JPH06506830A - オリゴ糖の配列決定 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 オリゴ環の配列決定 本発明は、オリゴ環の分析に関し、さらに詳しくは、オリゴ環の配列決定として 知られている分析の形態に関する。

本発明の１つの態様は、オリゴ糖体（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｅｎｔ ｉｔｙ）に適用されるべき配列決定因子の選択手段からなるオリゴ環の配列決定 用装置を提供するものである。

本発明のもう１つの態様は、オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手 段の使用を含むオリゴ環の配列決定方法を提供するものである。

オリゴ糖体は、例えば、オリゴ環、またはオリゴ環の生成物、またはオリゴ糖部 分を有する種である。オリゴ環の生成物は、例えば、予め、オリゴ環に配列決定 因子を適用することによって生成された生成物であってもよい：例えば、該生成 物は、それ自体、オリゴ環であってもよい。

オリゴ環は、グリコンド結合によって一緒に結合された多数の単糖単位から作ら れる化学化合物のクラスを形成する。重要な天然オリゴ糖源は、糖がＮ−グリコ ノド結合またはＯ−グリコノド結合のいずれかによってペプチド鎖に結合してい る糖タンパクである。これらのオリゴ環は、数個の単糖単位から、多くの（例え ば、３０を超える）単糖単位を含有する非常に枝別れした構造まで変化する。

オリゴ環の「配列決定」は、（ｉ）オリゴ環の各単糖単位のタイプ、（ｕ）単糖 単位がオリゴ環中で配列される順序、（伝）各単糖単位間の結合位置（例えば、 １−３．１−４など）、および、故に、いずれかの分枝パターン、および／また は（ｔｖ）各単糖単位間の結合の配位（すなわち、結合がα結合またはβ結合の Ｌｌずれであるか）のようなオリゴ環の構造に関するある情報を導き出すことに 関係する。

オリゴ環の構造に関するできる限り多くの情報を得ることが望ましい場合、オリ ボ糖の「配列決定」を行い、包括的に前記した特徴（ｉ）〜（汁）に関してでき る限り多くの情報を得ることができる。

オリゴ糖体に適用される場合に包括的に特徴（ｉ）〜（ｔｖ）のい（っがまたは 全てに関する情報を得ることを助ける因子は、「配列決定因子」とみなされる。

例えば、配列決定因子は、物理的因子または化学的因子である。物理的配列決定 因子の例は、分子量決定のためのプロトンｎ、ｍ、ｒ、、炭素−１３ｎ、ｍ、ｒ 、および質量分析である。

また、例えば、配列決定因子は、化学的結合の切断を生じることが可能であるか 、または、化学的結合の形成を生じることが可能である。

例えば、配列決定因子が化学試薬（例えば、化学試薬または生化学試薬であって もよい）である場合、配列決定因子は、配列決定試薬とみなされる。配列決定試 薬の例は、前記オリゴ糖の構造に関する情報を得ることを助けるオリゴ糖の化学 的切断および／またはオリゴ糖の化学的修飾を行うことが可能な酵素（例えば、 エキソグリコンダーゼおよびエンドグリコンダーゼ）および化学試薬（例えば、 過ヨウ素酸塩）である。

前記のとおり、オリゴ糖体は、例えば、オリゴ糖、またはオリゴ糖の生成物、ま たはオリゴ糖部分を有する種である。

かくして、例えば、かかるオリゴ糖が、本発明に従って配列決定に付され：さら に、例えば、別法としては、オリゴ糖の生成物が、本発明にしたがって配列決定 に付されると解されるべきである。（生成物はオリゴ糖自体であると解される。

）別法としては、例えば、オリゴ糖部分を有する種のオリゴ糖部分として提供さ れるオリゴ糖（例えば、コンジュゲートに結合したオリゴ糖）は、本発明にした がって配列決定に付される。糖タンパクおよび糖脂質は、オリゴ糖が配列決定に 付されるように本発明に従って配列決定に付されるオリゴ糖からなる一部分を有 する種の例である。

か（して、さらに、例えば、オリゴ糖は、所望により、そのコンジュゲートに結 合されている場合でさえ（例えば、ペプチド鎖）、コンジュゲートが許容されな い程度には配列決定を妨害しないことを条件に、本発明に従って配列決定される 。

前記から、例えば、配列決定に付されるべきオリゴ糖は、好適な形態で、かつ、 好適な手段で提供されると解される。

また、前記から、本発明のオリゴ糖の配列決定は、例えば、オリゴ糖、またはそ の生成物、またはオリゴ糖部分を有する種に配列決定因子を適用することを含む と解される。

配列決定試薬として使用される酵素の例を第１表に示す。

第１表には、一般にＮ−結合オリゴ糖からの単糖類の切断に使用される酵素のリ スト、ならびに、単糖類がこれらの酵素の各々によって切断され、オリゴ糖構造 切断の部分を予想することができることを示すルールを示す。

オリゴ糖の個々の結合または結合の切断を行うことができる配列決定因子は、オ リゴ糖に対して特異的形質転換を行うことができる因子である。

配列決定因子は、オリゴ糖体に適用される（例えば、化学的または生化学的試薬 の場合にはオリゴ糖体と接触させた）場合に得られる反応生成物がオリゴ糖体に おける個々の構造的サブユニット（例えば、単糖単位）の存在または不在を明ら かにするように選択されると解される。

第　１　表（続き） かくして、本発明の１つの具体例は、オリゴ糖体に配列決定因子を適用し、次い で、配列決定因子によってオリゴ糖体がら放出されたオリゴ糖体の成分について 分析することからなるオリゴ糖の配列決定方法を提供するものである。

