンパク質のリンカードメインに結合するタンパク質を同定することを目的とする。したがって、特定の実施例では、選択されたタンパク質のドメインを使用した。リンカードメインは、約90アミノ酸の領域をコードする。したがって、P−糖ペプチドのこの全リンカー配列を網羅するオーバーラップヘキサペプチドを、標準的なF−moc化学反応(74)を用いて固体の支持体上で合成した。共有結合により固定されたペプチド(固体の支持体上の)を、[35S]メチオニンで代謝的に標識された細胞に由来する全細胞リゼートとインキュベーションした。ペプチドと全細胞リゼートを担体物質(1〜3%ウシ血清アルブミン、または1〜3%ゼラチン、1〜3%スキムミルクなど)の存在下で4℃にて18時間インキュベーションした。インキュベーションした後、共有結合により固定化されたペプチドを、等張緩衝液で十分に洗浄した。洗浄工程の後でオーバーラップヘキサペプチドと会合したままの放射性標識された全細胞由来のタンパク質を、SDS含有試料緩衝液中で溶離し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)(62)で解析した。ゲルを乾燥し、シグナル増強をした後、SDSポリアクリルアミドゲル上の放射性標識されたタンパク質の存在によって、以下の情報が得られた:
1)特定のオーバーラップペプチドは、P−糖タンパク質リンカードメイン(または他の選択されたドメインもしくは選択されなかったドメイン)の高親和性結合配列を表している;そして、
2)特定のオーバーラップペプチドに結合したタンパク質は、関連するタンパク質である(図6を参照)。
【0073】
高親和性配列に結合する関連タンパク質は、エドマン分解法(28)などによるN末端アミノ酸配列によってその同一性を決定するために大量に単離することができる。簡潔にいえば、ある特定のタンパク質に結合するオーバーラップペプチドの配列を固体の支持体上で合成し、そこへ固定化させておく。[35S]メチオニンで代謝的に標識した細胞から得られた全細胞リゼートを、その固定化された高親和性配列ペプチドを含んでいる固体支持体に加えて、上記のとおりにインキュベーションする。結合しなかった物質を除去するための洗浄工程の後、関連タンパク質をSDS含有緩衝液を用いた溶出工程の後、大量に単離する(以下参照)。アミノ酸配列分析のために精製された関連タンパク質がここに準備される。もちろん、さらなる精製工程が必要であるならば、これらについては当業者がよく知っている。精製されたタンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル上を移動させ、分離したタンパク質を上記のとおりPVDF膜に転写する(108)。アミノ酸決定に他の方法を容易に適用することもできる(27、33)。
【0074】
2つの相互作用するタンパク質間のアミノ酸配列を同定する方法
2つのタンパク質間の高親和性結合配列を同定することを単に目的とするのであれば、上記と同じ概念を適用することができる。そのような二つのタンパク質の非限定的な例は、p53とMDMとの間の相互作用の領域である(28、103)。それゆえ、特に、この実行の目的は、タンパク質A(p53)とタンパク質B(MDM)との間の高親和性結合配列を、この相互作用を調節する化合物の同定のため、そしてさらにとりわけ薬物の開発のため、これらの配列を標的部位として使用するために同定することである。したがって、1つの態様では、ある特定の薬物が、タンパク質Aのこれら高い親和性の結合部位の1つに結合するとき、活性な複合体(タンパク質A+B)の形成を阻止し、それゆえ複合体の機能を阻害するであろう。タンパク質Aとタンパク質Bとの間の高親和性結合配列の鎖(図3参照)を単離するために、タンパク質A「おとり」の全アミノ酸配列を網羅する小さいオーバーラップペプチド(5〜7アミノ酸)を固体支持体上で同時に合成する(上記および実施例3により詳しく記載するように)。注目すべきことに、この特定の態様では、タンパク質A「おとり」の一次アミノ酸配列しか必要とされない。ペプチドが合成されれば(ペプチド合成は、96ウェルプレートにおいて固体支持体上で同時に行なわれる)、豊富化および放射性標識された完全長のタンパク質B「捕獲」(放射性標識されたタンパク質Bはインビトロ転写−翻訳反応によって容易に得られる(118))を、共有結合で固定化されたオーバーラップペプチドを含む96ウェルプレートの各ウェルに加える。タンパク質Aをコードするペプチドを、結合が起こすことが可能な放射性標識されたタンパク質Bとインキュベーションする。インキュベーションした後(5〜24時間)、結合しなかった放射性標識されたタンパク質Bを等張緩衝液中で十分洗浄することにより除去する。放射性標識されたタンパク質Bに結合するオーバーラップペプチドを、変性剤の存在下で溶出する。96ウェルプレートの各ウェルからの溶出液を、SDS PAGEに試料を流すことにより、放射性標識されたタンパク質Bの存在について解析する(62)。高親和性結合ペプチドは、放射性標識されたタンパク質Bを保持しているものとして同定されるであろう。
【0075】
「おとり」をコードするオーバーラップペプチドと相互作用するための「捕獲」として代謝的に標識されたタンパク質の使用は、この方法の感度を高め、1〜10個の放射性標識されたメチオニン残基をコードする標準的な50kDaのタンパク質に対し1010〜1012Mの結合親和性を有する相互作用するタンパク質の同定が可能になる(82)。
【0076】
リード化合物のスクリーニングのための高速大量処理分析において高親和性結合配列を使用する方法
薬物開発のための高親和性結合配列または標的部位を同定するための本明細書に記載した手法は、コンビナトリアルライブラリーによって得られた小さい分子をスクリーニングする高速大量処理分析において使用することもできる。例えば、タンパク質Aのタンパク質Bへの結合を特異的に阻害する薬物の選択(図4参照)。1またはそれ以上の標的部位(高親和性結合配列)を、以前に記載したように96ウェルプレートの各ウェルにおいて合成する。この実施例では(図4)、同じ高親和性結合配列がすべてのウェルにおいて合成される。高親和性結合配列を含む各ウェルに対して、コンビナトリアルライブラリーから得られた1またはそれ以上の小さい分子を加える。薬物を添加したのち、例えば、インビトロ転写−翻訳混合物から得られた放射性標識されたタンパク質Bを添加し、上に示したようにインキュベーションさせる。数回洗浄したのち、結合したタンパク質BをSDS−試料緩衝液で溶出する。放射性標識されたタンパク質Bを含むウェルは、その薬物がその高親和性結合配列とタンパク質Bとの間の結合に効果がないことを示している。別法として、1またはそれ以上のウェルが薬物の存在下で放射性標識されたタンパク質Bを含んでないならば、それは、薬物が、タンパク質Aとタンパク質Bにおける高親和性結合配列の間の相互作用を阻害しているということである。したがって、この薬物が良いリード化合物である。これらの薬物はここで、これら薬物が完全長のタンパク質Aとタンパク質Bの活性な複合体の形成を阻止するかどうかを分析する第2段階に進む。同定された活性な薬物は、インビボで試験してその作用機序がさらに確認されるであろう。この方法において、副作用の少ないあるいは全くない、より特異的な薬物が開発されるであろう。
【0077】
大部分のタンパク質は1以上の生物学的機能を有するので、後者の点は有益である。例えば、タンパク質Aがそれ自身と相互作用するなら、そのタンパク質は1つの機能を示し、異なるタンパク質を相互作用するその同じタンパク質は異なる機能を示す。さらに、関連タンパク質のある特定の複合体の一部であるときのタンパク質Aは、いくつかの機能に介在し、タンパク質Aとタンパク質Bとの間の相互作用の阻害する一方、タンパク質Aと無傷のタンパク質C、DまたはFとの間の相互作用をそのままにすることによって、1または2、3の細胞の経路が阻害されるであろう。対照的に、タンパク質Aの機能を阻害することによって複合体全体が阻害されるであろう。この点で、タンパク質の複合体内の2つのタンパク質間の相互作用を特異的に阻害する薬物の同定、単離および開発によって、副作用のより少ない、より特異的な薬物が得られる。さらに、異なるタンパク質が異なる組織または器官において直接発現するので、ある特定のタンパク質複合体の組成は、異なった組織の間で異なるであろう。したがって、タンパク質間相互作用を阻害する薬物の開発の手法によって、器官または組織特異的な薬物も得られるであろう。
【0078】
もちろん、本発明は、タンパク質間相互作用および化合物によるその調節を測定するための定量分析も提供するものであると理解されよう。
【0079】
結論として、相互作用するタンパク質、相互作用するタンパク質間の正確なアミノ酸配列およびタンパク質間相互作用を阻害する薬物のタンパク質におけるそのような特異的な配列の標的を同定するための、本願に記載の手法は、製薬産業において将来の薬物発見に影響する計り知れない可能性を有する。
【0080】
以下の非限定的な実施例によってさらに本発明を説明する。
【0081】
実施例1
チューブリンに対するP−糖タンパク質の結合には、リンカードメインの配列が関与する
化学療法剤による癌患者の処置の成功が薬剤耐性の腫瘍の発達によって制限されることが多い。単一の抗癌剤でインビトロで選択された腫瘍細胞系は、化学療法剤の広いスペクトルに対して耐性となり、これは多剤耐性(即ちMDR)腫瘍細胞と呼ばれる(21、45、66を参考)。さらに、これら腫瘍細胞におけるMDRの発現は、2つの膜タンパク質、MDR1 P−糖タンパク質(P−gp)および多剤体制関連タンパク質(MRP1)の過剰発現に関連している(21、45、66)。P−gpおよびMRPはいずれも、ATP結合カセットタンパク質またはABC膜トランスポーターとして知られている膜輸送タンパク質の大きなファミリーの一員である(54)。しかし、P−gpの構造は、推測の域を出ず(91)、蓄積されたトポロジーの証拠は、6個の膜貫通ドメインとATP結合配列をコードする大きな細胞質領域の一列に並んだ二重の構造を示唆している(58、68)。P−gp1の二等分された部分が、リンカードメインと称する、極性または荷電性アミノ酸に富む90残基の鎖によって連結されている。
【0082】
P−gp遺伝子ファミリーは、齧歯類において3つの(クラスI、IIおよびIII)、ヒトでは2つの(クラスIおよびIII)構造的に類似したアイソフォームから構成されている(20)。例えば、クラスIとクラスIIのP−gpアイソフォームのみがMDR表現型を示す(25、111)一方、クラスIIIアイソフォームはそうでなない(11、98)。クラスIIIアイソフォームは、形質膜の内小葉(inner leaflet)から外小葉(outer leaflet)へのホスファチジルコリンの輸送に関与している(「即ちフリパーゼ」)(92、100)。正常な組織においては、P−gp分布は主に分泌機能を有する組織に限られる(79、116)。副腎、肝臓、腎臓、腸におけるルーメンに面する突端面へのその二極化した分布は、正常な輸送または解毒のメカニズムを示唆する。さらに、造血幹細胞および特定のリンパ細胞サブクラスはさらに、高いレベルのP−gpを表現する(49)。クラスIおよびIIの通常の機能または基質は未だに明らかではない;しかし、マウスゲノムに由来するクラスIまたは/およびクラスII遺伝子の破壊によって、大部分の正常な組織において細胞増殖抑制剤または親油性化合物の蓄積を生じるが、脳においてより著しい(99、100)。これらの結果に基づけば、P−gp(クラスIおよびクラスIIまたはMDRを生じるP−gp)の正常な機能は、MDR細胞、特に脳血液関門、においてみられるのと同様に解毒であると考えられる(57)。
【0083】
高いレベルのP−gpが、大腸、腎臓、乳房および副腎に由来する多くの元来薬剤耐性である腫瘍並びに化学療法(例えば急性の非リンパ芽球性白血病における)の後にMDR表現型を獲得する他の腫瘍細胞において見られる(22、32、35、47、53、78)。いくつかの研究によって、今や、P−gp発現の反対の相関性および化学療法に対する応答が確立されている(5、89、113)。さらに、Chan et al.(16、17)は、P−gp発現が、小児白血病、子供の軟組織肉腫および神経芽細胞腫において、MDRの前兆であり持続的な応答であることを示した。これらの研究に照らせば、P−gpレベルは、化学療法による処置に対する応答を予測する少なくともいくつかの癌における説得力のある証拠のようである。
【0084】
P−gpと様々な親油性化合物との間の直接の結合は、光活性な薬物アナログを用いて実証されている(77、93、94)。P−gpに結合するある化合物は、恐らくP−gpにおける同じ薬物結合部位について競争することにより、MDR表現型を逆にすると示された(34、38)。総称してMDR反転剤(reversing agent)と名付けられているこれらの化合物には、いくつか例を挙げると、ベラパミル、キニジン、ルベルメクチン、シクロスポリンおよびジピリマドールアナログが含まれる(34、38)。MDR反転剤を使用する臨床試験(例えば、ベラパミルまたはキニジン)は、それを使用しなければ化学療法に応答しなかった腫瘍において応答を示した(23、44、117)。しかしながら、いくつかのMDR反転剤に関連する高い薬学的毒性によって、有効濃度でのその使用が阻止された(67)。他のMDR反転剤(即ちシクロスポリンAおよびその非免疫抑制剤アナログPSC833)を使用して、より良好な臨床応答が観察された。しかし、シクロスポリンによる毒性作用がみられた(101、115)。
【0085】
P−gpは、タンパク質キナーゼCおよびAの基質であることが示された(2、9)。さらに、タンパク質キナーゼC活性を調節する物質が、P−gpリン酸化およびそのMDR介在の表現型を調節するということが実証された(7、13)。1つの研究(31)では、PMAホルボールエステル(タンパク質キナーゼC活性化因子)がMCF7乳癌細胞においてMDR表現型と薬物流出を増大することが示された。別の研究(6)では、SW620ヒト大腸癌細胞の酪酸ナトリウム処置が、付随する薬物耐性または薬物流出を増大させることなく、P−gp発現の大きな増加をもたらすことが示された。興味深いことに、SW620細胞においてP−gpは、酪酸ナトリウム処置の後、少ししかリン酸化されていないことも示された(6)。これらをまとめると、SW620細胞におけるP−gpの輸送機能の欠如は明らかではないが、リンカードメイン内のP−gpリン酸化部位の突然変異は、その薬物輸送機能に影響を及ぼさないことが示された(40)。対照的に、リンカードメインにおけるセリン/トレオニン残基のタンパク質キナーゼC調節は、外因性の塩化物チャンネルの活性を調節した。したがって、これはP−gpがチャンネンル調節物質であることを示唆している(41、110)。このように、P−gp1のリンカードメインが介在しているのが、どのような機能であるのかは依然として明らかではないが、インビトロ分析を用いてリンカードメインと相互作用するタンパク質を同定することが目的であった。後者の分析は、本発明によって提供される、タンパク質相互作用についての新規な理解に基づいている。以下に示す結果は、リンカードメインの3つの配列が、みかけの分子量が約80kDa、57kDaおよび30kDaであるタンパク質に結合することを示す57kDaのタンパク質の精製と部分的なN末端アミノ酸配列分析により、それがα−およびβ−チューブリンのN末端アミノ酸をコードすることが示された。
【0086】
このように、本発明の有効性を確認する例として、タンパク質ドメインを使用して、
i)このドメインはタンパク質に特異的に結合した;
ii)特異的に結合するタンパク質が正式に同定され得る;さらに
iii)これらのタンパク質の特異的な結合に関与している配列が正式に同定された(得られる場合、このタンパク質の相互作用領域と一緒に)
ということが示された。
【0087】
実施例2
材料
[35S]メチオニン(1000Ci/mmol;Amersham Life Sciences, Inc.)および[125I]ヤギ抗マウス抗体をAmersham Biochemical Inc.から購入した。タンパク質Aセファロース−4Bは、Bio−Rad Life Scienceから購入した。使用した他の化学物質はすべて、入手し得る最高グレードのものであった。
【0088】
実施例3
ペプチド合成
予め誘導体化されたプラスチックロッド、活性なエステルおよびポリプロピレントレーは、Cambridge Research Biochemicals (Valley Stream, NY)から購入した。ペプチドは、固体のポリプロピレンロッド上で、以前に記述されているように合成した(36、37)。簡潔には、固体の支持体の予め誘導体化されたポリプロピレンロッド上のF−moc保護基(96ウェルのホルメート中で並べられた)を、30分間撹拌しながら、ジメチルホルムアミド (DMF)の中の20%(v/v)のピペリジンとインキュベーションすることにより脱離した。β−アラニンスペーサーをポリプロピレンロッド上で脱保護したのち、Fmoc保護されたアミノ酸をHOBt/DMFに溶解し、脱保護したロッドを含む適当なウェルに加えた。アミノ酸のカップリングを、室温で18時間行なった後、ロッドをDMF(1×2分)、メタノール(4×2分)およびDMF(1×2分)中で洗浄した。第2のアミノ酸のカップリングには、最初のアミノ酸のF−mocアミノ保護基の脱保護と第2の予め活性化されたF−moc保護されたアミノ酸(ペンタフルオロフェニル誘導体)を有するロッドとのインキュベーションを必要とした。18時間反応させ、ロッドを取り出し、上に示されたように洗浄した。同じ工程を、6個目のアミノ酸が連結されるまで、各アミノ酸カップリングについて繰り返した。最後のカップリング工程の後、F−moc N末端保護基を20%ピペリジン/DMFで脱離し、遊離のアミノ基を無水酢酸:ジイソプロピルエチルアミン(DIEA):DMF(50:1:50 v/v/v)を含むアセチル化カクテル中で90分間アセチル化した。ポリプロピレンロッド上のN末端のアセチル化ヘキサペプチドの側鎖保護基をトリフルオロ酢酸、フェノール、エタンジオールを含む開裂混合物(95:2.5:2.5 v/v//v)中、室温で4時間インキュベーションすることにより脱離した。開裂工程の後、ロッドをジクロロメタン(DCM)で洗浄し、5%(v/v)のDIEA/DCM中で中和した。脱保護されたペプチドが結合したロッドをDCM、メタノール中で洗浄し、18時間真空乾燥した。
【0089】
実施例4
組織培養および細胞の代謝標識
薬剤感受性(CEM)および耐性(CEM/VLB1.0)細胞を、以前に記載されているように(8)、10%ウシ胎児血清を添加したα−MEM培地において培養した(Hyclone. Inc.)。マイコプラズマ汚染について、すべての細胞をStratagene Inc. (San Diego, CA)のMycoplasma PCRキットを用いて3ヶ月ごとに試験した。細胞の代謝標識については、集密度70〜80%のCEMまたはCEM/VLB1.0細胞を、[35S]メチオニン(100μCi/mL)を用い、メチオニン不含α−MEM培地中37℃にて6時間代謝標識した。
【0090】
実施例5
細胞抽出および結合分析
[35S]メチオニンによるタンパク質の代謝標識の後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を3回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤(2mM PMSF、3μg/mLロイペプチン、4μg/mLペプスタチンAおよび1μg/mLアプロチニン)を含有する低張緩衝液(10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris−HCl, pH7.4)中に再懸濁し、氷上で30分間静置した。低張緩衝液中でのホモジネーションにより細胞を破壊した後、細胞リゼートを6000×gにて10分間遠心分離した。この遠心の後、上清を除いて、4M NaClのストック溶液で0.5M NaClの最終濃度にした。細胞リゼートを氷上で30分間インキュベーションした。試料を混合して0.1M NaClの最終濃度にした。細胞リゼートを、4℃にて15000×gで10分間遠心分離した。この上清を除き、SW55ローターを用い、ベックマン超遠心機で100,000×gで10分間再び遠心した。上記試料中の総タンパク量をローリー法(69)により測定した。
【0091】
結合分析については、全細胞リゼートから得られた[35S]メチオニン標識されたタンパク質を、同量の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の3〜6%BSAと混合し、ポリプロピレンロッドに共有結合により固定化されたオーバーラップヘキサペプチドとインキュベーションした。ペプチドおよび全細胞リゼートを4℃で一晩インキュベーションした。次いで、ロッドを除いて、PBS中4回洗浄した。ペプチドが固定化されたロッドを、1×SDS試料緩衝液中で室温にて60分間撹拌しながらインキュベーションすることにより結合したタンパク質を溶出した。超音波処理機にて、ペプチドが固定化されたロッドを、2%SDSおよび1mM β−メルカプトエタノールを含有するPBS中、65℃にて30分間インキュベーションすることにより再生した。このインキュベーション後、ロッドを、65℃の脱イオン水中で5分間、65℃のメタノール中で2分間洗浄した。次のスクリーニングラウンドのために、ペプチドが固定化されたロッドがここに準備された。結合に対する様々な界面活性剤の効果を試験する場合では、全細胞リゼートから得られた[35S]メチオニン標識されたタンパク質を同量の、KCl(300mM〜1200mM)、SDS(0.12%〜2%)またはCHAPS(20mM〜160mM)を含むリン酸緩衝化生理食塩水中の3%BSAと混合し、上記の、共有結合により固定化されたペプチドとインキュベーションした。
【0092】
実施例6
ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロッティング
Laemmliゲルシステム(62)を用いてタンパク質画分(100〜150μL)をSDS上で分離した。簡潔には、タンパク質を、1×可溶化試料緩衝液I(2%(w/v)SDS、10%(w/v)グリセロールおよび5%β−メルカプトエタノールを含有する62.5mM Tris−HCl、 pH6.8)中に溶解し、試料を定電流で電気泳動した。分離したタンパク質を含むゲルスラブを、50%メタノールおよび10%酢酸中で固定化した。[35S]メチオニンタンパク質を含むポリアクリルアミドゲルは、Amplify(商標)溶液(Amersham Inc.)中で30分間インキュベーションした後、Kodak X線フィルムに感光した。
【0093】
別法では、Towbin et al.の方法(108)に従うウエスタンブロット分析のために、タンパク質を、Tris−グリシン緩衝液中、20%メタノールの存在下で、ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜を、抗αまたはβチューブリンモノクローナル抗体(3%BSA中0.5μg/mL;Amersham.Inc)を加える前に、5%スキムミルク/PBS中でインキュベーションした。PBSで数回洗浄したのち、ニトロセルロース膜をヤギ抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲート抗体とインキュベーションし、免疫反応性タンパク質を化学ECL法(Amersham Inc.)を用いて、化学発光により視覚化した。
【0094】
実施例7
タンパク質精製およびN末端配列
57kDaの関連タンパク質を、2つの高親和性結合ペプチドを使用し、ポリプロピレンロッドのブロックを用いて精製した。簡潔には、ペプチドが固定化されたロッドを上に示したように、全細胞リゼートとインキュベーションしたが、この場合では、担体物質はゼラチン(1%)であった。結合したタンパク質を、2%SDSおよび0.1%β−メルカプトエタノールを含有する100mMリン酸緩衝液(pH7.4)中で溶出した。溶出したタンパク質を、9倍量の氷冷エタノールと混合し、−20℃でインキュベーションすることにより沈殿させた。この試料の高速遠心(4℃にて15,000×gで15分間)の後、沈殿したタンパク質を、PBS中の1%SDS中に再懸濁し、同量の2×SDS Laemmli試料緩衝液(62)と混合した。タンパク質の試料を10%SDS PAGE上で分離しPVDF膜に転写した。57kDaのバンドの移動をPVDF膜をponseau Sで染色することにより視覚化した。57kDaのバンドを含むPVDF膜を切り取り、トロント(オンタリオ)にあるバイオテクノロジー・サービス・センターのタンパク質配列分析施設に出した。ペプチドのアミノ酸配列分析は、Flynnによって記載された手順(33)に従ってアプライド・バイオシステムズGas−Phaseモデル470Aシークエネーター(商標)を使用して、EdmanとBeggの方法(27)により行なった。
【0095】
実施例8
P−gp相互作用タンパク質の同定
上に説明するように、P−gpは、それぞれ6膜貫通ドメイン をコードする部分とATP結合ドメイン からなる反復分子である。このP−gpの 半分の部分はリンカードメインによって連結されている。リンカードメインを形成する90アミノ酸のうち、32アミノ酸は生理的pHにおいて正または負の電荷を帯びている。P−gpリン酸化部位はP−gp機能に関与すると思われるが、Pgのリンカードメインの機能は依然未知である。MDRにおけるこのドメインの役割を同定し、分析するため、本発明のオーバーラップペプチド法を用いた。オーバーラップ合成ヘキサペプチドを用いる相互作用タンパク質を単離するための新規方法を開発した。相互作用タンパク質を単離するためのオーバーラップペプチドの使用は、相互作用タンパク質の特異的同定を可能にし、ランダムペプチドの使用に関連する多くの問題を回避する。図5はHP−gp1およびHP−gp3のリンカードメインのアミノ酸配列を示す。HP−gp1およびHP−gp3の2つのリンカードメインは41%アミノ酸配列同一性あるいは66%配列相同性を共有する。オーバーラップヘキサペプチドを、以前に記載されるように誘導体化ポリプロピレンロッド上で並行して合成した(36、37)。HP−gp1およびHP−gp3それぞれの完全リンカー配列を網羅する92および90ヘキサペプチドを合成した。このヘキサペプチドはポリプロピレンロッドに共有結合したままである。
【0096】
