JP2010538667A - 新規オリゴクローナル抗体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前向きな研究(例えば、「Impact of viral and bacterial infectious burden on long term prognosis in patients with coronary artery disease」 Rupprecht H.J. et al.、Circulation 2001、Jul 3;104(1): 25-31参照)において、1018人の患者の群で卒中と8種の異なる病原体(Herpes simplex virus 1-2、Epstein-Barr、Cytomegalovirus、Haemophilus influenzae、Mycoplasma pneumoniae、Helicobacter pylori、およびChlamydia pneumoniae)との関係について記載され、6〜8種の病原体の血清陽性に関連するそれぞれ7%および12.6%の死亡率の増加がみられた。
抗体の構造
以下は、本発明の目的の具体例であり、本明細書の全体的開示からより明らかであろう。
本発明の第4の目的は、該抗体の軽鎖をコードし、偶数配列番号54〜64、108〜190、212〜252、298〜344、352〜370、386〜390、および430〜454に対応するアミノ酸配列で示される
本発明では特記しない限り、用語「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたヌクレオチド」は、それぞれポリヌクレオチディックおよびヌクレオチディック、ならびにポリヌクレオチドおよびヌクレオチドが代替的に同じ意味で用いられ、通常、天然環境に存在するか、天然環境でそれと相互作用するあらゆる他の細胞物質または成分、例えば、他のヌクレオチディックもしくはポリヌクレオチディック配列、タンパク質、または他の細胞成分の断片、を実質的に含まないポリヌクレオチド分子を表す。
(i)グルタミンおよびアスパラギン酸、リジン、アルギニン、およびヒスチジンを含む荷電した基を含むアミノ酸;
(ii)リジン、アルギニン、およびヒスチジンを含む正に荷電した基を保持するアミノ酸;
(iii)グルタミンおよびアスパラギン酸を含む負に荷電した基を含むアミノ酸;
(iv)フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを含む芳香族基を保持するアミノ酸;
(v)ヒスチジンおよびトリプトファンを含む窒素環基を保持するアミノ酸;
(vi)バリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む大脂肪族非極性基を保持するアミノ酸;
(vii)メチオニンおよびシステインを含むわずかに極性の基を保持するアミノ酸;
(viii)セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、およびプロリンを含む小残基を保持するアミノ酸;
(ix)バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびシステインを含む脂肪族基を保持するアミノ酸;
(x)セリンおよびトレオニンを含む小ヒドロキシル基を保持するアミノ酸。
p-値
a)冠動脈プラークの適切な試料からmRNAを単離し、
b)逆転写を行って、対応するcDNAを得、
c)工程b)から得られた1またはそれ以上のcDNA分子(単数または複数)および上記適切な宿主細胞のいずれかを含む発現系を製造し、
d)適切な増殖条件下で宿主細胞を培養し、
e)産生された抗体またはそのあらゆる断片を回収し、
f)該抗体またはそのあらゆる断片を精製する。
1a)アテローム性動脈硬化性冠動脈(アテローム性)プラークのサンプリング
冠動脈アテローム切除術を受けた急性冠動脈症候群の患者のアテローム性プラークから十分な量の組織を得、液体窒素中に保存する。
1b)末梢血のサンプリング
2a)冠動脈プラークからのmRNA抽出
実施例1aで得たプラークをホモゲナイズし、総mRNAを、市販のmRNA抽出キット(Rneasyキット、Qiagen、Germany)を使用説明書に従って用いる常套的方法に従って抽出する。
2b)末梢血液試料からのmRNA抽出
3a)冠動脈プラーク試料からのmRNAのレトロ転写
実施例2aから得られた冠動脈プラーク試料からのmRNAの逆転写は、市販のmRNAのレトロ転写キット、Superscript III RT (Sigma-Aldrich、St Louis、Missouri)を使用説明書に従って使用して行う。cDNA合成は、オリゴ(dT)でプライムした総mRNAから標準的手順に従って行う。
3b)末梢血試料からのmRNAのレトロ転写
4a)冠動脈プラーク試料からのcDNA配列の増幅