本発明の前記具体例によると、それは、オリゴ糖体の構造に関する情報を得るた めに配列決定因子の適用後に分析されるオリゴ糖体ではないと解される。むしろ 、本発明の前記具体例によると、それは、「配列決定」を容易にするために、分 析されるオリゴ糖体から放出または切断される成分である。

かくして、例えば、分析を行う場合、切断反応の生成物中の個々の単糖からなる 成分の検出を使用して、オリゴ糖体の初期のオリゴ糖構造中の個々の結合および 単糖の存在を確認し得る。

本発明のもう１つの具体例は、オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択 手段、および配列決定因子によってオリゴ糖体がら放出されたオリゴ糖体の成分 について分析するための分析手段からなる装置を提供するものである。

オリゴ糖についての１組の可能な構造（すなわち、１組の「候補Ｊ　（ｃａｎｄ ｉｄａｔｅ）構造）は、いずれかの好適な方法で製造される。

例えば、１組の「候補」構造は、文献調査から引用した。

さらに、例えば、１組の「候補」構造は、単糖単位を一緒にゆだねることができ る置換を考慮することによって製造される。

別法としては、（以下に、さらに考慮する）構造および下位構造の概念を使用し て、未知のオリゴ糖に関する１組の候補構造を製造することもできる。

例えば、オリゴ糖体に種々の配列決定因子を連続して適用し、各配列決定因子の 使用によって得られた生成物を分析することによって、考慮がらある種の構造を 削除すること（すなわち、オリゴ糖体に関して仮定された１組の可能な「候補」 構造からある種の構造を削除すること）、および、ある種の構造の存在を確認し 、これによって、推論されるべきオリゴ糖体の構造に関する情報を得させること が可能であるとも解される。

かくして、例えば、オリゴ糖からなる所定のオリゴ糖体、または（オリゴ糖に配 列決定因子を予め適用することによって生成された生成物である）その生成物、 またはオリゴ糖部分を有する種に種々の配列決定因子を連続して適用し、各配列 決定因子の使用によって得られた生成物を分析することによって、考慮からある 種の構造を削除すること（すなわち、オリゴ糖に関して仮定された１組の可能な 「候補」構造からある種の構造を削除すること）、および、ある種の構造の存在 を確認し、これによって、推論されるべきオリゴ糖（例えば、オリゴ糖自体また はオリゴ糖部分を有する種のオリゴ糖部分であってもよい）の構造に関する情報 を得させることが可能であるとも解される。

オリゴ糖体のオリゴ糖構造の末端の個々の単糖の存在および結合は、例えば、所 定の配列決定因子（例えば、酵素（例えば、エキソグリコシダーゼ）のような生 化学的試薬）の、該結合を切断させることができる能力によって測定することが できる；かくして、切断が生じた場合、切断反応の反応生成物中の個々の単糖の 検出によって、初期のオリゴ糖構造中の該結合の存在が確認される。かくして、 既知の特異的結合切断能を有する多数の種々の配列決定因子を連続して使用する ことによって、分析下のオリゴ糖体の構造に関する多量の情報を推論することが 可能である。候補オリゴ糖構造間で区別することができる単一の配列決定因子を 見つけることができない場合、１つの因子を他の因子の後に適用することができ る２、３またはそれ以上の因子の組合せを考えることができる；各考察の段階で 、いずれかの１組の候補＃ｉ造に対する効果が全くない因子は削除される。同時 に２種類以上の因子の組合せを使用することは、配列決定分析を行うのに必要な 時間を短縮させ得るので、この組合せの使用も考えられる。

かくして、反復法を使用して、分析、１つの配列決定因子（または配列決定因子 の組合せ）の適用および次なる分析からなるサイクルを、入手可能な因子を用い てオリゴ糖体の構造に関してできる限り多（の情報を得るかまたはオリゴ糖体の 試料を使い尽くすまで、繰り返す。

前記から、ある環境下で、特定の配列決定因子は、オリゴ糖体と反応せず、これ によって、オリゴ糖体の構造に関して推論させるようには反応しないという事実 を可能にする生成物を与えると解される。

オリゴ糖体の配列決定の有効性は、配列決定の種々の段階で適用されるべき配列 決定因子の選択およびオリゴ糖体に所定の配列決定因子を適用した結果の解釈の 精度に左右されると思われる。

配列決定因子の良好な選択は、吟味されるオリゴ糖構造のタイプについていくつ かの知的推測を既に行ったことがある経験のあるオペレーターの技術に非常に左 右される。

配列決定因子のまずい選択の結果、配列決定因子の特定の適用によってさらなる 情報が全く明らかにされず、か（して、時間および物質を浪費させる。オペレー ターの偏見が結果の解釈のあいまいさを隠蔽するという危険性もある；例えば、 実際には、同一実験結果と一致する１種類以上の構造があるのに、オペレーター は、実験結果と一致する単一の構造を当てはめる。

入手可能な配列決定因子の使用によってさらなる情報を明らかにすることができ ない、配列決定におけるこの時点を定義することにおいて、さらなる困難性が生 じる。

糖タンパクから得られたオリゴ糖体（例えば、オリゴ糖）について、その配列決 定は、オリゴ糖構造を構築するのに関係する生合成経路の知識によって補助され る。かくして、例えば、Ｎ−結合オリゴ糖について、特徴的な核構造があり、さ らなる単糖類が、ある種のよく定義された順序および分枝パターンで付加される だけであることが知られている。

この知識を使用して、構造および下位構造の概念をオリゴ糖について発展させる ：これは、添付図面の第１図、第２図および第３図について以下にさらに検討す る。

例えば、本発明の配列決定に付されるオリゴ糖体がペプチド−Ｎ−グリコシダー ゼＦ酵素によって糖タンパクから放出されるオリゴ糖の混合物から得られたオリ ゴ糖である場合、オリゴ糖は、Ｎ−グリカンであり、その構造は、添付図面の第 １図、第２図または第３図の構造と同様の構造または添付図面の第１図、第２図 および第３図の構造と同様の構造から生じた下位構造であると思われる。