リンカードメインの種々のヘキサペプチドと相互作用するタンパク質を同定するため、ペプチド固定ロッドを、[35S]メチオニンで代謝的に標識されたCEMまたはCEM/VLB1.0細胞由来の全細胞リゼートとインキュベートした。非特異的結合リゼートタンパク質を洗浄した後、特異的結合タンパク質をSDS含有緩衝液で溶出させ、SDS−PAGEで分離した。図6は、HP−gp1リンカー配列由来の92オーバーラップヘキサペプチドと特異的に結合したタンパク質を示す。HP−gp1リンカードメインの3つの領域(617EKGIYFKLVTM627 (配列番号1)、657SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA676 (配列番号2)および693PVSFWRIMKLNLT705 (配列番号3))が57kDaタンパク質と結合した。ヘキサペプチド番号46−60、81−89および5−9(図5を参照)は減少した親和力で57kDaタンパク質と結合した(図6)。さらに、ペプチド46−60は、見かけの分子量80kDaおよび30kDaを有する2個の他のタンパク質との結合を示したが、これは57kDaタンパク質のものよりずっと弱かった。後者のタンパク質(80kDaおよび30kDa)は、57kDaタンパク質シグナルの強度が高い場合に検出されることから、57kDaと関連する可能性がある(図6、ペプチド50−56)。3つの57kDa結合タンパク質のアミノ酸配列を比較したが、その同タンパク質への結合を説明する、それらの間の有意な配列相同性は示されなかった。しかし興味深いことに、第二の領域(ペプチド46−60)のアミノ酸配列はタンパク質キナーゼC共通配列をコードする(15)。さらに第三の領域(ペプチド81−89)はまた、タンパク質キナーゼA部位をコードすることが示された(43)。
【0097】
ヘキサペプチドの配列および57kDaタンパク質間の結合の親和力を測定するために、657SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA676 (配列番号2)によってコードされるヘキサペプチドと57kDaタンパク質間の相互作用に対する、ハイソルト(0.3〜2.4M KCl)、両性イオン性界面活性剤(10〜160mM CHAPS)およびイオン性界面活性剤(0.1%〜2%SDS)の効果を測定することを目的にした。我々の結果では、この結合がハイソルトに対して安定で、高濃度のCHAPSに対して適度に安定であるが、低濃度のSDSに対して感受性であることが示された(図7)。共有結合ペプチドに対するタンパク質結合の安定性を考慮し、10mM CHAPSの存在下、HP−gp1リンカードメイン由来のヘキサペプチドの、複合膜タンパク質を含み得るCHAPS可溶性タンパク質に対する結合を測定することを目的にした。図8の結果は、HP−gp1のリンカードメインをコードする同オーバーラップヘキサペプチドに対する結合タンパク質を示す。ヘキサペプチド番号46−60、81−89および5−9(図5を参照)は57kDaタンパク質に結合した(図7)が;他のタンパク質は、10mM CHAPSの不存在下でタンパク質と結合しなかった、同ヘキサペプチドまたは異なるヘキサペプチドと相互作用することがわかった。例えば、ヘキサペプチド3−10は、CHAPSの不存在下で以前に検出されなかった〜210kDaタンパク質と結合した。同様に、CHAPSの不存在下でいずれのタンパク質をも結合しなかった、ヘキサペプチド16−20は同じ高分子量タンパク質と結合した(図7)。ペプチド46−60は、CHAPSの存在下で、いくつかの低分子量タンパク質(〜45−25kDa)とより強く結合した。ヘキサペプチド80−89は57kDaタンパク質に加えて2個の他のタンパク質と結合した。総合すると、図8の結果は、57kDaタンパク質に対する種々のヘキサペプチドの結合は、CHAPSのような穏やかな両性イオン性界面活性剤に対して抵抗性であることを示す。さらに、10mM CHAPS中、膜タンパク質を可溶化すると、10mM CHAPSの不存在下では見られない他のタンパク質との結合を示す。1つの可能性は10mM CHAPSが、複合膜タンパク質の、HP−gp1リンカードメインの種々のヘキサペプチドとの相互作用を可能にすることである。また、CHAPSは、新規ドメインを暴露し、これは次いでHP−gp1リンカードメインのヘキサペプチドへの結合を受ける。さらに、ヘキサペプチド40−60および80−89と結合する、より低分子量のタンパク質のいくつかは57kDaタンパク質の分解産物であるかもしれない(図8)。
【0098】
ヒトにおけるP−gp遺伝子ファミリーは2つのアイソフォーム、HP−gp1およびHP−gp3(またはmdr 1およびmdr 3;(20))によってコードされる。しかし、以前に示されるように、HP−gp1のみがMDR表現型を与える。さらに、HP−gp1および3は約80%アミノ酸配列相同性を共有し(111);リンカードメインは、66%アミノ酸配列相同性を有する、2つのアイソフォーム中で最も変化するドメインである。HP−gp3リンカードメインが同タンパク質または異なるタンパク質と結合するかどうかを測定するために、HP−gp3リンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドをポリプロピレンロッド上で合成し、可溶性タンパク質に対するその結合を上記のように試験した。図9は、HP−gp3のヘキサペプチドに対する結合タンパク質のプロファイルを示す。興味深いことに、類似の分子量のタンパク質(57kDa)はまた、HP−gp3由来のヘキサペプチドと結合した。しかし、いくつかのヘキサペプチドに対する結合はHP−gp1に関して観察されたものと相違した(図6対図9)。HP−gp3に関して、3つのより大きな鎖のアミノ酸(618LMKKEGVYFKLVNM631 (配列番号4)、648KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS674 (配列番号5)、および695PVSFLKVLKLNKT 707 (配列番号6))は57kDaタンパク質と結合した。HP−gp3リンカードメインの第一および第三領域は、HP−gp1リンカードメインの第一および第三領域と相当の配列同一性を共有する(図10)。したがって、同ヘキサペプチドが同タンパク質に結合したことは驚くべきことではない。HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの第二領域は異なっている(図10)。結果的に、HP−gp1およびHP−gp3配列の両者は57kDaと結合するが、HP−gp3と57kDaタンパク質間の相互作用領域はP−gp1のものよりも大きい(図6対図9)。HP−gp1およびHP−gp3結合ヘキサペプチド由来のアミノ酸配列の比較を図10に示す。
【0099】
実施例9
57kDaタンパク質の精製および配列決定
57kDaタンパク質のアイデンティティーを測定するために、HP−gp1リンカードメインの第二領域由来の2個のヘキサペプチド(658RSSLIR663 (配列番号7)および669SVRGSQ674 (配列番号8))の数コピーを合成した。後者のヘキサペプチド配列は57kDaタンパク質と最も高い親和性で結合するものであった。図11はこれらの2個のペプチドの、[35S]メチオニンで代謝的に標識された細胞由来の全細胞リゼートに対する結合を示す。両ヘキサペプチドは57kDaタンパク質および見かけの分子量〜41kDaの別のタンパク質と特異的に結合した。興味深いことに、全細胞リゼートのインキュベーション時間を長くすると、41kDaタンパク質のレベルが増加した(図11)。したがって、この41kDaバンドは57kDaタンパク質の分解産物である可能性がある。
【0100】
2個のヘキサペプチドを用いて57kDaタンパク質を精製するため、BSA以外の他の担体タンパク質を用いることができるかどうか測定することを目的とした。図12は、57kDaタンパク質へのヘキサペプチドの結合に対する、ブロッキング担体なし、1%ゼラチン、および0.3%または3%BSAの作用を示す。この実験のこれらの結果は、担体タンパク質なしが非特異的結合の減少に必要とされた点で驚くべきものであった。後者の確立された結合条件を用いて、数コピーのヘキサペプチド658RSSLIR663 (配列番号7)および669SVRGSQ674 (配列番号8)と結合した大量の57kDaタンパク質を単離した。図13は、クーマシーブルーで染色されたSDS−PAGE上の精製57kDaタンパク質を示す。後者の精製タンパク質をPVDF膜に転写し、Ponceau S で染色し、57kDaタンパク質の位置をつきとめた。予想される分子量で移動した Ponceau S 染色バンドを切り出し、直接N末端配列決定用に用いた(33)。まず7ラウンドのエドマン分解により、MREVISIおよびMREIVHIの2個の配列が示された。これらの2個の配列は3アミノ酸のみが異なっていた(IVHの代わりにVIS)。FastA タンパク質サーチエンジンを用いてこの2個の配列を既知のタンパク質配列と比較すると、後者の配列がαおよびβ−チューブリンの最初の7N末端アミノ酸をコードすることが示された。この57kDaタンパク質として、チューブリンを同定することは、見かけの分子量および長いインキュベーション期間後に観察された潜在的分解産物と矛盾しない。この57kDaタンパク質のチューブリンとしてのアイデンティティーをさらに確認するため、SDS−PAGEで分離され、ニトロセルロース膜に転写されたヘキサペプチド結合57kDaタンパク質および全細胞リゼートに対してウエスタンブロット分析を行った。次いでこのニトロセルロース膜を、それぞれ抗α−チューブリンおよび抗β−チューブリンモノクローナル抗体でプローブした。図14はウエスタンブロット分析の結果を示す。配列決定の結果と一貫して、両チューブリンサブユニット(αおよびβ)はヘキサペプチド結合タンパク質を含むレーンにおいて認識された。したがって、57kDaタンパク質のαおよびβ−チューブリンとしてのアイデンティティーが確立される。
【0101】
実施例10
このように、オーバーラップペプチドスパニング法発明の能力はP−gpを用いて確認された。上に示されるように、本発明のオーバーラップペプチドに基づく方法は、2個の相互作用するタンパク質間の領域は高親和性の結合配列および反発配列(repulsive sequences)から構成されることを示す仮説に対する原理の証拠、ならびにこのような方法を効率的かつ首尾良く用いて相互作用タンパク質のドメインおよび配列を同定し、特徴付けできることを提供する。高親和力と反発力のバランスは2個のタンパク質が安定な複合体を形成するかどうかを決定する。短い 一致するペプチドの使用により、ベイトおよびプレイタンパク質間のこのような高親和性の結合配列を同定できる。高親和性結合配列を単離するための短い 一致するペプチドの使用に関する理論的根拠は、本明細書中に記載される原理の証拠の成功および効率に本質的である。例えば、より大きなペプチドは、1ペプチド配列中に、相互作用の正味の力が負であるように、高親和性および反発結合配列を含むことができる。さらに、前または後のペプチドと1アミノ酸が異なるオーバーラップペプチドの使用は、非特異的結合の可能性を減少させる。したがって、オーバーラップペプチドはしばしば、種々のペプチドの結合親和力のピークを示す(図7および4を参照)。当業者であれば、より長いオーバーラップペプチドもまた使用できることが理解できよう。不幸にも、このようなより大きなペプチドは、高親和性と反発アミノ酸間のバランスの変化のせいで、相互作用タンパク質の同定をミスするリスクを増大させる。
【0102】
HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの3つの異なる領域に対する57kDaタンパク質の結合は、本明細書中で提案される仮説と一貫し、タンパク質相互作用を説明する(タンパク質間相互作用の原理を参照)。高親和性結合ドメインは長さが10〜26アミノ酸のサイズにおいて変化する。HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの場合、この3個の高親和性結合ドメインのうち2個が相当の配列同一性を共有していた。リンカードメインの第三の高親和性結合領域(658SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA 677 (配列番号2)対648KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS674 (配列番号5))はその一次アミノ酸配列において相同性を共有しなかった。しかし、これらの2個のドメインのらせん車輪の存在は、車輪の一表面上の正電荷を帯びた残基のクラスターと、他の側面上のセリン/スレオニン残基のクラスターを示す(図15を参照)。興味深いことに、57kDaタンパク質に対して最も高い結合親和性の領域は、HP−gp1中の3個の推定のリン酸化部位をコードする(15)。HP−gp3中のリン酸化部位の位置は実験では決定しなかったが、これらはプロテインキナーゼCの共通配列をコードする。この側面では、リンカードメインでのHP−gp1およびHP−gp3相互作用はこのドメインのリン酸化によって調節される。したがって、リンカードメイン内のP−gpリン酸化部位の突然変異はその薬物輸送機能に影響しないことが示されている(40)が、HP−gp1の他の提唱される機能(例えば内因性クロライドチャンネルのレギュレーター)はそのリン酸化状態によって影響されることが示された(41、110)。実際、同様のリンカードメインをコードする、ABCトランスポーターのメンバー、CFTR(嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子)は微小管ネットワークとともに局在することがわかった(107)。さらに、T84細胞の頂端原形質膜への、CFTRの微小管依存性急性補充は、細胞内cAMPの増加およびリンカードメインのリン酸化に応答するものであった(107)。総合すると、リン酸化がチューブリン依存性の様式でP−gp機能の調節に役割を担うかどうか明らかではないが、HP−gp1リン酸化およびチューブリンへの結合が共に局在することから、その可能性があり得る。 本明細書中に記載されるアッセイを用いて、リン酸化ヘキサペプチドがチューブリンと結合するかどうかについての実験が進行中である。したがって、本発明は生物学的に関連するタンパク質性ドメイン間の相互作用の証明に門戸を開く。
【0103】
57kDaタンパク質がポリプロピレンロッドまたはその誘導体化部分と結合する可能性は、同様に誘導体化されたすべての他のロッドがこの57kDaタンパク質と結合しなかったのでありそうもない。さらに、少なくとも4つの異なる時点で合成されたヘキサペプチドは同タンパク質と結合した。最後に、HP−gp1およびHP−gp3のリンカードメインの第一および第三高親和性結合領域をコードするヘキサペプチドはこの57kDaタンパク質と結合した。この57kDaタンパク質に加えて、見かけの分子量〜80kDaおよび30kDaの他のタンパク質もまた、リンカードメイン内のいくつかのヘキサペプチドと結合した。しかし、これらのタンパク質の結合は、この57kDaタンパク質よりずっと弱く、会合タンパク質であるかもしれない。種々のヘキサペプチドとこの57kDaタンパク質間の結合親和力の直接測定は行わなかったが、興味深いことにこの相互作用は10mM CHAPSおよびハイソルトに耐性である。さらに、インキュベーション混合物中に10mM CHAPSが存在すると、他のタンパク質(最も顕著には〜210kDaタンパク質)の数鎖のヘキサペプチド(これは10mM CHAPSの不存在下では結合しなかった)に対する結合が生じた。後者のタンパク質のヘキサペプチド15−28に対する結合は、CHAPSの不存在下では排除された、タンパク質の膜物質からの抽出のせいであり得る。CHAPSの不存在下では、細胞リゼートは可溶性タンパク質および膜結合タンパク質のみを含んでいた。
【0104】
HP−gp1またはHP−gp3がチューブリンと結合する生理学的サインは明らかでない。しかし、チューブリンはいくつかの膜タンパク質と相互作用することが示された(42、50、81、86)。HP−gp1またはHP−gp3はチューブリンと相互作用し、微小管は膜−骨格防御モデルの例である可能性がある(56)。このモデルでは、膜レセプターの小画分は基礎となる細胞骨格に固定されているようである(95)。この面において興味深いことに、インビボのレイト(rate)肝腫瘍におけるP−gpの安定性および発現の増大は、α−チューブリン、β−アクチン、およびサイトケラチン8/18を含む、いくつかの細胞骨格タンパク質の安定性における同様の増加と関連する(64)。 P−gpのチューブリンとのインビボ相互作用の機能的重要性についての実験が進行中である。
【0105】
実施例11
オーバーラップペプチドスパニング法はPgp相互作用タンパク質に限定されない
本発明のオーバーラップペプチド手法は、完全な膜貫通タンパク質であるP−糖タンパク質ではなく、可溶性の膜結合タンパク質であるアネキシンIを用いてさらに証明された。したがってアネキシンは構造的および機能的にP−糖タンパク質と異なっている。
【0106】
この手法を用いて、アネキシンIと相互作用するいくつかのタンパク質およびこれらの相互作用を媒介するアネキシンIの正確なアミノ酸配列を同定した。アネキシンIは、可逆的なカルシウム依存様式でリン脂質と結合する、細胞内の可溶性の膜結合タンパク質の大きなファミリーのメンバーである。アネキシンファミリーの種々のメンバーは、小胞性輸送、膜融合エキソサイトーシス、シグナル伝達、およびイオンチャンネル形成および薬物耐性を含む、多数の種々の細胞内プロセスに関与していた。アネキシンIの多くの可能な生理学的機能を考慮し、本発明の方法は、その相互作用タンパク質および、それに対するアネキシンI相互作用を媒介する正確なアミノ酸配列を同定するために設計された。
【0107】
簡単には、以前に記載されるように、アネキシンIの完全アミノ酸配列(トータル〜340ペプチドプラスコントロール)と対応するオーバーラップペプチドを、上記のように固形支持体上で合成した。この場合、ヘキサペプチドではなく、オーバーラップヘプタペプチドを用いた。次いでこのペプチドを、[35S]メチオニンで代謝的に標識されたMCF7乳腫瘍細胞から単離された全細胞性タンパク質とインキュベートした。数回洗浄した後、上に概説するように、結合タンパク質を溶出させ、SDS−PAGEで分離した。この結果はP−糖タンパク質を用いた以前の結果と一致し、この方法は分子量10kDa〜200kDaの範囲(具体的には、〜10kDa;〜29kDa;〜85kDa;〜106kDaおよび〜200kDa)の5タンパク質と相互作用するアネキシンIアミノ酸配列(データは示していない)のいくつかの集団(islands)を同定する。簡単には、抽出物の細胞性タンパク質に関して高い親和性を有する8相互作用ドメインを同定した。これらの高アフィニティー集団の2つはアネキシンの尾部ドメイン(残基1〜36)に位置し、6つはアネキシンIのαヘリックス束(残基37〜末端;例えばWO99/21980)に位置していた。後者の相互作用タンパク質の同定は現在研究下にある。しかし、10kDaタンパク質のアネキシンIとの相互作用は、アネキシンIとS100Cタンパク質間の直接相互作用を証明した以前の実験と一致している(70)。
【0108】
したがって、本発明は高親和性タンパク質相互作用を単純かつ効率的に同定することを可能にし、ならびに相互作用パートナーの少なくとも1つの正確なアミノ酸配列を同時に同定することを可能にすることが示される。
【0109】
結論
結論として、全細胞リゼートからP−gp相互作用タンパク質を同定する単純な手法を用いた。さらにこの手法は、P−gp1およびP−gp3リンカードメインにおける、このタンパク質のチューブリンとの相互作用を媒介する正確なアミノ酸配列の同定を可能にする。さらに、高親和性結合配列の知見は、さらにアネキシンIを用いて例証されたように、次いで細胞性タンパク質の全混合物からこの相互作用タンパク質を精製することを可能にする。実際、タンパク質間相互作用を研究するこの手法の単純性により、他のタンパク質に容易に適用される。最後に、我々の手法は、他の現在用いられている手法と比べて迅速で、いくつかの利点を有する。
【0110】
本発明は、本明細書中、その好ましい態様を用いて上に記載されたが、これは、請求の範囲に規定される本発明の精神および性質から逸脱することなく修飾可能である。
【0111】
参考文献
1. Adorini, L., 1993, Clin Exp Rheumatol 8:S41-44.
2. Ahmad et al., 1994, Biochemistry 33:10313-10318.
3. Alba et al., 1998, Electrophoresis 19:2407-2411.
4. Ausubel et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York
5. Bates et al., 1995, Cancer Chemotherapy & Pharmacology. 35:457-463.
6. Bates et al., 1992, Biochemistry 31:6366-6372.
7. Bates et al., 1993, Biochemistry 37:9156-9164.
8. Beck, W. T., 1983, Cancer Treat. Rep. 67:875-882.
9. Boscoboinik et al., 1990, Biochimica et Biophysica Acta 1027:225-228.
10. Brown et al., Nat Genet. 1999 Jan;21(1 Suppl):33-7, Review
11. Buschman et al., 1994, Cancer Research 54:4892-4898.
12. Campbell et al., 1984, Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science (Publ.), Amsterdam, The Netherlands
13. Chambers et al., 1990, Biochemical and Biophysical Research Communications 169:253-259.
14. Chambers et al., 1994, Biochemical Journal 299:309-315.
15. Chambers et al., 1993, The Journal of Biological Chemistry 268:4592-4595.
16. Chan et al., 1995, Hematology - Oncology Clinics of North America 9:275-318.
17. Chan et al., 1991, New England Journal of Medicine 325:1608-1614.
18. Chen et al., 1997, Curr Opin Chem Biol 1:458-466.
19. Cheung et al., Nat Genet. 1999 Jan;21(1 Suppl):15-9, Review
20. Childs et al., 1994, Important Adv Oncol :21-36.
21. Cole et al., 1996, Cancer Treatment & Research 87:39-62.
22. Cornelissen et al., 1994, Journal of Clinical Oncology 12:115-119.
23. Dalton et al., 1995, Cancer 75:815-820.
24. Debouck et al., Nat Genet. 1999 Jan;21(1 Suppl):48-50, Review
25. Devault et al., 1990, Molecular and Cellular Biology 10:1652-1663.
26. Duggan et al., Nat Genet. 1999 Jan;21(1 Suppl):10-4, Review
27. Edman et al., 1967, Eur J Biochem 1:80-91.
28. Ehrmann et al., 1997, Neoplasma 44:299-304.
29. Felder et al., 1993, Mol Cell Biol 13:1449-1455.
30. Fields et al., 1994, Trends Genet 10:286-292.
31. Fine et al., 1988, Proceedings of the National Academy of Science USA 85:582-586.
32. Fitscher et al., 1993, Analytical Biochemistry 213:414-421.
33. Flynn et al., 1983, Biochem Biophys Res Commun 117:859-65.
34. Ford et al., 1990, Pharmacological Reviews 42:155-199.
35. Futscher et al., 1993, Analytical Biochemistry 213:414-421.
36. Georges et al., 1993, The Journal of Biological Chemistry 268:1792-1798
37. Georges et al., 1990, Proceedings of the National Academy of Science USA 87:152-156.
38. Georges et al., 1990, Advances in Pharmacology 21:185-220.
39. Georges et al., 1991, Journal of Cellular Physiology 148:479-484.
40. Germann et al., 1996, J Biol Chem 271:1708-16.
41. Gill et al., 1992, Cell 71:23-32.
42. Giustetto et al., J Comp Neurol 395:231-244.
43. Glavy et al., 1997, J Biol Chem 272:5909-5914.
44. Goldstein, L. J., 1995, Curr Probl Cancer 19:65-124.
45. Gottesman et al., 1995, Annu Rev Genet 29:607-649.
46. Gottesman et al., 1993, Annual Review of Biochemistry 62:385-427.
47. Grogan et al., 1990, Laboratory Investigation 63:815-824.
48. Gros et al., 1986, Cell 47:371-380.
49. Gupta, S., 1996, "P-glycoprotein Expression in Normal Hematopoietic Progenitors and Cells of the Immune System" in Multidrug Resistance in Cancer Cells: Molecular, Biochemical, Physiological and Biological Aspects. Editors: Gupta, S. and Tsuruo, T., John Wiley & Sons, NY.:293-302.