実施例3aから得たcDNA 1μlをポリメラーゼ連鎖反応にかける。それぞれ重鎖および軽鎖の定常領域をコードする配列の断片をアニールするためにリバースプライマーを設計する(それぞれ軽鎖および重鎖について図10BおよびD)。フォワードプライマーは、「ファミリー特異的」であり、第1フレームワーク領域の重鎖および軽鎖遺伝子の5’末端に対応するよう設計される(それぞれ軽鎖および重鎖について図10AおよびC)。参考文献として、Phage display、Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor、New York. 第3版、2001を参照のこと。重鎖にはIgG1およびIgG2アイソタイプに特異的なプライマーを用いるが、軽鎖にはKアイソタイプに特異的なプライマーを用いる。1回の増幅は、以下の温度プロフィールで行う:94℃15秒間、52℃1分間、および72℃90秒間。反応は35サイクル行う。陰性コントロール(DNAなしの同じ混合物)および陽性コントロール(既知配列を挿入する)を各反応に含める。PCR生成物をエチジウムブロミドを含む2%アガロースゲルを用いる電気泳動により分析する。反応は、軽鎖に対応する≒650bpのバンドおよび重鎖に対応する700bpのバンドをもたらす。アンプリコン、すなわち、PRCプロセスの生成物を、市販のDNA抽出キット(QIAquickゲル抽出キット;Qiagen、Germany)を使用説明書に従って用いてゲルから抽出する。最後に、PCR産物を標準的方法により回収する。
4b)末梢血試料からのcDNA配列の増幅
先の実施例に従って得られた配列を定量および定性分析のためにシーケンシングする。
5.1)重鎖および軽鎖試料のプロセシング
5.2)Β−グロビン配列:内部基準
5.3)冠動脈プラーク試料由来の軽鎖
表I
5.7)結果
5.8)突然変異系統樹
5.8.1)系統樹の生成
5.8.2)結果
次に、クローンまたは軽鎖および重鎖をトランスフェクションのために選択する。特に冠動脈プラーク試料の軽鎖のクローン8(配列番号53に対応する)および重鎖のクローン11、9、13、および20(各配列番号21、43、51、および37に対応する)を、以下の手順に従って可溶性Fab断片を製造するために発現ベクター内にトランスフェクトするために選択する。
配列番号53
GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCGTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTAGTTTCCACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGTCTCCTCATCTACGGAACATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTCTGCGGTTTATTACTGTCAGCAGTATCATAACTGGCCTCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACC
配列番号21
CTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGGACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGATAGGGGGGAGAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGGGACAATTCTAAGAACACGCTGTATGTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCCTATATTTCTGCGCGAAAGATCAATTTCTATGGTTCGGGGAGTCAACAGCGGGTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACA
実施例6に記載の同じ手順を、実施例5に従って選択したクローン8の軽鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクター内に、クローン9の重鎖をコードする配列(配列番号43に対応する)を導入することにより繰り返す。
配列番号43
CTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGTTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATTTATATCATACATTAGTAGTGGTGGTGACACCATACACCACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAAGTCACTGTATCTCCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGTGCCGTGGGGTCTGGGGCCAGGGAACC
