DE69433675T2

DE69433675T2 - Verfahren zur Bestimmung einer Zuckerkettenstruktur

Info

Publication number: DE69433675T2
Application number: DE69433675T
Authority: DE
Inventors: Tsuyoshi Nishinomiya-shi Miyamura; Mutsumi Otsu-shi Sano; Akihiro Akashi-shi Kondo; Ikunoshin Uji-shi KATO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1993-08-23
Filing date: 1994-08-12
Publication date: 2005-03-03
Anticipated expiration: 2014-08-13
Also published as: DE69433675D1; JP3020811B2; EP0640835B1; EP0640835A3; CA2130028C; US5500342A; CA2130028A1; EP0640835A2; JPH07112996A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Struktur von Zuckerketten, einen Kit zur Verwendung in diesem Verfahren sowie neue Oligosaccharide. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Struktur einer Zuckerkette vom N-Acetyllactosamintyp, einen Kit zur Verwendung in diesem Verfahren sowie neue Zuckerketten vom N-Acetyllactosamintyp.
In der letzten Zeit wurden viele Hinweise darauf gefunden, daß Zuckerketten per se eine Funktion bei der Erkennung von Zellen, der Adhäsion von Zellen und der Metastasierung von Krebs haben, weswegen die Strukturanalyse von Zuckerketten in Glycokonjugaten wie Glycoproteinen und Glycolipiden immer mehr an Bedeutung gewinnt. Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß die Kettenstruktur über verschiedene analytische Methoden wie Analyse über Methylierung, Oxidation mit Periodat, enzymatischen Verdau, magnetische Kernresonanzspektroskopie und Massenspektrometrie analysiert wird. Zusätzlich können Zuckerketten über High Performance Flüssigkeitschromatographie (HPLC), die in den letzten Jahren zügig weiterentwickelt worden ist, analysiert werden. Ein Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Zuckern mit 2-Aminopyridin ist durch Hase et al. entwickelt worden (Journal of Biochemistry, 95, 197–203 (1984) – nachfolgend wird dieses Verfahren als PA-Verfahren sowie Aminopyridylzucker als PA-Zucker bezeichnet – wobei die Kombination aus der Markierung mit 2-Aminopyridin und HPLC unter Verwendung von zwei verschiedenen Säulen, das sogenannte zweidi mensionale Kartierungsverfahren (two-dimensional mapping method) es ermöglicht, viele Oligosaccharide hochempfindlich zu analysieren (Analytical Biochemistry, 171, 73–90 (1988)).
Allerdings ist es mit diesem Verfahren nicht möglich, Zuckerketten voneinander zu unterscheiden, die in den zwei verschiedenen Säulen gleiche oder nahe beieinanderliegende Elutionszeiten aufweisen. Außerdem ist dieses Verfahren für unkartierte Zuckerketten ineffizient, insbesondere für solche mit Sialinsäureresten und somit auch ungeeignet zur Bestimmung der Struktur einer Zuckerkette mit einer unbekannten Struktur.
Wenn die Struktur einer Zuckerkette durch ein Verfahren bestimmt wird, welches Markierungsmethoden mit Trennmethoden kombiniert, wie beispielsweise die Kombination von Markierung mit 2-Aminopyridin und HPLC, so sollten alle möglichen Zuckerketten für die Standardzuckerketten mit den durch eine beliebige Methode bestimmten Strukturen verfügbar sein, und sie sollten weiterhin durch die Trennmethoden aufgetrennt und identifiziert sein, aber das ist wegen der Vielfalt der Zuckerkettenstrukturen unmöglich. Folglich erfolgt die Bestimmung von Zuckerkettenstrukturen gewöhnlich durch Verdau mit Exoglycosidasen mit begrenzter Substratspezifität. Nach diesem Verfahren werden die Produkte des Verdaus mit Exoglycosidase aufgetrennt und durch Chromatographie identifiziert (siehe beispielsweise E. Tsuda et al., Biochemistry, 27, 5646–5654 (1988)). Der Verdau mit Exoglycosidase mit begrenzter Substratspezifität wird nachstehend als „enzymatischer Verdau (Verdauung)" bezeichnet.
Exoglycosidasen können eine Art von Zuckerrest am nichtreduzierenden Ende der Zuckerkette erkennen, und die Anomeren des Zuckerrests (α und β), und die Exoglycosidasen mit begrenzter Substratspezifität können auch die Position der Bindungen erkennen. Die Kombination aus den Anomeren und die Position der Bindung, z. B. α-2,3-Bindung oder β-1,4-Bindung wird hier nachfolgend als „Bindungsart" bezeichnet.
Beispielsweise erkennt β-Galactosidase aus Diplococcus pneumoniae nur Gal-β-1,4-Bindung am nicht reduzierenden Ende und hydrolysiert sie, und β-Galactosidase aus Jackbohnen erkennt das β-Anomere von Galactose am nicht reduzierenden Ende und setzt es frei. Die Art von Zuckerrest und die Art seiner Bindung am nicht reduzierenden Ende einer Zuckerkette kann unter Berücksichtigung der Substratspezifität von Exoglycosidasen abgeschätzt werden. Wenn z. B. eine Zuckerkettenprobe mit β-Galactosidase aus D. pneumoniae verdaut wird, so kann abgeschätzt werden, daß die Zuckerkette eine Gal-β-1,4-Bindung am nicht reduzierenden Ende hat.
Allgemein wird der enzymatische Verdau schrittweise durchgeführt. Wenn z. B. eine Zuckerkettenprobe 1 mit einem Enzym A verdaut wird, so wird als Produkt des Verdaus eine Zuckerkette 2 erhalten. Die Zuckerkette 2 wird zurückgewonnen und dann mit einem Enzym B verdaut, um Zuckerkette 3 zu ergeben, die weiter verdaut wird mit einem Enzym C. Dieser Vorgang wird wiederholt. Mithin hat die Technik der Strukturanalyse durch enzymatischen Verdau den schwerwiegenden Mangel, daß die Rückgewinnung des Verdauproduktes einen sehr zeitaufwendigen Schritt darstellt, obwohl durch die Technik ein Unterschied in einer Feinstruktur bestimmt werden kann.
Zur Überwindung dieses Mangels wurde eine Technik entwickelt, bei der der enzymatische Verdau der Zuckerkette zur Abschätzung ihrer Struktur systematisch durchgeführt wird (US-Patent Nr. 5,100,778 und C. J. Edge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 6338–6342 (1992)).
Diese Technik umfaßt die folgenden Schritte:

1. Aufteilung einer Zuckerkettenprobe, deren Struktur zu bestimmen ist, in gleiche Teile,
2. Vollständiger Verdau der jeweiligen Teile mit einer Serie von verschiedenen Enzymmischungen,
3. Chromatographische Analyse einer Mischung umfassend jede der Reaktionsmischungen,
4. Vergleich des Analysespektrums, insbesondere der Elutionsposition und der Intensität jedes Peaks, der durch die chromatographische Analyse mit dem Spektrum erhalten wurde, mit dem Spektrum, das aus der Zuckerkettenstruktur in Datenbanken theoretisch berechnet wird, und
5. Abschätzung der Struktur einer Zuckerkettenprobe, indem eine Struktur gewählt wird, die ein Analysespektrum ergibt, das statistisch gesehen der Struktur der Zuckerkettenprobe aus der Datenbank am ähnlichsten ist.

Diese Technik erfordert nur eine chromatographische Analyse, sie erfordert nicht die Rückgewinnung der Zuckerketten, so ist die Strukturanalyse der Zuckerketten durch enzymatischen Verdau vereinfacht und beschleunigt worden.
Da diese Technik jedoch auf der Annäherung des experimentellen Spektrums an das theoretische Spektrum basiert, besteht die Möglichkeit, daß die abgeschätzte Struktur fehlerhaft ist, wenn sich das experimentelle Spektrum sehr stark vom theoretischen unterscheidet oder daß die Abschätzung zu zwei oder mehr Strukturen führt, wenn zwei oder mehr Zuckerketten in der Datenbank gefunden werden, die identische oder außerordentlich ähnliche theoretische Spektren aufweisen. Wird beispielsweise gemäß C. J. Edge et al. (Proa. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 6338–6342 (1992)) eine Zuckerkette mit der einfachen Struktur gemäß Formel 5 [Chemische Formel 5]
durch diese Technik analysiert, so führt ausgehend von den analytischen Ergebnissen die theoretische Abschätzung mit gleicher Wahrscheinlichkeit zu zwei Strukturen, und es ist unmöglich, die richtige aus den beiden zu bestimmen. Edge und seine Mitarbeiter geben an, daß dieses Problem eventuell zumindest teilweise durch Zugabe eines Enzyms lösbar ist, das in Bezug auf die Enzymmischung eine höhere Bindungsspezifität aufweist. Wenn allerdings die Anzahl der zu verwendenden Enzyme ansteigt, so steigt die Anzahl der benötigten Enzymmischungen ebenso an, weswegen diese Technik unpraktikabel ist. Darüber hinaus ist die Anzahl solcher spezifischer Enzyme begrenzt, und es ist praktisch unmöglich, eine Enzymmischung herzustellen, die in der Lage ist, zwischen allen möglichen Strukturen von Zuckerketten zu unterscheiden.
Diese Technik weist einen weiteren schwerwiegenden Mangel auf. Viele Zuckerketten, insbesondere asparagin-gebundene Zuckerketten, sind nämlich nicht linear, sondern komplex verzweigt. Folglich hat eine Zuckerkette zwei oder mehr nicht reduzierende Enden, insbesondere Ver zweigungen. Selbst wenn Art und Anzahl der Zuckerreste und die Art ihrer Bindung durch diese Technik bestimmt sind, ist es unmöglich zu bestimmen, welche Verzweigungen die Zuckerreste aufweisen, wenn alle der Verzweigungen den Rest nicht aufweisen. Demzufolge kann in manchen Fällen die Struktur nicht bestimmt werden. Zusätzlich ist diese Technik sehr empfindlich gegenüber Faktoren, die das experimentelle Spektrum stören, wie z. B. Abnahme der Aktivität der verwendeten Enzyme, Kontaminierung mit einem kleinen Betrag unerwarteter Enzymaktivität und Kontaminierung mit anderen Zuckerketten. Es gibt jedoch keine Mittel, um zu bestätigen, ob das erhaltene Spektrum richtig oder falsch ist. Obwohl das Analyseverfahren leicht und schnell durchführbar ist, mangelt es ihm an Fehlerfreiheit des erhaltenen Spektrums, und es reicht deswegen zum Zweck der Strukturanalyse einer Zuckerkette nicht aus.
Biomedical Chromatography, Vol. 6, 77–83 (1992) beschreibt die Analyse von Oligosacchariden, die mit p-Aminobenzoesäureethylester markiert sind (ABEE-Derivate). Mittels HPLC werden die markierten Derivate und die resultierenden zweidimensionalen Karten zur Strukturanalyse verwendet.
Carbohydrate Research, Vol. 130, 1984, 85–101 hat die Synthese des zentralen Pentasaccharidkerns von Zuckerketten des N-Acetylglucosamintyps zum Inhalt, nachfolgend bezeichnet als M3 Kern (M3 core).
Die WO 92/19768 offenbart Oligosaccharidsequenzen, eingeschlossen ein Oligosaccharid, welches einen M3 Kern enthält und einen Acetylglucosaminrest, der an einen Mannoserest gebunden ist. Es werden verschiedene Sequenzierungsmittel eingesetzt, unter anderem Exoglycosidasereste.
Der Grund für die oben beschriebenen Einschränkungen dieses Verfahrens liegt im Mangel an Identifizierung jedes einzelnen Reaktionspro dukts. Mit dem Begriff „Identifizierung" ist gemeint, daß eine Substanz mit einer unbekannten Struktur durch chromatographische Analyse oder Ähnliches als identisch mit einer Substanz mit einer bekannten Struktur bestimmt wird. Für die Identifizierung ist es unabdingbar, alle möglichen Zuckerketten als Standard für die Analyse zu sammeln, und sie sollten voneinander durch ein analytisches Verfahren getrennt werden. Es ist allerdings unmöglich, eine vollständige Sammlung aller möglichen Zuckerketten als Standard zu haben und sie voneinander zu trennen und zwischen ihnen zu unterscheiden, da die Anzahl solcher Zuckerketten außerordentlich groß ist. Aus diesen Gründen wird in diesem Verfahren die Annäherung des experimentellen Spektrums an das theoretische Spektrum anstelle der Identifikation angewandt.
Grundsätzlich sollte jedoch ein unbestimmtes Näherungsverfahren nicht zur Bestimmung der Struktur einer Substanz angewandt werden. Solange das Näherungsverfahren eingesetzt wird, besteht die Gefahr, daß die Struktur nicht bestimmt werden kann oder eine falsche Struktur erhalten wird. Deswegen ist es wünschenswert, ein genaueres, verläßlicheres und einfacheres Verfahren zur Bestimmung einer Zuckerkettenstruktur zu entwickeln.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein genaueres, verläßlicheres und einfacheres Verfahren zur Bestimmung einer Zuckerkettenstruktur, einen Kit zur Verwendung in diesem Verfahren sowie neue Oligosaccharide, die sich als Standards für dieses Verfahren eignen, bereitzustellen.
Zusammenfassend hat die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Struktur einer Zuckerkette vom N-Acetyllactosamintyp zum Inhalt, das sich dadurch auszeichnet, daß der Bindungsort und die Art der Bindung von Zuckerresten am nicht reduzierenden Ende eines β-N-Acetylglucosaminrestes, welcher an einen α-Mannoserest im M3 Kern gebunden ist, bestimmt werden, indem das Vorhandensein des β-N- Acetylglucosaminrestes nach enzymatischer oder chemischer Behandlung dieser Zuckerkette detektiert wird. Weiterhin umfaßt eine Ausführungsform des Verfahrens die folgenden Schritte:

(1) Selektives Entfernen bestimmter β-N-Acetylglucosaminreste, die an einen α-Mannoserest im Pentasaccharid-Kern einer Zuckerkette vom N-Acetyllactosamintyp gebunden ist (Formel 7 unten) (M3 Kern),
(2) Im Fall, daß das Produkt aus Schritt 1 einen verbleibenden Zuckerrest aufweist, der an das nicht reduzierende Ende eines β-N-Acetylglucosaminrestes gebunden ist, welcher an einen α-Mannoserest im M3 Kern gebunden ist, Entfernen dieses verbleibenden Zuckerrestes, und
(3) Identifizierung der resultierenden Produkte aus Schritt (1) oder (2) durch Vergleich mit Standardzuckerketten.