50. Haga et al., 1988, Eur J Biochem 255:363-368.
51. Hardy et al., 1995, The EMBO Journal 14:68-75.
52. Heldin, C. H., 1995, Cell 80:213-223.
53. Herweijer et al., 1990, Journal of the National Cancer Institute 82:1133-1140.
54. Higgins, C. F., 1992, Annual Review of Cell Biology 8:67-113.
55. Hoogenboom et al., 1998, Immunotechnology 4:1-20.
56. Jacobson et al., 1995, Sciences 268:1441-1442.
57. Jolliet-Riant et al.,1999, Fundam Clin Pharmacol 13:16-26.
58. Kast et al.,1997, J. Biological Chemistry 272:26479-26487.
59. Klemm et al., 1998, Annu Rev Immunol 16:569-592.
60. Klotz et al., 1975, In H. Neurath and R. L. Hill (ed.), The Proteins. Academic Press, Inc. New York :293-411.
61. Kuriyan et al., 1997, Annu Rev Biophys Biomol Struct 26:259-288.
62. Laemmli, U. K., 1970, Nature 227:680-685.
63. Landschulz et al., 1988, Science 240:1759-1764.
64. Lee et al., 1998, J Cell Physiol 177:1-12.
65. Li et al., 1993, Nature 363:85-88.
66. Ling, V., 1997, Cancer Chemother Pharmacol 40:Suppl:S3-8.
67. List et al., 1993, Journal of Clinical Oncology 11:1652-1660.
68. Loo et al., 1995, The Journal of Biological Chemistry 270:843-848.
69. Lowry et al., 1951, Journal of Biological Chemistry 193; 265-275
70. Mailliard, W.S., et al., 1996, J. Biol. Chem., 271; 719-725
71. Martini et al., 1998, Curr Opin Neurol 11:545-556.
72. McCoy et al., 1997, EMBO J 16:6230-6236.
73. Miller, 1988, Ann. Reports Med. Chem. 23:295
74. Molina et al., 1996, Pept Res 9:151-155.
75. Moran et al., 1987, Nucleic Acids Res., 14:5019
76. Naito et al., 1992, Biochemical and Biophysical Research Communications 185:284-290.
77. Nare et al., 1994, Biochemical Pharmacology 48:2215-2222.
78. Nooter et al., 1994, Leukemia Research 18:233-243.
79. O'Brien et al., 1996, "P-glycoprotein Expression in Normal Human Tissues," in Multidrug Resistance in Cancer Cells: Molecular, Biochemical, Physiological and Biological Aspects.: S. Gupta, and T. Tsurucy (eds.), John Wiley & Sons.:285-292.
80. Pawson et al., 1992, Cell 71:359-362.
81. Perrot-Applanat et al., 1995, J Cell Sci 108:2037-2051.
82. Phizicky et al., 1995, Microbiological Reviews 59:94-123.
83. Porpaczy et al., 1983, Biochem. Biophysica. Acta. 749:172-179.
84. Prelich et al., 1989, Nature 326:517-520.
85. Ramsay et al., Nat Biotechnol. 1998 Jan;16(1):40-4, Review.
86. Ravindra, R., 1997, Endocrine 7:127-143.
87. Reed et al., 1996, J Cell Biochem 60: 23-32.
88. Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Ed.
89. Ro et al., 1990, Human Pathology. 21:787-791.
90. Roninson et al.,1986, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 83:4538-4542.
91. Rosenberg et al., 1997, Journal of Biological Chemistry. 272:10685-10694.
92. Ruetz et al., 1994, The Journal of Biological Chemistry 269:12277-12284.
93. Safa et al., 1986, The Journal of Biological Chemistry 261:6137-6140.
94. Safa, A. R., 1993, Cancer Investigation 11:46-56.
95. Sako et al., 1995, J Cell Biol 129:1559-1574.
96. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories
97. Schena et al., Trends Biotechnol. 1998 Jul;16(7):301-6, Review
98. Schinkel et al., 1991, Cancer Research 51:2628-2635.
99. Schinkel et al., 1994, Cell 77:491-502.
100. Smit et al., 1993, Cell 75:451-462.
101. Sonneveld et al., 1994, Journal Clinical Oncology 12:1584-91.
102. Stanfield et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:103-113.
103. Stefanou et al., 1998, Anticancer Res 18:4673-4681.
104. Steitz et al., 1977, J Biol Chem 252:4494-4500.
105. Stevenson et al., 1998, Anal Biochem 262:99-109.
106. Susskind et al., 1983, In R. W. Hendrix, J. W. Roberts, F. W. Stahl, and R.A. Weisberg (ed.), Lambda II. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. :347-363.
107. Tousson et al., 1996, J Cell Sci 109:1325-34.
108. Towbin et al., 1979, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76:4350-4354.
109. Tschesche et al., 1975, Eur J Biochem 58:439-451.
110. Valverde et al., 1992, Nature 355:830-833.
111. Van der Bliek et al., 1987, The EMBO Journal 6:3325-3331.
112. Venter et al., 1998, Science 280:1540-1542.
113. Verrelle et al., 1991, Journal of the National Cancer Institute 83:111-116.
114. Vincent et al., 1972, Biochemistry 11:2967-2977.
115. Watanabe et al., 1995, Acta Oncologica 34:235-241.
116. Weinstein et al., 1990, Human Pathology. 21:34-48.
117. Wigler, P. W., 1996, J Bioenerg Biomembr 28:279-84.
118. Wilson et al., 1995, Methods Enzymol 250:79-91.
119. EP-A-0818467
120. WO98 15833A
121. WO84 03564A
【0001】
(発明の分野)
本発明は、プロテオノミクス(proteonomics)に関する。さらに具体的には、本発明は、タンパク質間相互作用、並びに相互作用するタンパク質および相互作用部位のアミノ酸配列を同定するための方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
特異的なタンパク質間相互作用は、生物学的過程において非常に重要な事象である。細胞の情報の流れを処理し細胞の決定をコントロールする生物学的過程は、タンパク質間相互作用に支配される(例えば、情報伝達、細胞周期の調節および細胞構造の組み立て)。細胞のタンパク質間相互作用の全ネットワークは、生体内の活動および外部の情報に対するその生体の応答を調節する機能的な事象の生物学的なチャートである。この生物学的な相互作用のチャートの完成に欠くことのできない工程は、ある特定の生体におけるすべての遺伝子配列に関する知識である。ホモサピエンスゲノムの全DNA配列は、少なくとも2003年までには完成するであろう(112)。あいにく、遺伝子の配列は、その生物学的機能も生物学的なチャートにおけるその位置付けも明らかにするものではない。ヒトゲノムにおけるタンパク質の数は予想されており(80,000〜120,000)、タンパク質間相互作用の生物学的なチャートのマッピングは途方もない事業ではあるがやり甲斐はある。
【0003】
過去20〜30年の間に、タンパク質間相互作用を測定するための技術がいくつか開発されている(参考として(82)参照)。これらの技術には、i)相互作用するタンパク質を選択し検出する物理的な方法[例えばタンパク質アフィニティークロマトグラフィー、共免疫沈降、架橋、およびアフィニティーブロッティング]、ii)ライブラリーに基づく方法[例えば、ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステム];およびiii)遺伝的方法[例えば過剰産生表現型、合成的致死効果(synthetic lethal effects)および同一連鎖群に属さない非相補性(unlinked noncomplementaion)]が含まれる。タンパク質間相互作用を検出する上記の方法のうち、ツーハイブリッドシステムが最も一般的で、最も広く使用されている。古典的なツーハイブリッドシステム(30)では、リポーター遺伝子の転写が、DNAが結合した“おとり”タンパク質と、活性化ドメインを含む“捕獲”タンパク質との間の相互作用に依存する。あいにく、ツーハイブリッドシステムは多くの欠点に悩まされることがある。例えば、タンパク質の相互作用は、大部分のタンパク質が存在する細胞質ではなく核周囲で観察され、2つの相互作用するタンパク質の間の正確なアミノ酸配列が同時に同定できず、異なる相互作用するタンパク質が発現し得る異なる細胞種または組織に対して容易に応用することができない。
【0004】
小さい合成ペプチドがタンパク質に結合することができることは以前に実証されている(1、18、55、102)。しかし、相互作用するタンパク質ドメインおよび配列を同定する系統的手法における合成ペプチドの使用は提唱も提供もされていない。ある特定のシグネイチャードメインは、特定のペプチド配列に高い親和性で結合することが示されている(例えば、SrcファミリーキナーゼのSrcホモロジー−2またはSH2ドメインは、上皮成長因子受容体およびフォーカルアドヒージョンキナーゼにおいてみられるリン酸化されたチロシン(Y*−EEI)配列に強固に結合する)(61)。
【0005】
したがって、i)相互作用するタンパク質間の少なくとも1つの結合パートナーの正確なアミノ酸配列;ii)異なる細胞または組織における、多くの、恐らくはすべての相互作用するタンパク質;およびiii)リード薬物の単離の標的としての、2つの相互作用するタンパク質間の特定のドメイン(または配列)の同定を可能にする方法を提供する必要がある。さらに、従来の方式よりも著しく速い(例えば、数か月ではなく数日)、タンパク質の相互作用ドメインの正確なアミノ酸配列の同定を可能にする方法および分析を提供する必要がある。
【0006】
本発明は、これらおよび他の必要性を満たすことを目的とする。
【0007】
本記載は、数多くの文献を参考のために引用し、その全内容が本明細書の一部を構成する。
【0008】
(発明の要約)
本発明は、従来技術の欠点を克服することを目的とする。より具体的には、本発明は、従来技術と異なるタンパク質間相互作用ドメインを同定するための方法に関する。さらに、本発明の1つの方法は、タンパク質間相互作用を支配する原理についての理解に基づいている。したがって、そのような理解は、いくつかの方法の使用を可能にする。以下に、次のものを同定するためのそのような方法が詳細に例示される:i)相互作用するタンパク質間の少なくとも1つの正確なアミノ酸配列;ii)異なる細胞または組織における、多くの、恐らくはすべての相互作用するタンパク質;およびiii)リード薬物の単離の標的としての、2つの相互作用するタンパク質間の特定のドメイン(または配列)。好ましくは、本発明の方法および分析は、i)、ii)およびiii)の測定を可能にする。さらに、従来技術の手法と異なり、本明細書に記載の方法は、相互作用するタンパク質および相互作用の正確なアミノ酸配列の同定が数か月ではなく数日で可能である。
【0009】
ある遺伝子産物といくつかのパートナーその他との間の相互作用をブロックするタンパク質(あるいはその他の分子)を選択する能力は、ヒト細胞や他の現在取り扱いが難しい系における、細胞情報伝達または細胞代謝の高度な調節を可能にする。実際、治療上重要なタンパク質と相互作用するタンパク質の同定、および相互作用部位の同定は、“ノックアウト”などの他の遺伝的手法(71)よりも医薬品開発に適しているかもしれない。これは、多量体の複合体における1つのタンパク質(すべてではなく、せいぜい2、3個のタンパク質)の相互作用を阻害するのとは異なり、ある特定のタンパク質が関与するすべての相互作用を破壊することによる、表現型における帰結を取り扱うものである。
【0010】
本発明はさらに、薬物の発見における新規の手法に関する。疾患を処置するための薬物の開発における主な障害は、標的タンパク質とその機能部位の同定であった。事実、製薬会社における大部分の研究開発(R&D)事業は、有効な標的タンパク質を同定するまでに数年を要する。結合してこれらのタンパク質の機能を阻害する薬物の選択には数年を要し、一般的にこれは非特異的で無秩序なものである。さらに、現在の手法によって同定される薬物は、タンパク質の活性部位を標的としていることが多い。つまり、そのような薬物は重大な副作用につながることが多い。したがって、多くのR&D事業が徹底的な研究努力を3〜5年続けても具体的な薬物の開発に決してつながらないというのは、驚くべきことではない。本発明のタンパク質間相互作用を同定するための方法および分析は、薬物の開発における次の3つの重要な工程を扱うものである:
1)標的タンパク質における相互作用するすべてのドメインのアミノ酸配列の同定;
2)薬物開発のための、相互作用するタンパク質(好ましくは相互作用するすべてのタンパク質)のセットの同定;および
3)標的タンパク質において相互作用するドメインの各々に対して特異的な薬物のスクリーニング。
【0011】
P−糖タンパク質(P−gp)は、親油性の抗癌剤で選択された腫瘍細胞系において多剤耐性を引き起こすことが示されている。P−gpアミノ酸配列の解析は、約90アミノ酸の高度に荷電した領域、即ちリンカードメイン、によって連結された2つの疎水性と親水性のドメインを有する二重分子の提唱モデルが導かれた。同じように荷電したドメインがP−gpスーパーファミリーの他の分子において見つかっているが、このドメインの機能はわかっていない。本発明の方法を用いて、このドメインが他の細胞タンパク質と結合することをここに実証する。ヒトのP−糖タンパク質遺伝子1および3(HP−gp1およびHP−gp3)のリンカードメインの全アミノ酸配列にわたる、オーバーラップへキサペプチドを用いて、HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインと細胞内タンパク質との間の直接的且つ特異的な結合がここに示される。リンカードメインにおける3つの異なる鎖(HP−gp1に対しては617EKGIYFKLVTM627 (配列番号1), 658SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA677 (配列番号2)および694PVSFWRIMKLNLT706 (配列番号3)そしてHP−gp3に対しては618LMKKEGVYFKLVNM631 (配列番号4), 648KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS674 (配列番号5)および695PVSFLKVLKLNKT677 (配列番号6))が、みかけの分子量約80kDa、57kDaおよび30kDaを有するタンパク質と特異的に結合する。興味深いことに57kDaのタンパク質だけが、リンカードメインの3つの異なる配列に、変化する程度でもって結合した。リンカー配列をコードするオーバーラップペプチドと57kDaのタンパク質との間の結合は、両イオン性界面活性剤であるCHAPSに対して耐性であったが、SDSには感受性であった。57kDaのタンパク質の精製と部分的なN−末端アミノ酸配列の分析は、それがαおよびβチューブリンのN−末端をコードしていることを示した。さらに、αおよびβチューブリンに結合するモノクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティング分析によって、57kDaのタンパク質との同一性が確認された。これらをまとめると、これは、P−gpリンカードメインとのタンパク質相互作用を示す最初の例である。もちろん、これはP−gpの全体の機能に重要かもしれない。より重要なことに、この研究の結果は、高い反発性の結合エネルギーを有する少数のアミノ酸の鎖が2つのタンパク質間の相互作用に関わるという、新しい概念を実証するものである。
【0012】
本発明の1つの態様に従えば、選択されたタンパク質、そのドメインまたはその一部における、高い親和性で相互作用するドメインおよびそのアミノ酸配列を同定するための方法であって、
a)選択されたタンパク質、そのドメインまたはその一部の配列の全長にわたる、共有結合により支持体に結合したオーバーラップペプチドのセットを用意すること;
b)タンパク質の混合物および/またはペプチドの混合物を用意すること;
c)(a)記載のオーバーラップペプチドのセットと(b)記載の混合物とを、そのセットのペプチドにおける高い親和性で相互作用するドメインと(b)記載のタンパク質またはペプチドの1またはそれ以上との間の結合を可能にする条件下でインキュベーションすること;
d)(c)の高い親和性の相互作用でないタンパク質間相互作用を洗い流すこと;および
e)(a)記載のどのペプチドが、(b)記載のタンパク質またはペプチドと高い親和性で相互作用するかを同定すること
を含み、それによって(e)のペプチドおよびその配列が高い親和性で相互作用するドメインとして同定される、方法が提供される。
【0013】
本発明の別の態様によれば、選択されたタンパク質、そのドメインまたはその一部の配列の全長にわたる、共有結合により支持体に結合したオーバーラップペプチドのセットと、タンパク質の混合物および/またはペプチドの混合物との間の、高い親和性で相互作用するドメイン間の相互作用を調節する物質を同定するための方法であって、
a)そのオーバーラップペプチドのセットと、その混合物とを、そのセットのペプチドにおける高い親和性で相互作用するドメインと、その混合物のタンパク質またはペプチドの1またはそれ以上との間の結合を可能にする条件下、少なくとも1つの物質の存在下でインキュベーションすること;
b)(b)の高い親和性の相互作用でないタンパク質間相互作用を洗い流すこと;および
c)(a)記載のどのペプチドが、その混合物のタンパク質またはペプチドと、その物質の存在下で、その物質の非存在下と比較して高い親和性で相互作用するかを同定すること
を含み、それによって、その物質の存在下での相互作用に、その物質の非存在下での相互作用に対する測定できる差異があるとき、その物質が高い親和性の相互作用の調節物質として同定される、方法が提供される。
【0014】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の高い親和性のタンパク質の相互作用の調節物質として同定された物質が提供される。
【0015】
本発明において、次の略語および用語を以下に定義する。
【0016】
定義
用語「ペプチド配列にわたるオーバーラップペプチド」(例えばドメイン、完全長のタンパク質配列またはその一部)などは、そのタンパク質(またはその一部)の配列に基づく、選択された大きさのペプチドを意味する。好ましくは、これらのペプチドは合成ペプチドである。
【0017】
以下に説明されるように、オーバーラップペプチドの大きさは本発明の作用に重要な影響を及ぼし得る。例えば、隣接する4個のアミノ酸のペプチドは、それに対するタンパク質の低い親和性の結合を有意に増加させるようである。さらに、例えば20アミノ酸以上の、より大きなペプチドの使用は、高い親和性のアミノ酸に対する反発性のアミノ酸の比率を増加させると予想され、そのために、そのペプチドに特異的なタンパク質の結合がマスキングされるかまたは全体的に阻害される。したがって、より大きなペプチドではなく、小さいペプチドの選択に関して交換条件が存在すると当業者は理解するであろうが、本発明のオーバーラップペプチドに好ましい大きさは、5〜15アミノ酸、より好ましくは5〜12アミノ酸、さらに特に好ましくは5〜10アミノ酸である。
【0018】
本発明のオーバーラップペプチドが共有結合している支持体に関して、用語「支持体」は、当分野において得られる多数の支持体から選択することができる。そのような支持体には、チップ、プレート(例えば96ウェルプレート)、ガラスビーズなどが含まれる。チップ法は当分野ではよく知られている(10、19、24、26、85、97)。
【0019】
タンパク質配列は、IUPAC−IUBの生化学命名委員会の推奨に従って、当分野において一般的に使用されるような1文字または3文字のアミノ酸表記を用いて本明細書において示す。
【0020】
特記しないかぎり、本明細書において使用される学術用語および技術用語および命名法は、本発明に関係する当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学的方法などの手順は、当分野において用いられている一般的な方法である。そのような標準的な技術は、 レファレンスマニュアルに見ることができる(4、96)。
【0021】
本明細書の記載は、 主としてタンパク質、または組み換えDNA(rDNA)技術の用語に言及するものである。選択された例示は、明瞭かつ一貫させるために記載するものである。
【0022】
本明細書において用いられているように、「核酸分子」は、ヌクレオチドのポリマーを意味する。その非限定的な例には、DNA(例えばゲノムDNA、cDNA)およびRNA分子(例えばmRNA)が含まれる。核酸分子はクローニング技術によって得るかあるいは合成することができる。DNAは二本鎖でも一本鎖でもよい(コード鎖または非コード鎖[アンチセンス])。
【0023】