本発明の装置の１つの具体例では、装置は、オリゴ糖体への配列決定因子適用手 段、オリゴ糖体への配列決定因子の適用によって得られる生成物の分析のための 分析手段、オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段、およびオリゴ 糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段への分析手段からの分析結果の供 給手段からなる。

本発明の別の具体例では、装置は、前段に記載した装置の特徴の全てを含み、か つ、さらに、オリゴ糖体への、配列決定因子選択手段によって選択される配列決 定因子の適用手段からなる。

本発明の装置は、オリゴ糖体の予備分析を行うための手段も含む；この手段は、 所望により、オリゴ糖体に配列決定因子を適用することによって得られる生成物 を分析するための分析手段、またはその一部分であると思われる。かくして、所 望により、該分析手段は、オリゴ糖体からの単糖単位の検出を可能にするもので あると解されるべきである。

当該装置は、また、所望により、この予備分析の結果を、オリゴ糖体に適用され るべき配列決定因子の選択手段に供給する手段をも含む。

オリゴ糖体への配列決定因子の適用手段は、例えば、配列決定因子およびオリゴ 糖体を一緒に接触させるための手段（例えば、反応容器）からなる。

また、当該装置は、例えば、配列決定因子およびオリゴ糖体を一緒に接触させる 手段への配列決定因子供給手段を含む。

配列決定因子供給手段は、例えば、多数の配列決定因子を個々に供給するか、ま たは、例えば、配列決定因子を選択されたシーケンスまたは組合せで供給するよ うな手段である。

配列決定因子、または、配列決定因子の組合せは、好適な手段でオリゴ糖体に適 用される。

配列決定因子または配列決定因子の組合せを、好適な溶媒中で配列決定因子およ びオリゴ糖体を一緒に接触させるための手段に導入する。

所望により、例えば、配列決定に付されるべきオリゴ糖体を好適な支持体上に固 定化してもよい。

か（して、例えば、本発明の装置は、配列決定に付されるべきオリゴ糖体を固定 化する支持体を含む。

また、例えば、本発明の方法は、配列決定に付されるべきオリゴ糖体を支持体上 に固定化させる工程を含む。

オリゴ糖体は、例えば、好適な手段によって支持体上に固定化される。かくして 、例えば、オリゴ糖体がオリゴ糖またはその生成物である場合、固定化は、例え ば、オリゴ糖の還元末端を介する化学的付着（例えば、共有結合）によって行わ れる。

オリゴ糖、またはその生成物からなるオリゴ糖体は、例えば、支持体との直接共 有結合によって、または支持体との直接非共有（例えば、親水性）結合によって 、本発明に従って固定化される。

別法としては、例えば、オリゴ糖部分を有する種からなるオリゴ糖体は、配列決 定に付される前に支持体上に固定化される。

例えば、コンジュゲートに付着したまま、オリゴ糖またはその生成物を固定化さ せるのが望ましい場合、該コンジュゲートは、オリゴ糖またはその生成物がコン ジュゲートを介して支持体に間接的に結合されるように（例えば、共有結合また は非共有（例えば、親水性）結合によって）支持体に結合される。

オリゴ糖体が支持体上に固定化される場合、オリゴ糖体、または配列決定因子の 適用によって生成され、かつ、支持体上に維持されているその生成物は、配列決 定因子の適用によって生じた、（新しい還元末端を有する）種のような放出生成 物から容易に分離される。かくして、例えば、オリゴ糖体の生成物は、支持体上 に維持され、新しい還元末端を有する種は、好適な洗浄によって除去される。

本発明において有用な支持体の例としては、１．１′カルボニルジイミダゾール 活性化アカロースからなる固体支持体が挙げられる。

支持体上でのオリゴ糖体の固定化は、いずれかの好適な手段によって行われる。

か（して、例えば、オリゴ糖体がオリゴ糖またはオリゴ糖の生成物である場合、 支持体上でのオリゴ糖またはオリゴ糖の生成物の固定化は、以下の方法で行われ 非還元オリゴ糖＋２−アミノピリジン／　Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈｓ　ＣＮ→オリゴ〜ピ リジルアミノ誘導体→結合。

さらに、例えば、オリゴ糖体がオリゴ糖またはオリゴ糖の生成物である場合、オ リゴ糖またはその生成物は、以下の方法によって支持体上に固定化される。

非還元オリゴ糖＋ダンンルヒドラシン／ＴＦＡ→オリゴ−ダンシルヒドラジン誘 導体、 オリゴーダンシルヒドラシン誘導体＋Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４／　Ｈ２０→結合。

還元末端を介するオリゴ糖体の支持体への付着は、オリゴ糖体中に存在するいず れのオリゴ糖構造とも無関係であるのが好ましいと解されるべきである。当該付 着は、例えば、閉環配置に維持されるべき還元末端単糖を必要としない。

本発明の装置は、例えば、分析手段の使用前に、（例えば、反応容器中に形成さ れた）反応混合物から過剰の配列決定因子を除去することができる濾過手段（例 えば、クロマトグラフィー分離または他の化学的分離手段に関係する濾過カラム ）を含む。

本発明に有用な分析手段は、オリゴ糠中に存在する単糖類および／またはオリゴ 糖体に配列決定因子を適用することによって（例えば、配列決定因子およびオリ ゴ糖体を一緒にすることによって）生成された単糖類のタイプおよび相対量を測 定することができる検出器を含む。例えば、単糖類は、単糖類またはその誘導さ れた生成物として測定される。

本発明の装置は、例えば、フラッノング手段を含み、これによって、さらなる配 列決定因子の導入前に、配列決定因子およびオリゴ糖体を一緒に接触させる手を 維持するための手段を装置している。