Die vorliegende Erfindung hat zudem einen Kit zur Bestimmung der Struktur einer Zuckerkette vom N-Acetyllactosamintyp zum Inhalt, der die in den Ansprüchen 16 und 17 beschriebenen Komponenten umfaßt.
Weiterhin befaßt sich die vorliegende Erfindung mit den Oligosacchariden gemäß den Ansprüchen 18 bis 21.
Die Erfinder dieser Erfindung erzielten den Zweck dieser Erfindung während Forschungen an ein Verfahren zur Strukturanalyse von Zuckerketten, in dem sie einem Verfahren zur Behandlung von Zuckerketten entwickelten, wobei die Anzahl der möglichen Produkte aus der Behandlung begrenzt sein sollte, um der Anwendbarkeit eines Identifizierungsprozesses willen, einen Kit zur Verwendung in diesem Verfahren und neue Oligosaccharide, die sich als Standards in einem Identifizierungsprozess eignen.
Es folgt eine ausführliche Beschreibung der vorliegenden Erfindung. Zuckerketten vom N-Acetyllactosamintyp schließen beispielsweise solche ein, die durch die folgende allgemeine Formel (6) dargestellt werden. [Chemische Formel 6]
worin SA für einen Sialinsäurerest steht, Gal einen Galactoserest darstellt, GN einen N-Acetylglucosaminrest darstellt, Fuc einen Fucoserest darstellt, Man einen Mannoserest darstellt, das Symbol in den auf jeden Rest folgenden Klammern auf die Bindungsart hinweist und die Symbole I_x, m_x, m'_x, n_x, n'_x und p_x (x kann 1, 2, 3 oder 4 sein) und q jeweils eine Variable darstellen, mit der Maßgabe, daß m_xm'_x = n_xn'_x = m'_xp_x = 0 und I_x ≥ m_x,m'_x ≥ n_x,n'_x und I_x ≥ p_x.
Wenngleich die Feinstrukturen der Zuckerketten vom N-Acetyllactosamintyp eine große Vielfalt aufweisen, hat die Grundstruktur dieser Zuckerketten eine gemeinsame Struktureinheit (nachfolgend bezeichnet als M3 Kern), dargestellt durch folgende Formel (7).
[Chemische Formel 7]
Alle üblichen Strukturen werden durch oben dargestellte Formel (6) repräsentiert. Der N-Acetyllactosamintyp von Zuckerketten hat eine dendritische Struktur, die den M3 Kern umfaßt, welcher Verzweigungen über vier GN's aufweist. Die Verzweigungen (nachfolgend ist mit „Verzweigung„ die Gruppe umfassend ein verzweigtes GN und Zuckerreste an der nicht reduzierenden terminalen Seite des GN gemeint) enthalten GN-, Gal-, SA- und Fuc-Zuckerreste. Gal und SA können jeweils auf zwei Arten gebunden sein, nämlich als Galβ-1,3 oder Galβ-1,4 und SAα-2,3 oder SAα-2,6. Diese Bindungsarten müssen voneinander unterschieden werden. Die Anzahl jedes Zuckerrestes, der eine Verzweigung bildet ist höchstens 1 und deren Sequenz ist festgelegt. Die Inhalte jeder Verzweigung werden durch die folgende Formel 8 dargestellt.
[Chemische Formel 8]
Da die Anzahl jedes einzelnen Zuckerrests in einer Verzweigung auf 0 oder 1 begrenzt ist und deren Sequenz als chemische Formel 8 angegeben wurde, kann die Struktur einer Zuckerkette vom N-Acetyllactosamintyp nur bestimmt werden, indem die Anwesenheit oder Abwesenheit jedes einzelnen Zuckerrests in jeder einzelnen Verzweigung bestimmt wird, und die Sequenz der Zuckerreste ist selbstverständlich bestimmt.
Die Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit jedes einzelnen Zuckerrests in jeder einzelnen Verzweigung ist gleichbedeutend mit der Bestimmung der Verzweigung, die einen bestimmten Zuckerrest aufweist. Deswegen kann die Struktur einer Zuckerkette vom N-Acetyllactosamintyp bestimmt werden, indem die Verzweigung bestimmt wird, die in jedem Fall einen bestimmten Zuckerrest aufweist.
Es folgt eine Beschreibung des Verfahrens zur Bestimmung, welche Verzweigung einen bestimmten Zuckerrest aufweist (Verzweigungsinformation).
Nach einer typischen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Verzweigungen, die bestimmte Zuckerreste, deren Anwesenheit bestimmt werden soll, aufweisen, von den Verzweigungen unterschieden werden, die keine Reste aufweisen, indem die Verzweigun gen durch enzymatische oder chemische Behandlung entfernt werden, die keine Reste einer Zuckerkettenprobe aufweisen.
Wenn die Verzweigung kein GN aufweist, so weist eine Zuckerkettenprobe keine Verzweigung auf, und demzufolge ist das Entfernen der Verzweigungen ohne GN überflüssig. Die Verzweigungen ohne Gal, SA oder Fuc können von der Zuckerkettenprobe beispielsweise auf folgende Art entfernt werden.
Wenn die Verzweigungen kein Gal aufweisen, dann weisen sie vielleicht GN und/oder Fuc auf, und folglich können die Verzweigungen dann entfernt werden, beispielsweise durch Behandlung einer Zuckerkettenprobe mit der Mischung zweier Enzyme, β-N-Acetylglucosaminidase und α-Fucosidase. In den Verzweigungen, die Gal aufweisen, wird GN durch Gal vor der Behandlung geschützt, und folglich werden die Verzweigungen mit Gal nicht entfernt. Wenn die Verzweigungen kein SA aufweisen, dann weisen sie vielleicht GN, Gal und/oder Fuc auf, und folglich können die Verzweigungen dann entfernt werden, beispielsweise durch Behandlung einer Zuckerkettenprobe mit der Mischung dreier Enzyme, β-N-Acetylglucosaminidase, β-Galactosidase und α-Fucosidase. In den Verzweigungen, die SA aufweisen, sind GN und Gal durch SA vor der Behandlung geschützt, und folglich werden die Verzweigungen, die SA aufweisen, nicht entfernt. Wenn die Verzweigungen kein Fuc aufweisen, dann weisen sie vielleicht GN, Gal und/oder SA auf, und folglich können die Verzweigungen entfernt werden, beispielsweise durch Behandlung der Zuckerkettenprobe mit der Mischung dreier Enzyme, β-N-Acetylglucosaminidase, β-Galactosidase und Sialidase. In den Verzweigungen, die Fuc aufweisen, ist GN durch Fuc vor der Behandlung geschützt und folglich werden die Verzweigungen, die Fuc aufweisen, nicht entfernt. Nach dem Entfernen der Verzweigungen, die nicht jeden einzelnen der drei Zuckerreste Gal, SA und Fuc gemäß dem oben beschriebenen Verfahren aufweisen, sollen die verbliebenen Verzweigungen identifiziert werden. Zum Zweck der Identifizierung werden die verbleibenden Verzweigungen in Verzweigungen mit der einfachsten Struktur, nämlich Verzweigungen, die nur GN aufweisen, durch enzymatische oder chemische Behandlung umgewandelt. Nach dieser Behandlung ist die Anzahl der Endprodukte so begrenzt, daß die Endprodukte leicht identifizierbar sind.
Die Anzahl der Strukturen mit dem M3 Kern, der GN's aufweist, wird wie folgt berechnet: 2 × 2 × 2 × 2 = 16, weil es für jedes der vier GN's zwei Möglichkeiten gibt, nämlich Anwesenheit oder Abwesenheit. Diese Strukturen sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Anwesenheit oder Abwesenheit jeder Verzweigung im Behandlungsprodukt kann bestimmt werden, indem das Produkt aus der Behandlung der Zuckerkette mit irgendeiner der 16 Zuckerketten identifiziert wird mit der Maßgabe, daß die 16 Zuckerketten durch eine beliebige Methode getrennt werden können.
Wie oben beschrieben, kann die Verzweigungsinformation für alle die Zuckerreste, die die Verzweigung bilden, erhalten werden, wenn die Behandlung so durchgeführt wird, daß nur GN der Verzweigung verbleibt, die von den Verzweigungen einen bestimmten Zuckerrest aufweist und die 16 Zuckerketten aus Tabelle 1 durch chromatographische Analyse oder Ähnliches getrennt und identifiziert werden können. Aus diesen Daten kann die Struktur einer Zuckerkette vom N-Acetyllactosamintyp, dargestellt durch die chemische Formel 6, bestimmt werden.
Im Folgenden wird ein erfindungsgemäßes Verfahren erklärt, in dem die Behandlung der Zuckerkette durch Verdau mit Glycosidasen erfolgt.
Die Struktur einer typischen Zuckerkette vom N-Acetyllactosamintyp kann grundsätzlich bestimmt werden, indem (i) der Ort der Bindung von GN, und zwar die Bindungsstelle von GN (nachfolgend bedeutet der Ausdruck „der Ort der Bindung eines bestimmten Zuckerrestes" die Ver zweigung, die einen bestimmten Zuckerrest und seine Bindung aufweist) bestimmt wird, (ii) der Ort und die Art der Gal-Bindung, (iii) der Ort und die Art der SA-Bindung und (iv) der Ort der Fuc-Bindung.
In typischen Zuckerketten ist eine Bindung von GN gewöhnlich an den folgenden vier Stellen möglich: GN(β1-6)Man(α1-6), GN(β1-2)Man(α1-6), GN(β1-4)Man(α1-3) und GN(β1-2) Man(α1-3). Die Bestimmung, an welche dieser vier Stellen GN bindet, ist gleichbedeutend mit der Bestimmung der vier Variablen, d. h. I₁, I₂, I₃ und I₄ in der Formel 6.
Die oben erwähnten vier GN's sind die Zuckerreste, an die Gal gebunden sein kann, wobei zwei Arten von Gal-Bindung möglich sind, nämlich β-1,3 und β-1,4. Deswegen ist die Bestimmung der Stelle und der Art der Gal-Bindung gleichbedeutend mit der Bestimmung der acht Variablen m₁, m'₁, m₂, m'₂, m₃, m'₃, m₄ und m'₄. Da zwei oder mehr Gal's nicht an ein GN gebunden sind, gilt m_xm'_x = 0 (x = 1, 2, 3 oder 4). Weiterhin, wenn I_x = 0, dann gilt m_xm'_x = 0, insbesondere I_x ≥ m_x, m'_x, weil Gal nur an GN gebunden ist.
SA kann an Gal auf zwei Arten gebunden sein, nämlich α-2,3 und α-2,6. Deswegen ist die Bestimmung der Stelle und der Art der SA-Bindung gleichbedeutend mit der Bestimmung der acht Variablen n₁, n'₁, n₂, n'₂, n₃, n'₃, n₄ und n'₄ in der obigen Formel (6). Da zwei oder mehr SA's nicht an ein Gal gebunden sind, gilt n_xn'_x = 0 (x = 1, 2, 3 oder 4). Weiterhin, wenn m_x, m'_x = 0, dann gilt n_xn'_x = 0, insbesondere m_x, m'_x ≥ n_xn'_x, weil SA nur an Gal gebunden ist.
Fuc kann am reduzierenden Ende einer Zuckerkette vom N-Acetyllactosamintyp α-1,6 und auch an vier GN's in Verzweigungen α-1,3 bindungsspezifisch gebunden sein. Demzufolge ist die Bestimmung von Ort und Art der Fuc-Bindung gleichbedeutend mit der Bestimmung der fünf Variablen q, p₁, p₂, p₃ und p₄ in der obigen Formel (6). Wenn Gal aber β- 1,3 bindungsspezifisch an GN gebunden ist, dann ist es unmöglich, daß Fuc an GN α-1 ,3 bindungsspezifisch gebunden ist. Es gilt insbesondere p_xm'_x = 0 (x = 1, 2, 3 oder 4). Weiterhin gilt, wenn I_x = 0, dann ist p_x = 0, insbesondere p_x ≤ I_x, da Fuc nur an GN gebunden sein kann.
Die folgenden Informationen (i) bis (iv) über eine bestimmte Zuckerkette können durch Verdau der Zuckerkette mit mindestens einer Art von Glycosidase und Analyse der Reaktionsprodukte bestimmt werden: (i) der Ort der GN-Bindung, (ii) der Ort und die Art der Gal-Bindung, (iii) der Ort und die Art der SA-Bindung und (iv) der Ort der Fuc-Bindung. In anderen Worten, die vollständige Struktur der Zuckerkettenprobe kann über enzymatischen Verdau bestimmt werden, welcher so ausgestaltet ist, daß lediglich am M3 Kern gebundenes GN zurückbleibt, daß lediglich GN's an den Verzweigungen mit Gal zurückbleiben, daß lediglich GN's an den Verzweigungen mit SA zurückbleiben und daß lediglich GN's, an welche Fuc gebunden ist, zurückbleiben, und durch Identifikation jedes einzelnen Reaktionsprodukts unter Verwendung von Standardzuckerketten.
Es folgt eine Beschreibung der Standardzuckerketten, die in der vorliegenden Erfindung genutzt werden.
In dieser Erfindung werden als Standardzuckerketten 16 Zuckerketten verwendet, in denen ausschließlich GN's an den M3 Kern gebunden sind, dargestellt durch die folgende Formel (9), die auch den M3 Kern enthält. [Chemische Formel 9]
worin Y₁, Y₂, Y₃ und Y₄ jeweils ein Wasserstoffatom oder β-GN darstellen.
Indem man die 16 Standardzuckerketten mit den Reaktionsendprodukten vergleicht, soll der Ort der Bindung des GN an den M3 Kern im finalen Reaktionsprodukt bestimmt werden. Der Zusammenhang zwischen den 16 Zuckerketten, nämlich den Oligosacchariden I bis XVI, mit dem Ort der GN-Bindung ist in Tabelle 1 dargestellt.
Die Oligosaccharide I bis XVI können durch Verdau einer Zuckerkette vom N-Acetyllacosamintyp mit verschiedenen Glycosidasen hergestellt werden. Das Oligosaccharid XVI beispielsweise kann durch vollständigen Verdau einer Zuckerkette, die aus menschlicher α₁-Glycoproteinsäure (Sigma) durch Hydrazinolyse und N-Acetylierung erhalten werden kann, mit Sialinidase, β-Galactosidase und Fucosidase, hergestellt werden. Das Oligosaccharid XVI kann teilweise mit β-N-Acetylglucosaminidase aus Rinderniere verdaut werden, wobei eine Mischung der Oligosaccharide I bis XVI resultiert, die durch HPLC oder Ähnliches aufgereinigt werden kann. Ein weiteres Beispiel ist, daß das Oligosaccharid VIII durch vollständigen Verdau einer Zuckerkette mit Sialidase und β-Galactosidase hergestellt werden kann, welche aus Fetuin vom Rind (Sigma) durch Hydrazinolyse und N-Acetylierung erhältlich ist. Das Oligosaccharid VIII kann teilweise mit β-N-Acetylglucosaminidase aus Rinderniere zu einer Mischung der Oligosaccharide I bis VIII verdaut werden, welche durch HPLC oder Ähnliches gereinigt werden kann. Diese Oligosaccharide können mit hoher Empfindlichkeit mit einem gepulsten amperometrischen Detektor (PAD) detektiert werden.
Diese Oligosaccharide können in intakter Form oder in der Form gemäß der folgenden Formel (10) eingesetzt werden. [Chemische Formel 10]
worin Y₁, Y₂, Y₃ und Y₄ jeweils ein Wasserstoffatom oder β-GN sein können und R₂ eine Aldehydgruppe, eine markierte Methylengruppe oder eine markierte Methingruppe ist.
Die Methylengruppe kann beispielsweise mit 2-Aminopyridin (Agricultural and Biological Chemistry, 54, 2169–2170 (1990)), p-Aminobenzoesäureethylesther (ABEE) (Analytical Biochemistry, 141, 366–381 (1984)) oder 8-Aminonaphtalin-1,3,6-trisulfonsäure (ANTS) (Biochemical Journal, 270, 705–713 (1990)) markiert werden.
Die Methingruppe kann beispielsweise mit radioaktivem Material (Tritium) markiert werden (Methods in Enzymology, 50, 50 (1978)) oder mit 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolon (PMP) (Analytical Biochemistry, 180, 351–357 (1998)). Die Oligosaccharide I bis XVI aus Tabelle 1 können mit 2-Aminopyridin markiert werden. Die PA-Oligosaccharide I bis XVI werden entsprechend als I-PA bis XVI-PA bezeichnet. I-PA bis VII-PA können beispielsweise durch partiellen Verdau von VIII-PA mit β-N-Acetylglucosaminidase aus Rinderniere und durch Aufreinigung der Verdauprodukte mit HPLC gewonnen werden, wobei VIII-PA aus Oligosaccharid VIII über das PA-Verfahren erhältlich ist. IX-PA bis XV-PA können beispielsweise durch partiellen Verdau von XVI-PA mit β-N- Acetylglucosaminidase aus Rinderniere und durch Aufreinigung der Verdauprodukte mit HPLC gewonnen werden, wobei XVI-PA aus Oligosaccharid XVI über das PA-Verfahren erhältlich ist. Diese PA-Oligosaccharide können als Standard benutzt werden, um die Struktur der Reaktionsendprodukte dieser Erfindung zu bestimmen.
Die Mischung der acht Oligosaccharide I-PA bis VIII-PA kann beispielsweise durch HPLC mit PALPAK^® TYPE R (Takara Shuzo) aufgetrennt werden (Eluens: 100 mM Essigsäure/Triethylamin (pH 4.0) mit einem Anteil von 0,035 % 1-Butanol). 1 zeigt ein Beispiel der Auftrennung einer äquimolaren Mischung aus I-PA bis VIII-PA. In 1 repräsentiert die Y-Achse die relative Intensität der Fluoreszenz und die X-Achse stellt die Elutionszeit (min) dar (nachfolgend gilt das Gleiche).
Die Mischung der 16 Oligosaccharide I-PA bis XVI-PA kann über HPLC aufgetrennt werden. Beispielsweise wird die Mischung durch HPLC mit PALPAK^® TYPE N (Takara Shuzo) analysiert (Eluens: 50 mM Essigsäure/Triethylamin (pH 7,3) mit Acetonitril; einem linearen Gradienten von 70 % Acetonitril (0 Minuten) bis 50 % Acetonitril (300 Minuten). I-PA bis XVI-PA können auf der Basis der unterschiedlichen Anzahl an Zuckerresten der Komponenten voneinander getrennt werden. Ein Beispiel dazu ist in 2 gegeben. In 2 wird ein Oligosaccharid, in dem kein GN an den M3 Kern gebunden ist, z. B. IV-PA, über einen Zeitraum von 13 bis 17 Minuten eluiert; diejenigen, in denen ein GN an den M3 Kern gebunden ist (I-PA, V-PA, VI-PA und XII-PA), werden in der Zeit von 18 bis 23 Minuten eluiert (Fraktion 2); diejenigen, in denen zwei GN's an den M3 Kern gebunden sind (II-PA, III-PA, VII-PA, IX-PA, XIII-PA und XIV-PA), werden in der Zeit von 24 bis 29 Minuten eluiert (Fraktion 3); diejenigen, in denen drei GN's an den M3 Kern gebunden sind (VIII-PA, X-PA, XI-PA und XV-PA), werden in der Zeit von 32 bis 38 Minuten eluiert (Fraktion 4); und das, in dem vier GN's an den M3 Kern gebunden sind (XVI-PA), wird in der Zeit von 42 bis 46 Minuten eluiert.
Wenn Fraktion 2 weiter durch HPLC mit PALPAK^® TYPE R aufgereinigt wird (Eluens: 100 mM Essigsäure/Triethylamin (pH 4,0) mit 0,07 % 1-Butanol) können vier Oligosaccharide, in denen ein GN gebunden ist (nämlich I-PA, V-PA, VI-PA und XII-PA), abgetrennt werden. 3 zeigt davon ein Beispiel. In gleicher Weise können vier Oligosaccharide, nämlich VIII-PA, X-PA, XI-PA und XV-PA, aus Fraktion 4 aufgereinigt werden. 4 zeigt davon ein Beispiel. Wenn Fraktion 3 weiter über HPLC mit PALPAK^® TYPE R aufgereinigt wird (Eluens: 100 mM Essigsäure/Triethylamin mit 0,035 % 1-Butanol (pH 4,0)), können sechs Oligosaccharide, nämlich II-PA, III-PA, VII-PA, IX-PA, XIII-PA und XIV-PA, abgetrennt werden. 5 zeigt ein Beispiel davon. Demzufolge können 16 Oligosaccharide I-PA bis XVI-PA aufgetrennt werden.
Die 16 PA-Oligosaccharide können isoliert werden, indem man die Fraktionen, die den jeweiligen Peak in 2 bis 5 enthalten, zusammenlegt. Obwohl XIV-PA durch Zusammenlegen der den Peak enthaltenden Fraktion in 5 isoliert werden kann, kann es durch die folgende Methode noch leichter erhalten werden. Ein Teil von Fraktion 3 kann vollständig mit β-N-Acetylglucosaminidase aus D. pneumoniae β-1,2 bindungsspezifisch verdaut werden. Dann können die Produkte unter den selben Bedingungen wie denjenigen aus 5 durch HPLC analysiert werden, dann verschwinden die Peaks von III-PA und VII-PA (weil sie in I-PA bzw. in IV-PA umgewandelt werden), und es bleibt lediglich XIV-PA zurück. Folglich kann XIV-PA durch Zusammenlegen der Fraktion, die den verbleibenden Peak enthält, erhalten werden. Ein Beispiel davon ist in 6 gegeben.
IX-PA bis XV-PA können auch sehr gut aus XVI-PA gewonnen werden, z. B. die PA-Zuckerkette 004 (Takara Shuzo) durch Verwendung von Sialyltransferase und Galactose-Oxidase.
Jedes der 16 PA-Oligosaccharide, I-PA bis XVI-PA, kann über HPLC mit zwei Arten von Säulen, PALPAK^® Typ N Säule (Eluens A, eine 25:75 Mischung von 0,2 M Essigsäure/Triethylamin-Puffer bei pH 7,3 und Acetonitril; Eluens B, eine 50:50 Mischung von 0,1 M Essigsäure/Triethyl amin-Puffer bei pH 7,3 und Acetonitril; nach Probeninjektion in die Säule ins Gleichgewicht gebracht mit einer 80:20 Mischung von Eluens A und B, der prozentuale Anteil an Eluens B wird auf einem linearen Gradienten erhöht, bis 40 % über einen Zeitraum von 75 min) und PALPAK^® Typ R Säule (Eluens: 100 mM Essigsäure/Triethylamin (pH 4,0) mit 0,02 1-Butanol) analysiert werden. Ein typisches Elutionsprofil der Mischung der 16 PA-Oligosaccharide auf den zwei Säulen wird in 7 gezeigt. Die Elutionsposition jedes einzelnen PA-Oligosaccharids auf den zwei Säulen kann aufgezeichnet werden und damit eine zweidimensionale Zuckerkarte erstellt werden. 7 zeigt auch ein Beispiel einer zweidimensionalen Zuckerkarte. Das Reaktionsendprodukt der Erfindung kann leicht unter Verwendung dieser zweidimensionalen Zuckerkarte identifiziert werden.
Die Eigenschaften von I-PA, II-PA, III-PA, IX-PA, X-PA, XI-PA, XII-PA, XIII-PA und XIV-PA werden im Folgenden beschrieben werden. Das magnetische Protonen-Kernresonanzspektrum (¹H-MMR) von I-PA wird in 8 und 9 dargestellt, das von II-PA in 10 und 11, das von III-PA in 12 und 13, das von IX-PA in 14, das von X-PA in 15 und 16, das von XI-PA in 17, das von XII-PA in 18, das von XIII-PA in 19 und das von XVI-PA in 20. Die chemischen Verschiebungen werden in Parts per Million (ppm) bezogen auf die Referenzverbindung Natrium-4,4-Dimethyl-4-silapentan-1-sulfonat (DSS) angegeben, wurden aber tatsächlich mit Aceton als internem Standard gemessen (2,218 ppm in D₂O bei 37 °C). In den 9, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19 und 20 ist das Signal bei 2,218 ppm das der Methylprotonen von Aceton, das als interner Standard verwendet wurde.
(Eigenschaften von I-PA)