当分野で知られている用語「組換えDNA」は、DNA断片の連結によって生じるDNA分子を意味する。これはしばしば遺伝子操作と呼ばれる。用語「DNA断片」は、ヌクレオチドの直鎖状の鎖または配列を含んでなるDNA分子を意味するために本明細書において用いられる。遺伝暗号に従って読まれれば、この配列は、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片などと呼ばれるアミノ酸の直鎖状の鎖または配列をコードすることができる。
【0024】
用語「増幅ペア」は本明細書において、本発明のオリゴヌクレオチド(オリゴ)のペアを意味し、これは多くのタイプの増幅方法うちの1つ、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応による、選択された核酸配列の増幅において一緒に使用されるために選択されるものである。他のタイプの増幅方法には、以下により詳細に説明されるように、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅または核酸配列に基づく増幅が含まれる。当分野において一般に知られているように、オリゴは、選択された条件下で相補的な配列に結合するように設計する。
【0025】
本発明を実施するための核酸(例えばDNAまたはRNA)は、よく知られた方法によって得ることができる。
【0026】
本明細書において用いられているように、用語「生理学上関連のある」は、1以上のタンパク質の自然環境における活性またはレベルを調節する効果をもたらす相互作用を記述することを意味する。
【0027】
用語「DNA」分子または配列(時として用語「オリゴヌクレオチド」も同様)は、デオキシリボヌクレオチドである、アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)および/またはシトシン(C)からなる二本鎖の形態の分子を意味し、本明細書において定義される用語として本発明の「調節エレメント」からなるかまたはそれを含む。用語「オリゴヌクレオチド」または「DNA」は、直鎖状のDNA分子または断片、ウィルス、プラスミド、ベクター、染色体または合成によって得られたDNAに見られる。本明細書において使用されるように、具体的な二本鎖DNA配列は、通常の規定にしたがい、5'から3'方向の配列のみで記述することができる。
【0028】
「核酸ハイブリダイゼーション」は、適当な条件下で熱力学的に有利な二本鎖構造を形成する相補的な塩基配列を有する2本の一本鎖核酸分子のハイブリッド形成を意味する。ハイブリダイゼーション条件の例は、上に引用した2つの実験マニュアルにみつけることができ(4,96)、当分野において一般的に知られている。ニトロセルロースフィルターへのハイブリダイゼーションの場合では、よく知られたサザンブロッティング法における例に関して、ニトロセルロースフィルターを、50%のホルムアミド、ハイソルト(5×SSCまたは5×SSPE)、5×Denhardt溶液、1%SDSおよび100のμg/mL変性キャリアーDNA(例えば、サケ精子DNA)を含む溶液中で標識プローブを用いて65℃で一晩インキュベーションすることができる。次いで、非特異的に結合したプローブを、2×SSC/0.1%SDS中、所期のストリンジェンシーを考慮して選択された温度、即ち、室温(低いストリンジェンシー)、42℃(中程度のストリンジェンシー)または65℃(高いストリンジェンシー)にて、数回洗浄することによりフィルターから洗い流すことができる。選択された温度は、DNAハイブリッドの融解温度(Tm)に基づく。もちろん、RNA−DNAハイブリッドも形成させ検出することができる。そのような場合、ハイブリダイゼーションと洗浄の条件を、当業者によく知られた方法にしたがって適合させることができる。ストリンジェントな条件が好ましく用いられるであろう(96)。
【0029】
核酸のためのプローブは、天然の糖リン酸骨格並びに、ホスホロチオエート、ジチオネート、アルキルホスホネート、およびα−ヌクレオチドなどを含む修飾された骨格を利用することができる。修飾された糖リン酸骨格は、 一般に教示されている(73,75)。本発明のプローブは、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)のいずれか、好ましくはDNAから構築することができる。
【0030】
本発明の利点は、タンパク質および/またはペプチド間の相互作用の検出が標識に依存するということである。そのような標識によって感度がもたらされ、自動化が可能になる。本発明の1つの態様では、チップ法を用いて自動化を行なう。例えば、タンパク質の選択された配列にわたるオーバーラップペプチドをチップに結合し、その後、タンパク質またはペプチドとの相互作用についての試験を自動化するためにそれを使用することができる。もちろん、選択されたタンパク質配列にわたるオーバーラップペプチドのセットの設計や合成に、本発明が厳密に依存するわけではないことは理解すべきである。実際、ペプチドのバンクが利用可能であり、そこからこのオーバーラップペプチドのセットを構築することができる。
【0031】
タンパク質の標識は当分野においてよく知られている。標識の非限定的な例は、3H、14C、32Pおよび35Sが含まれる。検出可能なマーカーの非限定的な例には、リガンド、蛍光体、化学発光剤、酵素および抗体が含まれる。特定の標識の選択によって、その標識のタンパク質に対する結合様式が決まるということは当業者には明らかであろう。
【0032】
例えば、この相互作用は、プロテオミクス的手法(例えば2Dゲルおよび質量分析法)を用いて評価することができるので、相互作用の同定は、タンパク質の標識には特に依存するものではない。
【0033】
一般に知られているように、放射性アミノ酸を、いくつかのよく知られ た方法によって本発明のペプチドまたはタンパク質に組み込むことができる。その非限定的な例には、35SMetを用いる、タンパク質のインビトロまたはインビボ標識が含まれる。
【0034】
用語「ベクター」は、当分野において一般に知られており、プラスミドDNA、ファージDNA、ウイルスDNAなどであり、これらは、本発明のDNAがそこへクローニングされるDNAビークルとしてはたらく。数多くのタイプのベクターが存在し、当分野においてよく知られている。
【0035】
用語「発現」は、遺伝子がmRNAへ転写され(転写)、次いでmRNAが1以上のポリペプチド(あるいはタンパク質)に翻訳される(翻訳)過程を定義するものである。
【0036】
用語「発現ベクター」は、上記のベクターまたはビークルであるが、宿主内への形質転換後に挿入された配列の発現を可能にするよう設計されたベクターまたはビークルとして定義される。クローニングされた遺伝子(挿入された配列)は、通常、プロモーター配列のような制御エレメントの制御下に置かれる。そのような制御配列下でのクローニングされる遺伝子の配置は、しばしば、制御エレメントまたは配列を制御するために作動可能なように連結された、と呼ばれる。
【0037】
作動可能なように連結された配列は、さらに同じRNA転写物に転写された2つの断片を含んでいる。即ち、プロモーターおよび「リポーター配列」のような2つの配列は、プロモーターにおける転写の開始によってレポーター配列のRNA転写物が産生されるならば、作動可能なように連結している。「作動可能なように連結され」るためには、2つの配列が互いに直接隣接していることは必要ではない。
【0038】
発現制御配列は、ベクターが原核生物または真核生物の宿主あるいはその両方(シャトルベクター)において作動可能なように遺伝子を発現するよう設計されているか否か、およびエンハンサーエレメント、終止配列、組織特異的エレメントおよび/または翻訳開始および終止部位などの転写要素をさらに含むことができるか否かに依存して変わるであろう。
【0039】
原核生物での発現は、目的のDNA配列によってコードされる大量のタンパク質の製造に有用である。このタンパク質は、大きさや電荷などのそのタンパク質固有の特性を利用した標準的なプロトコル(例えばSDSゲル電気泳動、ゲルろ過、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィーなど)にしたがって精製することができる。さらに、目的のタンパク質は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。精製されたタンパク質は、治療的適用のために使用することができる。
【0040】
DNA構築物は、本発明のオリゴヌクレオチド配列に作動可能なように連結されたプロモーターを含むベクターであり、本発明のオリゴヌクレオチド配列もまた、ルシフェラーゼリポーター分子の遺伝子などのヘテロローガスな遺伝子に作動可能なように連結されている。「プロモーター」は、細胞内のRNAポリメラーゼに直接的または間接的に結合することができ、下流の(3'方向)、コード配列の転写を開始することができるDNA調節領域を意味する。本発明において、プロモーターは転写開始部位とその3'末端で結合し、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要最小限の数の塩基またはエレメントを含むように上流に(5'方向)伸びる。プロモーター内では、転写開始部位(S1ヌクレアーゼによるマッピングにより便利に定義される)、並びにRNAポリメラーゼの結合をつかさどる結合ドメイン(コンセンサス配列)がみられる。真核生物のプロモーターは、常にではないが、「TATA」ボックスおよび「CCAT」ボックスを含んでいることが多い。原核生物のプロモーターは、−10および−35のコンセンサス配列に加えて、シャイン−ダルガノ配列を含んでいる。
【0041】
本明細書において用いられている表示「機能的誘導体」は、核酸配列かアミノ酸配列かにかかわらず配列の機能的誘導体という意味において、もとの配列の生物学的活性と実質的に同様である生物学的活性(機能または構造のいずれか)を保持している分子を意味する。この機能的誘導体または等価物は、天然の誘導体でも、あるいは合成によって製造されたものでのよい。そのような誘導体には、1またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列が含まれるが、但し、そのタンパク質の生物学的活性は保存されている。配列の生物学活性が一般に維持されるかぎり、同じことが、1またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有する核酸配列の誘導体にも当てはまる。タンパク質配列に関して、置換するアミノ酸は、置換されるアミノ酸の物理化学的性質と類似の物理化学的性質を有するものである。類似の物理化学的性質には、電荷、かさばり、疎水性、親水性などにおける類似が含まれる。用語「機能的誘導体」は、本発明の主題の「断片」、「部分」、「変異体」、「類縁体」または「化学的誘導体」が含まれる。
【0042】
当分野においてよく知られているように、アミノ酸の「保存的な突然変異または 置換」は、
1)ポリペプチドの骨格の構造(例えば、βシートまたはαヘリックス構造);
2)アミノ酸の電荷または疎水性;または
3)側鎖のかさばり
を維持する突然変異または置換を意味する。より具体的には、よく知られている用語「親水性残基」は、セリンまたはトレオニンを意味する。「疎水性残基」は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンを意味する。「正に荷電した残基」は、リジン、アルギニンまたはヒスチジンを意味する。「負に荷電した残基」は、アスパラギン酸またはグルタミン酸を意味する。「かさばった側鎖」を有する残基は、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンを意味する。
【0043】
本発明のペプチド、タンパク質断片などは、よく知られている方法に従って、その配列に依存してまたは無関係に修飾することができる。例えば、ペプチドは、1、2、3またはそれ以上の位置での保存的なアミノ酸置換を用いて、図面において例示された野生型の配列から得ることができる。用語「保存的なアミノ酸置換」は、当分野においてよく知られており、特定のアミノ酸を同様の特性を有するアミノ酸で置換すること(例えばグルタミン酸に対してアスパラギン酸、またはロイシンに対してイソロイシン)を意味する。もちろん、非保存的なアミノ酸置換、並びに欠失または挿入などのその他のタイプの修飾も行なうことができるが、但し、これらの修飾は、ペプチドを適当なやり方で(例えば、これが修飾によって意図するものであれば、そのペプチドの生物学的な活性に影響を及ぼすことなく)修飾するものである。典型的な保存的なアミノ酸置換の一覧を以下に示す。
【表1】
【0044】
この表からわかるように、これらの修飾のうちのいくつかをタンパク質分解により強いペプチドを得るために使用することができる。もちろん、ペプチドの修飾も、当分野においてよく知られているように、酵素または化学的な処理を用いて、その主要な配列に影響を及ぼすことなく行なうことができる。
【0045】
このように、本明細書において、用語「変異体」は、本発明のタンパク質または核酸に、構造および生物学的活性において本質的に類似しているタンパク質または核酸分子を意味する。
【0046】
本発明の機能的誘導体は、当分野においてよく知られている方法を用いて、化学的に合成するかまたは組換えDNA技術によって製造することができる。本発明の1つの具体的な態様では、本発明の変異体は本発明の方法によって同定することができる。さらに、それは、特定のアミノ酸の保存性について正式に試験するために設計することができる(例えば、変異体または突然変異ペプチドの合成によって)。これらの変異体は、相互作用を確認するために、タンパク質の完全長の配列の一部として試験することもできる。もちろん、当業者は、高い親和性のタンパク質相互作用に関与する領域として選択されたタンパク質の領域の同定が、この領域の構造と機能の関連を同定し分析するための、この領域のインビトロ突然変異誘発(または関連するペプチド配列の試験)を可能にすることを理解するであろう。そのような方法は当業者によく知られている。2つのタンパク質の相互作用するドメインが同定されれば、当業者は、相互作用するタンパク質に対し、修飾された親和性を有する変異体を同定および/または設計することが可能である。もちろん、相互作用する配列が両方ともわかっていれば、これらの間の高い親和性の相互作用を支配する構造と機能の関連性を分析することが強く求められるであろう。
【0047】
本明細書において用いられる、「化学的誘導体」は、通常、本発明の主要部ではないさらなる化学的部分を包含することを意味する。そのような部分は、その誘導体の物理化学的特性(例えば、可溶性、吸収、半減期など、毒性の減少)に影響するであろう。そのような部分は、Remington's Pharmaceutical Sciences (88)に例示されている。これらの物理化学的部分をポリペプチドにカップリングする方法は、当分野においてよく知られている。
【0048】
用語「対立遺伝子」は、染色体上のある特定の座を占める遺伝子の二者択一的形態を定義するものである。
【0049】
一般に知られているように、「突然変異」は、娘細胞へ伝達され得る遺伝物質における検出可能な変化である。よく知られているように、突然変異は、例えば1またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドにおける検出可能な変化である。例えば、ヌクレオチドは、付加、欠失または置換されているか、反転しているか、または新しい位置へ転位することがある。偶発的な突然変異および実験的に誘発された突然変異がある。核酸分子の突然変異の結果が突然変異核酸分子である。突然変異体ポリペプチドは、この突然変異核酸分子からコードされる。
【0050】
本明細書において用いられるように、用語「精製された」は、細胞成分から分離された分子を意味する。したがって、例えば、「精製されたタンパク質」は、自然界で見つからない程度まで精製されている。「実質的に純粋な」分子は、大部分の他の細胞成分を含まない分子である。
【0051】
本明細書において使用される用語「分子」、「化合物」または「リガンド」は天然の分子、合成分子または半合成分子、または化合物を意味するために、交換可能なようにそして広く用いられる。したがって、用語「分子」は、例えば、化学物質、巨大分子、細胞または組織の抽出物(植物または動物由来)などを意味する。分子の非制限的な例には、核酸分子、ペプチド、抗体、炭水化物および医薬的作用物質が含まれる。作用物質は、ランダムスクリーニング、合理的選択、例えばコンピュータモデリングのようなタンパク質またはリガンドのモデリングを用いた合理的設計によって、コンビナトリアルライブラリースクリーニングなどを含む様々な手段によって選択しスクリーニングすることができる。用語「合理的に選択された」または「合理的に設計された」は、本発明の相互作用領域の構造に基づいて選択された化合物を意味し定義するものである。当業者によって理解されるように、天然に存在しない修飾を有する巨大分子も、用語「分子」の範囲に含まれる。例えば、製薬産業においてよく知られ、ペプチド類縁体として一般に呼ばれているペプチド模擬体(peptidomimetics)は、上記のモデリングによって作製することができる。同様に、好ましい態様では、本発明のポリペプチドを、その安定性を高めるために修飾する。ほとんどの場合、この修飾は相互作用領域の生物学的活性に変化を及ぼすものではないと理解すべきである。本発明の教示に従って同定された分子は、細胞および/または組織の生理機能またはホメオスタシスが本発明に従って同定される高い親和性のタンパク質相互作用によって危険にさらされるような疾患または状態において治療上の価値を有する。あるいは、本発明の教示に従って同定された分子は、そのような相互作用を調節することができるより効果的な物質の開発に有用である。
【0052】
化合物のライブラリー(公に利用可能または商業的に利用可能の、例えばコンビナトリアルライブラリー)は、当分野においてよく知られている。ペプチドのライブラリーも利用可能である。そのようなライブラリーは、選択されたドメイン、タンパク質またはその一部にわたるオーバーラップペプチド配列のセットを構築するために使用することができる。
【0053】
本明細書において用いられるように、「指標細胞」は、1つの具体的な態様において、本発明の2つの相互作用するペプチドドメインを発現する細胞を意味し、ここで、これらのタンパク質または相互作用するそのドメイン間の相互作用が、その相互作用が評価または確認されるような同定可能か選択可能な表現型あるいは特性と結びついている。そのような指標細胞も、本発明のスクリーニング分析において使用することができる。ある態様では、指標細胞は、選択された誘導体、断片、相同体またはこれらの相互作用するドメインの突然変異体を発現するように処理を施されている。細胞は、酵母細胞または哺乳類細胞(WO96/41169)などの高等真核生物細胞でもよい。1つの具体的な態様では、指標細胞は、当分野においてよく知られた、ツーハイブリッドシステム法の使用を可能にするベクターを有する酵母細胞(4)であり、化合物またはそのライブラリーを試験するために使用することができる。1つの態様では、選択可能なマーカーまたは分析可能なタンパク質をコードするリポーター遺伝子を、その選択可能なマーカーまたは分析可能なタンパク質の発現がタンパク質Aおよびタンパク質Bドメインの相互作用に依存するように、制御エレメントと作動可能なように連結することができる。そのような指標細胞は膨大な分子の高速大量処理での迅速スクリーニングに使用することができる。具体的な態様では、リポーター遺伝子がルシフェラーゼまたはβ−Galである。
【0054】
1つの態様では、本発明の2つの相互作用するタンパク質またはドメインのうちの少なくとも1つが、融合タンパク質として提供されていてもよい。そのための構築物の設計、および融合タンパク質の発現と産生は当分野においてよく知られている(4,96)。具体的な態様では、両方の相互作用領域が融合タンパク質の一部である。そのような融合タンパク質の非限定的な例には、Lex−Aタンパク質A融合(DNA結合ドメイン−タンパク質A;おとり(bait))およびB42タンパク質B融合(トランス活性化因子ドメイン−タンパク質B;捕獲(prey))を含んでいる。さらに具体的な態様では、Lex−Aタンパク質A融合およびB42タンパク質B融合タンパク質を、LexAオペレーターおよび/またはLexA応答エレメントに作動可能なように連結されたリポーター遺伝子をさらに有する酵母細胞において発現させる。もちろん、その他の融合タンパク質をそのようなツーハイブリッドシステムにおいて使用することができることは認識されるであろう。さらに、融合タンパク質が完全長の相互作用するタンパク質を含む必要がないことは認識されよう。実際、これらのポリペプチドの断片は、それらが相互作用するドメインを含んでいるかぎり、本発明のペプチドスパンニング法で証拠づけられるように、本発明にしたがって使用することができる。
【0055】
そのような融合タンパク質の非限定的な例には、ヘマグルチニン融合物、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合物およびマルトース結合タンパク質(MBP)融合物が含まれる。ある態様では、融合させた2つのポリペプチド配列の間にプロテアーゼ開裂部位を導入することが有益であろう。2つのヘテロローガスに融合したポリペプチド間のそのようなプロテアーゼ開裂部位は当分野においてよく知られている。
【0056】
ある態様では、本発明の相互作用するドメインを、宿主細胞からの融合タンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチド配列に融合させることが有益であろう。種々の生物由来のシグナルペプチドが当分野においてよく知られている。バクテリアのOmpAおよび酵母Suc2は、シグナル配列を含んでいるタンパク質の2つの非限定的な例である。ある具体的な態様では、相互作用ドメインとヘテロローガスなポリペプチド部分の間の(一般に知られている)リンカーを導入することも有益であろう。そのような融合タンパク質は、本発明の分析並びに精製や検出などに有用である。
【0057】
もちろん、本発明を実施するのに有用な配列およびポリペプチドには、それらに限定されることなく、突然変異体、同族体、サブタイプ、対立遺伝子などが含まれる。一般に、本発明の配列は(不完全とはいえ)機能的な相互作用ドメインをコードすると理解すべきである。本発明の相互作用ドメイン、その変異体、誘導体または断片が、そのパートナーに対する結合における機能を保持するかどうかは当業者には明らかであり、本発明の教示および分析並びに当分野の一般的な教示を用いて容易に測定されるであろう。
【0058】
以下に例示されるように、本発明の相互作用ドメインを、例えばインビトロの突然変異誘発によって修飾し、その構造と機能の関連を分析し、調節化合物のより良い設計と同定を可能にすることができる。しかし、その各々の相互作用パートナーと相互作用するという生物学的機能を喪失した誘導体または類縁体は、例えば、抗体を惹起するために依然として有用であろう。そのような類縁体または誘導体は、例えば、本発明の相互作用ドメインに対する抗体を惹起するために使用することができる。これらの抗体は、検出または精製に使用することができるであろう。さらに、これらの抗体は、競争または非競争阻害剤としても作用し、本発明にしたがって同定される相互作用の調節物質が見つかるであろう。
【0059】
宿主細胞または指標細胞は、外因性またはヘテロローガスなDNA(例えば、DNA構築物)が細胞内部に導入されているとき、そのようなDNAによって「トランスフェクト」ている。トランスフェクトされるDNAは、細胞のゲノムを構築する染色体DNA内に組み込まれていても(共有結合で連結していても)、組み込まれていなくてもよい。例えば、原核生物、酵母および哺乳類細胞では、トランスフェクトするDNAは、プラスミドなどのエピゾームエレメントにおいて維持されていてもよい。真核細胞に関しては、安定にトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトされるDNAが、染色体複製を通じて娘細胞に受け継がれるように、染色体内へ組み込まれるようになったものである。この安定性は、トランスフェクトされたDNAを含んでいる娘細胞の集団からなる細胞系またはクローンを確立するその真核細胞の能力によって実証される。トランスフェクション法は、当分野においてよく知られている(4,96)。指標としての哺乳類細胞の使用は、試験される2つのポリペプチドの相互作用を可能にするかまたは調節する、下等な真核生物または原核生物には存在していないであろう介在因子が提供されるという利点をもたらすことができる。もちろん、試験されたポリペプチドの両方が直接相互作用するとしても利点はあるかどうかはまだわからない。例えば、具体的な態様において哺乳細胞からの抽出物を用いて、選択された指標細胞におけるある特定の因子の欠如を補うことができることは理解されるであろう。翻訳の領域は、異なるタイプの抽出物を調製し再構成する方法を十分教示するものであると認識されるであろう。
【0060】
一般に、抗体(モノクローナル抗体およびハイブリドーマを含む)を調製するための技術、および抗体を使用して抗原を検出するための技術は、当分野においてよく知られている(12)。本発明はさらに、それらの各々の相互作用ドメインを阻害または中和するおよび/またはそれら対して特異的である、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそのヒト化形態、キメラ抗体などを提供する。