実施例6に記載の手順を、実施例5に従って選択したクローン8の軽鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクター内に、クローン13の重鎖をコードする配列(配列番号51に対応する)を導入することにより繰り返す。
配列番号51
CTCGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTTACTACTGGACCTGGATCCGCCAGTACCCAGGGAGGGGCCTGGAGTGGATTGGATACATCTCTTACAGGGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACAATATCACTAGACACGTCTAAGAACCAGTTTTTCTTGAACCTGACCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAGATCGGAGTAGAGCAACATCTGGTATTCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACC
実施例6に記載の手順を、実施例5に従って選択したクローン8の軽鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクター内に、クローン20の重鎖をコードする配列(配列番号37に対応する)を導入することにより繰り返す。
配列番号37
CTCGAGTCGGGGGGAGGCTTCGTACAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGGGACTATGCCATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCCGGAGTGGGTCTCAATTATTAGTGCTAGTGGTGGTTCCATATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACACTGTATCTGCAAATGAACAGTCTCAGAGCCGACGACACGGCTGTATACTACTGTGCAAGACAGACCAGCAGCAGATGGTATGATTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACC
新鮮プラーク試料を液体窒素中で凍結し、クリオスタットで切片にする。5μm厚の切片を氷冷アセトンで固定し、室温で1時間、血清ブロッキング溶液(2%血清、1%BSA、0.1% Triton X-100、0.05% Tween 20)でブロックする。固定した切片を、適切な希釈の、本発明に従って製造し同定したFabでプローブし、室温で2時間インキュベーションする。切片をPBSで5回洗浄し、適切な希釈のFITC (フルオレセインイソチオシアネート)結合第2抗ヒトFab (Sigma-Aldrich、St Louis、Missouri)を加える。室温で30分後、切片を再度洗浄し、形成されたリガンド/抗体複合体を蛍光顕微鏡で検出する。
線状ファージM13のcpIIIコートタンパク質のN末端にドデカペプチドを発現するランダムファージ表現ペプチドライブラリー(Ph.D.-12TMファージ表現ペプチドライブラリーキット、カタログ#E8110S、New England Biolabs、Beverly、Massachusetts)のパンニングを、使用説明書に従って、Fabコートした高結合96ウェルELISAプレート(Costar 96w ポリスチレン1/2面積平底HI結合平底、cat #3690)を用いて行う。
実施例11から得られるすべてのファージを用いてE.coli ER2537株を感染させ、無作為に選んだ単一プラークを、本発明に従って製造および同定したFabおよび標準IgGプールを用いて酵素免疫測定法でスクリーニングした。
Hep-2 (ATCC CCL-23)細胞を、抗生物質/抗真菌剤溶液(Invitrogen、Antibiotic/Antimycotic Solution、液体、15240-062)および10%FBSを添加したE-Mem (Invitrogen 0820234DJ)中で増殖させる。細胞は5日毎に規則的に1:10に分割する。5 x 106個の細胞をPBSで洗浄し、RIPA緩衝液(50mM Tris HCL ph8+ 150mM NaCl + 1% NP-40+ 0.5% NAデオシコレート(deossicolate)+ 0.1%SDS)を用いて溶解する。
14.1)概要
化学試薬、化学構造部分、および技術の略号:
AA−アミノ酸、AcOH−酢酸、ACN−アセトニトリル、API−ES−大気圧イオン化エレクトロスプレー、Btn−ビオチン、Boc−tert−ブチルオキシカルボニル、DCM−ジクロロメタン、DIC−N,N−ジイソプロピルカルボジイミド、DIEA−N,N−ジイソプロピルエチルアミン、DMF−N,N−ジメチルホルムアミド、Et2O−ジエチルエーテル、Fmoc−9−フルオレニルメトキシカルボニル、Adoa−8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸、HFIP−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール、HOBt−N−ヒドロキシベンゾトリアゾール、MeOH−メタノール、Neg.イオン−陰イオン、NHS−N−ヒドロキシスクシンイミド、NMP−N−メチルピロリドン、Pip−ピペリジン、Pos.イオン−陽イオン、HBTU−O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、PyBOP−ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、tR−保持時間(分間)、試薬B(88:5:5:2−TFA:H2O:フェノール:TIPS−v/v/wt/v)、Su−スクシンイミジル、TFA−トリフルオロ酢酸、TIPS−トリイソプロピルシラン、H2O−水。
14.2) 固相ペプチド合成(SPPS)の一般的方法。
14.2.1) 線状ペプチドを、Fmoc-Pal-Peg-PS樹脂(0.2mmol/g)および/または適切なプレロードした樹脂、Fmoc保護アミノ酸、およびDMF中のPyBop介在エステル活性化を用い、Rainin PTI Symphony(登録商標)ペプチド合成装置(12ペプチド配列/合成)を用いる確立された自動化プロトコールにより合成する。残りのペプチド配列を、SPPS法により段階的に、典型的には0.2mmolスケールでFmoc-Pal-Peg-PSおよび/または他の樹脂にロードする。DMF中のPyBop-DIEA試薬により活性化した4倍過剰の各アミノ酸でアミノ酸カップリングを行う。4倍過剰のBtn-NHSエステルを用いて該ペプチドのN末端にビオチンを結合させる。
14.2.2)プレロードしたトリチル樹脂上ジアミンを用いる時は、最終アセチル化後、完全に保護されたペプチド鎖を、8:1:1-DCM:AcOH:HFIPで樹脂から開裂させ、揮発物を蒸発させた後、最終Btn-Adoa-Adoaを溶液中、該アミンのC末端と結合させる。粗完全保護ペプチドを、溶液中の1.0等量の予め形成されたBtn-Adoa-Adoa-NHSエステルにて室温で16時間処理する(総容量5.0mL/g粗重量)。
14.3)ペプチドの精製−一般的手順
「Symphony」機器を用いるMW〜2000のペプチドの200μmol規模の合成は、各反応容器(RV)から〜200−300mgの粗ペプチドをもたらした。粗ペプチド(〜200−500mg)を逆相HPLCに1回流して精製する。ACN(10mL)に溶解した粗ペプチド(〜200mg)をH2Oで最終容量50mLに希釈し、溶液を濾過する。濾過した溶液を、H2O中の10%ACN(0.1%TFA)で予め平衡化したプレパラティブHPLCカラム(Waters、Sunfire(登録商標)Prep C8、50 × 250mm 10μ、120Å)にロードする。カラムに溶液を適用中は、プレパラティブHPLCシステムからの平衡化溶離剤の流出は停止する。溶液をカラムに適用した後、勾配HPLCシステムからの平衡化溶離剤の流出を再開し、次いで溶離剤の組成物を10.0分間かけて20% ACN-H2O (0.1%TFA)まで勾配させ、次いで、H2O(0.1%TFA)にACN(0.1%TFA)を0.5%/minの速度で直線勾配を開始し、60分間維持する。分画(15mL)を、生成物溶出の指標として220nmのUVを用いて回収する。回収した分画を、分析的逆相C8カラム(Waters Sunfire(登録商標)OBD-C8、4.6 × 50 mm、5μ、120Å)で分析し、純度>95%の生成物含有分画を混合し、凍結乾燥して対応するペプチドを得る。単離した後、該ペプチドをHPLCおよび質量分析で分析し、同一性と純度を確認する。ペプチドのデータを、表VI(配列、樹脂のローディング、および収量)、表VII(HPLCおよび質量分析)、および表VIII(ペプチドの構造)に示す。
ELISAプレート(Costar 96wポリスチレン1/2面積平底HI結合平底、cat #3690)を、PBSに再懸濁した100ngのペプチドで4℃、一夜コーティングする。37℃で2時間、PBS+BSA3%でブロッキングした後、Fab24(20μg/ml)を37℃で1時間、コートした抗原とインキュベーションする。PBS+Tween20 0.1% (SIGMA cod:PL379)で洗浄した後、プレートを抗ヒトIgGパーオキシダーゼ(SIGMA cod: A2290)で37℃、30分間インキュベーションする。PBS+Tween 0.1%で洗浄した後、TMB基質をウェル(PIERCE TMBパーオキシダーゼ用基質キット:SK 4400)に加える。ELISAプレートを450nmの分光高度計で分析する。結果を図15に示す。
表V:略号および構造
Claims (41)
- 偶数配列番号2〜390および396〜454のいずれかを含むアミノ酸配列またはそのあらゆる断片をコードする、奇数配列番号1〜389および395〜453のいずれかを含む単離されたポリヌクレオチド分子またはそのあらゆる断片。