Molgewicht. 1192.7 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.556 (H-1, GN-7), 2.067 (NAc, GN-7)
Zucker Man: GN = 3.0 : 2.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von II-PA)

Molgewicht 1395.4 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.541 (H-1, GN-5'), 4.556 (H-1, GN-7), 2.040 (NAc, GN-5'), 2.066 (NAc, GN-7)
Zucker Man: GN = 3.0 : 3.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von III-PA)

Molgewicht 1395.5 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.527 (H-1, GN-5), 4.515 (H-1, GN-7), 2.045 (NAc, GN-5), 2.067 (NAc, GN-7)
Zucker Man: GN = 3.0 : 3.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von IX-PA)

Molgewicht 1395.0 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.552 (H-1, GN-7'), 4.535 (H-1, GN-5), 2.046 (NAc, GN-7'), 2.046 (NAc, GN-5)
Zucker Man: GN = 3.0 : 3.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von X-PA)

Molgewicht 1599.0 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.528 (H-1, GN-7'), 4.549 (H-1, GN-5'), 4.557 (H-1, GN-7), 2.028 (NAc, GN-7'), 2.038 (NAc, GN-5'), 2.067 (NAc, GN-7)
Zucker Man: GN = 3.0 : 4.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von XI-PA)

Molgewicht 1598.0 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.546 (H-1, GN-7'), 4.515 (H-1, GN-7), 4.529 (H-1, GN-5), 2.045 (NAc, GN-7'), 2.065 (NAc, GN-7), 2.045 (NAc, GN-5)
Zucker Man: GN = 3.0 4.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von XII-PA)

Molgewicht 1191.5 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.542 (H-1, GN-7'), 2.043 (NAc, GN-7')
Zucker Man: GN = 3.0 : 2.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von XIII-PA)

Molgewicht 1395.0 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.530 (H-1, GN-7'), 4.548 (H-1, GN-5'), 2.027 (NAc, GN-7'), 2.038 (NAc, GN-5')
Zucker Man: GN = 3.0 : 3.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von XIV-PA)

Molgewicht 1395.0 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.530 (H-1, GN-T), 4.556 (H-1, GN-7), 2.043 (NAc, GN-7'), 2.038 (NAc, GN-7)
Zucker Man: GN 3.0 : 3.5, frei von Gal und Fuc.