【0061】
本明細書および添付した請求の範囲から、「治療剤」なる用語は、少なくとも2つのそのような治療剤の組合せも含むように広い意味に解されるべきである。さらに、本発明のDNA断片またはタンパク質は、多くの方法によって人に投与することができる。例えば、赤血球産生細胞を罹患者から単離し、本発明のDNA構築物で形質転換し、静脈注射を含む多くの方法により、その罹患者に再投与することができる。別法として、DNA構築物を、例えば骨髄における注入によって、罹患者に直接投与することができる。治療剤は、具体的なタイプの細胞を標的として設計し、種々の経路を通じて投与されるように処理を施すことができる、リポソームなどのビークルを通じて投与することもできる。
【0062】
ヒトへの投与に関しては、処方している医学専門家が、特定の患者に対して適切な剤型と用量を最終的に決定し、これは、選択された治療計画(例えば、DNA構築物、タンパク質、分子)、患者の応答および状態並びに疾患の重篤度によって変わるものと予想される。
【0063】
本発明の範囲に含まれる組成物は、所望の治療効果を達成するのに有効であり、有害な副作用を回避する量の活性成分(例えばタンパク質、核酸あるいは分子)を含有する。典型的には、本発明の核酸は、1日あたり、処置されるその哺乳動物の体重1kgあたり0.005〜1mgの用量で、哺乳動物(例えばヒト)に投与することができる。活性成分の製薬的に許容される調製物および塩は、本発明の範囲内に含まれ、当分野においてよく知られている(88)。ポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニストなどの投与に関しては、有害な副作用を回避するように投与量を選択する。用量は、患者の疾患の程度や種々のパラメータなどの慣用的な要因に従い、臨床医が調整する。典型的には、0.001〜50mg/kg/日を哺乳動物に投与する。
【0064】
本発明の方法および分析を、さらにアネキシンにより確認した。このタンパク質は、P−糖タンパク質と構造および機能の両方において有意に異なる。従って、タンパク質化学および分子生物学についての知識とともに、これらの確認によって、すべてのタンパク質(ウイルス、細胞、動物、植物由来などの)についての本分析および方法の有用性が裏付けられる。
【0065】
このように、本発明を概説したが、本発明の好ましい態様を説明する目的で図面を引用する。
【0066】
本発明の他の目的、利点および特徴は、例示的な添付の図面を参照して、以下の好ましい態様の非限定的な記載を読めばより明らかになるであろう。そして本発明の範囲を限定するものとして理解すべきではない。
【0067】
(好ましい態様の記載)
タンパク質の機能因子(functionor)または機能は、他の細胞または細胞外タンパク質徒の間のそのタンパク質の相互作用が関与している。これまで、2つのタンパク質間の相互作用には相補的なアミノ酸配列を有するポリペプチドの大きな断片が関与していると考えられていた。しかし、これらの相補的な配列が、タンパク質間の相互作用にどのように関与しているかはわからない。本願では、タンパク質間相互作用の原理を説明する新たな概念を提唱するものである。即ち、任意の2つ以上のタンパク質間相互作用は高い親和性の結合と高い反発力を有する不連続な配列の鎖が介在している[図1を参照]。タンパク質の露出された配列全体のこれらの力の合計は、タンパク質間の性質と程度を決定づける。これらの相互作用するドメインの大きさは、長さで5〜25アミノ酸の範囲で変わる。2つの小さい高親和性結合配列間の引力は、2つのタンパク質間のすべての高い親和性の結合力および反発力の合計よりも一般に大きい。したがって、本発明の手段を用いて、高親和性結合配列のみをコードする短いペプチド(およそ6アミノ酸)を用いて、タンパク質の混合物から相互作用するタンパク質を単離することが可能である。実際、想像してみれば、相互作用するタンパク質を単離する多くの試みがなぜ失敗に終わったのかを理解するのは、今や容易いことである。相互作用するタンパク質を単離するための大きな断片またはタンパク質の使用は、引力/反発力の合計が引力の鎖よりもずっと弱いので効果が低い。本明細書において提唱される原理はさらに、タンパク質間相互作用が、翻訳後修飾(例えばリン酸化(29)によって)および他の相互作用するタンパク質の存在(60)によって調節することができるという事実と一致する。従って、翻訳後修飾後の弱い相互作用の付加または喪失によって、タンパク質を会合した状態に保つかまたはそれらの会合を阻止する高い親和性の結合と高い反発力との間の非常に微妙なバランスを破壊することができる。2つの高親和性結合配列間の引力の大きさについての根拠は、抗原が2、3個のアミノ酸のみであり得る抗体抗原結合において実証される(36、37)。更に、 多くの例は、タンパク質間の細胞の相互作用が5〜10のアミノ酸の小さなコンセンサス配列の存在により生じる生物学において存在する。そのような小さなコンセンサスの非限定的な例には、ロイシン・ジッパー(63)、およびSH2およびSH3結合配列(63、80)が含まれる。2つ以上のタンパク質間の相互作用(上に示した)のドメインに加えて、タンパク質間相互作用は、例えば以下のもののような、多くの測定可能な作用を有することができる:i)一方または両方のタンパク質の動力学特性の変化(83、84);ii)新しい結合または機能的部位の形成(65、104);そしてiii)機能の不活性化(106、114)。言い換えれば、ある特定のタンパク質は、なんらかの相互作用するタンパク質の非存在下ではなく存在下で種々の機能的ドメインまたは配列を露出することができるであろう。したがって、タンパク質Bの存在下で、タンパク質Aは他のタンパク質に対して今まで露出されなかった他の配列を露出することができる(65、83、84、104、106、114)。後者の概念は、タンパク質の解明された結晶構造からの機能または表面に露出されたドメインの予測における構造的研究(即ち、X線およびNMR)の有効性に反論するものであるので非常に重要である。ある特定のタンパク質のすべての高い親和性の結合部位の測定と同定を可能にすることによって、本発明はそのような構造の研究から得られた結果の欠点を克服しようとするものである。
【0068】
タンパク質間相互作用の上記の例に加えてさらに、タンパク質間相互作用の部分集合は二量体化である。タンパク質間相互作用が、機能の活性化または阻害(59)にとって本質的であるような例が生物学にはたくさん存在する。ホモまたはヘテロ二量体の非限定的な例には、成長因子受容体(52);膜輸送タンパク質(9、36、76);腫瘍抑制タンパク質(72);およびアポトーシスに関与するタンパク質(87)が含まれる。実際、動的な二量体化は、情報伝達の調節における共通のテーマである。二量体化の機能上の帰結には、シングル膜貫通細胞表面受容体(例えばEGF受容体(52))の活性化に関する増大した近接性およびヘテロ二量体化による差異のある調節[例えば、BCL2ファミリーのタンパク質(87)]が含まれる。
【0069】
生細胞におけるタンパク質濃度は非常に高く、10〜30mg/mLの範囲にある。この高いタンパク質濃度で、すべてではないにしても大部分のタンパク質が、他の細胞タンパク質と精密にそして特異的に相互作用する。相互作用するタンパク質のいくつかが機能を阻害する物質として作用する一方、他のタンパク質は活性化因子になりうる[例えば、BCL2−BAXファミリーのタンパク質(87)]。さらに、活性化因子と阻害因子の会合との間のある特定のタンパク質の循環は、迅速に起こるような会合−解離過程が必要であろう。例えば、タンパク質Xが阻害タンパク質Iに会合しているとき、タンパク質Xとタンパク質Aとの会合に必要なそのドメイン(小さい配列)は、X−I複合体に容易には接近できないかもしれない。したがって、会合したタンパク質を同定するための本方法(即ち、ツーハイブリッドシステムおよび同様の手法)は、会合したタンパク質をすべて同定することができないかもしれない。言いかえれば、本方法は、成功すれば、それらの会合したタンパク質のすべてではないがいくつかの機能的なドメインのみを同定することができる。対照的に、ペプチドスキャンニングの手法を用いて、本発明の方法は、タンパク質Xおよびその関連タンパク質の機能的なドメインまたは高い親和性の相互作用ドメインをすべて同定することができる。一旦関連するタンパク質が同定されれば、標的タンパク質Xに関連しているその関連タンパク質の生物学の機能を試験することができる。したがって、ある特定の相互作用するタンパク質に関して、1または多くの可能性のある関連タンパク質による相互作用が機能にとって重要であると分かれば、(タンパク質Xとタンパク質IまたはAとの間の)高親和性結合配列を容易に同定することができ、高速大量処理薬物スクリーニング分析(以下参照)またはその他の分析の標的部位として使用することができる。
【0070】
本発明は、タンパク質間相互作用が、タンパク質の三次元配列の全体にわたって散在した不連続な高い親和性の結合と高い反発力からなり、これらの配列を本明細書において示された多くの可能な手段のうちの1つを使用して単離することができるという[図1A〜Dに記載された]概念を含んでいる。本発明では、オーバーラップペプチドの手段を例示するが、同様の結果をもたらす他の手段も想像することができる。本明細書に記載した手段は、タンパク質間相互作用を同定するための他の一般に使用される方法に影響を及ぼす、相互作用するタンパク質によって生じる立体配置の変化には影響されない(例えば、ツーハイブリッドシステム、アフィニティーブロッティング、および架橋)ことが強調される。ツーハイブリッドシステムでは、例えば、タンパク質Aを、別のタンパク質配列(DNAが結合した「おとり」タンパク質)に融合し、他方の相互作用するタンパク質を、活性化ドメイン含んでいる「捕獲」タンパク質に融合する。タンパク質Aへの相互作用するタンパク質の融合は、それらの相互作用に影響を及ぼす、自然状態の立体構造には見られる領域以外の領域を露出するであろう。更に、ツーハイブリッドシステムはいくつかの欠点を有しているが、それらのうちのいくつかを以下に記載する。
i.タンパク質の相互作用は、大部分のタンパク質が存在する細胞質ではなく、核周辺で観察される。
ii.タンパク質が異なる細胞または生物において表現すると毒性を示すことがある。
iii.ツーハイブリッドシステムでの複合体における2つのタンパク質間の相互作用は、他の相互作用するタンパク質の結合を立体的に排除することがある。
iv.1つのタンパク質の修飾後翻訳は、他のタンパク質との相互作用を排除することがある。
v.ツーハイブリッドシステムは、2つの相互作用するタンパク質間の正確なアミノ酸配列を同時に同定することはできない。
vi.ツーハイブリッドシステムの適用には、誤って陽性とされる高いパーセンテージを伴う。
vii.ツーハイブリッドシステムは、異なる相互作用するタンパク質が発現するかもしれない(これはこのシステムの重大な欠点である)異なる細胞または組織に容易に適用することができない。
【0071】
相互作用タンパク質およびタンパク質Aに対する相互作用部位を同定するための方法
2またはそれ以上の相互作用するタンパク質間の配列の不連続な鎖を同定するために使用される本手法および本方法論は、スキャンニングオーバーラップペプチド法である。この手法を用いて、ある特定のタンパク質の全アミノ酸配列を網羅する大量の短いオーバーラップペプチド、「おとり」を、不活発な固体支持体上で同時に合成する[図2参照]。不連続なペプチドライブラリーとは対照的に、大量のオーバーラップペプチドを合成する原理は、ある特定のタンパク質のどの正確な配列が高い親和性の結合部位と反発する配列を含んでいるかが推測によってはわからないという事実に基づいている。それゆえ、不連続なペプチド法は、同じペプチドにおいて高親和性結合配列と反発性配列の両方の存在を導くことが多い。そのようなペプチドは、可能性のある相互作用するタンパク質には高い親和性で結合しないであろう。さらに、オーバーラップペプチドの使用は、非特異的結合の内部対照をもたらす。例えば、オーバーラップペプチドを使用すると、高い親和性ドメイン内においてペプチドが高い親和性アミノ酸配列を有し反発力をもたらすアミノ酸を欠いている場合、シグナルはピークになる[実施例1の図6参照]。もちろん、本発明は、全ペプチド配列の長さには依存しないことは理解されるべきである。実際、タンパク質のサブ領域を使用することができる。さらに、オーバーラップペプチドは、タンパク質の選択されたドメインから得られる。また、第2のタンパク質のオーバーラップペプチドのセットによって第1のタンパク質のオーバーラップペプチドの副次的なセットが判明することは認識できるであろう。
【0072】
全細胞タンパク質の混合物から、相互作用するタンパク質である「捕獲」を単離するための「おとり」としてオーバーラップペプイドの手法をどのように使用できるかを実証するために、以下の実施例が考慮されよう。P−糖タンパク質は、抗癌剤に対する耐性をもたらす膜タンパク質(46)であり、それゆえ化学療法が失敗する要因となっている。しかし、P−糖タンパク質は、腫瘍細胞における化学治療剤の蓄積を阻止することによって機能することが示されている。このタンパク質がどのように機能するかの正確なメカニズム、および何がその機能を調節する関連しているタンパク質であるかはわかっていない。したがって、例えばP−糖タンパク質とその関連タンパク質との間の結合を阻害し、それによって耐性腫瘍細胞におけるその機能を強力に調節することを可能するための、P−糖タンパク質と相互作用するタンパク質を同定することが目的である。この実施例では、P−糖タンパク質のリンカードメインに結合するタンパク質を同定することを目的とする。したがって、特定の実施例では、選択されたタンパク質のドメインを使用した。リンカードメインは、約90アミノ酸の領域をコードする。したがって、P−糖ペプチドのこの全リンカー配列を網羅するオーバーラップヘキサペプチドを、標準的なF−moc化学反応(74)を用いて固体の支持体上で合成した。共有結合により固定されたペプチド(固体の支持体上の)を、[35S]メチオニンで代謝的に標識された細胞に由来する全細胞リゼートとインキュベーションした。ペプチドと全細胞リゼートを担体物質(1〜3%ウシ血清アルブミン、または1〜3%ゼラチン、1〜3%スキムミルクなど)の存在下で4℃にて18時間インキュベーションした。インキュベーションした後、共有結合により固定化されたペプチドを、等張緩衝液で十分に洗浄した。洗浄工程の後でオーバーラップヘキサペプチドと会合したままの放射性標識された全細胞由来のタンパク質を、SDS含有試料緩衝液中で溶離し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)(62)で解析した。ゲルを乾燥し、シグナル増強をした後、SDSポリアクリルアミドゲル上の放射性標識されたタンパク質の存在によって、以下の情報が得られた:
1)特定のオーバーラップペプチドは、P−糖タンパク質リンカードメイン(または他の選択されたドメインもしくは選択されなかったドメイン)の高親和性結合配列を表している;そして、
2)特定のオーバーラップペプチドに結合したタンパク質は、関連するタンパク質である(図6を参照)。
【0073】
高親和性配列に結合する関連タンパク質は、エドマン分解法(28)などによるN末端アミノ酸配列によってその同一性を決定するために大量に単離することができる。簡潔にいえば、ある特定のタンパク質に結合するオーバーラップペプチドの配列を固体の支持体上で合成し、そこへ固定化させておく。[35S]メチオニンで代謝的に標識した細胞から得られた全細胞リゼートを、その固定化された高親和性配列ペプチドを含んでいる固体支持体に加えて、上記のとおりにインキュベーションする。結合しなかった物質を除去するための洗浄工程の後、関連タンパク質をSDS含有緩衝液を用いた溶出工程の後、大量に単離する(以下参照)。アミノ酸配列分析のために精製された関連タンパク質がここに準備される。もちろん、さらなる精製工程が必要であるならば、これらについては当業者がよく知っている。精製されたタンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル上を移動させ、分離したタンパク質を上記のとおりPVDF膜に転写する(108)。アミノ酸決定に他の方法を容易に適用することもできる(27、33)。
【0074】
2つの相互作用するタンパク質間のアミノ酸配列を同定する方法
2つのタンパク質間の高親和性結合配列を同定することを単に目的とするのであれば、上記と同じ概念を適用することができる。そのような二つのタンパク質の非限定的な例は、p53とMDMとの間の相互作用の領域である(28、103)。それゆえ、特に、この実行の目的は、タンパク質A(p53)とタンパク質B(MDM)との間の高親和性結合配列を、この相互作用を調節する化合物の同定のため、そしてさらにとりわけ薬物の開発のため、これらの配列を標的部位として使用するために同定することである。したがって、1つの態様では、ある特定の薬物が、タンパク質Aのこれら高い親和性の結合部位の1つに結合するとき、活性な複合体(タンパク質A+B)の形成を阻止し、それゆえ複合体の機能を阻害するであろう。タンパク質Aとタンパク質Bとの間の高親和性結合配列の鎖(図3参照)を単離するために、タンパク質A「おとり」の全アミノ酸配列を網羅する小さいオーバーラップペプチド(5〜7アミノ酸)を固体支持体上で同時に合成する(上記および実施例3により詳しく記載するように)。注目すべきことに、この特定の態様では、タンパク質A「おとり」の一次アミノ酸配列しか必要とされない。ペプチドが合成されれば(ペプチド合成は、96ウェルプレートにおいて固体支持体上で同時に行なわれる)、豊富化および放射性標識された完全長のタンパク質B「捕獲」(放射性標識されたタンパク質Bはインビトロ転写−翻訳反応によって容易に得られる(118))を、共有結合で固定化されたオーバーラップペプチドを含む96ウェルプレートの各ウェルに加える。タンパク質Aをコードするペプチドを、結合が起こすことが可能な放射性標識されたタンパク質Bとインキュベーションする。インキュベーションした後(5〜24時間)、結合しなかった放射性標識されたタンパク質Bを等張緩衝液中で十分洗浄することにより除去する。放射性標識されたタンパク質Bに結合するオーバーラップペプチドを、変性剤の存在下で溶出する。96ウェルプレートの各ウェルからの溶出液を、SDS PAGEに試料を流すことにより、放射性標識されたタンパク質Bの存在について解析する(62)。高親和性結合ペプチドは、放射性標識されたタンパク質Bを保持しているものとして同定されるであろう。
【0075】
「おとり」をコードするオーバーラップペプチドと相互作用するための「捕獲」として代謝的に標識されたタンパク質の使用は、この方法の感度を高め、1〜10個の放射性標識されたメチオニン残基をコードする標準的な50kDaのタンパク質に対し1010〜1012Mの結合親和性を有する相互作用するタンパク質の同定が可能になる(82)。
【0076】
リード化合物のスクリーニングのための高速大量処理分析において高親和性結合配列を使用する方法
薬物開発のための高親和性結合配列または標的部位を同定するための本明細書に記載した手法は、コンビナトリアルライブラリーによって得られた小さい分子をスクリーニングする高速大量処理分析において使用することもできる。例えば、タンパク質Aのタンパク質Bへの結合を特異的に阻害する薬物の選択(図4参照)。1またはそれ以上の標的部位(高親和性結合配列)を、以前に記載したように96ウェルプレートの各ウェルにおいて合成する。この実施例では(図4)、同じ高親和性結合配列がすべてのウェルにおいて合成される。高親和性結合配列を含む各ウェルに対して、コンビナトリアルライブラリーから得られた1またはそれ以上の小さい分子を加える。薬物を添加したのち、例えば、インビトロ転写−翻訳混合物から得られた放射性標識されたタンパク質Bを添加し、上に示したようにインキュベーションさせる。数回洗浄したのち、結合したタンパク質BをSDS−試料緩衝液で溶出する。放射性標識されたタンパク質Bを含むウェルは、その薬物がその高親和性結合配列とタンパク質Bとの間の結合に効果がないことを示している。別法として、1またはそれ以上のウェルが薬物の存在下で放射性標識されたタンパク質Bを含んでないならば、それは、薬物が、タンパク質Aとタンパク質Bにおける高親和性結合配列の間の相互作用を阻害しているということである。したがって、この薬物が良いリード化合物である。これらの薬物はここで、これら薬物が完全長のタンパク質Aとタンパク質Bの活性な複合体の形成を阻止するかどうかを分析する第2段階に進む。同定された活性な薬物は、インビボで試験してその作用機序がさらに確認されるであろう。この方法において、副作用の少ないあるいは全くない、より特異的な薬物が開発されるであろう。
【0077】
大部分のタンパク質は1以上の生物学的機能を有するので、後者の点は有益である。例えば、タンパク質Aがそれ自身と相互作用するなら、そのタンパク質は1つの機能を示し、異なるタンパク質を相互作用するその同じタンパク質は異なる機能を示す。さらに、関連タンパク質のある特定の複合体の一部であるときのタンパク質Aは、いくつかの機能に介在し、タンパク質Aとタンパク質Bとの間の相互作用の阻害する一方、タンパク質Aと無傷のタンパク質C、DまたはFとの間の相互作用をそのままにすることによって、1または2、3の細胞の経路が阻害されるであろう。対照的に、タンパク質Aの機能を阻害することによって複合体全体が阻害されるであろう。この点で、タンパク質の複合体内の2つのタンパク質間の相互作用を特異的に阻害する薬物の同定、単離および開発によって、副作用のより少ない、より特異的な薬物が得られる。さらに、異なるタンパク質が異なる組織または器官において直接発現するので、ある特定のタンパク質複合体の組成は、異なった組織の間で異なるであろう。したがって、タンパク質間相互作用を阻害する薬物の開発の手法によって、器官または組織特異的な薬物も得られるであろう。
【0078】
もちろん、本発明は、タンパク質間相互作用および化合物によるその調節を測定するための定量分析も提供するものであると理解されよう。
【0079】
結論として、相互作用するタンパク質、相互作用するタンパク質間の正確なアミノ酸配列およびタンパク質間相互作用を阻害する薬物のタンパク質におけるそのような特異的な配列の標的を同定するための、本願に記載の手法は、製薬産業において将来の薬物発見に影響する計り知れない可能性を有する。
【0080】
以下の非限定的な実施例によってさらに本発明を説明する。
【0081】
実施例1
チューブリンに対するP−糖タンパク質の結合には、リンカードメインの配列が関与する
化学療法剤による癌患者の処置の成功が薬剤耐性の腫瘍の発達によって制限されることが多い。単一の抗癌剤でインビトロで選択された腫瘍細胞系は、化学療法剤の広いスペクトルに対して耐性となり、これは多剤耐性(即ちMDR)腫瘍細胞と呼ばれる(21、45、66を参考)。さらに、これら腫瘍細胞におけるMDRの発現は、2つの膜タンパク質、MDR1 P−糖タンパク質(P−gp)および多剤体制関連タンパク質(MRP1)の過剰発現に関連している(21、45、66)。P−gpおよびMRPはいずれも、ATP結合カセットタンパク質またはABC膜トランスポーターとして知られている膜輸送タンパク質の大きなファミリーの一員である(54)。しかし、P−gpの構造は、推測の域を出ず(91)、蓄積されたトポロジーの証拠は、6個の膜貫通ドメインとATP結合配列をコードする大きな細胞質領域の一列に並んだ二重の構造を示唆している(58、68)。P−gp1の二等分された部分が、リンカードメインと称する、極性または荷電性アミノ酸に富む90残基の鎖によって連結されている。
【0082】
P−gp遺伝子ファミリーは、齧歯類において3つの(クラスI、IIおよびIII)、ヒトでは2つの(クラスIおよびIII)構造的に類似したアイソフォームから構成されている(20)。例えば、クラスIとクラスIIのP−gpアイソフォームのみがMDR表現型を示す(25、111)一方、クラスIIIアイソフォームはそうでなない(11、98)。クラスIIIアイソフォームは、形質膜の内小葉(inner leaflet)から外小葉(outer leaflet)へのホスファチジルコリンの輸送に関与している(「即ちフリパーゼ」)(92、100)。正常な組織においては、P−gp分布は主に分泌機能を有する組織に限られる(79、116)。副腎、肝臓、腎臓、腸におけるルーメンに面する突端面へのその二極化した分布は、正常な輸送または解毒のメカニズムを示唆する。さらに、造血幹細胞および特定のリンパ細胞サブクラスはさらに、高いレベルのP−gpを表現する(49)。クラスIおよびIIの通常の機能または基質は未だに明らかではない;しかし、マウスゲノムに由来するクラスIまたは/およびクラスII遺伝子の破壊によって、大部分の正常な組織において細胞増殖抑制剤または親油性化合物の蓄積を生じるが、脳においてより著しい(99、100)。これらの結果に基づけば、P−gp(クラスIおよびクラスIIまたはMDRを生じるP−gp)の正常な機能は、MDR細胞、特に脳血液関門、においてみられるのと同様に解毒であると考えられる(57)。
【0083】