本発明の分析に付されるべきオリゴ糖体は、例えば、好適な支持体上に固定化さ れることを前記した。しかしながら、さらに、例えば、オリゴ糖体は、かかる固 定化を伴わずに本発明の分析に付されてもよい：かくして、例えば、オリゴ糖体 は、溶液中、遊離状態のままで、配列決定因子、または、多数のもしくは一連の 配列決定因子をそれに適用した。

本発明の装置では、オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段は、例 えば、論理的な選択を行うことができるユニット（例えば、論理的ユニット）ま た、該ユニットは、分析手段によって生じた結果を解釈することができ、かつ、 オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子（または配列決定因子の組合せ）を選 択することができるようなユニットである。かくして、例えば、該ユニットは、 オリゴ糖体への配列決定因子（または、配列決定因子の組合せ）の適用、オリゴ 糖体の生成物であるオリゴ糖体への別の配列決定因子（または配列決定因子の組 合せ）の適用、またはオリゴ糖体もしくはオリゴ糖体の生成物であるオリゴ糖体 への別のもしくはさらなる配列決定因子（または配列決定因子の組合せ）の適用 を必要とすることができるようなものである。

例えば、本発明の装置は、実施において、前記のようなユニ・ントが分析される べきオリゴ糖体（固定化形態など）への配列決定因子の適用を制御し、検出器か らの出力を解釈してオリゴ糖体の未知のオリゴ糖構造の同定および配列決定のた めの完全に自動化された装置を提供するようなものである。

かくして、例えば、本発明の装置は、実施において、前記ユニットが分析される べきオリゴ糖体（固定化形態など）を含有する反応容器への配列決定因子の添木 発明の装置は、例えば、いずれかの好適な方法でオリゴ糖体のオリゴ糖構造の同 定および配列決定の結果が得られるように配置される。

本発明の方法の１つの具体例では、方法は、オリゴ糖体を分析し、オリゴ糖体に 配列決定因子を適用し、オリゴ糖体に配列決定因子を適用することによって得ら れる生成物を分析し、得られた分析結果を、オリゴ糖体と接触させるべき配列決 定因子の選択手段に供給することを含む。

本発明の方法の別の具体例では、方法は、前段に記載の方法の全ての工程を含み 、かつ、さらに、配列決定因子選択手段によって選択された配列決定因子をオリ ゴ糖体に適用する工程を含む。

本発明の方法は、また、配列決定因子の適用前に未知の構造のオリゴ糖体の予備 分析を行う工程を含んでもよい。

かかる分析の結果を、配列決定試薬決定手段に供給する。

構成に関する予備分析は、次なる構造分析の間に考慮されるのが必要な、オリゴ 糖の候補構造の数を減少させることができると思われる；かくして、かかる予備 構造分析は、配列決定因子適用数を減少させることができるオリゴ糖体の分析（ 例えば、予備分析またはいずれかの次なる分析）は、いずオリゴ糖体を、メタノ ール分解、Ｎ−アセチル化（所望による）およびシリル化に付して、得られた物 質を、ガスクロマトグラフィー／質量分析に付す。

さらに、例えば、オリゴ糖体のオリゴ糖構造に関する情報は、クロマトグラフィ ーカラム上でのその保持時間を観察することによっても得られる：例えば、クロ マトグラフィーカラムは、オリゴ糖体の保持時間がグルコース単位で表されるよ −スとする方法：　（ｉ）ＳＰ　１０１０逆相カラムの使用、（ｉｔ）　Ｄｉｏ ｎｅｘ装置を使用するＰＡＤによるＨＰＡＥおよび（坦）キャピラリー電気泳動 である。

本発明は、配列決定因子の使用を最適化し、明確にオリゴ糖体および配列決定因 子間の反応の分析結果を解釈し、入手可能な配列決定因子によるさらなる配列決 定が可能ではない時点を決定することの可能性を提供する。

本発明では、例えば、検出器によって検出されるようなオリゴ糖体（またはオリ ゴ糖体に対する配列決定因子の効果によって生成されたその生成物）への配列決 定因子の適用手段から得られた情報が、オリゴ糖体（またはオリゴ糖体に対する 配列決定因子の効果によって生成されたその生成物）に適用されるべき配列決定 因子の選択手段に供給され、かつ、配列決定因子選択手段によって行われるよう な、次に適用されるべき配列決定因子の選択が配列決定因子適用手段に供給され る「ループ」を達成することができ、反復サイクルが確立されると解される。

例えば、かかる反復サイクルは、オリゴ糖体試料を配列決定因子適用手段に導入 し、オリゴ糖体のオリゴ糖構造の配列決定が終わるか、または所望の程度の配列 決定が起こるまで、当該装置を機能させるような完全に自動化された装置におい て行われる。

か（して、本発明の１つの具体例では、オリゴ糖体への配列決定因子適用手段、 オリゴ糖体に配列決定因子を適用することによって得られた生成物の検出手段、 およびオリゴ糖体に適用されるべき配列決定試薬の選択手段からなり、実施にお いて、反復サイクルを達成することができ、これによって、配列決定因子選択手 段によって選択される配列決定因子を適用した結果が、生成物検出手段を介して 、配列決定因子選択手段にフィードバックされ、これによって配列決定因子選択 手段がさらなる配列決定因子をオリゴ糖体またはその生成物に適用させるような 配置である装置を提供する。

本発明を、単に例として、添付図面および実施例に関して、さらに説明する。

第１図は、高マンノース型（Ｍａｎ　９）のＮ−結合オリゴ糖の構造を示す。

第２図は、ハイブリッド型（Ｈｙ　２）のＮ−結合オリゴ糖の構造を示す。

第３図は、マルチーアンテナリー（ｍｕｌｔｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）型（Ｈｅ ｘ　２）のＮ−結合オリゴ糖の構造を示す。