Die Referenznummern der Zuckerreste im ¹H-NMR-Spektrum sind der folgenden chemischen Formel (11) zu entnehmen:
[Chemische Formel 11]
Wenn der enzymatische Verdau als Behandlung im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, dann wird eine Zuckerkettenprobe mit Glycosidasen in einem oder mehreren Schritten, die einen Reaktionsabbruchvorgang im Reaktionsverlauf beinhalten, verdaut, und das Endprodukt wird einer chromatographischen Analyse unterzogen, in der ein Vergleich mit den oben genannten Standard-Zuckerketten stattfindet.
Die zu analysierende Zuckerkette kann eine sein, die durch die obige chemische Formel (6) dargestellt wird. Sogar eine Zuckerkette, die nicht durch Formel (6) dargestellt ist, kann durch das erfindungsgemäße Verfahren analysiert werden, soweit sie durch enzymatische oder chemische Behandlungen in eine Zuckerkette umgewandelt werden kann, die durch die obige Formel (6) dargestellt wird.
Eine Zuckerkette mit einer Polylactosaminstruktur, in der das wiederholende N-Acetyllactosamin [(–3)Gal(β1-4)GIcNAc(β1-)] an die Gal-Reste aus der Formel (6) gebunden ist, wird nicht durch Formel 6 dargestellt. Die Zuckerkette mit Polylactosamin kann durch sequenziellen Verdau mit β-Galactosidase und β-N-Acetylglucosaminidase [T. Ohkura et al., J. Biol. Chem. (1981) 256, 8485–8490] oder durch Verdau mit endo-β-Galactosidase aus Escherichia freundii in eine durch Formel (6) dargestellte Zuckerkette umgewandelt werden.
Die zu analysierende Zuckerkette kann markiert oder nicht markiert sein. Obwohl die Zuckerkette eine Mischung aus mehreren Zuckerketten sein kann, liegt ihre Reinheit vorzugsweise bei mehr als 80 %.
Die in den einzelnen Schritten verwendete Glycosidase kann einzeln oder als Mischung aus zwei oder mehr Glycosidasen vorliegen. Obwohl die zu verwendende Glycosidase vorzugsweise eine Exoglycosidase ist, können auch Endoglycosidasen verwendet werden. Die Reaktionstemperatur, die keinen außergewöhnlichen Einschränkungen unterliegt, beträgt üblicherweise 20 °C bis 50 °C, insbesondere 37 °C. Die Reaktionszeit, die keinen außergewöhnlichen Einschränkungen unterliegt, beträgt üblicherweise 10 Minuten bis 20 Stunden, insbesondere 3 Stunden bis 5 Stunden. Nach jedem Schritt wird die Reaktion durch Deaktivierung der Glycosidasen durch Inkubieren der Reaktionsmischung bei 80 °C bis 120 °C für 3 bis 10 Minuten beendet. Solch ein Deaktivierungsschritt ist nicht immer notwendig. Anders gesagt ist der Deaktivierungsschritt nicht immer notwendig, wenn die im vorhergehenden Schritt verwendeten Glycosidasen keine Aktivitäten zeigen, weil die optimale Temperatur, Druck, pH, Konzentration des organischen Lösungsmittels etc. für den nachfolgenden Schritts sehr stark von denen des vorhergehenden Schritts differieren oder wenn die im vorhergehenden Schritt eingesetzte Glycosidase mit Antikörper-Kügelchen (antibody beads) oder einem Ionenaustausch-Harz entfernt werden kann.
Das Analyseverfahren zur Analyse des Reaktionsprodukts, wobei das Verfahren nicht besonders beschränkt ist, kann unter anderem Dünnschichtchromatographie, Elektrophorese, Massenspektrometrie, Gaschromatographie etc. einschließen, die Analyse über HPLC ist besonders bevorzugt. Die Reaktionsabfolge schließt üblicherweise 1 bis 6 Reaktionen für jede Probe ein. Die Produkte jeder Reaktion werden analysiert, und die Zuckerkettenstruktur wird durch Kombination der verschiedenen erhaltenen Teilinformationen bestimmt. Im folgenden wird jede Reaktion detailliert beschrieben.
Bestimmung des Ortes der GN-Bindung
Wenn eine Zuckerkettenprobe mit einer Mischung aus β-Galactosidase, Sialidase und α-Fucosidase verdaut wird, so können Gal, SA und Fuc von der Kette entfernt werden, so daß nur GN zurückbleibt. Deshalb sollte das Reaktionsprodukt eine der Zuckerketten sein, die durch die chemischen Formeln (9) oder (10) dargestellt werden. Das Reaktionsprodukt kann identifiziert werden, indem die oben beschriebenen Standardzuckerketten verwendet werden und dann der Ort der GN-Bindung in der Ausgangsprobe der Zuckerkette, d. h. die Variablen I₁, I₂, I₃ und I₄ in der Formel (6) bestimmt werden kann. Die dabei verwendeten Glycosidasen können vorzugsweise solche mit geringer Substratspezifität wie β-Galactosidase aus Jackbohnen (Seikagaku-Kogyo), β-Galactosidase aus Streptococcus (Seikagaku-Kogyo), Sialidase aus Arthrobacter urea faciens (Nacalai Tesque), α-Fucosidase aus Rinderniere (Boehringer Mannheim) etc. sein.
Bestimmung von Ort und Art der Gal-Bindung
Wenn eine Zuckerkettenprobe mit einer Mischung aus β-N-Acetylglucosaminidase, Sialidase und α-Fucosidase verdaut wird, so können Fuc und GN, das nicht mit Gal substituiert ist, von der Kette entfernt werden, so daß Gal und GN an der gleichen Verzweigung zurückbleiben. Nach Entfernen oder Deaktivierung der Enzyme wird die Zuckerkette weiter mit β-Galactosidase verdaut, um Gal zu entfernen. Das Reaktionsprodukt muß eine der Zuckerketten sein, die durch die chemischen Formeln (9) oder (10) dargestellt werden. Das Reaktionsprodukt kann identifiziert werden, indem die oben beschriebenen Standardzuckerketten verwendet werden, dann kann der Ort der Gal-Bindung in der Ausgangsprobe der Zuckerkette bestimmt werden. Durch diese Reaktion kann die Art der Gal-Bindung nicht bestimmt werden. Es kann nämlich nur bestimmt werden, daß entweder m_x oder m'_x (x = 1, 2, 3 oder 4) 1 ist oder, in anderen Worten, es kann bestimmt werden, daß (m_x + m'_x) entweder 0 oder 1 ist. Die dabei verwendeten Glycosidasen können vorzugsweise solche mit geringer Substratspezifität wie β-N-Acetylglucosaminidase aus Rinderniere (Boehringer Mannheim), β-Galactosidase aus Jackbohnen, β-Galactosidase aus Streptococcus, Sialidase aus A. ureafaciens und α-Fucosidase aus Rinderniere sein.
Um die Art der Gal-Bindung zu bestimmen, wird eine Zuckerkettenprobe mit der gleichen wie oben beschriebenen Mischung aus Glycosidasen, außer daß eine bindungsspezifische β-Galactosidase verwendet wird, verdaut. Die Zuckerkette wird mit einer Mischung aus β-N-Acetylglucosaminidase, Sialidase, α-Fucosidase und β-1,4 bindungsspezifischer oder β-1,3 bindungsspezifischer β-Galactosidase verdaut. Gal, das mit der bindungsspezifischen β-Galactosidase verdaut werden kann und GN an der gleichen Verzweigung und Fuc und GN, die nicht mit Gal substituiert sind, können von der Kette entfernt werden, wobei Gal, welches nicht mit der bindungsspezifischen β-Galactosidase verdaut werden kann, und GN an der gleichen Verzweigung zurückbleiben. Nach Entfernen oder Deaktivierung der Enzyme wird die Zuckerkette weiter mit nicht spezifischer β-Galactosidase verdaut, um Gal zu entfernen. Das Reaktionsprodukt muß eine der Zuckerketten sein, die durch die chemischen Formeln (9) oder (10) dargestellt werden. Das Reaktionsprodukt kann identifiziert werden, indem die oben beschriebenen Standardzuckerketten verwendet werden, dann kann der Ort der Gal-Bindung, die nicht mit der bindungsspezifischen β-Galactosidase hydrolysiert werden kann, in der Ausgangsprobe der Zuckerkette bestimmt werden. Wenn beispielsweise β-1,4 bindungsspezifische Galactosidase aus D. pneumoniae (Boehringer Mannheim) verwendet wird, so kann der Ort der Galβ-1,3-Bindung, d. h. die Variablen m'₁, m'₂, m'₃ und m'₄ in der Formel (6) bestimmt werden. Weil m₁+m'₁, m₂+m'₂, m₃+m'₃ und m₄+m'₄ durch die oben beschriebene Reaktion bestimmt worden sind, so kann der Ort der Galβ-1,4-Bindung, d. h. die Variablen m₁, m₂, m₃ und m₄ in der Formel (6) durch Kombination dieser Daten bestimmt werden.
Bestimmung von Ort und Art der SA-Bindung
Wenn eine Zuckerkettenprobe mit einer Mischung aus β-N-Acetylglucosaminidase, β-Galactosidase und α-Fucosidase verdaut wird, so können Gal und GN, das nicht mit SA substituiert ist, von der Kette entfernt werden, so daß SA, Gal und GN an der gleichen Verzweigung zurückbleiben. Nach Entfernen oder Deaktivierung der Enzyme wird die Zuckerkette weiter mit einer Mischung aus Sialidase und α-Galactosidase verdaut. Das Reaktionsprodukt muß eine der Zuckerketten sein, die durch die chemischen Formeln (9) oder (10) dargestellt werden. Das Reaktions produkt kann identifiziert werden, indem die oben beschriebenen Standardzuckerketten verwendet werden, dann kann der Ort der SA-Bindung in der Ausgangsprobe der Zuckerkette bestimmt werden. Durch diese Reaktion kann die Art der SA-Bindung nicht bestimmt werden. Es wird nämlich nur bestimmt, daß entweder n_x oder n'_x (x = 1, 2, 3 oder 4) 1 ist oder, in anderen Worten, es kann bestimmt werden, daß (n_x + n'_x) entweder 0 oder 1 ist. Die dabei verwendeten Glycosidasen können vorzugsweise solche mit geringer Substratspezifität wie β-N-Acetylglucosaminidase aus Rinderniere, β-Galactosidase aus Jackbohnen, β-Galactosidase aus Streptococcus, Sialidase aus A. ureafaciens, α-Fucosidase aus Rinderniere etc. sein.
Um die Art der SA-Bindung zu bestimmen, wird eine Zuckerkettenprobe mit der gleichen, oben beschriebenen Mischung aus Glycosidasen, außer daß eine bindungsspezifische Sialidase verwendet wird, verdaut. Die Zuckerkette wird mit einer Mischung aus β-N-Acetylglucosaminidase, β-Galactosidase, α-Fucosidase und α-2,3 bindungsspezifischer oder α-2,6 bindungsspezifischer Sialidase verdaut. SA, das mit der in der Reaktion verwendeten spezifischen Sialidase nicht verdaut werden kann und Gal und GN an der gleichen Verzweigung, bleiben nach der Reaktion zurück. Nach Entfernen oder Deaktivierung der Enzyme wird die Zuckerkette weiter mit nicht spezifischer Sialidase und β-Galactosidase verdaut, um Gal zu entfernen. Das Reaktionsprodukt muß eine der Zuckerketten sein, die durch die chemischen Formeln (9) oder (10) dargestellt werden. Das Reaktionsprodukt kann identifiziert werden, indem die oben beschriebenen Standardzuckerketten verwendet werden, dann kann der Ort der Gal-Bindung, die nicht mit der bindungsspezifischen Sialidase hydrolysiert werden kann, in der Ausgangsprobe der Zuckerkette bestimmt werden. Wenn beispielsweise α-2,3 bindungsspezifische Sialidase aus Salmonella typhimurium (Takara Shuzo) verwendet wird, so kann der Ort der SA- α2,6-Bindung, d. h. die Variablen n₁, n₂, n₃ und n₄ in der Formel (6) durch diese Reaktion bestimmt werden. Weil n₁+n'₁, n₂+n'₂, n₃+n'₃ und n₄+n'₄ durch die oben beschriebene Reaktion be stimmt worden sind, so kann der Ort der SAα-2,6-Bindung, d. h. die Variablen n'₁, n'₂, n'₃ und n'₄ in der Formel (6) durch Kombination dieser Daten bestimmt werden.
Wenn nur der Ort und die Art der SA-Bindung in einer Zuckerkette bestimmt werden soll, dann werden die Standard Oligosaccharide aus Formel (9) oder (10) nicht notwendigerweise eingesetzt. Wenn beispielsweise Ort und Art der SA-Bindung in der sogenannten „zweiantennigen" Zuckerkette („biantennary sugar chain"), d. h. die Variablen n₂, n'₂, n₄ und n'₄ aus Formel (6), bestimmt werden sollen, dann wird die Zuckerkette zuerst mit β-Galactosidase verdaut, und dann werden die Enzyme entfernt oder deaktiviert. Dann wird die Reaktionsmischung mit Sialidase verdaut. Nach dem enzymatischen Verdau muß Gal, das durch SA gebunden ist, zurückbleiben, und folglich muß das Reaktionsprodukt eines der vier möglichen Produkte sein, also eines der durch Formel (6) dargestellten Oligosaccharide mit den Variablen (I₂=I₄=1, m₂=m₄=0), (I₂=I₄=I, m₂=0, m₄=1), (I₂=I₄=1, m₂=1, m₄=0), (I₂=I₄=1, m₂=m₄=1). Deswegen kann der Ort der SA-Bindung bestimmt werden, wenn das Reaktionsprodukt mit diesen vier Standard Oligosacchariden identifiziert wird, und auch die Art der SA-Bindung kann durch Verwendung einer α-2,3 bindungsspezifischen Sialidase bestimmt werden.