高いレベルのP−gpが、大腸、腎臓、乳房および副腎に由来する多くの元来薬剤耐性である腫瘍並びに化学療法(例えば急性の非リンパ芽球性白血病における)の後にMDR表現型を獲得する他の腫瘍細胞において見られる(22、32、35、47、53、78)。いくつかの研究によって、今や、P−gp発現の反対の相関性および化学療法に対する応答が確立されている(5、89、113)。さらに、Chan et al.(16、17)は、P−gp発現が、小児白血病、子供の軟組織肉腫および神経芽細胞腫において、MDRの前兆であり持続的な応答であることを示した。これらの研究に照らせば、P−gpレベルは、化学療法による処置に対する応答を予測する少なくともいくつかの癌における説得力のある証拠のようである。
【0084】
P−gpと様々な親油性化合物との間の直接の結合は、光活性な薬物アナログを用いて実証されている(77、93、94)。P−gpに結合するある化合物は、恐らくP−gpにおける同じ薬物結合部位について競争することにより、MDR表現型を逆にすると示された(34、38)。総称してMDR反転剤(reversing agent)と名付けられているこれらの化合物には、いくつか例を挙げると、ベラパミル、キニジン、ルベルメクチン、シクロスポリンおよびジピリマドールアナログが含まれる(34、38)。MDR反転剤を使用する臨床試験(例えば、ベラパミルまたはキニジン)は、それを使用しなければ化学療法に応答しなかった腫瘍において応答を示した(23、44、117)。しかしながら、いくつかのMDR反転剤に関連する高い薬学的毒性によって、有効濃度でのその使用が阻止された(67)。他のMDR反転剤(即ちシクロスポリンAおよびその非免疫抑制剤アナログPSC833)を使用して、より良好な臨床応答が観察された。しかし、シクロスポリンによる毒性作用がみられた(101、115)。
【0085】
P−gpは、タンパク質キナーゼCおよびAの基質であることが示された(2、9)。さらに、タンパク質キナーゼC活性を調節する物質が、P−gpリン酸化およびそのMDR介在の表現型を調節するということが実証された(7、13)。1つの研究(31)では、PMAホルボールエステル(タンパク質キナーゼC活性化因子)がMCF7乳癌細胞においてMDR表現型と薬物流出を増大することが示された。別の研究(6)では、SW620ヒト大腸癌細胞の酪酸ナトリウム処置が、付随する薬物耐性または薬物流出を増大させることなく、P−gp発現の大きな増加をもたらすことが示された。興味深いことに、SW620細胞においてP−gpは、酪酸ナトリウム処置の後、少ししかリン酸化されていないことも示された(6)。これらをまとめると、SW620細胞におけるP−gpの輸送機能の欠如は明らかではないが、リンカードメイン内のP−gpリン酸化部位の突然変異は、その薬物輸送機能に影響を及ぼさないことが示された(40)。対照的に、リンカードメインにおけるセリン/トレオニン残基のタンパク質キナーゼC調節は、外因性の塩化物チャンネルの活性を調節した。したがって、これはP−gpがチャンネンル調節物質であることを示唆している(41、110)。このように、P−gp1のリンカードメインが介在しているのが、どのような機能であるのかは依然として明らかではないが、インビトロ分析を用いてリンカードメインと相互作用するタンパク質を同定することが目的であった。後者の分析は、本発明によって提供される、タンパク質相互作用についての新規な理解に基づいている。以下に示す結果は、リンカードメインの3つの配列が、みかけの分子量が約80kDa、57kDaおよび30kDaであるタンパク質に結合することを示す57kDaのタンパク質の精製と部分的なN末端アミノ酸配列分析により、それがα−およびβ−チューブリンのN末端アミノ酸をコードすることが示された。
【0086】
このように、本発明の有効性を確認する例として、タンパク質ドメインを使用して、
i)このドメインはタンパク質に特異的に結合した;
ii)特異的に結合するタンパク質が正式に同定され得る;さらに
iii)これらのタンパク質の特異的な結合に関与している配列が正式に同定された(得られる場合、このタンパク質の相互作用領域と一緒に)
ということが示された。
【0087】
実施例2
材料
[35S]メチオニン(1000Ci/mmol;Amersham Life Sciences, Inc.)および[125I]ヤギ抗マウス抗体をAmersham Biochemical Inc.から購入した。タンパク質Aセファロース−4Bは、Bio−Rad Life Scienceから購入した。使用した他の化学物質はすべて、入手し得る最高グレードのものであった。
【0088】
実施例3
ペプチド合成
予め誘導体化されたプラスチックロッド、活性なエステルおよびポリプロピレントレーは、Cambridge Research Biochemicals (Valley Stream, NY)から購入した。ペプチドは、固体のポリプロピレンロッド上で、以前に記述されているように合成した(36、37)。簡潔には、固体の支持体の予め誘導体化されたポリプロピレンロッド上のF−moc保護基(96ウェルのホルメート中で並べられた)を、30分間撹拌しながら、ジメチルホルムアミド (DMF)の中の20%(v/v)のピペリジンとインキュベーションすることにより脱離した。β−アラニンスペーサーをポリプロピレンロッド上で脱保護したのち、Fmoc保護されたアミノ酸をHOBt/DMFに溶解し、脱保護したロッドを含む適当なウェルに加えた。アミノ酸のカップリングを、室温で18時間行なった後、ロッドをDMF(1×2分)、メタノール(4×2分)およびDMF(1×2分)中で洗浄した。第2のアミノ酸のカップリングには、最初のアミノ酸のF−mocアミノ保護基の脱保護と第2の予め活性化されたF−moc保護されたアミノ酸(ペンタフルオロフェニル誘導体)を有するロッドとのインキュベーションを必要とした。18時間反応させ、ロッドを取り出し、上に示されたように洗浄した。同じ工程を、6個目のアミノ酸が連結されるまで、各アミノ酸カップリングについて繰り返した。最後のカップリング工程の後、F−moc N末端保護基を20%ピペリジン/DMFで脱離し、遊離のアミノ基を無水酢酸:ジイソプロピルエチルアミン(DIEA):DMF(50:1:50 v/v/v)を含むアセチル化カクテル中で90分間アセチル化した。ポリプロピレンロッド上のN末端のアセチル化ヘキサペプチドの側鎖保護基をトリフルオロ酢酸、フェノール、エタンジオールを含む開裂混合物(95:2.5:2.5 v/v//v)中、室温で4時間インキュベーションすることにより脱離した。開裂工程の後、ロッドをジクロロメタン(DCM)で洗浄し、5%(v/v)のDIEA/DCM中で中和した。脱保護されたペプチドが結合したロッドをDCM、メタノール中で洗浄し、18時間真空乾燥した。
【0089】
実施例4
組織培養および細胞の代謝標識
薬剤感受性(CEM)および耐性(CEM/VLB1.0)細胞を、以前に記載されているように(8)、10%ウシ胎児血清を添加したα−MEM培地において培養した(Hyclone. Inc.)。マイコプラズマ汚染について、すべての細胞をStratagene Inc. (San Diego, CA)のMycoplasma PCRキットを用いて3ヶ月ごとに試験した。細胞の代謝標識については、集密度70〜80%のCEMまたはCEM/VLB1.0細胞を、[35S]メチオニン(100μCi/mL)を用い、メチオニン不含α−MEM培地中37℃にて6時間代謝標識した。
【0090】
実施例5
細胞抽出および結合分析
[35S]メチオニンによるタンパク質の代謝標識の後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を3回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤(2mM PMSF、3μg/mLロイペプチン、4μg/mLペプスタチンAおよび1μg/mLアプロチニン)を含有する低張緩衝液(10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris−HCl, pH7.4)中に再懸濁し、氷上で30分間静置した。低張緩衝液中でのホモジネーションにより細胞を破壊した後、細胞リゼートを6000×gにて10分間遠心分離した。この遠心の後、上清を除いて、4M NaClのストック溶液で0.5M NaClの最終濃度にした。細胞リゼートを氷上で30分間インキュベーションした。試料を混合して0.1M NaClの最終濃度にした。細胞リゼートを、4℃にて15000×gで10分間遠心分離した。この上清を除き、SW55ローターを用い、ベックマン超遠心機で100,000×gで10分間再び遠心した。上記試料中の総タンパク量をローリー法(69)により測定した。
【0091】
結合分析については、全細胞リゼートから得られた[35S]メチオニン標識されたタンパク質を、同量の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の3〜6%BSAと混合し、ポリプロピレンロッドに共有結合により固定化されたオーバーラップヘキサペプチドとインキュベーションした。ペプチドおよび全細胞リゼートを4℃で一晩インキュベーションした。次いで、ロッドを除いて、PBS中4回洗浄した。ペプチドが固定化されたロッドを、1×SDS試料緩衝液中で室温にて60分間撹拌しながらインキュベーションすることにより結合したタンパク質を溶出した。超音波処理機にて、ペプチドが固定化されたロッドを、2%SDSおよび1mM β−メルカプトエタノールを含有するPBS中、65℃にて30分間インキュベーションすることにより再生した。このインキュベーション後、ロッドを、65℃の脱イオン水中で5分間、65℃のメタノール中で2分間洗浄した。次のスクリーニングラウンドのために、ペプチドが固定化されたロッドがここに準備された。結合に対する様々な界面活性剤の効果を試験する場合では、全細胞リゼートから得られた[35S]メチオニン標識されたタンパク質を同量の、KCl(300mM〜1200mM)、SDS(0.12%〜2%)またはCHAPS(20mM〜160mM)を含むリン酸緩衝化生理食塩水中の3%BSAと混合し、上記の、共有結合により固定化されたペプチドとインキュベーションした。
【0092】
実施例6
ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロッティング
Laemmliゲルシステム(62)を用いてタンパク質画分(100〜150μL)をSDS上で分離した。簡潔には、タンパク質を、1×可溶化試料緩衝液I(2%(w/v)SDS、10%(w/v)グリセロールおよび5%β−メルカプトエタノールを含有する62.5mM Tris−HCl、 pH6.8)中に溶解し、試料を定電流で電気泳動した。分離したタンパク質を含むゲルスラブを、50%メタノールおよび10%酢酸中で固定化した。[35S]メチオニンタンパク質を含むポリアクリルアミドゲルは、Amplify(商標)溶液(Amersham Inc.)中で30分間インキュベーションした後、Kodak X線フィルムに感光した。
【0093】
別法では、Towbin et al.の方法(108)に従うウエスタンブロット分析のために、タンパク質を、Tris−グリシン緩衝液中、20%メタノールの存在下で、ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜を、抗αまたはβチューブリンモノクローナル抗体(3%BSA中0.5μg/mL;Amersham.Inc)を加える前に、5%スキムミルク/PBS中でインキュベーションした。PBSで数回洗浄したのち、ニトロセルロース膜をヤギ抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲート抗体とインキュベーションし、免疫反応性タンパク質を化学ECL法(Amersham Inc.)を用いて、化学発光により視覚化した。
【0094】
実施例7
タンパク質精製およびN末端配列
57kDaの関連タンパク質を、2つの高親和性結合ペプチドを使用し、ポリプロピレンロッドのブロックを用いて精製した。簡潔には、ペプチドが固定化されたロッドを上に示したように、全細胞リゼートとインキュベーションしたが、この場合では、担体物質はゼラチン(1%)であった。結合したタンパク質を、2%SDSおよび0.1%β−メルカプトエタノールを含有する100mMリン酸緩衝液(pH7.4)中で溶出した。溶出したタンパク質を、9倍量の氷冷エタノールと混合し、−20℃でインキュベーションすることにより沈殿させた。この試料の高速遠心(4℃にて15,000×gで15分間)の後、沈殿したタンパク質を、PBS中の1%SDS中に再懸濁し、同量の2×SDS Laemmli試料緩衝液(62)と混合した。タンパク質の試料を10%SDS PAGE上で分離しPVDF膜に転写した。57kDaのバンドの移動をPVDF膜をponseau Sで染色することにより視覚化した。57kDaのバンドを含むPVDF膜を切り取り、トロント(オンタリオ)にあるバイオテクノロジー・サービス・センターのタンパク質配列分析施設に出した。ペプチドのアミノ酸配列分析は、Flynnによって記載された手順(33)に従ってアプライド・バイオシステムズGas−Phaseモデル470Aシークエネーター(商標)を使用して、EdmanとBeggの方法(27)により行なった。
【0095】
実施例8
P−gp相互作用タンパク質の同定
上に説明するように、P−gpは、それぞれ6膜貫通ドメイン をコードする部分とATP結合ドメイン からなる反復分子である。このP−gpの 半分の部分はリンカードメインによって連結されている。リンカードメインを形成する90アミノ酸のうち、32アミノ酸は生理的pHにおいて正または負の電荷を帯びている。P−gpリン酸化部位はP−gp機能に関与すると思われるが、Pgのリンカードメインの機能は依然未知である。MDRにおけるこのドメインの役割を同定し、分析するため、本発明のオーバーラップペプチド法を用いた。オーバーラップ合成ヘキサペプチドを用いる相互作用タンパク質を単離するための新規方法を開発した。相互作用タンパク質を単離するためのオーバーラップペプチドの使用は、相互作用タンパク質の特異的同定を可能にし、ランダムペプチドの使用に関連する多くの問題を回避する。図5はHP−gp1およびHP−gp3のリンカードメインのアミノ酸配列を示す。HP−gp1およびHP−gp3の2つのリンカードメインは41%アミノ酸配列同一性あるいは66%配列相同性を共有する。オーバーラップヘキサペプチドを、以前に記載されるように誘導体化ポリプロピレンロッド上で並行して合成した(36、37)。HP−gp1およびHP−gp3それぞれの完全リンカー配列を網羅する92および90ヘキサペプチドを合成した。このヘキサペプチドはポリプロピレンロッドに共有結合したままである。
【0096】
リンカードメインの種々のヘキサペプチドと相互作用するタンパク質を同定するため、ペプチド固定ロッドを、[35S]メチオニンで代謝的に標識されたCEMまたはCEM/VLB1.0細胞由来の全細胞リゼートとインキュベートした。非特異的結合リゼートタンパク質を洗浄した後、特異的結合タンパク質をSDS含有緩衝液で溶出させ、SDS−PAGEで分離した。図6は、HP−gp1リンカー配列由来の92オーバーラップヘキサペプチドと特異的に結合したタンパク質を示す。HP−gp1リンカードメインの3つの領域(617EKGIYFKLVTM627 (配列番号1)、657SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA676 (配列番号2)および693PVSFWRIMKLNLT705 (配列番号3))が57kDaタンパク質と結合した。ヘキサペプチド番号46−60、81−89および5−9(図5を参照)は減少した親和力で57kDaタンパク質と結合した(図6)。さらに、ペプチド46−60は、見かけの分子量80kDaおよび30kDaを有する2個の他のタンパク質との結合を示したが、これは57kDaタンパク質のものよりずっと弱かった。後者のタンパク質(80kDaおよび30kDa)は、57kDaタンパク質シグナルの強度が高い場合に検出されることから、57kDaと関連する可能性がある(図6、ペプチド50−56)。3つの57kDa結合タンパク質のアミノ酸配列を比較したが、その同タンパク質への結合を説明する、それらの間の有意な配列相同性は示されなかった。しかし興味深いことに、第二の領域(ペプチド46−60)のアミノ酸配列はタンパク質キナーゼC共通配列をコードする(15)。さらに第三の領域(ペプチド81−89)はまた、タンパク質キナーゼA部位をコードすることが示された(43)。
【0097】
ヘキサペプチドの配列および57kDaタンパク質間の結合の親和力を測定するために、657SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA676 (配列番号2)によってコードされるヘキサペプチドと57kDaタンパク質間の相互作用に対する、ハイソルト(0.3〜2.4M KCl)、両性イオン性界面活性剤(10〜160mM CHAPS)およびイオン性界面活性剤(0.1%〜2%SDS)の効果を測定することを目的にした。我々の結果では、この結合がハイソルトに対して安定で、高濃度のCHAPSに対して適度に安定であるが、低濃度のSDSに対して感受性であることが示された(図7)。共有結合ペプチドに対するタンパク質結合の安定性を考慮し、10mM CHAPSの存在下、HP−gp1リンカードメイン由来のヘキサペプチドの、複合膜タンパク質を含み得るCHAPS可溶性タンパク質に対する結合を測定することを目的にした。図8の結果は、HP−gp1のリンカードメインをコードする同オーバーラップヘキサペプチドに対する結合タンパク質を示す。ヘキサペプチド番号46−60、81−89および5−9(図5を参照)は57kDaタンパク質に結合した(図7)が;他のタンパク質は、10mM CHAPSの不存在下でタンパク質と結合しなかった、同ヘキサペプチドまたは異なるヘキサペプチドと相互作用することがわかった。例えば、ヘキサペプチド3−10は、CHAPSの不存在下で以前に検出されなかった〜210kDaタンパク質と結合した。同様に、CHAPSの不存在下でいずれのタンパク質をも結合しなかった、ヘキサペプチド16−20は同じ高分子量タンパク質と結合した(図7)。ペプチド46−60は、CHAPSの存在下で、いくつかの低分子量タンパク質(〜45−25kDa)とより強く結合した。ヘキサペプチド80−89は57kDaタンパク質に加えて2個の他のタンパク質と結合した。総合すると、図8の結果は、57kDaタンパク質に対する種々のヘキサペプチドの結合は、CHAPSのような穏やかな両性イオン性界面活性剤に対して抵抗性であることを示す。さらに、10mM CHAPS中、膜タンパク質を可溶化すると、10mM CHAPSの不存在下では見られない他のタンパク質との結合を示す。1つの可能性は10mM CHAPSが、複合膜タンパク質の、HP−gp1リンカードメインの種々のヘキサペプチドとの相互作用を可能にすることである。また、CHAPSは、新規ドメインを暴露し、これは次いでHP−gp1リンカードメインのヘキサペプチドへの結合を受ける。さらに、ヘキサペプチド40−60および80−89と結合する、より低分子量のタンパク質のいくつかは57kDaタンパク質の分解産物であるかもしれない(図8)。
【0098】
ヒトにおけるP−gp遺伝子ファミリーは2つのアイソフォーム、HP−gp1およびHP−gp3(またはmdr 1およびmdr 3;(20))によってコードされる。しかし、以前に示されるように、HP−gp1のみがMDR表現型を与える。さらに、HP−gp1および3は約80%アミノ酸配列相同性を共有し(111);リンカードメインは、66%アミノ酸配列相同性を有する、2つのアイソフォーム中で最も変化するドメインである。HP−gp3リンカードメインが同タンパク質または異なるタンパク質と結合するかどうかを測定するために、HP−gp3リンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドをポリプロピレンロッド上で合成し、可溶性タンパク質に対するその結合を上記のように試験した。図9は、HP−gp3のヘキサペプチドに対する結合タンパク質のプロファイルを示す。興味深いことに、類似の分子量のタンパク質(57kDa)はまた、HP−gp3由来のヘキサペプチドと結合した。しかし、いくつかのヘキサペプチドに対する結合はHP−gp1に関して観察されたものと相違した(図6対図9)。HP−gp3に関して、3つのより大きな鎖のアミノ酸(618LMKKEGVYFKLVNM631 (配列番号4)、648KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS674 (配列番号5)、および695PVSFLKVLKLNKT 707 (配列番号6))は57kDaタンパク質と結合した。HP−gp3リンカードメインの第一および第三領域は、HP−gp1リンカードメインの第一および第三領域と相当の配列同一性を共有する(図10)。したがって、同ヘキサペプチドが同タンパク質に結合したことは驚くべきことではない。HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの第二領域は異なっている(図10)。結果的に、HP−gp1およびHP−gp3配列の両者は57kDaと結合するが、HP−gp3と57kDaタンパク質間の相互作用領域はP−gp1のものよりも大きい(図6対図9)。HP−gp1およびHP−gp3結合ヘキサペプチド由来のアミノ酸配列の比較を図10に示す。
【0099】
実施例9
57kDaタンパク質の精製および配列決定
57kDaタンパク質のアイデンティティーを測定するために、HP−gp1リンカードメインの第二領域由来の2個のヘキサペプチド(658RSSLIR663 (配列番号7)および669SVRGSQ674 (配列番号8))の数コピーを合成した。後者のヘキサペプチド配列は57kDaタンパク質と最も高い親和性で結合するものであった。図11はこれらの2個のペプチドの、[35S]メチオニンで代謝的に標識された細胞由来の全細胞リゼートに対する結合を示す。両ヘキサペプチドは57kDaタンパク質および見かけの分子量〜41kDaの別のタンパク質と特異的に結合した。興味深いことに、全細胞リゼートのインキュベーション時間を長くすると、41kDaタンパク質のレベルが増加した(図11)。したがって、この41kDaバンドは57kDaタンパク質の分解産物である可能性がある。
【0100】
2個のヘキサペプチドを用いて57kDaタンパク質を精製するため、BSA以外の他の担体タンパク質を用いることができるかどうか測定することを目的とした。図12は、57kDaタンパク質へのヘキサペプチドの結合に対する、ブロッキング担体なし、1%ゼラチン、および0.3%または3%BSAの作用を示す。この実験のこれらの結果は、担体タンパク質なしが非特異的結合の減少に必要とされた点で驚くべきものであった。後者の確立された結合条件を用いて、数コピーのヘキサペプチド658RSSLIR663 (配列番号7)および669SVRGSQ674 (配列番号8)と結合した大量の57kDaタンパク質を単離した。図13は、クーマシーブルーで染色されたSDS−PAGE上の精製57kDaタンパク質を示す。後者の精製タンパク質をPVDF膜に転写し、Ponceau S で染色し、57kDaタンパク質の位置をつきとめた。予想される分子量で移動した Ponceau S 染色バンドを切り出し、直接N末端配列決定用に用いた(33)。まず7ラウンドのエドマン分解により、MREVISIおよびMREIVHIの2個の配列が示された。これらの2個の配列は3アミノ酸のみが異なっていた(IVHの代わりにVIS)。FastA タンパク質サーチエンジンを用いてこの2個の配列を既知のタンパク質配列と比較すると、後者の配列がαおよびβ−チューブリンの最初の7N末端アミノ酸をコードすることが示された。この57kDaタンパク質として、チューブリンを同定することは、見かけの分子量および長いインキュベーション期間後に観察された潜在的分解産物と矛盾しない。この57kDaタンパク質のチューブリンとしてのアイデンティティーをさらに確認するため、SDS−PAGEで分離され、ニトロセルロース膜に転写されたヘキサペプチド結合57kDaタンパク質および全細胞リゼートに対してウエスタンブロット分析を行った。次いでこのニトロセルロース膜を、それぞれ抗α−チューブリンおよび抗β−チューブリンモノクローナル抗体でプローブした。図14はウエスタンブロット分析の結果を示す。配列決定の結果と一貫して、両チューブリンサブユニット(αおよびβ)はヘキサペプチド結合タンパク質を含むレーンにおいて認識された。したがって、57kDaタンパク質のαおよびβ−チューブリンとしてのアイデンティティーが確立される。
【0101】
実施例10