第４図は、本発明の装置の線図を示す。

第５図は、本発明の別の装置の線図を示す。

第６図は、本発明の使用のための装置の線図を示す。

第７図は、本発明の使用のためのさらなる装置の線図を示す。

第８図は、標準的な単糖類のＴＭＳ−メチルグリコシドの全イオン電流クロマト グラム（ｔｏｔａｌ　ｉｏｎ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）を 示す。

第９図〜第２７図は、標準的な単糖類のＴＭＳ−メチルグリコンドについてのガ スクロマトグラフィー−質量分析を示す。該当する単糖を、各図面の右上の角に 示す；図面中のＭ／Ｚは質量／電荷比を示すと解される。

第２８図は、実施例１で引用するオリゴ糖体の構造を示す。

第２９図は、実施例１（ａ）の記載に従って得られたＴＭＳ−メチルグリコンド の全イオン電流クロマトグラムを示す。

第３０図〜第３３図は、実施例１（ａ）の記載に従って得られたＴＭＳ−メチル グリコシドのガスクロマトグラフィー−質量分析を示す。

第３４図は、実施例１（ｂ）の記載に従って得られたＴＭＳ−メチルグリコシド の全イオン電流クロマトグラムを示す。

第３５図〜第３７図は、実施例１（ｂ）の記載に従って得られたＴＭＳ−メチル グリコンドについてのガスクロマトグラフィー−質量分析を示す。

第３８図は、実施例１（Ｃ）の記載に従って得られたＴＭＳ−メチルグリコンド の全イオン電流クロマトグラムを示す。

第３９図〜第４１図は、実施例１（Ｃ）の記載に従って得られたＴＭＳ−メチル グリコシドのガスクロマトグラフィー−質量分析を示す。

第４２図は、実施例２で引用するオリゴ糖体の構造を示す。

第４３図は、実施例３で引用するオリゴ糖体の構造を示す。

第４４図は、実施例４で引用するオリゴ糖体の構造を示す。

添付図面の第１図、第２図および第３図、および本明細書では、略語Ｍａｎ。

ＦｕｃＳＧａｌおよびＧ　１ｃｎａｃは、各々、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース 、Ｄ−ガラクトースおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを意味する。

添付図面の第１図では、高マンノース型のＮ−結合オリゴ糖についての構造式％ 式％ 該構造は、種々の結合基によって結合した多数のマンノースおよびＮ−アセチル グルコサミン単糖単位を示すと解される：該図面の最も右側までのＮ−アセチル グルフサミン単位は、該構造の還元末端として定義されると解される。構造およ び下位構造の概念は前記したが、今、特定の構造が該当するオリゴ糖が該構造自 体であるか、または、構造の１組の下位構造の成員であると仮定するとする。

ここで、下位構造は、構造上で特異的な転換を行うことによって生じる。これに よって、オリゴ糖体のオリゴ糖構造の連続的な配列決定が、さらなる情報を得る ことができなくなるまで、１組の構造からより多くの候補構造を削除することを 可能にする。

かくして、オリゴ糖体の未知のオリゴ糖構造は、残りの構造の１つとして同定さ れる。

第１図（および第２図および第３図）に示される構造の場合、下位構造を生じさ せるために使用した転換は、全ての可能な方法における末端単糖類の連続欠失で ある。これは、下位構造に存在する単糖類の組合せが当該構造のものに従う構造 と同一の原因を有する全ての固有の下位構造を形成する。

添付図面の第２図では、ハイブリッド型（Ｈｙ　２）のＮ−結合オリゴ糖の構造 を示す。

第１図に関して与えられた前記構造および下位構造に関する記載は、第２図に関 して必要な変更を加えて適用する。

添付図面の第３図では、マルチーアンテナリー型（Ｈｅｘ　２）のＮ−結合オリ ゴ糖の構造を示す。

第１図に関して与えられた前記構造および下位構造に関する記載は、第３図に関 して必要な変更を加えて適用する。

添付図面の第４図では、オリゴ糖体への配列決定因子適用手段１、オリゴ糖体へ の配列決定因子適用によって得られる生成物の分析のための分析手段２、および オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段３を有する本発明の装置の 線図を示す。

実施において、オリゴ糖体（例えば、オリゴ糖またはその生成物、またはオリゴ 糖部分を有する種）を手段１に導入し、第１に選択された配列決定因子、または 第１に選択された配列決定因子の組合せを適用する。得られた反応生成物を手段 ２によって分析し、分析結果を、経路４によって同定されたリンクを経由して手 段３に通す。手段３の出力を、経路５として同定されたリンクを経由して手段１ にフィードバックする。これによって、オリゴ糖、またはオリゴ糖体に対する第 １に選択された配列決定因子もしくは第１に選択された配列決定因子の組合せの 効果によって生成されたその生成物に、第２に選択された配列決定因子または第 ２に選択された配列決定因子の組合せを適用する。

例えば、次いで、第３の配列決定因子または第３の配列決定因子の組合せを、第 ２の配列決定因子または第２の配列決定因子の組合せを適用することによって得 られた結果などに基づいて適用する。

かくして、手段２によって検出された、手段１でオリゴ糖体に配列決定因子また は配列決定因子の組合せを適用することによって得られた情報を、手段３に供給 し、手段３によって行われた次に適用されるべき配列決定因子の選択を手段１に 供給して「ループ」を達成することができ、反復サイクルを確立することができ る。例えば、配列決定因子の適用、分析、およびさらなる配列決定因子の適用か らなるサイクルが、所望により多くの配列決定因子を使用してしまうまで、繰り 返されると解される。かくして、例えば、添付図面の第４図について前記したよ うな装置は、完全に自動化さねるよに配置されて、オリゴ糖体試料を手段１に導 入し、オリゴ糖体のオリゴ糖構造の配列決定が終わるまでか、または所望の程度 の配列決定が生じるまで、該装置を機能させる。