Bestimmung des Ortes der Fuc-Bindung
Wenn eine Zuckerkettenprobe mit einer Mischung aus β-N-Acetylglucosaminidase, β-Galactosidase und Sialidase verdaut wird, so bleiben mit Fuc substituierte Fuc und GN zurück, während GN, Gal und SA von der Kette entfernt werden.
Nach Entfernen oder Deaktivierung der Enzyme wird die Zuckerkette weiter mit α-Fucosidase verdaut, um Fuc zu entfernen. Wenn nötig, wird auch β-Galactosidase zu der Mischung gegeben, weil Gal, das an das gleiche GN wie Fuc gebunden ist, nach der oben beschriebenen Reakti on zurückbleiben könnte. Das Reaktionsprodukt muß eine der Zuckerketten sein, die durch die chemischen Formeln (9) oder (10) dargestellt werden. Das Reaktionsprodukt kann identifiziert werden, indem die oben beschriebenen Standardzuckerketten verwendet werden, dann kann der Ort der Fucα-1,3-Bindung in der Ausgangsprobe der Zuckerkette bestimmt werden, d. h. die Variablen p₁, p₂, p₃ und p₄ in der Formel (6) können bestimmt werden. Die dabei verwendete Glycosidase ist vorzugsweise eine mit geringer Substratspezifität wie β-N-Acetylglucosaminidase aus Rinderniere, β-Galactosidase aus Jackbohnen, β-Galactosidase aus Streptococcus, Sialidase aus A. ureafaciens, α-Fucosidase aus Rinderniere etc.
Die Anwesenheit oder Abwesenheit der Fucα-1,6-Bindung an GN am reduzierenden Ende der Zuckerkettenprobe, nämlich die Variable q in der Formel (6), kann durch Verwendung von α-1,3/4 bindungsspezifischer α-Fucosidase bestimmt werden. Wenn die Zuckerkette mit einer Mischung aus β-N-Acetylglucosaminidase, β-Galactosidase, Sialidase und beispielsweise α-1,3/4-Fucosidase aus Streptomyces (Takara Shuzo) verdaut wird, werden GN, Gal, SA und α-1,3 gebundenes Fuc entfernt, wobei α-1 ,6 gebundenes Fuc zurückbleibt. Somit muß das Produkt, sofern die Zuckerkettenprobe frei von α-1,6 gebundenem Fuc ist oder, anders gesagt, wenn q gleich 0 ist, der M3 Kern sein, der von dem M3 Kern mit α-1 ,6 gebundenem Fuc unterschieden werden kann. Aus diesen Ergebnissen kann die Anwesenheit oder Abwesenheit der Fucα-1,6-Bindung bestimmt werden.
Die Zuckerkette vom N-Acetyllactosamintyp enthält manchmal zusätzlich zu den in Formel (6) dargestellten Bindungsarten eine Fuc(α1-2)Gal Sequenz. Der Ort der Fucα-1,2-Bindung kann durch die selbe, oben beschriebene Reaktion bestimmt werden, außer wenn eine α-1,2 bindungsspezifische Fucosidase wie eine α-1,2-Fucosidase aus Arthrobacter (Takara Shuzo) verwendet wird.
Bestimmung der Struktur von Zuckerketten
Wenn die Struktur einer zu analysierenden Zuckerkette durch Formel (6) wiedergegeben ist, so kann die genaue Struktur aus den oben beschriebenen Ergebnissen (i) bis (iv) bestimmt werden. Der Ort der GN-Bindung, d. h. die Variablen I₁, I₂, I₃ und I₄ in der Formel (6), kann aus den Ergebnissen von (i) bestimmt werden. Ort und Art der Gal-Bindung, d. h. die Variablen m_1,m'₁, m₂, m'₂, m₃, m'₃, m₄ und m'₄ in der Formel (6) können aus den Ergebnissen von (ii) bestimmt werden. Ort und Art der SA-Bindung, d. h. die Variablen n_1,n'₁, n₂, n'₂, n₃, n'₃, n₄ und n'₄ in der Formel 6 können aus den Ergebnissen von (iii) bestimmt werden. Der Ort der Fuc-Bindung, d. h. die Variablen q, p₁, p₂, p₃ und p₄ in der Formel (6), kann aus den Ergebnissen von (iv) bestimmt werden.
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Verzweigungen mit einem bestimmten Zuckerrest, dessen Anwesenheit bestimmt werden soll, von den Verzweigungen unterschieden werden, die den Rest nicht aufweisen, indem die Verzweigungen mit dem Rest von einer Zuckerkettenprobe durch enzymatische oder chemische Behandlung entfernt werden. Beispielsweise können GN-Reste in den Verzweigungen mit einer Galβ-1,3-Bindung gezielt durch Verdau mit Lacto-N-Biosidase, welche das Disaccharid Gal(β1-3)GN freisetzt, vom nichtreduzierenden Ende einer Zuckerkette entfernt werden [M. Sano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 8512–8516 (1992)]. Die Verzweigungen mit Gal(β1-3)GN können spezifisch durch Behandlung mit der Mischung aus Sialidase, α-Fucosidase und Lacto-N-Biosidase entfernt werden. Dann können die Reaktionsprodukte mit β-Galactosidase verdaut werden, und die Reaktionsendprodukte müssen eine der Zuckerketten sein, die durch die chemischen Formeln (9) oder (10) dargestellt werden. Die von diesem Verfahren ausgelassenen Verzweigungen von den Verzweigungen mit GN können als die Verzweigungen bestimmt werden, die Gal(β1-3)GN aufweisen, d. h. die Verzweigungen, die eine Galβ-1,3-Bindung aufweisen.
Die Nützlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Struktur einer Zuckerkette kann noch weiter verbessert werden, indem die durch Formel 12 dargestellten Oligosaccharide als Standard-Zuckerketten verwendet werden. [Chemische Formel 12]
worin Z₁, Z₂, Z₃, Z₄, Z₅ und Z₆ jeweils einen Wasserstoff oder β-GN darstellen.
Obwohl die meisten der Zuckerketten vom N-Acetyllactosamintyp durch die Formel (6) wiedergegeben werden, haben manche Zuckerketten die Kernstruktur nach Formel (12), die mit Gal-, SA und Fuc-Resten modifiziert sein kann. Die Standardzuckerketten nach Formel (12) können nützlich für die Analyse dieser Zuckerketten sein. Fünf Oligosaccharide, die für die Analyse besonders nützlich sind, sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 2
Diese Oligosaccharide können wie die Oligosaccharide I bis XVI ohne oder nach Markierung verwendet werden.
Die typische Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens schließt einen Prozeß zur Identifizierung durch Vergleich mit den Standardzuckerketten des aus der Behandlung resultierenden Produkts ein, wenn allerdings die Struktur des resultierenden Produkts durch andere analytische Techniken wie NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie bestimmt werden kann, dann können auch diese für die vorliegende Erfindung angewandt werden.
Die Struktur der Zuckerkette kann einfacher bestimmt werden, in dem die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Reagenzien zu einem Kit kombiniert werden. Der Kette enthält mindestens eines der Ofigosaccharide aus Formel (4) und, falls notwendig, ein Oligosaccharid aus den Formeln (9) oder (10). Beispielsweise ist ein Kit, der I-PA bis VIII-PA enthält, besonders effektiv zur Analyse eines zweiantennigen Zucker aus der Formel (6), in dem I₁=I₃=0 und I₂=I₄=1 ist, oder eines dreiantennigen Zuckers der gleichen Formel (6), in dem I₁ = 0 und I₂=I₃=I₄=1 ist. Ein Kit mit I-PA bis XVI-PA ist weitgehend zur Analyse von Zuckerketten vom N-Acetyllactosamintyp einsetzbar.
Der Kit kann zusätzlich zu den Oligosacchariden Glycosidasen, eine Säule für die Analyse, eine Pufferlösung etc. enthalten. Die Reagenzien können in dem Kit in Form einer Lösung oder eines gefriergetrockneten Produktes enthalten sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein HPLC-Spektrum einer Mischung aus 8 Oligosacchariden I-PA bis VIII-PA unter Kondition 1.
2 zeigt ein HPLC-Spektrum einer Mischung aus 16 Oligosacchariden I-PA bis XVI-PA unter Kondition 2.
3 zeigt ein HPLC-Spektrum von Fraktion 2 in 2 unter Kondition 3.
4 zeigt ein HPLC-Spektrum von Fraktion 4 in 2 unter Kondition 3.
5 zeigt ein HPLC-Spektrum von Fraktion 3 in 2 unter Kondition 1.
6 zeigt ein HPLC-Spektrum der Fraktion in 2 unter Kondition 1 nach vollständigem Verdau mit β-N-Acetylglucosaminidase aus D. pneumoniae.
7 zeigt ein Elutionsprofil einer Mischung aus 16 Oligosacchariden I-PA bis XVI-PA unter den Bedingungen 2 und 4 und eine zweidimensionale Karte davon.
8 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von I-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 3,00 bis 5,50 ppm.
9 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von I-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 1,85 bis 2,50 ppm.
10 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von II-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 3,00 bis 5,50 ppm.
11 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von II-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 1,85 bis 2,50 ppm.
12 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von III-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 3,00 bis 5,50 ppm.
13 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von III-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 1,85 bis 2,50 ppm.
14 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von IX-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 1,60 bis 2,50 ppm.
15 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von X-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 1,85 bis 2,50 ppm.
16 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von X-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 3,00 bis 5.50 ppm.
17 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von XI-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 1,60 bis 5,50 ppm.
18 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von XII-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 1,60 bis 5,50 ppm.
19 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von XIII-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 1,60 bis 5,50 ppm.
20 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von XIV-PA im Bereich einer chemischen Verschiebung von 1,60 bis 5,50 ppm.
21 zeigt ein Elutionsprofil der Produkte aus teilweisem Verdau einer Zuckerkette mit β-N-Acetylglucosaminidase aus Rinderniere. Der GN-Rest in der Sequenz, GN(β1-6)Man(α) in der Zuckerkette ist geschützt.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiter die vorliegende Erfindung, ohne sie in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiel 1
200 nmol kommerziell erhältliches Oligosaccharid VIII-PA (PA Zuckerkette 013; Takara Shuzo) wurden mit 20 mU β-N-Acetylglucosaminidase aus D. pneumoniae (Boehringer Mannheim) in 50 mM Phosphat/Citrat-Puffer (pH 5,0) bei 37 °C verdaut. Ein Teil der Reaktionsmischung wurde mit HPLC analysiert, und sobald der Anteil an nicht abgebauter Substanz bei etwa 25 % des Ganzen lag, wurde die Reaktionsmischung für 5 Minuten auf 100 °C erhitzt, um die Reaktion zu beenden. Dann wurden die Produkte durch HPLC aufgetrennt so daß I-PA (22,4 Minuten), II-PA (42,5 Minuten) und III-PA (25,2 Minuten) erhalten wurden, welche dann aufgereinigt wurden. Die HPLC Konditionen waren wie folgt:
Dann wurde die Zusammensetzung von jedem der drei aufgereinigten Oligosaccharide I-PA, II-PA und III-PA durch Massenspektrometrie mit einem API-III Massenspektrometer (Perkin-Elmer Sciex), NMR-Spektroskopie (in D₂O) mit einem 400 MHz Protonenkernresonanzspektrometer (Bruker) und Monosaccharidanalyse nach saurer Hydrolyse analysiert.
Die Eigenschaften der jeweiligen Oligosacchariden sind unten angegeben. Weiterhin ist in den 8 und 9 das ¹H-NMR-Spektrum von I-PA angegeben, das von II-PA in den 10 und 11 und das von III-PA in 12 und 13. Die chemischen Verschiebungen in diesen ¹H-NMR-Spektren werden relativ zum Wert der chemischen Verschiebung der Methylprotonen von Aceton von 2,218 ppm in D₂O bei 37 °C angegeben, wenn DSS als Standard verwendet wird. In 9, 11 und 13 ist das Si gnal bei 2,218 ppm das der Methylprotonen von Aceton, das als interner Standard eingesetzt wurde.
(Eigenschaften von I-PA)