このように、オーバーラップペプチドスパニング法発明の能力はP−gpを用いて確認された。上に示されるように、本発明のオーバーラップペプチドに基づく方法は、2個の相互作用するタンパク質間の領域は高親和性の結合配列および反発配列(repulsive sequences)から構成されることを示す仮説に対する原理の証拠、ならびにこのような方法を効率的かつ首尾良く用いて相互作用タンパク質のドメインおよび配列を同定し、特徴付けできることを提供する。高親和力と反発力のバランスは2個のタンパク質が安定な複合体を形成するかどうかを決定する。短い 一致するペプチドの使用により、ベイトおよびプレイタンパク質間のこのような高親和性の結合配列を同定できる。高親和性結合配列を単離するための短い 一致するペプチドの使用に関する理論的根拠は、本明細書中に記載される原理の証拠の成功および効率に本質的である。例えば、より大きなペプチドは、1ペプチド配列中に、相互作用の正味の力が負であるように、高親和性および反発結合配列を含むことができる。さらに、前または後のペプチドと1アミノ酸が異なるオーバーラップペプチドの使用は、非特異的結合の可能性を減少させる。したがって、オーバーラップペプチドはしばしば、種々のペプチドの結合親和力のピークを示す(図7および4を参照)。当業者であれば、より長いオーバーラップペプチドもまた使用できることが理解できよう。不幸にも、このようなより大きなペプチドは、高親和性と反発アミノ酸間のバランスの変化のせいで、相互作用タンパク質の同定をミスするリスクを増大させる。
【0102】
HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの3つの異なる領域に対する57kDaタンパク質の結合は、本明細書中で提案される仮説と一貫し、タンパク質相互作用を説明する(タンパク質間相互作用の原理を参照)。高親和性結合ドメインは長さが10〜26アミノ酸のサイズにおいて変化する。HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの場合、この3個の高親和性結合ドメインのうち2個が相当の配列同一性を共有していた。リンカードメインの第三の高親和性結合領域(658SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA 677 (配列番号2)対648KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS674 (配列番号5))はその一次アミノ酸配列において相同性を共有しなかった。しかし、これらの2個のドメインのらせん車輪の存在は、車輪の一表面上の正電荷を帯びた残基のクラスターと、他の側面上のセリン/スレオニン残基のクラスターを示す(図15を参照)。興味深いことに、57kDaタンパク質に対して最も高い結合親和性の領域は、HP−gp1中の3個の推定のリン酸化部位をコードする(15)。HP−gp3中のリン酸化部位の位置は実験では決定しなかったが、これらはプロテインキナーゼCの共通配列をコードする。この側面では、リンカードメインでのHP−gp1およびHP−gp3相互作用はこのドメインのリン酸化によって調節される。したがって、リンカードメイン内のP−gpリン酸化部位の突然変異はその薬物輸送機能に影響しないことが示されている(40)が、HP−gp1の他の提唱される機能(例えば内因性クロライドチャンネルのレギュレーター)はそのリン酸化状態によって影響されることが示された(41、110)。実際、同様のリンカードメインをコードする、ABCトランスポーターのメンバー、CFTR(嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子)は微小管ネットワークとともに局在することがわかった(107)。さらに、T84細胞の頂端原形質膜への、CFTRの微小管依存性急性補充は、細胞内cAMPの増加およびリンカードメインのリン酸化に応答するものであった(107)。総合すると、リン酸化がチューブリン依存性の様式でP−gp機能の調節に役割を担うかどうか明らかではないが、HP−gp1リン酸化およびチューブリンへの結合が共に局在することから、その可能性があり得る。 本明細書中に記載されるアッセイを用いて、リン酸化ヘキサペプチドがチューブリンと結合するかどうかについての実験が進行中である。したがって、本発明は生物学的に関連するタンパク質性ドメイン間の相互作用の証明に門戸を開く。
【0103】
57kDaタンパク質がポリプロピレンロッドまたはその誘導体化部分と結合する可能性は、同様に誘導体化されたすべての他のロッドがこの57kDaタンパク質と結合しなかったのでありそうもない。さらに、少なくとも4つの異なる時点で合成されたヘキサペプチドは同タンパク質と結合した。最後に、HP−gp1およびHP−gp3のリンカードメインの第一および第三高親和性結合領域をコードするヘキサペプチドはこの57kDaタンパク質と結合した。この57kDaタンパク質に加えて、見かけの分子量〜80kDaおよび30kDaの他のタンパク質もまた、リンカードメイン内のいくつかのヘキサペプチドと結合した。しかし、これらのタンパク質の結合は、この57kDaタンパク質よりずっと弱く、会合タンパク質であるかもしれない。種々のヘキサペプチドとこの57kDaタンパク質間の結合親和力の直接測定は行わなかったが、興味深いことにこの相互作用は10mM CHAPSおよびハイソルトに耐性である。さらに、インキュベーション混合物中に10mM CHAPSが存在すると、他のタンパク質(最も顕著には〜210kDaタンパク質)の数鎖のヘキサペプチド(これは10mM CHAPSの不存在下では結合しなかった)に対する結合が生じた。後者のタンパク質のヘキサペプチド15−28に対する結合は、CHAPSの不存在下では排除された、タンパク質の膜物質からの抽出のせいであり得る。CHAPSの不存在下では、細胞リゼートは可溶性タンパク質および膜結合タンパク質のみを含んでいた。
【0104】
HP−gp1またはHP−gp3がチューブリンと結合する生理学的サインは明らかでない。しかし、チューブリンはいくつかの膜タンパク質と相互作用することが示された(42、50、81、86)。HP−gp1またはHP−gp3はチューブリンと相互作用し、微小管は膜−骨格防御モデルの例である可能性がある(56)。このモデルでは、膜レセプターの小画分は基礎となる細胞骨格に固定されているようである(95)。この面において興味深いことに、インビボのレイト(rate)肝腫瘍におけるP−gpの安定性および発現の増大は、α−チューブリン、β−アクチン、およびサイトケラチン8/18を含む、いくつかの細胞骨格タンパク質の安定性における同様の増加と関連する(64)。 P−gpのチューブリンとのインビボ相互作用の機能的重要性についての実験が進行中である。
【0105】
実施例11
オーバーラップペプチドスパニング法はPgp相互作用タンパク質に限定されない
本発明のオーバーラップペプチド手法は、完全な膜貫通タンパク質であるP−糖タンパク質ではなく、可溶性の膜結合タンパク質であるアネキシンIを用いてさらに証明された。したがってアネキシンは構造的および機能的にP−糖タンパク質と異なっている。
【0106】
この手法を用いて、アネキシンIと相互作用するいくつかのタンパク質およびこれらの相互作用を媒介するアネキシンIの正確なアミノ酸配列を同定した。アネキシンIは、可逆的なカルシウム依存様式でリン脂質と結合する、細胞内の可溶性の膜結合タンパク質の大きなファミリーのメンバーである。アネキシンファミリーの種々のメンバーは、小胞性輸送、膜融合エキソサイトーシス、シグナル伝達、およびイオンチャンネル形成および薬物耐性を含む、多数の種々の細胞内プロセスに関与していた。アネキシンIの多くの可能な生理学的機能を考慮し、本発明の方法は、その相互作用タンパク質および、それに対するアネキシンI相互作用を媒介する正確なアミノ酸配列を同定するために設計された。
【0107】
簡単には、以前に記載されるように、アネキシンIの完全アミノ酸配列(トータル〜340ペプチドプラスコントロール)と対応するオーバーラップペプチドを、上記のように固形支持体上で合成した。この場合、ヘキサペプチドではなく、オーバーラップヘプタペプチドを用いた。次いでこのペプチドを、[35S]メチオニンで代謝的に標識されたMCF7乳腫瘍細胞から単離された全細胞性タンパク質とインキュベートした。数回洗浄した後、上に概説するように、結合タンパク質を溶出させ、SDS−PAGEで分離した。この結果はP−糖タンパク質を用いた以前の結果と一致し、この方法は分子量10kDa〜200kDaの範囲(具体的には、〜10kDa;〜29kDa;〜85kDa;〜106kDaおよび〜200kDa)の5タンパク質と相互作用するアネキシンIアミノ酸配列(データは示していない)のいくつかの集団(islands)を同定する。簡単には、抽出物の細胞性タンパク質に関して高い親和性を有する8相互作用ドメインを同定した。これらの高アフィニティー集団の2つはアネキシンの尾部ドメイン(残基1〜36)に位置し、6つはアネキシンIのαヘリックス束(残基37〜末端;例えばWO99/21980)に位置していた。後者の相互作用タンパク質の同定は現在研究下にある。しかし、10kDaタンパク質のアネキシンIとの相互作用は、アネキシンIとS100Cタンパク質間の直接相互作用を証明した以前の実験と一致している(70)。
【0108】
したがって、本発明は高親和性タンパク質相互作用を単純かつ効率的に同定することを可能にし、ならびに相互作用パートナーの少なくとも1つの正確なアミノ酸配列を同時に同定することを可能にすることが示される。
【0109】
結論
結論として、全細胞リゼートからP−gp相互作用タンパク質を同定する単純な手法を用いた。さらにこの手法は、P−gp1およびP−gp3リンカードメインにおける、このタンパク質のチューブリンとの相互作用を媒介する正確なアミノ酸配列の同定を可能にする。さらに、高親和性結合配列の知見は、さらにアネキシンIを用いて例証されたように、次いで細胞性タンパク質の全混合物からこの相互作用タンパク質を精製することを可能にする。実際、タンパク質間相互作用を研究するこの手法の単純性により、他のタンパク質に容易に適用される。最後に、我々の手法は、他の現在用いられている手法と比べて迅速で、いくつかの利点を有する。
【0110】
本発明は、本明細書中、その好ましい態様を用いて上に記載されたが、これは、請求の範囲に規定される本発明の精神および性質から逸脱することなく修飾可能である。
【0111】
参考文献
1. Adorini, L., 1993, Clin Exp Rheumatol 8:S41-44.
2. Ahmad et al., 1994, Biochemistry 33:10313-10318.
3. Alba et al., 1998, Electrophoresis 19:2407-2411.
4. Ausubel et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York
5. Bates et al., 1995, Cancer Chemotherapy & Pharmacology. 35:457-463.
6. Bates et al., 1992, Biochemistry 31:6366-6372.
7. Bates et al., 1993, Biochemistry 37:9156-9164.
8. Beck, W. T., 1983, Cancer Treat. Rep. 67:875-882.
9. Boscoboinik et al., 1990, Biochimica et Biophysica Acta 1027:225-228.
10. Brown et al., Nat Genet. 1999 Jan;21(1 Suppl):33-7, Review
11. Buschman et al., 1994, Cancer Research 54:4892-4898.
12. Campbell et al., 1984, Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science (Publ.), Amsterdam, The Netherlands
13. Chambers et al., 1990, Biochemical and Biophysical Research Communications 169:253-259.
14. Chambers et al., 1994, Biochemical Journal 299:309-315.
15. Chambers et al., 1993, The Journal of Biological Chemistry 268:4592-4595.
16. Chan et al., 1995, Hematology - Oncology Clinics of North America 9:275-318.
17. Chan et al., 1991, New England Journal of Medicine 325:1608-1614.
18. Chen et al., 1997, Curr Opin Chem Biol 1:458-466.
19. Cheung et al., Nat Genet. 1999 Jan;21(1 Suppl):15-9, Review
20. Childs et al., 1994, Important Adv Oncol :21-36.
21. Cole et al., 1996, Cancer Treatment & Research 87:39-62.
22. Cornelissen et al., 1994, Journal of Clinical Oncology 12:115-119.
23. Dalton et al., 1995, Cancer 75:815-820.
24. Debouck et al., Nat Genet. 1999 Jan;21(1 Suppl):48-50, Review
25. Devault et al., 1990, Molecular and Cellular Biology 10:1652-1663.
26. Duggan et al., Nat Genet. 1999 Jan;21(1 Suppl):10-4, Review
27. Edman et al., 1967, Eur J Biochem 1:80-91.
28. Ehrmann et al., 1997, Neoplasma 44:299-304.
29. Felder et al., 1993, Mol Cell Biol 13:1449-1455.
30. Fields et al., 1994, Trends Genet 10:286-292.
31. Fine et al., 1988, Proceedings of the National Academy of Science USA 85:582-586.
32. Fitscher et al., 1993, Analytical Biochemistry 213:414-421.
33. Flynn et al., 1983, Biochem Biophys Res Commun 117:859-65.
34. Ford et al., 1990, Pharmacological Reviews 42:155-199.
35. Futscher et al., 1993, Analytical Biochemistry 213:414-421.
36. Georges et al., 1993, The Journal of Biological Chemistry 268:1792-1798
37. Georges et al., 1990, Proceedings of the National Academy of Science USA 87:152-156.
38. Georges et al., 1990, Advances in Pharmacology 21:185-220.
39. Georges et al., 1991, Journal of Cellular Physiology 148:479-484.
40. Germann et al., 1996, J Biol Chem 271:1708-16.
41. Gill et al., 1992, Cell 71:23-32.
42. Giustetto et al., J Comp Neurol 395:231-244.
43. Glavy et al., 1997, J Biol Chem 272:5909-5914.
44. Goldstein, L. J., 1995, Curr Probl Cancer 19:65-124.
45. Gottesman et al., 1995, Annu Rev Genet 29:607-649.
46. Gottesman et al., 1993, Annual Review of Biochemistry 62:385-427.
47. Grogan et al., 1990, Laboratory Investigation 63:815-824.
48. Gros et al., 1986, Cell 47:371-380.
49. Gupta, S., 1996, "P-glycoprotein Expression in Normal Hematopoietic Progenitors and Cells of the Immune System" in Multidrug Resistance in Cancer Cells: Molecular, Biochemical, Physiological and Biological Aspects. Editors: Gupta, S. and Tsuruo, T., John Wiley & Sons, NY.:293-302.
50. Haga et al., 1988, Eur J Biochem 255:363-368.
51. Hardy et al., 1995, The EMBO Journal 14:68-75.
52. Heldin, C. H., 1995, Cell 80:213-223.
53. Herweijer et al., 1990, Journal of the National Cancer Institute 82:1133-1140.
54. Higgins, C. F., 1992, Annual Review of Cell Biology 8:67-113.
55. Hoogenboom et al., 1998, Immunotechnology 4:1-20.
56. Jacobson et al., 1995, Sciences 268:1441-1442.
57. Jolliet-Riant et al.,1999, Fundam Clin Pharmacol 13:16-26.
58. Kast et al.,1997, J. Biological Chemistry 272:26479-26487.
59. Klemm et al., 1998, Annu Rev Immunol 16:569-592.
60. Klotz et al., 1975, In H. Neurath and R. L. Hill (ed.), The Proteins. Academic Press, Inc. New York :293-411.
61. Kuriyan et al., 1997, Annu Rev Biophys Biomol Struct 26:259-288.
62. Laemmli, U. K., 1970, Nature 227:680-685.
63. Landschulz et al., 1988, Science 240:1759-1764.
64. Lee et al., 1998, J Cell Physiol 177:1-12.
65. Li et al., 1993, Nature 363:85-88.
66. Ling, V., 1997, Cancer Chemother Pharmacol 40:Suppl:S3-8.
67. List et al., 1993, Journal of Clinical Oncology 11:1652-1660.
68. Loo et al., 1995, The Journal of Biological Chemistry 270:843-848.
69. Lowry et al., 1951, Journal of Biological Chemistry 193; 265-275
70. Mailliard, W.S., et al., 1996, J. Biol. Chem., 271; 719-725
71. Martini et al., 1998, Curr Opin Neurol 11:545-556.
72. McCoy et al., 1997, EMBO J 16:6230-6236.
73. Miller, 1988, Ann. Reports Med. Chem. 23:295
74. Molina et al., 1996, Pept Res 9:151-155.
75. Moran et al., 1987, Nucleic Acids Res., 14:5019
76. Naito et al., 1992, Biochemical and Biophysical Research Communications 185:284-290.
77. Nare et al., 1994, Biochemical Pharmacology 48:2215-2222.
78. Nooter et al., 1994, Leukemia Research 18:233-243.
79. O'Brien et al., 1996, "P-glycoprotein Expression in Normal Human Tissues," in Multidrug Resistance in Cancer Cells: Molecular, Biochemical, Physiological and Biological Aspects.: S. Gupta, and T. Tsurucy (eds.), John Wiley & Sons.:285-292.
80. Pawson et al., 1992, Cell 71:359-362.
81. Perrot-Applanat et al., 1995, J Cell Sci 108:2037-2051.
82. Phizicky et al., 1995, Microbiological Reviews 59:94-123.
83. Porpaczy et al., 1983, Biochem. Biophysica. Acta. 749:172-179.
84. Prelich et al., 1989, Nature 326:517-520.
85. Ramsay et al., Nat Biotechnol. 1998 Jan;16(1):40-4, Review.
86. Ravindra, R., 1997, Endocrine 7:127-143.
87. Reed et al., 1996, J Cell Biochem 60: 23-32.
88. Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Ed.
89. Ro et al., 1990, Human Pathology. 21:787-791.
90. Roninson et al.,1986, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 83:4538-4542.
91. Rosenberg et al., 1997, Journal of Biological Chemistry. 272:10685-10694.
92. Ruetz et al., 1994, The Journal of Biological Chemistry 269:12277-12284.
93. Safa et al., 1986, The Journal of Biological Chemistry 261:6137-6140.
94. Safa, A. R., 1993, Cancer Investigation 11:46-56.
95. Sako et al., 1995, J Cell Biol 129:1559-1574.
96. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories
97. Schena et al., Trends Biotechnol. 1998 Jul;16(7):301-6, Review
98. Schinkel et al., 1991, Cancer Research 51:2628-2635.
99. Schinkel et al., 1994, Cell 77:491-502.
100. Smit et al., 1993, Cell 75:451-462.
101. Sonneveld et al., 1994, Journal Clinical Oncology 12:1584-91.
102. Stanfield et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:103-113.
103. Stefanou et al., 1998, Anticancer Res 18:4673-4681.
104. Steitz et al., 1977, J Biol Chem 252:4494-4500.
105. Stevenson et al., 1998, Anal Biochem 262:99-109.
106. Susskind et al., 1983, In R. W. Hendrix, J. W. Roberts, F. W. Stahl, and R.A. Weisberg (ed.), Lambda II. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. :347-363.