- 偶数配列番号2〜390および396〜454のいずれかを含むアミノ酸配列、またはあらゆるホモローガスな配列、または冠動脈プラーク中にみいだされる可能性がある抗原と結合する保存的置換を有するあらゆる配列、またはそのあらゆる断片。
- 配列番号22、38、44、52、および54に対応する請求項2に記載の単離されたアミノ酸配列。
- 少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも97%の生殖細胞系相同性を有する請求項2記載のアミノ酸配列、またはそのあらゆる断片。
- CDR3部分のρ値が5%以下、好ましくは2%以下、より好ましくは1%以下、およびさらにより好ましくは1‰以下である請求項2または3記載のアミノ酸配列またはそのあらゆる断片。
- 請求項1のポリヌクレオチド分子をコードする請求項2〜5のいずれかに記載のアミノ酸配列、またはそのあらゆる断片。
- 1またはそれ以上の請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド分子を含む、発現ベクター。
- 配列番号53、および所望により配列番号21、37、43、および51に記載の配列のいずれかを含む請求項7記載の発現ベクター。
- プラスミド、コスミド、YAC、ウイルス粒子、またはファージを含む群から選ばれる請求項7または8記載の発現ベクター。
- 請求項7記載の1またはそれ以上の発現ベクターを含む発現系。
- 請求項10の発現系を含む単離された組み換え宿主細胞。
- 以下の原核性組み換え単離細胞を含む群から選ばれる請求項11記載の単離された組み換え宿主細胞:例えば、Enterobacter、Escherichia、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella、Serratia、Shigella、Bacilli、Pseudomonas、およびStrepromyces;好ましくは該原核性組み換え単離細胞は、E. coli、Salmonella typhimurium、Serratia marcescans、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Pseudomonas aeruginosaを含む群から選ばれ、さらにより好ましくは該原核性組み換え単離宿主細胞はE. coli XL1-Blueである;酵母組み換え宿主細胞、例えば、Saccharomyces、Pichia pastoris、Kluyveromyces、例えば、K. lactis、K. fragilis、K. bulgaricus、K. wickeramii、K. waltii、K. drosophilarum、K. thermotolerans、K. marxianus、Schizosaccharomyces、例えば、Schizosaccharomyces pombe、yarrowia、Hansenula、Trichoderma reesia、Neurospora crassa、Schwanniomyces、例えば、Schwanniomyces occidentalis、Neurospora、Penicillium、Tolypociadium、Aspergillus、例えば、A. nidulans、Candida、Torulopsis、およびRhodotorula;好ましくは該酵母組み換え宿主細胞はSaccharomyces cerevisiaeである;ヒト組み換え単離宿主細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)、SV40で形質転換したサル腎臓CVI系(COS-7、ATCC CRL 1651)、ヒト胚腎臓系、チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR、マウスセルトリ細胞、ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065);およびマウス乳癌(MMT 060562、ATCC CCL51);単離された植物組み換え宿主細胞、例えばAgrobacterium tumefaciensおよびNicotiana tabacum;昆虫組み換え単離細胞、例えばDrosophila S2およびSpodoptera Sf9。
- 以下の工程を含む組み換え抗体またはそのあらゆる断片の製造方法:
a)請求項1記載のポリヌクレオチド配列のいずれかに対応する1またはそれ以上のポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター、および該発現ベクターを含む宿主細胞を含む発現系を製造し、
b)適切な増殖条件下で該宿主細胞を培養し、
c)そのようにして製造された該抗体またはそのあらゆる断片を回収し、