Molgewicht 1192,7
¹H-NMR 4.556 (H-1, GN-7), 2.067 (NAc, GN-7)
Zucker Man: GN = 3.0 : 2.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von II-PA)

Molgewicht 1395,4
¹H-NMR 4.541 (H-1, GN-5'), 4.556 (H-1, GN-7), 2.040 (NAc, GN-5'), 2.066 (NAc, GN-7)
Zucker Man: GN = 3.0 : 3.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von III-PA)

Molgewicht 1395,5
¹H-NMR 4.527 (H-1, GN-5), 4.515 (H-1, GN-7), 2,045-(NAc, GN-5), 2.067 (NAc, GN-7)
Zucker Man:GN = 3.0 : 3.5, frei von Gal und Fuc.

Die Referenznummern der Zuckerreste im ¹H-NMR-Spektrum sind der folgenden chemischen Formel (11) zu entnehmen: [Chemische Formel 11]
Beispiel 2
(1) Auftrennung von I-PA bis VIII-PA:
Eine Lösung enthaltend 1 pmol I-PA, II-PA and III-PA aus Beispiel 1 und kommerziell erhältliches IV-PA (PA Zuckerkette 016; Takara Shuzo), V-PA (PA Standardzuckerkette 100.1; Nakano Vinegar), VI-P (PA Standardzuckerkette 100.2; Nakano Vinegar), VII-PA (PA Zuckerkette 012; Takara Shuzo) und VIII-PA (PA Zuckerkette 013; Takara Shuzo) wurde durch HPLC unter Kondition 1 (1) aufgearbeitet. Acht verschiedene PA-Oligosaccharide wurden aufgetrennt.
(2) Auftrennung von I-PA to XVI-PA:
1 nmol XVI-PA (PA Zuckerkette 014; Takara Shuzo) wurde mit 1 mU β-N-Acetylglucosaminidase aus Rinderniere, die eine verhältnismäßig geringe Substratspezifität aufweist, in 50 mM Phosphat/Citrat-Puffer (pH 5.0) bei 37 °C verdaut. Ein Teil der Reaktionsmischung wurde durch HPLC analysiert mit PALPACK^® TYPE N [Eluens: 50 mM Säure Essigsäure/Triethylamin (pH 7,3); linearer Gradient von Acetonitril 70 % (0 min) to 50 % (300 min); die anderen Konditionen gleich wie in Kondition 1 (nachfolgend bezeichnet als „Kondition 2")]. Sobald der Anteil an nicht abgebauter Substanz bei etwa 20 % des Ganzen lag, wurde die Reaktionsmischung für 5 Minuten auf 100 °C erhitzt, um die Reaktion zu beenden und dadurch eine Mischung aus I-PA bis XVI-PA zu erhalten.
Die Mischung wurde durch HPLC unter Kondition 2 aufgetrennt. Das erhaltene Spektrum ist in 2 dargestellt. Die Peaks wurden in fünf Fraktionen aufgeteilt, Fraktion 1 eluierte im Zeitabschnitt zwischen 13 bis 17 Minuten, Fraktion 2 im Zeitabschnitt zwischen 18 bis 23 Minuten, Fraktion 3 im Zeitabschnitt zwischen 24 bis 29 Minuten, Fraktion 4 im Zeitabschnitt zwischen 32 bis 38 Minuten und Fraktion 5 im Zeitabschnitt zwischen 42 bis 46 Minuten.
Unter Kondition 2 konnte die Zuckerkette auf Basis der Anzahl der Zuckerreste, die die Kette bilden, abgetrennt werden. Durch Vergleich mit der Elutionsposition von kommerziell erhältlichem IV-PA, V-PA, VII-PA, VIII-PA and XVI-PA in der HPLC unter Kondition 2, wurde gefunden, daß der Peak der Fraktion 1 erhalten bei 15,4 Minuten min. von einem stammt, in dem GN nicht an den M3 Kern gebunden war, er wurde nämlich mit IV-PA identifiziert. Auf die gleiche Weise war die Fraktion 2 eine, in der ein GN an den M3 Kern gebunden war, sie wurde nämlich mit einer Mischung aus vier Oligosacchariden, d. h. I-PA, V-PA, VI-PA und XII-PA, identifiziert; die Fraktion 3 war eine, in der 2 GN's an den M3 Kern gebunden waren, sie wurde nämlich mit einer Mischung aus sechs Oligosacchariden und zwar II-PA, III-PA, VII-PA, IX-PA, XIII-PA und XIV-PA identifiziert; die Fraktion 4 war eine, in der drei GN's an den M3 Kern gebunden waren, sie wurde nämlich mit einer Mischung aus vier Oligosacchariden identifiziert nämlich VIII-PA, X-PA, XI-PA und XV-PA; der Peak aus Fraktion 5 bei 44,0 min. war einer, in dem vier GN's an den M3 Kern gebunden sind, er war nämlich mit XVI-PA identifiziert worden.
Der Peak aus Fraktion 1 bei 15,4 min (IV-PA) und der aus Fraktion 5 bei 44,0 Minuten (XVI-PA) traten auch bei HPLC mit PALPACK^® TYPE R als einzelne Peaks bei 12,0 Minuten bzw. 15,7 Minuten auf [Eluens: Essigsäure/Triethylamin (pH 4,0) mit 0,07 % 1-Butanol; die übrigen Bedingungen waren gleich denen aus Kondition 1 (nachfolgend bezeichnet als „Kondition 3")].
Bei Auftrennung von Fraktion 2 durch HPLC unter Kondition 3 eluierte VI-PA bei 11,2 Minuten, XII-PA bei 12,8 Minuten, I-PA bei 15,2 Minuten und V-PA bei 20,7 Minuten. Das Muster ist in 3 dargestellt. Bei Analyse von Fraktion 3 unter Kondition 1 durch HPLC, eluierte XIII-PA bei 15,0 Minuten, IX-PA bei 16,8 Minuten, III-PA bei 25,2 Minuten, XIV-PA bei 25,9 Minuten, bei VII-PA 26,7 Minuten, und II-PA bei 42,5 Minuten. Das Muster ist in 5 dargestellt. Bei Analyse von Fraktion 4 durch HPLC unter Kondition 3 eluierte XV-PA bei 10,4 Minuten, X-PA bei 13,3 Minuten, XI-PA bei 17,6 Minuten und VIII-PA bei 25,9 Minuten. Das Muster ist in 4 dargestellt. Folglich konnten 16 verschiedene der PA-Oligosaccharide I-PA bis XVI-PA getrennt werden.
Die jeweiligen Peaks wurden wie folgt identifiziert. I-PA, II-PA und III-PA aus Beispiel 1 und kommerziell erhältliche IV-PA, V-PA, VI-PA, VII-PA, VIII-PA and XVI-PA wurden als die Standardzuckerketten verwendet. Durch Vergleich der Elutionspositionen der Peaks wurde der Peak bei 15,4 Minuten in 2 mit IV-PA identifiziert, der bei 44,0 Minuten in 2 mit XVI-PA, der bei 11,2 Minuten in 3 mit VI-PA, der bei 15,2 Minuten in 3 mit I-PA, der bei 20,7 Minuten in 3 mit V-PA, der bei 25,9 Minuten in 4 mit VIII-PA, der bei 25,2 Minuten in 5 mit III-PA, der bei 26,7 Minuten in 5 mit VII-PA und der bei 42,5 Minuten in 5 mit II-PA.
Der Peak bei 12,8 Minuten in 3 wurde mit XII-PA identifiziert, basierend auf der Erkenntnis, daß bei Rückgewinnung und darauf folgender Behandlung mit β-N-Acetylglucosaminidase aus Rinderniere der M3 Kern gebildet wurde, das Ausgangsmaterial XVI-PA war und daß drei andere Oligosaccharide zu verschiedenen Zeiten eluiert wurden.
Betreffend die Peaks der verbleibenden sechs Oligosaccharide wurde jeder von ihnen fraktioniert und durch ein Verfahren identifiziert, welches unten beschrieben wird. Der Peak bei 25,9 Minuten in 5 wurde wie folgt behandelt: Bei vollständigem Verdau von Fraktion 3 mit β-1,2-bindungsspezifischer β-N-Acetylglucosaminidase aus D. pneumoniae und anschließender Behandlung durch HPLC unter der Kondition 1 verschwanden die Peaks bei 25,2 Minuten (III-PA) und bei 26,7 Minuten (VII-PA) (d. h. sie wurden zu I-PA bzw. IV-PA hydroly siert), so daß nur der Peak bei 25,9 Minuten (6) zurückblieb, der zurückgewonnen wurde.
Die Oligosaccharide der jeweiligen auf diese Weise fraktionierten Peaks wurden teilweise mit β-N-Acetylglucosaminidase aus Rinderniere verdaut und dann durch HPLC unter Kondition 2 behandelt, um eine Fraktion abzutrennen, in der ein GN an den M3 Kern gebunden ist. Die auf diese Weise zurückgewonnene Fraktion wurde dann mit HPLC unter der Kondition 3 analysiert. Da V-PA, VI-PA und XII-PA im Verdauprodukt des Peaks bei 10,5 Minuten in 4 entdeckt wurden, wurde der Peak mit XV-PA identifiziert. Und da I-PA, V-PA und XII-PA im Verdauprodukt des Peaks bei 13,3 Minuten in 4 entdeckt wurden, wurde der Peak mit X-PA identifiziert. Weiter, da I-PA, VI-PA und XII-PA im Verdauprodukt des Peaks bei 17,6 Minuten in 4 entdeckt wurden, wurde der Peak mit XI-PA identifiziert: Da V-PA und XII-PA im Verdauprodukt des Peaks bei 15,0 Minuten in 5 entdeckt wurden, wurde der Peak mit XIII-PA identifiziert. Da VI-PA und XII-PA im Verdauprodukt des Peaks bei 16,8 Minuten in 5 entdeckt wurden, wurde der Peak mit IX-PA identifiziert. Da I-PA und XII-PA im Verdauprodukt des Peaks bei 25,9 Minuten in 6 entdeckt wurden, wurde der Peak mit XIV-PA identifiziert.
Beispiel 3
(1) Eine Mischung aus 2,5 μmol CMP-Sialinsäure (Cytidine-5'-monophospho-N-acetylneuraminsäure, CMP-NANA; Sigma) mit 850 nmol vierantenniger Asialozuckerkette (asialosugar chain; PA-Sugar Chain 004; Takara Shuzo) wurde mit 0,1 U α-2,6-Sialyltransferase aus Rattenleber (Boehringer Mannheim) in 12,5 mM Cacodylat-Puffer (pH 6,8) mit 0,5 % Triton CF-54 bei 37 °C für 36 Stunden umgesetzt. Im Reaktionsverlauf wurden 16 Stunden und 24 Studen nach Start der Reaktion 2,5 μmol of CMP-NANA zu der Reaktionsmischung gegeben.
Die Reaktionsmischung wurde durch eine Sephadex^TM G-15-Säule entsalzt, die Fraktion mit der Zuckerkette wurde in eine monoQ^TM-Säule (Pharmacia) injiziert und eluiert mit einem Gradienten von 10 mM bis 100 mM Ammoniumacetat (pH 8,5). Eine Fraktion mit 3 mol Sialinsäure pro mol Zuckerkette wurde von den eluierten Fraktionen zurückgewonnen. Die Menge an rückgewonnener sialylierter Zuckerkette betrug 646 nmol.
500 nmol der rückgewonnenen sialylierten Zuckerkette wurden mit 100 U of Galactose-Oxidase aus Dactylium dendoroides (Takara Shuzo) in Anwesenheit von 4,7 mU of Catalase (Sigma) in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 37 °C für 2 Stunden umgesetzt.
Die Reaktionsmischung wurde auf einem kochenden Wasserbad für 10 Minuten behandelt, um die Reaktion zu beenden. Dann wurde 1 U Sialidase aus A. ureafaciens (Kyokuto Pharmaceutical) zu der Reaktionsmischung gegeben, um einen Verdau bei 37 °C für 2 Stunden durchzuführen. Dann wurden 250 U β-Galactosidase aus Aspergillus (Toyobo) zu der Reaktionsmischung gegeben, und die Reaktion wurde für 5,5 Stunden bei 37 °C fortgeführt.
Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde mit 5 N Natriumhydroxid auf etwa 11 eingestellt. 20 mg Natriumborhydrid (NaBH₄) wurden zu der Reaktionsmischung gegeben, die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehengelassen. Weitere 30 mg Natriumborhydrid wurden zu der Reaktionsmischung gegeben, die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehengelassen, um die Reduktion zu vervollständigen.
Die Reduktions-Reaktionsmischung wurde durch eine Sephadex^TM G-15-Säule entsalzt und dann in eine PALPAK^® TYPE R Säule injiziert. Die Elu tion wurde mit 0,1 % 1-Butanol and 0,05 % Trifluoressigsäure durchgeführt, der Hauptpeak bei 30 Minuten wurde zurückgewonnen. Die resultierende Zuckerkette war XVI-PA, in dem β-1,6-gebundenes GN mit Gal geschützt ist. Die Menge an rückgewonnener Zuckerkette betrug 300 nmol.
Ein Teil (250 nmol) der geschützten, auf diese Weise erhaltenen Zuckerkette wurde mit 2,5 U N-Acetylglucosaminidase aus Rinderniere in 50 mM Citratpuffer (pH 5,0) in Anwesenheit von 50 mM D-(+)-Galactono-1,4-lacton (Nacalai Tesque) verdaut. Nach der Reaktion für 3,5 Stunden wurde die Reaktionsmischung für 10 Minuten auf einem kochenden Wasserbad behandelt, um die Reaktion zu beenden.
Die Reaktionsmischung wurde durch eine Sephadex^TM G-15-Säule entsalzt, und drei Fraktionen wurden über HPLC nach den unten beschriebenen Konditionen zurückgewonnen, abhängig von der Anzahl der an den M3 Kern gebundenen GN-Einheiten (Fraktion A mit einer gebundenen GN-Einheit, Fraktion B mit zwei gebundenen GN-Einheiten und Fraktion C mit drei gebundenen GN-Einheiten). Das HPLC-Spektrum wird in 21 gezeigt.

HPLC Konditionen:
Chromatograph: LC 6A (Shimadzu),
Säule: Asahi PAK^® NH₂ P-50 (6,0 mm Durchmesser × 150 mm) (Asahi Chemical Industry),
Eluens A: 50 mM Essigsäure/Triethylamin mit 75 % Acetonitril (pH 7,3),
Eluens B: 50 mM Essigsäure/Triethylamin mit 50 % Acetonitril (pH 7,3),
Elution: Gradientenelution, wobei der Anteil an Eluens B über 100 Minu ten von 10 % auf 25 % erhöht wurde,
Detektion: Fluoreszenz-Detector RF-535 (Shimadzu),
Anregungswellenlänge: 315 nm,
Fluoreszenzwellenlänge: 380 nm,
Flußrate: 1 ml/min, und
Säulentemperatur.: 40 °C.

Jede Fraktion wurde mit 7,3 U β-Galactosidase aus Aspergillus bei 37 °C für 15 Stunden verdaut. Dann wurde die Verdaumischung für 10 Minuten auf einem kochenden Wasserbad für 10 Minuten behandelt, um die Reaktion zu beenden, und die Reaktionsprodukte wurden durch HPLC, deren Konditionen unten beschrieben sind, aufgetrennt. XII-PA (23,6 Minuten) wurde aus dem Reaktionsprodukt von Fraktion B zurückgewonnen, IX-PA (21,4 Minuten) und XIV-PA (31,3 Minuten) aus dem von Fraktion B und XV-PA (18,9 Minuten), X-PA (25,4 Minuten) und XI-PA (33,4 Minuten) aus dem von Fraktion C.

HPLC Konditionen:
Chromatograph: LC 6A (Shimadzu),
Säule: YMC Pack AM (10 mm Durchmesser × 150 mm) (YMC)
Eluens: 0,05 % Trifluoressigsäure mit 0,1 % 1-Butanol,
Detektion: Fluoreszenzdetektor RF-535 (Shimadzu)
Anregungswellenlänge: 320 nm,
Fluoreszenzwellenlänge: 400 nm,
Flußrate: 2 ml/min, und
Säulentemperatur: 40 °C.

Dann wurde jeder der sechs aufgereinigten Oligosaccharide IX-PA, X-PA, XI-PA, XII-PA, XIII-PA und XIV-PA durch Massenspektrometrie mit einem API-III Massenspektrometer, NMR-Spektroskopie (in D₂O) mit einem 500 MHz Protonenkernresonanzspektrometer (JEOL) oder dem oben beschriebenen von Bruker (nur X-PA) und Monosaccharidanalyse nach saurer Hydrolyse analysiert.
Die Eigenschaften der entsprechenden Oligosaccharide werden unten angegeben. Weiterhin ist das ¹H-NMR-Spektrum von IX-PA in 14 dargestellt, das von X-PA in 15 und 16, das von XI-PA in 17, das von XII-PA in 18, das von XIII-PA in 19 und das von XIV- PA in 20. Die chemischen Verschiebungen in diesen ¹H-NMR-Spektren sind angegeben relativ zu der chemischen Verschiebung der Methylprotonen von Aceton, die bei 2,218 ppm liegt mit DSS als Standard. In den 14, 15, 17, 18, 19, und 20 ist das Signal bei 2,218 ppm das der Methylprotonen von Aceton in D₂O bei 37 °C, das als interner Standard verwendet wurde.
Die Referenznummern der Zuckerreste im ¹H-NMR-Spektrum entsprechen denen der oben dargestellten chemischen Formel (11):
(Eigenschaften von IX-PA)

Molgewicht 1395,0 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.552 (H-1, GN-7'), 4.535 (H-1, GN-5), 2.046 (NAc, GN-7'), 2.046 (NAc, GN-5)
Zucker Man: GN = 3.0 : 3.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von X-PA)

Molgewicht 1599,0 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.528 (H-1, GN-7'), 4.549 (H-1, GN-5'), 4.557 (H-1, GN-7), 2.028 (NAc, GN-7'), 2.038 (NAc, GN-5'), 2.067 (NAc, GN-7)
Zucker Man: GN 3.0 : 4.5 frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von XI-PA)

Molgewicht 1598,0 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.546 (H-1, GN-7'), 4.515 (H-1, GN-7), 4.529 (H-1, GN- 5), 2.045 (NAc, GN-7'), 2.065 (NAc, GN-7), 2.045 (NAc, GN-5)
Zucker Man: GN = 3.0 : 4.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von XII-PA)

Molgewicht 1191,5 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.542 (H-1, GN-7'), 2.043 (NAc, GN-7'),
Zucker Man: GN = 3.0 : 3.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von XIII-PA)

Molgewicht 1395,0 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.530 (H-1, GN-7'), 4.548 (H-1, GN-5), 2.027 (NAc, GN-7'), 2.038 (NAc, GN-5')
Zucker Man: GN = 3.0 : 3.5, frei von Gal und Fuc.

(Eigenschaften von XIV-PA)

Molgewicht 1395,0 (durch Massenspektrometrie)
¹H-NMR 4.545 (H-1, GN-7'), 4.556 (H-1, GN-7), 2.043 (NAc, GN-7'), 2.065 (NAc, GN-7)
Zucker Man: GN = 3.0 : 3.5, frei von Gal und Fuc.