６として定義されたリンクは、手段１および手段２がある好適な方法で連絡され ていることを示す。かくして、例えば、手段２が直接光学手段によって分析する ことができる場合、リンク６は光学的である。さらに、例えば、手段２が手段１ から採取した試料を分析することができる場合、リンク６は、手段１から手段２ に試料を移動させるための手段である。

添付図面の第５図については、反応ユニット１１、検出器手段１２（キャピラリ ー電気泳動装置を含む）およびオリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択 手段１３を有するユニット１０を有する本発明の他の装置の線図を示す。ここで 、手段１３は、論理的ユニットを含む。

実施において、オリゴ糖体を反応ユニット１１に導入し、次いで、第１に選択さ れた配列決定因子、または第１に選択された配列決定因子の組合せを導入する。

得られた反応生成物を、検出器手段１２によって検出し、該検出器手段１２の出 力を１４として示されたリンクによって手段１３に通す。手段１３の出力を、１ ５として示されたリンクによって反応ユニット１１にフィードバックし、これに よって、オリゴ糖体、またはオリゴ糖体に対する第１に選択された配列決定因子 、もしくは第１に選択された配列決定因子組合せの効果によって生成されたその 生成物に、第２に選択された配列決定因子または第２に選択された配列決定因子 の組合せを適用する。

例えば、第２の配列決定因子または第２の配列決定因子組合せを適用することに よって得られた結果などに基づいて、第３の配列決定因子、または第３の配列決 定因子の組合せを適用する。

か（して、検出器手段１２によって検出された、反応ユニット１１中のオリゴ糖 体に配列決定因子、または配列決定因子の組合せを適用することによって得られ た情報を手段１３に供給し、手段１３によって行われる、次に適用されるべき配 列決定因子の選択を反応ユニット１１に供給する「ループ」を達成することがで き、その結果、相互に作用するサイクルを確立する。所望の多くの配列決定因子 が使用されてしまうまで、配列決定因子の適用、分析、およびさらなる配列決定 因子の適用からなるサイクルを繰り返す。かくして、例えば、添付図面の第５図 に関して記載した前記装置は、完全に自動化されるように配置されて、オリゴ糖 体試料を反応ユニット１１中に導入し、オリゴ糖体のオリゴ糖構造の配列決定が 終わるまで、または、所望の程度の配列決定がおこるまで、該装置を機能させ添 付図面の第６図では、反応容器２０、該反応容器２０を加熱するための加熱器２ １、供給ライン２２、供給ライン２３、緩衝剤貯蔵手段２４、（冷却手段（示さ れない）が準備されている）配列決定因子貯蔵手段２５、分離手段２６および収 集容器２７を有する本発明の使用のための装置の線図を示す。

実施において、配列決定に付されるべきオリゴ糖体を支持体に付着させて結合体 を形成し、該結合体を反応容器２０中に置く。供給ライン２２および２３を介す る窒素ガスの適用、ならびに、所望により、バルブ（この線図には示されない） の使用によって、緩衝剤を緩衝剤貯蔵手段２４から（ライン２８、および供給ラ イン２３およびライン３０を経由して）反応容器２０に移動させ、配列決定因子 を、配列決定因子貯蔵手段２５から（ライン２９、供給ライン２３およびライン ３０を経由して）反応容器２０に移動させる。

加熱器２１を使用して、選択された温度に反応容器２０の温度を維持する。

かくして、配列決定因子を（所望により、緩衝剤と一緒に）、反応容器２０中の 結合体に適用する。

窒素ガスの使用、および所望により、バルブ（この線図において示されない）の 使用によって、反応容器２０中で形成された反応生成物を、反応容器２０から（ ライン３０および供給ライン２３を経由して）取り出し、不必要な物質の除去を 行うのに好適な物質を含有する分離手段２６を通過させ、ライン３１を経由しら なる配列決定因子を選択し、次いで、（所望により緩衝剤貯蔵手段２４からの緩 衝剤と一緒に）配列決定因子貯蔵手段２５がら反応容器２ｏに供給する。このよ うに、配列決定を行う反復サイクルを行うことができる「ループ」が確立され所 望により、ライン３１は、収集容器２７よりもむしろ分析手段（示されない）（ 例えば、キャピラリー電気泳動装置を含む手段）に直接試料を供給するように１ 　配置される。

廃棄ライン３２．３３および３４は、所望により、装置から不必要な物質を排出 するために設けられる。

ライン３５は、反応容器２０を、所望により供給ライン２２または廃棄ライン３ ２と（所望により、バルブ（示されない）を経由して）結合させるように設けら れる。

添付図面の第７図では、オリゴ糖体貯蔵容器４ｏ１　（所望により加熱器（示さ れない）を設けた）反応容器４１、供給ライン４２、緩衝剤貯蔵手段４３、（冷 却手段（示されない）を設けた）配列決定因子貯蔵手段４４、分離手段４５およ び収集容器４６を有する本発明の使用のためのさらなる装置の線図を示す。

実施において、本発明の配列決定に付されるべきオリゴ糖体を含有する溶液の供 給は、オリゴ糖体貯蔵容器４０中に配置する。次いで、供給ライン４２を介する 窒素ガスの適用、および、所望によりバルブ（この線図には示されない）の使用 によって、オリゴ糖体の試料を、オリゴ糖貯蔵容器４０から（ライン４７および 供給ライン４２およびライン４８を経由して）反応容器４１に移動させ、緩衝剤 を、緩衝剤貯蔵手段４３から（ライン４９、供給ライン４２およびライン４８を 経由して）反応容器４１に移動させ、さらに、配列決定試薬を、配列決定試薬貯 蔵手段４４から（ライン５０、供給ライン４２およびライン４８を経由して）反 応容器４１に移動させる。