d)該抗体またはそのあらゆる断片を精製する。 - 工程a)の1またはそれ以上のポリヌクレオチド分子が配列番号1〜389および395〜453の奇数配列であるか、またはそれから選ばれる請求項13記載の方法。
- 該組み換え単離宿主細胞が、E. coli、B. subtilis、S. Cerevisiae、またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)を含む群から選ばれる請求項13または14に記載の方法。
- IgG抗体またはそのあらゆる断片を製造するための請求項13〜15のいずれかに記載の方法。
- IgG抗体のFab断片を製造するための請求項13〜15のいずれかに記載の方法。
- 請求項13〜15のいずれかに記載の方法に従って製造された組み換え単離抗体またはそのあらゆる断片。
- 請求項13〜15のいずれかに記載の方法に従って製造された組み換えIgG抗体またはそのあらゆる断片。
- 請求項13〜15のいずれかに記載の方法に従って製造された組み換えIgG Fab断片。
- 請求項13〜16のいずれかに記載の方法に従って製造される、配列番号22、38、44、52、および54に記載のアミノ酸配列のいずれかを含む組み換え単離IgG Fab断片。
- さらに請求項13〜16のいずれかに記載の方法に従って製造される、請求項21記載の組み換え単離IgG Fab断片。
- 冠動脈プラークに存在する可能性がある抗原と結合する請求項21記載の組み換え単離IgG Fab断片。
- 請求項18〜23のいずれかに記載の組み換え抗体またはそのあらゆる断片、および所望により治療的部分を含む治療用組成物。
- 該治療的部分が、放射性核種、薬物およびプロドラッグ、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、レセプターアンタゴニスト、酵素または別の物質により活性化されるプロ酵素、オートクリンまたはサイトカイン、抗菌剤、および毒素を含む群から選ばれる請求項24記載の治療用組成物。
- 請求項18〜23のいずれかに記載の組み換え抗体またはそのあらゆる断片、および診断的部分を含む治療的組成物。
- 急性冠動脈症候群(ACS)を治療するための請求項24または25記載の治療用組成物。
- 急性冠動脈症候群(ACS)を診断するための請求項26記載の診断用組成物。
- 請求項2〜6のいずれかに記載のアミノ酸配列と結合するリガンド。
- 請求項18〜23のいずれかに記載の組み換え抗体またはそのあらゆる断片と結合するリガンド。
- 請求項18〜23のいずれかに記載の組み換え抗体またはその断片と結合するアミノ酸コンセンサス配列を含むペプチド。
- 配列番号391〜394に対応するアミノ酸配列を有する請求項31記載のペプチド。
- 請求項2〜6の単離されたアミノ酸配列の使用を含む方法により選択される請求項29記載のリガンド。
- 請求項18〜23のいずれかに記載の組み換え抗体の使用を含む方法により選択される請求項30記載のリガンド。
- 以下の工程を含む請求項18〜23のいずれかに記載の組み換え抗体またはそのあらゆる断片と結合するリガンドの同定方法:
a)該抗体またはそのあらゆる断片を固相上に結合させ、
b)1またはそれ以上の洗浄工程により非結合物質を除去し、
c)候補分子を工程a)で調製した固相と接触させて、該候補分子と該固相を適切な時間インキュベーションし、
d)1またはそれ以上の洗浄工程により非結合物質を除去し、
e)工程a)の抗体とそれと結合した候補分子との複合体に特異的な二次抗体を加え、
f)工程a)の抗体に結合した分子を同定する。 - 工程a)の抗体またはその断片が請求項18〜23に記載の抗体またはその断片である請求項35記載の方法。
- 以下の工程を含む請求項2〜6のいずれかに記載のアミノ酸配列またはそのあらゆる断片と結合するリガンドの同定方法:
a)該アミノ酸配列またはそのあらゆる断片を固相上に結合させ、
b)1またはそれ以上の洗浄工程により非結合物質を除去し、
c)候補分子を工程a)で調製した固相と接触させて、該候補分子と該固相を適切な時間インキュベーションし、
d)1またはそれ以上の洗浄工程により非結合物質を除去し、
e)工程a)のアミノ酸配列とそれと結合した候補分子との複合体に特異的な二次抗体を加え、
f)工程a)の抗体に結合した分子を同定する。 - 工程a)のアミノ酸配列またはそのあらゆる断片が請求項2〜6のアミノ酸配列またはそのあらゆる断片である請求項36記載の方法。
- 全血、血清、および冠動脈プラーク断片を含む群から選ばれる試料を請求項19〜23のいずれかに記載の抗体またはそのあらゆる断片と接触させる工程を含むex-vivoまたはin vitro診断方法。
- 患者の急性冠動脈症候群(ACS)を診断するための請求項39記載のex-vivoまたはin vitro診断方法。
- 急性冠動脈症候群(ACS)のリスクがある個体群をスクリーニングするための請求項39記載のex-vivoまたはin vitro診断方法。
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