(2) Zweidimensionale Kartierung der Oligosaccharide I-PA to XVI-PA:
500 fmol von jedem der 16 PA-Oligosaccaride I-PA to XVI-PA wurden durch HPLC mit zwei verschiedenen Säulen analysiert, PALPAK^® TYPE N Säule [Kondition 2] und PALPAK^® TYPE R Säule [Eluens: 100 mM Essigsäure/Triethylamin (pH 4,0) mit 0,02 % 1-Butanol; die anderen Konditionen waren gleich denen unter Kondition 1 (nachfolgend bezeichnet als Kondition 4)]. Die Elutionsprofile der Mischung der 16 PA-Oligosaccharide auf den zwei Säulen wurden in 7 gezeigt. Die Elutionsposition von jedem der PA-Oligosaccharide auf den zwei Säulen wurde geplottet, und auf diese Art wurde die zweidimensionale Karte hergestellt. 7 zeigt auch die zweidimensionale Zuckerkarte. Ein Reaktionsendprodukt dieser Erfindung kann leicht durch Verwendung dieser zweidimensionalen Zuckerkarte identifiziert werden. Die durch „reversed-phase"-HPLC (PAL-PAK^® TYPE R Säule) erhaltenen Elutionszeiten wurden jeweils auf der Ordinate aufgetragen, die durch „size fractionation"-HPLC [HPLC-Fraktio nierung nach der Größe] (PALPAK^® TYPE N Säule) erhaltenen jeweils auf der Abszisse.
Beispiel 4
Herstellung eines Kits zur Bestimmung der Zuckerkettenstruktur:
Kits 1 and 2 zur Bestimmung der Struktur von Zuckerketten vom N-Acetyllactosamintyp wurden hergestellt (Tabellen 3 und 4).
Die Oligosaccharide IV-PA, VII-PA, VIII-PA und XVI-PA, die in den Kits enthalten sein sollen, waren die oben erwähnten hergestellt von Takara Shuzo. Ebenso waren die Oligosaccharides V-PA and VI-PA die von Nakano Vinegar hergestellten.
Die Oligosaccharide IX-PA bis XV-PA wurden durch das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren erhalten oder durch partielle Hydrolyse der Oligosaccharide XVI-PA mit N-Acetylglucosaminidase aus Rinderniere, gefolgt von Aufreinigung durch HPLC nach dem in Beispiel 2-(2) beschriebenen Verfahren.
Tabelle 3
Tabelle 4
Beispiel 5
Fetuin aus Rind ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 48.000, etwa 22 Gew.-% davon enthalten Zuckerketten. Die Struktur der Zuckerketten des Fetuin wurden genau analysiert, so daß es für die Verwendung bei der Untersuchung der Zuckerketten von Glycoproteinen geeignet ist. Die wichtigsten Asparagin bindenden Zuckerketten des Fetuin haben eine derartige Struktur, daß 0 – 5 SA's an die Struktur von XXII oder XXIII in Tabelle 5 gebunden sind. Die Struktur des Fetuin variiert abhängig von der Anzahl, dem Ort und der Art der SA-Bindung. Da die meisten der verschiedenen Strukturen des Fetuin durch die Formel (6) dargestellt werden, konnten sie mit dem erfindungsgemäßen Kit analysiert werden.
(1) Herstellung einer Zuckerkette aus Fetuin aus Rind
1 g Fetuin aus Rind (Takara Shuzo) wurde mit Hydrazin behandelt, das Produkt wurde dann N-acetyliert, um eine freie Zuckerkettenfraktion zu erhalten. Diese Fraktion wurde mit 2-Aminopyridin markiert. Überschüs sige Reagenzien wurden mit einer SephadexTM G15 Säule (Pharmacia) entfernt, um die PA-Zuckerkette zu erhalten, die einer Chromatographie mit DEAE Toyopearl^TM 650 M Säule (18 mm Durchmesser × 250 mm; Tosoh) equilibriert mit 10 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 9,0) zur Durchführung einer Elution mit dem NaCl-Konzentrationsgradienten von 0 bis 100 mM unterworfen wurde.
Folglich wurde die PA-Zuckerkette in 5 Fraktionen aufgeteilt, in denen 0 bis 4 SA's an jedes Molekül gebunden waren. Von den 5 Fraktionen wurde eine Fraktion mit 1 SA und eine andere Fraktion mit 2 SA's verwendet. Ein Teil (1/100) jeder Fraktion wurde durch HPLC aufgetrennt [Eluens: 50 mm Essigsäure/Triethylamin (pH 5,0) mit 0,15 % 1-Butanol] mit einer „reversed phase"-Säule Cosmosil^TM 5C₁₈AR (4,6 mm Durchmesser x 250 mm; Nacalai Tesque). Ein Peak bei 40 Minuten wurde aus der Fraktion mit einem gebundenen SA aufbereitet, Peaks bei 38, 48 und 72 Minuten wurden aus der mit 2 gebundenen SA's aufbereitet, sie wurden dann weiter aufgereinigt durch HPLC mit ASAHIPAK^® NH₂ P50. Die Zuckerkette mit 2 SA's in der Fraktion bei 48 Minuten, die mit 2 SA's bei 38 Minuten, die mit 1 SA bei 40 Minuten und die mit 2 SA's bei 72 Minuten werden als A, B, C sowie D bezeichnet. Jede Zuckerkette wurde zur Herstellung einer Probenlösung jeweils in 100 μl destilliertem Wasser gelöst.
(2) Bestimmung der Struktur von Zuckerkette A
Der folgende Arbeitsgang wurde mit Kit 1 aus Beispiel 4 durchgeführt:

(Reaktion 1) 4 μl von Reagenz 2, 4 μl von Reagenz 3, 4 μl von Reagenz 5 und 3 μl destilliertes Wasser wurden zu 4 μl der Probe gegeben, um eine Reaktion bei 37 °C für eine Dauer von 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde bei 100 °C für 10 Minuten behandelt, 2 μl des resultierenden Produkts wurden durch HPLC unter Kondition 1 analysiert.
(Reaktion 2) 4 μl von Reagenz 2, 4 μl von Reagenz 5, 4 μl von Reagenz 7 und 3 μl destilliertes Wasser wurden zu 5 μl der Probe gegeben, um eine Reaktion bei 37 °C für 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, 2 μl von Reagenz 3 und 2 μl von Reagenz 5 wurden zu der Mischung gegeben zur Durchführung einer Reaktion für weitere 5 Stunden. Die Reaktionsmischung wurde bei 100 °C für 10 Minuten behandelt, dann wurden 2 μl des Produkts auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durch HPLC analysiert.
(Reaktion 3) 4 μl von Reagenz 2, 4 μl von Reagenz 4, 4 μl von Reagenz 5 und 4 μl von Reagenz 7 wurden zu 5 μl der Probe gegeben, um eine Reaktion bei 37 °C für eine Dauer von 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, 2 μl von Reagenz 3 und 2 μl von Reagenz 5 wurden zu der Mischung gegeben, um eine Reaktion für weitere 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, dann wurden 2 μl des Produkts auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durch HPLC analysiert.

Ergebnisse
Die Reaktionsmischung aus Reaktion 1 wurde analysiert, wobei herausgefunden wurde, daß das Produkt VIII-PA war, wie aus seiner Elutionszeit geschlossen wurde. Dies deutet darauf hin, daß Gal der Zuckerkette A mit β-1,4-bindungsspezifischer β-Galactosidase, also dem in der Reaktion 1 verwendeten Reagenz 5, vollständig entfernt worden war. Alle die Gal-Bindungen der Zuckerkette A waren nämlich β-1,4-Bindungen. Folglich wurde die Zuckerkette (A) als eine identifiziert, in der I₁=m₁=m'₁=m'₂=m'₃=m'₄=q=p₁=p₂=p₃=p₄=0 und I₂=I₃=I₄=m₂=m₃=m₄=1 in der Formel (6) ist. Dann wurde die Reaktionsmischung aus Reaktion 2 analysiert, wobei herausgefunden wurde, daß das Produkt III-PA war, wie aus seiner Elutionszeit geschlossen worden war. Folglich wies die Zuckerkette A SA an zwei Gal's auf, welche an zwei GN's am α-1,3-gebundenen Man des PA-Oligosaccharids XXII (XXII-PA) aus Tabelle 5 gebunden waren. Und zwar ist n₁=n₂=n'₁=n'₂=0 und n₃+n'₃=n₄+n'₄=1 in der Formel (6). Danach wurde die aus der Reaktion 3 erhaltene Reaktionsmischung analysiert, wobei herausgefunden wurde, daß das Produkt etwa 80 % VI-PA und etwa 20 % III-PA enthielt, wie aus deren Elutionszeiten geschlossen worden war. Folglich wurde bestimmt, daß die Zuckerkette A zu etwa 20 % aus Ketten besteht, in denen SA an beide der zwei Gal's, an die SA gebunden ist, wie durch die oben stehenden Ergebnisse bewiesen wurde, α-2,6-gebunden vorliegt, in anderen Worten, worin n₃=1 und n₄=1, und zu etwa 80 % aus Ketten, in denen SA an das einzige Gal, das an GN (β1-2)Man(α-3) gebunden ist, α-2,6-gebunden ist, in anderen Worten, worin n₃=0 und n₄=1. Als ein Ergebnis wurde bestimmt, daß die Zuckerkette A eine Mischung aus XXIV-PA und XXV-PA im Verhältnis von etwa 4:1 ist, wobei die Strukturen jeweils in Tabelle 5 gegeben sind.
(3) Bestimmung der Struktur von Zuckerkette B
Der folgende Arbeitsgang wurde mit Kit 1 aus Beispiel 4 durchgeführt:

(Reaktion 1) 4 μl von Reagenz 2,4 μl von Reagenz 3,4 μl von Reagenz 5 und 3 μl destilliertes Wasser wurden zu 5 μl der Probe gegeben, um eine Reaktion bei 37 °C für eine Dauer von 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, 2 μl des resultierenden Produkts wurden durch HPLC auf die gleiche Weise wie unter Punkt (2) analysiert.
(Reaktion 2) 4 μl von Reagenz 2,4 μl von Reagenz 5,4 μl von Reagenz 7 und 3 μl destilliertes Wasser wurden zu 5 μl der Probe gegeben, um eine Reaktion bei 37 °C für die Dauer von 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, dann 2 μl von Reagenz 3 und 2 μl von Reagenz 5 wurden zu der Mischung gegeben, um für weitere 5 Stunden eine Reaktion durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, dann wurden 2 μl des Produkts auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durch HPLC analysiert.
(Reaktion 3) 4 μl von Reagenz 2,4 μl von Reagenz 4,4 μl von Reagenz 5 und 4 μl von Reagenz 7 wurden zu 5 μl der Probe gegeben, um eine Reaktion bei 37 °C für eine Dauer von 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, und 2 μl von Reagenz 3 und 2 μl von Reagenz 5 wurden zu der Mischung gegeben, um eine Reaktion für weitere 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, dann wurden 2 μl des Produkts auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durch HPLC analysiert.

Ergebnisse
Die aus Reaktion 1 erhaltene Reaktionsmischung wurde analysiert, wobei herausgefunden wurden, daß das Produkt VII-PA war, wie aus seiner Elutionszeit geschlossen worden war. Demzufolge wurde die Zuckerkette B als eine bestimmt, worin I₁=I₃=m₁=m₃=m'₂=m'₃=q=p₁=p₂=p₃=p₄=0 und I₂=I₄=m₂=m₄=1 in der Formel (6). Dann wurde die aus Reaktion 2 erhaltene Reaktionsmischung analysiert, wobei herausgefunden wurde, daß das Produkt VII-PA war, wie aus seiner Elutionszeit geschlossen worden war. Folglich wurde die Zuckerkette B als eine bestimmt, die SA in beiden Gal's im PA-Oligosaccharid XXIII (XXIII-PA) in Tabelle 5 aufwies, mit anderen Worten, worin n₂+n'₂=n₄+n'₄=1 in der Formel (6).
Danach wurde die aus Reaktion 3 erhaltene Reaktionsmischung analysiert, wobei herausgefunden wurde, daß das Produkt VI-PA war, wie aus seiner Elutionszeit geschlossen worden war. Folglich wurde die Zuckerkette B als eine bestimmt, die α-2,6-gebundenes SA in der Verzweigung von Man aufwies, welche über eine α-1,3-Bindung in XXIII-PA gebunden war, in anderen Worten, worin n₂=0 und n₄=1. Als Ergebnis wurde bestimmt, daß die Zuckerkette B XXVI-PA in Tabelle 5 ist.
(4) Bestimmung der Struktur von Zuckerkette C
Der folgende Arbeitsgang wurde mit Kit 1 aus Beispiel 4 durchgeführt:

(Reaktion 1) 4 μl von Reagenz 2,4 μl von Reagenz 3,4 μl von Reagenz 5 und 3 μl destilliertes Wasser wurden zu 5 μl der Probe gegeben, um eine Reaktion bei 37 °C für die Dauer von 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde bei 100 °C 10 Minuten behandelt, 2 μl des resultierenden Produkts wurden auf die gleiche Weise wie unter Punkt (2) durch HPLC analysiert.
(Reaktion 2) 4 μl von Reagenz 2,4 μl von Reagenz 5,4 μl von Reagenz 7 und 3 μl destilliertes Wasser wurden zu 50 μl der Probe gegeben, um eine Reaktion bei 37 °C für 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, und 2 μl von Reagenz 3 und 2 μl von Reagenz 5 wurden zu der Mischung gegeben, um eine Reaktion für weitere 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, dann wurden 2 μl des Produkts auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durch HPLC analysiert.
(Reaktion 3) 4 μl von Reagenz 2, 4 μl von Reagenz 4, 4 μl von Reagenz 5 und 4 μl von Reagenz 7 wurden zu 5 μl der Probe gegeben, um eine Reaktion bei 37 °C für 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmi schung wurde bei 100 °C für 10 Minuten behandelt, und 2 μl von Reagenz 3 und 2 μl von Reagenz 5 wurden zu der Mischung gegeben, um eine Reaktion für weitere 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, dann wurden 2 μl des Produkts auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durch HPLC analysiert.