かくして、配列決定因子は、（所望により、緩衝剤と一緒に）オリゴ糖体の供給 から得られるオリゴ糖体の試料と混合される。

窒素ガスの使用、および、所望によりバルブ（この線図には示されない）の使用 によって、反応容器４１中で形成された反応生成物を（ライン４８および供給ラ イン４２を経由して）移動させ、不必要な物質の除去を行うのに好適な物質を含 有する分離手段４５を通過させ、ライン５１を介して収集容器４６中に試料とし て収集する。

収集容器４６中の試料を、（例えば、キャピラリー電気泳動装置１ｉＦ（示され ない）の使用によって）いずれかの好適な分析に付し、分析の結果を、さらなる 配列決定因子が選択され、次いで、オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の 選択手段（示されない）に供給され、その結果、さらなる配列決定因子が選択さ れ、（所望により、緩衝剤貯蔵手段４３からの緩衝剤と一緒に）反応容器４１中 に、（オリゴ糖体貯蔵容器４０からの）オリゴ糖体の新しい試料に（配列決定因 子貯蔵手段４４から）供給される。このようにして、配列決定が行われる反復サ イクルを行わせることができる「ループ」を確立する。

所望により、ライン４６は、収集容器４６よりもむしろ分析手段（示されない） （例えば、キャピラリー電気泳動装置を含む手段）に直接的に試料を供給するよ この実施例では、添付図面の第２８図に示される構造のオリゴ糖からなるオリゴ 糖体を使用して、本発明の使用を示した。

該オリゴ糖は、５００Ｍ）（３’Ｈ−ＮＭＲ（１次元）および高速陰イオン交換 クロマトグラフィーによって〉９５％の純度を有すると確認された。

オリゴ糖は、以下のとおり、還元アミノ化を使用して、１，１゛カルボニルジイ ミダゾール活性化アカロースからなる支持体に結合することによって固定化され ことによって製造された試薬８０μｌと一緒にオリゴ糖１１１９を加熱した。次 いで、濃度１．６６９／Ｉ／のシアノホウ水素化ナトリウムのジメチルスルホキ シド溶液８μｌを添加し、得られた混合物を９０℃でさらに９０分間加熱した。

冷却後、混合物をｎ−ブタノール：エタノール（４：　１）　０．５ｓｌで希釈 し、次いで、セルロースカラム（４ｍｌ）に供給し、ｎ−ブタノール・エタノー ル：水［４：　４　：　１］、次に、メタノール（３ｓｌ）、次いで、水Ｃ５ｍ Ａ’）で溶離した。メタノールおよび水フラションを合わせ、ロータリーエバポ レーションによって０．２１１Ｉ！に濃縮した。ジイミダゾールカルボニル活性 化アガロースのアセトン（０，５ｍＡ’）中スラリーを添加し、得られた混合物 を室温で２４時間撹拌した。

０．１Ｍ塩化ナトリウム中で洗浄し、次いで、遠心しく１０００ｇで１分間）、 液体上清を廃棄することによって、支持体に結合したオリゴ糖の組合せ（該組合 せはこの実施例では「結合体」と称される）を反応混合物およびいずれの非結合 物質からも分離した：該洗浄、遠心および液体の廃棄を５回繰り返した。

結合体をエキソグリコシダーゼと一緒にインキュベートし、以下のとおり、いず れかの放出された単糖類を同定および定量化することによって、固定化オリゴ糖 を配列決定に付した・ オリゴ糖の予備分析を行い、以下の単糖単位を同定した：Ｍａｎ（３単位）、Ｇ ａ１（２単位）およびＧｌｃｎａｃ　（４単位）。

オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段（該手段は論理的ユニット を含む）と連結して、予備分析の結果を使用して、候補構造を同定し、次いで、 結合体に適用されるべき配列決定因子を選択した。

（ａ）プラスチック管中の結合体に、（タチナタマメから得られた）精製したβ −Ｄ−ガラクトンダーゼ酵素１．０単位を含有する０、１Ｍクエン酸ナトリウム ／リン酸塩（ｐＨ３，５）からなる溶液１００μｌを添加して、混合物を形成し た。

該管に蓋をし、混合物を３７℃で６時間インキュベートした。０．１Ｍ塩化ナト リウム中で洗浄し、次いで、遠心（１０００ｇで１分間）することによって、結 合体を分離した。液体上演を結合体から分離し、収集した。これを繰り返し、全 ての液体上清をプールし、ダウエックス（Ｄｏｖｅｘ）ＡＧ３Ｘ　４Ａ　（ＯＨ つ樹脂Ｑ、５ｍｌの下にダウエックス（Ｄｏｖｅｘ）ＡＧ５０Ｘ　１２　（Ｈつ 樹脂Ｑ、５＊１からなるイオン交換カラムを通過させることによって脱塩した（ 両樹脂は、共に、バイオ・ラッド（Ｂｉｏ　ＲＡＤ）から購入した）。カラムか らの溶出液を収集し、回転蒸発乾固し、チャツプリン（Ｃｈａｐｌｉｎ）の標準 的な方法［アナリテイカル・バイオケミストリーＣＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１２３、第３３６頁（１９８２）〕に正確に従って、 １−０−メチルトリメチルシリルグリコシドに転換した。得られた１−０−メチ ルトリメチルシリルグリコシドをＧＣ−ＭＳによって定量化し、ＧＣの間の保持 時間およびマススペクトルに基づいて既知の標準化合物を参照して同定した。標 準単糖類の全イオン電流クロマトグラムを添付図面の第８図に示し、標準単糖類 のマススペクトルを添付図面の第９図〜第２７図に示す。β−Ｄ−ガラクトンダ ーゼと一緒に結合体をインキュベートした後に回収した液体上清についての全イ オン電流クロマトグラムおよびマススペクトルを添付図面の第２９図、第３０図 〜第３３図に各々示す。この情報から、β−Ｄ〜ガラクトノダーゼの作用は、ガ ラクトース５１１ナノモルを含み、かつ、他の単糖を含まない結合体から分離さ せると推論することができる。