107. Tousson et al., 1996, J Cell Sci 109:1325-34.
108. Towbin et al., 1979, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76:4350-4354.
109. Tschesche et al., 1975, Eur J Biochem 58:439-451.
110. Valverde et al., 1992, Nature 355:830-833.
111. Van der Bliek et al., 1987, The EMBO Journal 6:3325-3331.
112. Venter et al., 1998, Science 280:1540-1542.
113. Verrelle et al., 1991, Journal of the National Cancer Institute 83:111-116.
114. Vincent et al., 1972, Biochemistry 11:2967-2977.
115. Watanabe et al., 1995, Acta Oncologica 34:235-241.
116. Weinstein et al., 1990, Human Pathology. 21:34-48.
117. Wigler, P. W., 1996, J Bioenerg Biomembr 28:279-84.
118. Wilson et al., 1995, Methods Enzymol 250:79-91.
119. EP-A-0818467
120. WO98 15833A
121. WO84 03564A
【図面の簡単な説明】
【図1】 タンパク質間相互作用の原理を示す。プラス(+)記号は、高い親和性の結合の領域を示す。マイナス(−)記号は、高い反発力の領域を示す。本文中に示したように、2つのタンパク質間の相互作用は、高い親和性の結合と高い反発力の非連続的な領域から構成されており、それらは、ほぼ、高い親和性の結合に傾く平衡状態にあり、タンパク質は共に会合している。
【図2】 本発明の1つの態様に従う高親和性結合配列の同定方法の概略図である。A、種々の形は、全細胞リゼートにおける種々のタンパクを表す。記号は図1と同様である。B、タンパク質Aの全配列(または断片)を網羅する小さなオーバーラップペプチドは、96ウェルのポリプロピレンプレート上の誘導体化ウェルにおいて直接合成される。ペプチドの合成後、代謝的に放射性同位体で標識された細胞リゼートを、様々なペプチドを含む各ウェルに加え、インキュベーター緩衝液中でインキュベーションする。C、黒っぽく塗られた円は、タンパク質Aの高親和性結合配列を同定するために96ウェルプレートのすべてのウェルに添加された代謝的に放射性同位体で標識された、細胞から単離された全細胞リゼートに由来する放射性標識されたタンパク質を表する。D、よく洗浄したのち、高親和性結合配列(タンパク質A由来のオーバーラップペプチド)は、放射性標識されたタンパク質(黒っぽく示した)と結合したウェルに存在する。タンパク質Aと別のタンパク質との間の高親和性結合配列が第1、3、6および8列に示されている。高親和性結合配列を含むウェルは、放射性標識計測とSDS−PAGEによって同定する。
【図3】 本発明の別の態様による高親和性結合配列の同定方法を示す概略図である。Aは、タンパク質Aとタンパク質Bとの間の相互作用を示す概略図である。B、タンパク質の全配列(または断片)を網羅する小さなオーバーラップペプチドは、96ウェルポリプロピレンプレートの誘導体化ウェル上で直接合成される。ペプチドの合成後、放射性標識されたタンパク質B(インビトロ転写−翻訳反応混合物から合成された)を、様々なペプチドを含む各ウェルに加え、インキュベーション緩衝液中でインキュベーションする。C、黒っぽく塗られた円は、タンパク質Aの高親和性結合配列を同定するために96ウェルプレートのすべてのウェルに添加された放射性標識されたタンパク質Bを表する。D、洗浄後、高親和性結合配列は、タンパク質B(黒っぽく示した放射性標識したタンパク質)がタンパク質A由来のペプチドに依然として結合しているウェルに存在する。E、タンパク質Aとタンパク質Bとの間の4つの高親和性結合配列が、第1、3、6および8列に示されている。高親和性結合配列を含むウェルは、放射性標識計測とSDS−PAGEによって同定する。
【図4】 本発明の1つの態様によるタンパク質Bに対するタンパク質Aの結合を特異的に阻害する薬物の選択方法を示す概略図である。Aは、タンパク質Aとタンパク質Bとの間の相互作用を示す概略図である。B、タンパク質Aとタンパク質Bとの間の会合そして最終的にはその複合体の機能を阻害する特異的な薬物の選択のためのリード配列として使用される高親和性結合配列をコードするペプチド。図2および図3において同定された高親和性結合配列を標的とするために、高親和性結合配列の1つをコードするペプチドを96ウェルプレートのすべてのウェルにおいて合成する。灰色の円は、図2および3で同定された4つの高親和性結合配列の1つを表する。C、試験化合物を96ウェルプレートの各ウェルに加えた後、放射性標識されたタンパク質Bを各ウェルに加える。もちろん、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングしてタンパク質Aの高親和性結合配列に特異的に結合する薬物を同定することができる。上と同様に、転写−翻訳反応混合物から得られた放射性標識されたタンパク質Bを示す。プレートを洗浄し、タンパク質Aの高親和性結合配列に特異的に結合する薬物が、放射性標識されたタンパク質Bを含まないウェルにおいて見つかる。D、タンパク質Aにおける高親和性結合配列の1つに特異的に結合し、したがってタンパク質Bの結合を阻害する薬物/化合物を含んでいるウェルは、黒っぽい円の不在によって示す(つまり、第28、70および75ウェル)。選択された薬物/化合物は、その作用機序を確認するための生物学的分析において使用することができる貴重なリード化合物を示す。確認された薬物は、インビボ試験へと進むことができる。
【図5】 二次構造とリンカードメインのアミノ酸で示されたP−糖タンパク質を表す。P−gpの概略図は二次構造である。12個の塗られた四角は12個の推定される膜貫通ドメインを表す。2つのATP結合ドメインをP−gpのN末端側とC末端側で2つの円で表す。挿入部は結合ドメインを表す。ヒトP−gp1(HP−gp1)およびHP−gp3の結合ドメインのアミノ酸配列は、一文字のアミノ酸記号として示す。HP−gp1およびHP−gp3の各アミノ酸配列の始めと終わりの括弧内の数字は、結合物ドメインの長さを示す(HP−gp1およびHP−gp3についてそれぞれ1〜90および1〜88)。アミノ酸配列の下の番号が付けられた線は、オーバーラップヘキサペプチドの配列を表し、それらは1個のアミノ酸ごとに異なる。HP−gp3については、最後のヘキサペプチドは88番である。
【図6】 HP−gp1リンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドに結合するタンパク質を示す。HP−gp1のリンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドをポリプロピレンロッド上で合成し、これらのペプチドに結合するタンパク質を同定するために使用した。HP−gp1について合計90+2個の対照ヘキサペプチドを[35S]メチオニンで代謝標識した細胞由来の全細胞リゼートとインキュベーションした(方法参照)。すべての結合したタンパク質をペプチドが固定化されたロッドから溶出し、10%SDS PAGEで解析した。レーン1〜92は、HP−gp1由来の[35S]メチオニン結合タンパク質を示す。分子量マーカーの移動をゲルの左側に示す。
【図7】 HP−gp1ヘキサペプチドへのタンパク質の結合に対する種々の界面活性剤またはハイソルトの効果を示す。HP−gp1リンカードメイン由来のヘキサペプチド(ヘキサペプチド50〜53)に結合した代謝的に標識されたタンパク質を陰イオン性界面活性剤(0.12%〜0.5% SDS)、両性イオン性界面活性剤(20mM〜80mM CHAPS)または塩(0.3M〜1.2M KCl)の増加する濃度の存在下で溶出した。y−軸は、3つのヘキサペプチド(50〜53)のプールから溶出された放射能の量を表す。
【図8】 HP−gp1リンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドへのタンパク質の結合に対するCHAPSの効果を示す。HP−gp1のリンカードメインのオーバーラップヘキサペプチドを、10mM CHAPSで抽出された[35S]メチオニンで代謝的に標識された細胞由来の全細胞リゼートとインキュベーションした。結合したタンパク質をペプチドが固定化されたロッドから溶出し、10%SDS PAGEで解析した。レーン1〜92はHP−gp1リンカードメインに対する[35S]メチオニン結合したタンパク質を表す。分子量マーカーの移動をゲルの左側に示す。
【図9】 HP−gp3リンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドに対するタンパク質結合を示す。HP−gp3のリンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドは、ポリプロピレンロッド上で合成され、これらのペプチドに結合するタンパク質を同定するために使用する。HP−gp3について合計88のヘキサペプチドと2個の対照ヘキサペプチドを、 [35S]メチオニンを代謝標識した細胞由来の全細胞リゼートとインキュベーションした。すべての結合したタンパク質を、ペプチドが固定化されたロッドから溶出し、10%SDS PAGEで解析した。レーン1〜90は、HP−gp3由来の[35S]メチオニン結合タンパク質を示す。分子量マーカーの移動をゲルの左側に示す。
【図10】 HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの3つの結合領域の配列を示す。HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの配列はアミノ酸の一文字記号を用いて示す。HP−gp3およびHP−gp1に対する高い結合親和性の領域は太字で示す。同一のアミノ酸は、並べられた2つの配列の間の一文字記号によって示す。保存されたアミノ酸は、プラス(+)記号によって示す。リンカードメインのアミノ酸配列の両側の数字は、ヒトP−gp1およびP−gp3のアミノ酸配列を参照している(90,111)。
【図11】 2つの高親和性結合ヘキサペプチドを示す。HP−gp1リンカードメイン由来の2つの高親和性結合配列658RSSLIR663 (配列番号7)および669SVRGSQ674 (配列番号8)を再合成し、24時間または48時間のインキュベーションの後、[35S]メチオニンで代謝的に標識された細胞由来の全細胞リゼートとインキュベーションした。結合したタンパク質を、ペプチドが固定化されたロッドから溶出し、10%SDS PAGEで解析した。分子量マーカーの移動を図の左側に示す。
【図12】 非特異的な結合のブロッキング剤としての種々のキャリアータンパク質の効果を示す。[35S]メチオニンで代謝的に標識されたCEM細胞由来の全細胞リゼートをそのまま使用するか1%ゼラチン、0.3%BSAまたは3%BSAを調製した。細胞リゼートを、HP−gp1リンカードメイン由来の高親和性結合ヘキサペプチド658RSSLIR663 (配列番号7)とインキュベーションした。結合したタンパク質をSDS試料緩衝液で溶出し、10%SDS PAGEで解析した。分子量マーカーの移動を図の左側に示す。
【図13】 57のkDaタンパク質の精製を示す。全細胞リゼートを、50のHP−gp1ヘキサペプチド658RSSLIR663 (配列番号7)および669SVRGSQ674 (配列番号8)とインキュベーションした。100のヘキサペプチドインキュベーション混合物から得られた57kDaタンパク質(P57)を含む試料をプールし、10%SDS PAGEで解析した。解析したタンパク質をPVDF膜に転写し、Ponseau Sで染色した。分子量マーカーの移動を図の左側に示す。
【図14】 抗チューブリンモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティング分析を示す。CEM細胞由来の全細胞リゼートおよびHP−gp1リンカードメイン(P57)の高親和性結合ヘキサペプチドから溶出されたタンパク質をSDS PAGEで解析しニトロセルロース膜に転写した。膜の半分を抗αおよび抗βチューブリンモノクローナル抗体でプローブした。分子量マーカーの移動を図の左側に示す。
【図15】 HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの高親和性領域のらせん車輪を示す。HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの高い親和性の結合領域を一文字のアミノ酸記号で示す。らせんの片側の正に荷電したアミノ酸を円で囲んだ。
【図1】 タンパク質間相互作用の原理を示す。プラス(+)記号は、高い親和性の結合の領域を示す。マイナス(−)記号は、高い反発力の領域を示す。本文中に示したように、2つのタンパク質間の相互作用は、高い親和性の結合と高い反発力の非連続的な領域から構成されており、それらは、ほぼ、高い親和性の結合に傾く平衡状態にあり、タンパク質は共に会合している。
【図2】 本発明の1つの態様に従う高親和性結合配列の同定方法の概略図である。A、種々の形は、全細胞リゼートにおける種々のタンパクを表す。記号は図1と同様である。B、タンパク質Aの全配列(または断片)を網羅する小さなオーバーラップペプチドは、96ウェルのポリプロピレンプレート上の誘導体化ウェルにおいて直接合成される。ペプチドの合成後、代謝的に放射性同位体で標識された細胞リゼートを、様々なペプチドを含む各ウェルに加え、インキュベーター緩衝液中でインキュベーションする。C、黒っぽく塗られた円は、タンパク質Aの高親和性結合配列を同定するために96ウェルプレートのすべてのウェルに添加された代謝的に放射性同位体で標識された、細胞から単離された全細胞リゼートに由来する放射性標識されたタンパク質を表する。D、よく洗浄したのち、高親和性結合配列(タンパク質A由来のオーバーラップペプチド)は、放射性標識されたタンパク質(黒っぽく示した)と結合したウェルに存在する。タンパク質Aと別のタンパク質との間の高親和性結合配列が第1、3、6および8列に示されている。高親和性結合配列を含むウェルは、放射性標識計測とSDS−PAGEによって同定する。
【図3】 本発明の別の態様による高親和性結合配列の同定方法を示す概略図である。Aは、タンパク質Aとタンパク質Bとの間の相互作用を示す概略図である。B、タンパク質の全配列(または断片)を網羅する小さなオーバーラップペプチドは、96ウェルポリプロピレンプレートの誘導体化ウェル上で直接合成される。ペプチドの合成後、放射性標識されたタンパク質B(インビトロ転写−翻訳反応混合物から合成された)を、様々なペプチドを含む各ウェルに加え、インキュベーション緩衝液中でインキュベーションする。C、黒っぽく塗られた円は、タンパク質Aの高親和性結合配列を同定するために96ウェルプレートのすべてのウェルに添加された放射性標識されたタンパク質Bを表する。D、洗浄後、高親和性結合配列は、タンパク質B(黒っぽく示した放射性標識したタンパク質)がタンパク質A由来のペプチドに依然として結合しているウェルに存在する。E、タンパク質Aとタンパク質Bとの間の4つの高親和性結合配列が、第1、3、6および8列に示されている。高親和性結合配列を含むウェルは、放射性標識計測とSDS−PAGEによって同定する。
【図4】 本発明の1つの態様によるタンパク質Bに対するタンパク質Aの結合を特異的に阻害する薬物の選択方法を示す概略図である。Aは、タンパク質Aとタンパク質Bとの間の相互作用を示す概略図である。B、タンパク質Aとタンパク質Bとの間の会合そして最終的にはその複合体の機能を阻害する特異的な薬物の選択のためのリード配列として使用される高親和性結合配列をコードするペプチド。図2および図3において同定された高親和性結合配列を標的とするために、高親和性結合配列の1つをコードするペプチドを96ウェルプレートのすべてのウェルにおいて合成する。灰色の円は、図2および3で同定された4つの高親和性結合配列の1つを表する。C、試験化合物を96ウェルプレートの各ウェルに加えた後、放射性標識されたタンパク質Bを各ウェルに加える。もちろん、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングしてタンパク質Aの高親和性結合配列に特異的に結合する薬物を同定することができる。上と同様に、転写−翻訳反応混合物から得られた放射性標識されたタンパク質Bを示す。プレートを洗浄し、タンパク質Aの高親和性結合配列に特異的に結合する薬物が、放射性標識されたタンパク質Bを含まないウェルにおいて見つかる。D、タンパク質Aにおける高親和性結合配列の1つに特異的に結合し、したがってタンパク質Bの結合を阻害する薬物/化合物を含んでいるウェルは、黒っぽい円の不在によって示す(つまり、第28、70および75ウェル)。選択された薬物/化合物は、その作用機序を確認するための生物学的分析において使用することができる貴重なリード化合物を示す。確認された薬物は、インビボ試験へと進むことができる。
【図5】 二次構造とリンカードメインのアミノ酸で示されたP−糖タンパク質を表す。P−gpの概略図は二次構造である。12個の塗られた四角は12個の推定される膜貫通ドメインを表す。2つのATP結合ドメインをP−gpのN末端側とC末端側で2つの円で表す。挿入部は結合ドメインを表す。ヒトP−gp1(HP−gp1)およびHP−gp3の結合ドメインのアミノ酸配列は、一文字のアミノ酸記号として示す。HP−gp1およびHP−gp3の各アミノ酸配列の始めと終わりの括弧内の数字は、結合物ドメインの長さを示す(HP−gp1およびHP−gp3についてそれぞれ1〜90および1〜88)。アミノ酸配列の下の番号が付けられた線は、オーバーラップヘキサペプチドの配列を表し、それらは1個のアミノ酸ごとに異なる。HP−gp3については、最後のヘキサペプチドは88番である。
【図6】 HP−gp1リンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドに結合するタンパク質を示す。HP−gp1のリンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドをポリプロピレンロッド上で合成し、これらのペプチドに結合するタンパク質を同定するために使用した。HP−gp1について合計90+2個の対照ヘキサペプチドを[35S]メチオニンで代謝標識した細胞由来の全細胞リゼートとインキュベーションした(方法参照)。すべての結合したタンパク質をペプチドが固定化されたロッドから溶出し、10%SDS PAGEで解析した。レーン1〜92は、HP−gp1由来の[35S]メチオニン結合タンパク質を示す。分子量マーカーの移動をゲルの左側に示す。
【図7】 HP−gp1ヘキサペプチドへのタンパク質の結合に対する種々の界面活性剤またはハイソルトの効果を示す。HP−gp1リンカードメイン由来のヘキサペプチド(ヘキサペプチド50〜53)に結合した代謝的に標識されたタンパク質を陰イオン性界面活性剤(0.12%〜0.5% SDS)、両性イオン性界面活性剤(20mM〜80mM CHAPS)または塩(0.3M〜1.2M KCl)の増加する濃度の存在下で溶出した。y−軸は、3つのヘキサペプチド(50〜53)のプールから溶出された放射能の量を表す。
【図8】 HP−gp1リンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドへのタンパク質の結合に対するCHAPSの効果を示す。HP−gp1のリンカードメインのオーバーラップヘキサペプチドを、10mM CHAPSで抽出された[35S]メチオニンで代謝的に標識された細胞由来の全細胞リゼートとインキュベーションした。結合したタンパク質をペプチドが固定化されたロッドから溶出し、10%SDS PAGEで解析した。レーン1〜92はHP−gp1リンカードメインに対する[35S]メチオニン結合したタンパク質を表す。分子量マーカーの移動をゲルの左側に示す。
【図9】 HP−gp3リンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドに対するタンパク質結合を示す。HP−gp3のリンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドは、ポリプロピレンロッド上で合成され、これらのペプチドに結合するタンパク質を同定するために使用する。HP−gp3について合計88のヘキサペプチドと2個の対照ヘキサペプチドを、 [35S]メチオニンを代謝標識した細胞由来の全細胞リゼートとインキュベーションした。すべての結合したタンパク質を、ペプチドが固定化されたロッドから溶出し、10%SDS PAGEで解析した。レーン1〜90は、HP−gp3由来の[35S]メチオニン結合タンパク質を示す。分子量マーカーの移動をゲルの左側に示す。
【図10】 HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの3つの結合領域の配列を示す。HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの配列はアミノ酸の一文字記号を用いて示す。HP−gp3およびHP−gp1に対する高い結合親和性の領域は太字で示す。同一のアミノ酸は、並べられた2つの配列の間の一文字記号によって示す。保存されたアミノ酸は、プラス(+)記号によって示す。リンカードメインのアミノ酸配列の両側の数字は、ヒトP−gp1およびP−gp3のアミノ酸配列を参照している(90,111)。
【図11】 2つの高親和性結合ヘキサペプチドを示す。HP−gp1リンカードメイン由来の2つの高親和性結合配列658RSSLIR663 (配列番号7)および669SVRGSQ674 (配列番号8)を再合成し、24時間または48時間のインキュベーションの後、[35S]メチオニンで代謝的に標識された細胞由来の全細胞リゼートとインキュベーションした。結合したタンパク質を、ペプチドが固定化されたロッドから溶出し、10%SDS PAGEで解析した。分子量マーカーの移動を図の左側に示す。
【図12】 非特異的な結合のブロッキング剤としての種々のキャリアータンパク質の効果を示す。[35S]メチオニンで代謝的に標識されたCEM細胞由来の全細胞リゼートをそのまま使用するか1%ゼラチン、0.3%BSAまたは3%BSAを調製した。細胞リゼートを、HP−gp1リンカードメイン由来の高親和性結合ヘキサペプチド658RSSLIR663 (配列番号7)とインキュベーションした。結合したタンパク質をSDS試料緩衝液で溶出し、10%SDS PAGEで解析した。分子量マーカーの移動を図の左側に示す。
【図13】 57のkDaタンパク質の精製を示す。全細胞リゼートを、50のHP−gp1ヘキサペプチド658RSSLIR663 (配列番号7)および669SVRGSQ674 (配列番号8)とインキュベーションした。100のヘキサペプチドインキュベーション混合物から得られた57kDaタンパク質(P57)を含む試料をプールし、10%SDS PAGEで解析した。解析したタンパク質をPVDF膜に転写し、Ponseau Sで染色した。分子量マーカーの移動を図の左側に示す。
【図14】 抗チューブリンモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティング分析を示す。CEM細胞由来の全細胞リゼートおよびHP−gp1リンカードメイン(P57)の高親和性結合ヘキサペプチドから溶出されたタンパク質をSDS PAGEで解析しニトロセルロース膜に転写した。膜の半分を抗αおよび抗βチューブリンモノクローナル抗体でプローブした。分子量マーカーの移動を図の左側に示す。
【図15】 HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの高親和性領域のらせん車輪を示す。HP−gp1およびHP−gp3リンカードメインの高い親和性の結合領域を一文字のアミノ酸記号で示す。らせんの片側の正に荷電したアミノ酸を円で囲んだ。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US13425999P | 1999-05-14 | 1999-05-14 | |
US60/134,259 | 1999-05-14 | ||
PCT/CA2000/000587 WO2000070351A2 (en) | 1999-05-14 | 2000-05-12 | Protein-protein interactions and methods for identifying them |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002544522A JP2002544522A (ja) | 2002-12-24 |
JP2002544522A5 true JP2002544522A5 (ja) | 2007-10-18 |
Family
ID=22462515
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000618735A Pending JP2002544522A (ja) | 1999-05-14 | 2000-05-12 | タンパク質間相互作用並びに相互作用するタンパク質および相互作用部位のアミノ酸配列を同定する方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7176035B2 (ja) |
EP (1) | EP1179186B1 (ja) |
JP (1) | JP2002544522A (ja) |
AT (1) | ATE315787T1 (ja) |
AU (1) | AU773957C (ja) |
CA (1) | CA2372794A1 (ja) |
DE (1) | DE60025480T2 (ja) |
IL (1) | IL146450A0 (ja) |
WO (1) | WO2000070351A2 (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2005211232A1 (en) * | 2004-01-07 | 2005-08-18 | Rambam Medical Center, Funds For Medical Research Development Of Infrastructure And Health Services | Induction of apoptosis via ARTS-IAP complexes |
JP4564926B2 (ja) * | 2005-01-25 | 2010-10-20 | エワ ユニバーシティ−インダストリー コラボレーション ファウンデーション | ヒスタミン分泌能を有する欠失型IgE依存的ヒスタミン放出因子、HRF結合ペプチドおよびその利用方法 |
US20090098130A1 (en) * | 2007-01-05 | 2009-04-16 | Bradshaw Curt W | Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds |
JP5643116B2 (ja) | 2008-03-03 | 2014-12-17 | ナイキ イノベイト セー. フェー. | 対話型運動器具システム |
US10070680B2 (en) | 2008-06-13 | 2018-09-11 | Nike, Inc. | Footwear having sensor system |
CN105768322A (zh) | 2008-06-13 | 2016-07-20 | 耐克创新有限合伙公司 | 具有传感器系统的鞋 |
US8231506B2 (en) | 2008-12-05 | 2012-07-31 | Nike, Inc. | Athletic performance monitoring systems and methods in a team sports environment |
US8628453B2 (en) | 2008-12-05 | 2014-01-14 | Nike, Inc. | Athletic performance monitoring systems and methods in a team sports environment |
US20100184564A1 (en) | 2008-12-05 | 2010-07-22 | Nike, Inc. | Athletic Performance Monitoring Systems and Methods in a Team Sports Environment |
EP4138095A1 (en) | 2010-11-10 | 2023-02-22 | Nike Innovate C.V. | Systems and methods for time-based athletic activity measurement and display |
CN107122585B (zh) | 2011-02-17 | 2022-07-01 | 耐克创新有限合伙公司 | 使用图像数据选择并关联体育活动数据 |
CN109801674B (zh) * | 2019-01-30 | 2022-06-14 | 长沙学院 | 一种基于异构生物网络融合的关键蛋白质识别方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ207394A (en) * | 1983-03-08 | 1987-03-06 | Commw Serum Lab Commission | Detecting or determining sequence of amino acids |
AU6108396A (en) | 1995-06-07 | 1996-12-30 | David M. Geshwind | Systems using motion detection, interpolation, and cross-dis solving for improving picture quality |
JPH1025299A (ja) * | 1996-07-12 | 1998-01-27 | Nec Corp | 整列ペプチド、及びそれを用いたタンパク質の結合・相互作用部位検出方法 |
DK0934526T3 (da) * | 1996-10-08 | 2003-05-05 | Bisys B V U | Fremgangsmåder og midler til udvælgelse af peptider og proteiner, der har specifik affinitet til et mål |
CA2219299A1 (en) | 1997-10-24 | 1999-04-24 | Elias Georges | P-40, a new member of the multidrug resistance gene family |
CA2438652A1 (en) * | 2001-02-19 | 2002-09-06 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity |
-
2000
- 2000-05-12 AU AU47397/00A patent/AU773957C/en not_active Ceased
- 2000-05-12 CA CA002372794A patent/CA2372794A1/en not_active Abandoned
- 2000-05-12 JP JP2000618735A patent/JP2002544522A/ja active Pending
- 2000-05-12 EP EP00929188A patent/EP1179186B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-12 AT AT00929188T patent/ATE315787T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-05-12 IL IL14645000A patent/IL146450A0/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-05-12 WO PCT/CA2000/000587 patent/WO2000070351A2/en active IP Right Grant
- 2000-05-12 DE DE60025480T patent/DE60025480T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-11-13 US US10/010,310 patent/US7176035B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-02-09 US US11/704,773 patent/US20080009068A1/en not_active Abandoned
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20080009068A1 (en) | Protein-protein interactions and methods for identifying interacting proteins and the amino acid sequence at the site of interaction | |
JP2006524827A (ja) | 組織保護サイトカイン受容体複合体、組織保護化合物を同定するアッセイおよびそれらの使用 | |
EP0706657A1 (en) | Inhibiting protein interactions | |
US7494976B2 (en) | Caveolin peptides and their use as therapeutics | |
JP2002504818A (ja) | リガンドファミリーのntn−2メンバー | |
AU1254700A (en) | Peptides that modulate the interaction of b class ephrins and pdz domains | |
KR100565819B1 (ko) | 신호 전달 단백질과 glgf(pdz/dhr)도메인간의 상호작용을 저해하는 조성물과 상기 조성물의 용도 | |
JP2002544522A5 (ja) | ||
JP4187412B2 (ja) | 乳癌耐性蛋白質(bcrp)とそれをコードするdna | |
EP0900273A2 (en) | A family of organic anion transporters, nucleic acids encoding them, cells comprising them and methods for using them | |
WO1998056806A1 (en) | A TRANSCRIPTION FACTOR COACTIVATOR PROTEIN, p/CIP | |
US7399830B2 (en) | Synaptic activation protein compositions and method | |
EP1684077A1 (en) | Method for identifying modulators of interacting proteins | |
US6437113B1 (en) | Suppressors of death domains | |
WO1998040407A9 (en) | Synaptic activation protein compositions and method | |
US7211402B2 (en) | Transcription factor coactivator protein, p/CIP | |
US7115381B1 (en) | Methods for treating cardiovascular disorders | |
KR20120109824A (ko) | Pauf 및 그의 결합 파트너를 상호작용을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법 | |
US20110027185A1 (en) | Methods of Screening for Anti-Angiogenic Compounds | |
WO1999058566A1 (en) | INHIBITION OF p53 FUNCTION BY A p53-DERIVED SUBSTANCE | |
WO2003018776A9 (en) | IDENTIFICATION OF THE IκBNS PROTEIN AND ITS PRODUCTS | |
JP2008510125A (ja) | 大腸癌関連遺伝子C20orf20のp120との相互作用 |