Ergebnisse
Die aus Reaktion 1 erhaltene Reaktionsmischung wurde analysiert, wobei herausgefunden wurde, daß das Produkt VIII-PA war, wie aus seiner Elutionszeit geschlossen worden war. Demzufolge wurde die Zuckerkette C als eine bestimmt, in der I₁=m₁=m'₁=m'₂=m'₃=m'₄=q=p₁=p₂=p₃=p₄=0 und I₂=I₃=I₄=m₂=m₃=m₄=1 in der Formel (6). Dann wurde die aus Reaktion 2 erhaltene Reaktionsmischung analysiert, wobei herausgefunden wurde, daß das Produkt etwa 50 % I-PA und etwa 50 % V-PA enthielt, wie aus deren Elutionszeiten geschlossen worden war. Folglich wurde bestimmt, daß die Zuckerkette C annähernd eine 1:1 Mischung eines Oligosaccharids war, indem SA an das Gal gebunden war, welches an GN(β1-4)Man(α1-3) von XXII-PA gebunden war, in anderen Worten, worin n₂=n₄=n'₂=n'₄=0 und n₃+n'₃=1 in der Formel (6) und eines Oligosaccharids, in dem SA an das Gal gebunden ist, das an GN(β1-2)Man(α1-6) gebunden war, in anderen Worten, n₃=n₄=n'₃=n'₄=0 und n₂+n'₂=1 in der Formel (6). Danach wurde die aus Reaktion 3 erhaltene Reaktionsmischung analysiert, wobei herausgefunden wurde, daß das Produkt IV-PA war, wie aus seiner Elutionszeit geschlossen worden war. Folglich wurde die Zuckerkette C als eine bestimmt, in der kein SA vorlag, das α-2,6 gebunden war, sondern in der die SA's alle α-2,3 gebunden vorlagen, in anderen Worten, worin n'₂=1 oder n'₃=1 in der Formel (6). Im Ergebnis wurde bestimmt, daß die aufgereinigte Zuckerkette C annähernd als 1:1 Mischung von XXVII-PA und XXVIII-PA in Tabelle 5 vorlag.
(5) Bestimmung der Struktur der Zuckerkette D
Der folgende Arbeitsgang wurde mit Kit 1 aus Beispiel 4 durchgeführt:

(Reaktion 1) 4 μl von Reagenz 2, 4 μl von Reagenz 3, 4 μl von Reagenz 5 und 3 μl destilliertes Wasser wurden zu 5 μl der Probe gegeben, um eine Reaktion bei 37 °C für die Dauer von 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, und 2 μl des erhaltenen Produkts wurden durch HPLC auf dieselbe Weise wie bei Punkt (2) analysiert.
(Reaktion 2) 4 μl Reagenz 2, 4 μl Reagenz 5, 4 μl Reagenz 7 und 3 μl destilliertes Wasser wurden zu 5 μl der Probe gegeben, um eine Reaktion bei 37 °C für die Dauer von 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, und 2 μl von Reagenz 3 und 2 μl von Reagenz 5 wurden zu der Mischung gegeben, um eine Reaktion für weitere 5 Stunden durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 100 °C behandelt, dann wurden 2 μl des Produkts auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durch HPLC analysiert.

Ergebnisse: Die aus Reaktion 1 erhaltene Reaktionsmischung wurde analysiert, wobei herausgefunden wurde, daß das Produkt VIII-PA war, wie aus seiner Elutionszeit geschlossen worden war. Demzufolge wurde die Zuckerkette D als eine bestimmt, in der I₁=m₁=m'₁=m'₂=m'₃=m'₄=q=p₁=p₂=p₃=p₄=0 und I₂=I₃=I₄=m₂=m₃=m₄=1 in der Formel (6). Dann wurde die aus der Reaktion 2 erhaltene Reaktionsmischung analysiert, wobei herausgefunden wurde, daß das Produkt II-PA war, wie aus seiner Elutionszeit geschlossen worden war. Folglich wurde die Zuckerkette D als eine bestimmt, in der SA an das Gal gebunden ist, das an GN(β1-4)Man(α1-3) gebunden ist, und auch SA an das Gal gebunden ist, das an GN(β1-4)Man(α1-6) von XXII-PA gebunden ist, in anderen Worten, worin n₂+n'₂=n₃+n'₃=1 in der Formel (6). Demzufolge wurde bestimmt, daß die Zuckerkette D XXIX-PA in Tabelle 5 ist.
Die Oligosaccharide XXII bis XXIX erfüllen die Bedingungen in Bezug auf die Variablen I_x, m_x, m'_x, n_x, n'_x, q und p_x (x = 1, 2, 3 oder 4) in der Formel (6), die in der folgenden Tabelle 5 angegeben sind. Und XXII-PA bis XXIX-PA werden durch jeweilige Markierung der Oligosaccharide XXII bis XXIX mit 2-Aminopyridin erhalten.
in der obigen Tabelle 5 bedeutet das Symbol (1), daß eine der zwei Variablen 1 ist und die andere ist 0.
Beispiel 6
Die Zuckerkettenfraktion wurde aus 1 mg α₁-Glycoproteinsäure (Sigma) durch Hydrazinolyse und N-Acetylierung erhalten.
Zur Entfernung von SA-Resten wurde die Fraktion mit 0.1 N HCl behandelt, dann wurde die Mischung auf einer Bio-Gel^TM-Säule P-4 (Bio-Rad) (25 mm × 900 mm × 2) chromatographiert. Zuckerketten wurden mit H₂O eluiert, die Fraktionen mit der Elutionsposition entsprechend der von Isomaltooligosaccharid (DP=21), das einen Polymerisationsgrad von 21 aufwies, wurden zusammengelegt und lyophilisiert. Die zusammengelegte Fraktion wurde mit 2-Aminopyridin markiert. PA-Oligosaccharide wurden durch HPLC mit einer Säule PALPAK^® TYPE R aufgereinigt, dann erhielt man die Zuckerkette E.
50 pmol der Zuckerkette E wurden mit 5 mU endo-β-Galactosidase aus Escherichia freundii für eine Dauer von 2 Stunden bei 37 °C verdaut, ein Teil wurde durch HPLC mit einer Amid-Silica-Säule [Anal. Biochem. 171, 73–90, (1988)] analysiert. Der Produktpeak wurde etwa 2.5 Glucoseeinheiten vor der Zuckerkette E eluiert. Diese Produkt wurde Zuckerkette F genannt.
Diesen Ergebnissen zufolge könnte Zuckerkette E eine N-Acetyllactosamin-Einheit in einer bestimmten Verzweigung der Zuckerkette nach Formel (6) mit den Variablen (I₁=I₂=I₃=I₄=m₂=m₃=m₄=1, der Rest war 0) haben, d. h. eine sogenannte vierantennige Zuckerkette. Endo-β-Galactosidase könnte Gal(β1-4)GN(β1-3)Gal aus der Zuckerkette E freisetzen und so Zuckerkette F erzeugen.
Die Verzweigung mit einer N-Acetyllactosamin-Einheit wurde mit Kit 2 aus Beispiel 4 bestimmt.

(Reaktion 1) Zuckerkette F, 10 pmol/5 μl, wurde mit 4 μl von Reagenz 2, 2 μl von Reagenz 5 und 9 μl destilliertem Wasser vermischt, die Mischung wurde für eine Dauer von 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nachdem die Mischung zum Abbruch der Reaktion für 10 Minuten bei 100 °C gekocht wurde, wurden 2 μl der Mischung durch HPLC unter den Konditionen von 2 und 4 analysiert.
(Reaktion 2) Zuckerkette F, 1 O pmol/5 μl, wurde mit 4 μl von Reagenz 2, 4 μl von Reagenz 7 und 7 μl destilliertem Wasser vermischt, die Mischung wurde für eine Dauer von 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nachdem die Mischung zum Abbruch der Reaktion für 10 Minuten bei 100 °C gekocht wurde, wurden 2 μl von Reagenz 5 zu der Mischung gegeben und die Mischung wurde für eine Dauer von 2 Stunden inkubiert. Nachdem die Mischung zum Abbruch der Reaktion für 10 Minuten bei 100 °C gekocht wurde, wurden 2 μl der Mischung durch HPLC unter den Konditionen von 2 und 4 analysiert.

Ergebnisse
Das Produkt aus Reaktion 1 wurde mit XVI-PA identifiziert als Folgerung aus der Elutionsposition des Produkts und der Standardzuckerkette in der HPLC unter den Konditionen von 2 und 4. Folglich sollte Zuckerkette F durch die Formel (6) mit den Variablen (I₁=I₂=I₃=I₄) dargestellt sein. Das Produkt aus Reaktion 2 wurde auf die gleiche Weise mit XI-PA identifiziert und demnach wurde die Zuckerkette F identifiziert mit einer Zuckerkette dargestellt durch Formel (6) mit den Variablen (m₁=m₂= m₄=1, m₂=0). Diesen Ergebnissen zufolge wurde Zuckerkette F durch die Formel (6) mit den Variablen (I₁=I₂=I₃=I₄=m₂=m₃=m₄=1, der Rest war 0) dargestellt. Die Ergebnisse zeigen auch, daß die N-Acetyllactosamin-Einheit an Gal gebunden war, das an GN(β1-4)GN(α1-6) gebunden war.
Wirkung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine genaueres, verläßlicheres und einfacheres Verfahren zur Bestimmung der Struktur von Zuckerketten bereit, einen Kit zur Verwendung für das genannte Verfahren und neue Oligosaccharide, die für das genannte Verfahren als Standards von Nutzen sind.

Claims

Ein Verfahren zur Bestimmung der Struktur einer Zuckerkette vom N-Acetyllactosamintyp, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsstelle und die Bindungsart von Zuckerresten an der nicht reduzierten terminalen Seite eines β-N-Acetylglucosaminrestes, der an einen α-Mannoserest in einem Pentasaccharidkern einer Zuckerkette vom N-Acetyllactosamintyp gebunden ist, bestimmt wird, (Formel 7) (M3 Kern) [Chemische Formel 7]
durch Mittel zur Ermittlung der Anwesenheit eines β-N-Acetylglucosaminrestes nach enzymatischer oder chemischer Behandlung dieser Zuckerkette.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte: 1) gezieltes Entfernen bestimmter β-N-Acetylglucosaminreste, die an einen α-Mannoserest in dem M3 Kern gebunden sind; 2) im Falle, daß das Produkt aus Schritt (1) einen verbliebenen Zuckerrest hat, der gebunden ist an das nicht reduzierte Ende von β-N-Acetylglucosaminresten, die an einen α-Mannoserest in dem M3-Kern gebunden sind, Entfernen dieses verbliebenen Zuckerrestes; und (3) Identifizierung der sich ergebenden Produkte aus Schritt (1) oder (2) durch ihren Vergleich mit Standardzuckerketten.
Ein Verfahren nach Anspruch 2, worin die β-N-Acetylglucosaminreste aus Schritt (1) keinen spezifischen Zuckerrest an der nicht reduzierten terminalen Seite haben, worin die Bindungsstelle und die Bindungsart des spezifischen Zuckerrestes bestimmt werden soll.
Ein Verfahren nach Anspruch 3, worin die Zuckerreste durch enzymatische Behandlung entfernt werden.
Ein Verfahren nach Anspruch 4, worin die enzymatische Behandlung Verdauung mit Glycosidasen ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 5, worin die Glycosidasen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus β-N-Acetylglucosaminidase, β-Galactosidase, Sialidase und α-Fucosidase sind.
Ein Verfahren nach Anspruch 6, worin mindestens eine der Glycosidasen eine bindungsspezifische Glycosidase ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 7, worin die bindungsspezifische Glycosidase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus β-1,3-bindungspezifischer β-Galactosidase, β-1,4-bindungsspezifischer β-Galactosidase, α-2,3-bindungsspezifischer Sialidase, α-2,6-bindungsspezifischer Sialidase, α-1,3/4-bindungsspezifischer α-Fucosidase und α-1,2-bindungsspezifischer α-Fucosidase ist
Ein Verfahren nach Anspruch 2, worin die β-N-Acetylglucosaminreste aus Schritt (1) einen spezifischen Zuckerrest an der nicht reduzierten terminalen Seite haben, worin die Bindungsstelle und die Bindungsart des spezifischen Zuckerrestes bestimmt werden soll.
Ein Verfahren nach Anspruch 9, worin die Zuckerreste durch enzymatische Behandlung entfernt werden.
Ein Verfahren nach Anspruch 10, worin die enzymatische Behandlung Verdauung mit Glycosidasen ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 11, worin die Glycosidasen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus β-N-Acetylglucosaminidase, β-Galactosidase, Sialidase, α-Fucosidase, Lacto-N-Biosidase und Endo-β-Galactosidase sind.
Ein Verfahren nach Anspruch 12, worin mindestens eine der Glycosidasen eine bindungsspezifische Glycosidase ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 13, worin die bindungsspezifische Glycosidase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus β-1,3-bindungsspezifischer β-Galactosidase, β-1,4-bindungsspezifischer β-Galactosidase, α-2,3-bindungsspezifischer Sialidase, α-2,6-bindungsspezifischer Sialidase, α-1,3/4-bindungsspezifischer α-Fucosidase und α-1,2-bindungsspezifischer α-Fucosidase ist.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, umfassend den Schritt der Identifizierung der sich ergebenden Produkte aus Schritt (1) oder (2) durch ihren Vergleich mit Standardzuckerketten der folgenden chemischen Formel:
worin X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ und X₆ Wasserstoff oder einen β-N-Acetylglucosaminrest darstellen und R₁ durch die folgende Formel 2 oder 3 dargestellt wird: [chemische Formel 2]
[chemische Formel 3]
worin R₂ eine Aldehydgruppe, eine markierte Methylengruppe oder eine markierte Methingruppe darstellt.
Ein Kit zur Verwendung in der Bestimmung von Zuckerkettenstrukturen nach einem der Ansprüche 1 bis 15, umfassend: (i) eine Reagenz, die enzymatisch oder chemisch Zweige entfernt, die nicht einen der Zuckerreste Gal, SA oder Fuc von der Zuckerkette haben, und (ii) mindestens eine Standardzuckerkette entsprechend der Formel:
worin X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ und X₆ Wasserstoff oder einen β-N-Acetylglucosaminrest darstellen und R₁ durch die folgende chemische Formel 2 oder 3 dargestellt wird: [chemische Formel 2]
[chemische Formel 3]
worin R₂ eine Aldehydgruppe, eine markierte Methylengruppe oder eine markierte Methingruppe ist.
Ein Kit nach Anspruch 16, weiter umfassend ein zweites Oligosaccharid dargestellt durch die folgende chemische Formel:
worin X₁, X₂, X₃ und X₄ Wasserstoff oder einen β-N-Acetylglucosaminrest darstellen und R₁ durch die folgende chemische Formel 2 oder 3 dargestellt wird: [chemische Formel 2]
[chemische Formel 3]
worin R₂ eine Aldehydgruppe, eine markierte Methylengruppe oder eine markierte Methingruppe darstellt.
Ein Oligosaccharid dargestellt durch die folgende chemische Formel:
worin X₁, X₂, X₃ und X₄ Wasserstoff oder einen β-N-Acetylglucosaminrest darstellen und R₁ durch die folgende chemische Formel 2 oder 3 dargestellt wird: [chemische Formel 2]
[chemische Formel 3]
worin R₂ eine Aldehydgruppe, eine markierte Methylengruppe oder eine markierte Methingruppe darstellt; mit den zwei Bedingungen, dass (i) die Fälle ausgeschlossen sind, wo beide X₁ und X₃ gleichzeitig Wasserstoff darstellen, und (ii) die Fälle ausgeschlossen sind, wo beide X₂ und X₄ gleichzeitig β-N-Acetylglucosaminreste darstellen.
Ein Oligosaccharid nach Anspruch 18, worin R₁ dargestellt ist durch die chemische Formel 3.
Ein Oligosaccharid nach Anspruch 19, worin R₂ eine markierte Methylengruppe darstellt.
Ein Oligosacchard nach Anspruch 20, worin die markierte Methylengruppe eine mit 2-Aminopyridin markierte Methylengruppe ist.