（ｂ）前記（ａ）で得られた情報を、オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子 の選択手段（該手段は論理的ユニットを含む）と連結して使用して、前記（ａ） に記載した処理の後に得られた結合体に適用されるべきさらなる配列決定因子を 選択した。

か（して、プラスチック管中の（前記（ａ）に記載の処理の後に得られた）結合 体に（ストレプトコッカスψ二ｘ−モニＺ　（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　 ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から得られた）精製したβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−へキソ サミニダーゼ酵素４８マイクロ単位を含有する０、１Ｍカコジル酸ナトリウム（ ｐｌ（６，０）からなる溶液１００μｌを添加して、混合物を形成した。該管に 蓋をし、混合物を３７℃で６時間インキュベートした。０．１Ｍ塩化ナトリウム 中で洗浄し、次いで、遠心（１０００ｇで１分間）することによって、結合体を 分離した。液体上清を結合体から分離し、収集した。これを繰り返し、全ての液 体上清をプールし、ダウエックスＡＧ３Ｘ　４Ａ（ＯＨ→樹脂０．５＊ｌの下の ダウエックスＡＧ５０Ｘ　１２（Ｈつ樹脂Ｑ、５ｍｎからなるイオン交換カラム を通過させることによって脱塩した（両樹脂は、共に、バイオ・ラッド（Ｂｉｏ 　ＲＡＤ）から購入した）。該カラムからの溶出液を収集し、回転蒸発乾固し、 チャツプリン（Ｃｈａｐｌｉｎ）の標準的な方法［アナリティカル・バイオケミ ストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１２３、第３ ３６頁（１９８２）］に正確に従って、１−０−メチルトリメチルシリルグリコ シドに転換した。得られた１−〇−メチルトリメチルンリルグリコンドをＧＣ− ＭＳによって定量化し、ＧＣの間の保持時間およびマススペクトルに基づいて既 知の標準化合物を参照して同定した。標準単糖類の全イオン電流クロマトグラム を添付図面の第８図に示し、標準単糖類のマススペクトルを添付図面の第９図〜 第２７図に示す。β−Ｎ−アセチル−Ｄ−へキソサミニダーゼと一緒に結合体を インキュベートした後に回収した液体上清についての全イオン電流クロマトグラ ムおよびマススペクトルを添付図面の第３４図および第３５図〜第３７図に示す 。この情報から、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼの作用は、Ｎ−ア セチルグルコサミン４８７ナノモルを含み、かつ、他の単糖を含まない結合体か ら分離させると推論することができる。

（ｃ）前記（ｂ）で得られた情報を、オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子 の選択手段（該手段は理論的ユニットを含む）と連結して使用して、前記（ｂ） に記載の処理の後に得られた結合体に適用されるべきさらなる配列決定因子を選 択した。

かくして、プラスチック管中の（前記（ｂ）に記載処理の後に得られた）結合体 に、（タチナタマメから得られた）精製したα−Ｄ−マンノシダーゼ酵素６単位 を含有する０、１Ｍ酢酸ナトリウム１０．　Ｏ１Ｍ酢酸亜鉛（ｐＨ５，０）から なる溶液１００μｌを添加して、混合物を形成した。管に蓋をし、該混合物を３ ７℃で６時間インキュベートした。０．１Ｍ塩化ナトリウム中で洗浄し、次いで 、遠心（１０００ｇで１分間）することによって、結合体を分離した。液体上清 を結合体から分離し、収集した。これを繰り返し、全ての液体上清をプールし、 ダウエックスＡＧ３Ｘ　４Ａ（ＯＨ→樹脂０，５社の下のダウエックスＡＧ５０ Ｘ　１２（Ｈつ樹脂Ｑ、５＊ｌからなるイオン交換カラムを通過させることによ って脱塩した。

（両樹脂は、共に、バイオ・ラッド（Ｂｉｏ　ＲＡＤ）から購入した。）カラム からの溶出液を収集し、回転蒸発乾固し、チャツプリン（Ｃｈａｐｌｉｎ）の標 準的な方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１２３、第３３６頁（１９８２）］に正確に従って １−０−メチルトリメチルシリルグリコシドに転換した。得られた１−０−メチ ルトリメチルシリルグリコシドをＱＣ−ＭＳによって定量化し、ＧＣの間の保持 時間およびマススペクトルに基づいて既知の標準化合物を参照して同定した。標 準単糖類の全イオン電流クロマトグラムを添付図面の第８図に示し、標準単糖類 のマススペクトルを添付図面の第９図〜第２７図に示す。α−Ｄ−マンノシダー ゼと一緒に結合体をインキュベートした後に回収した液体上清についての全イオ ン電流クロマトグラムおよびマススペクトルを、各々、添付図面の第３８図およ び第３９図〜第４１図に示す。この情報から、α−Ｄ−マンノシダーゼの作用は 、マンノース５２７ナノモルを含み、かつ、他の単糖類を含まない結合体から分 離させると推論することができる。

（ｄ）前記（Ｃ）で得られた情報を、オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子 の選択手段（該手段は理論的ユニットを含む）と連結して使用して、前記（ｃ） に記載の処理の後に得られた結合体に適用されるべきさらなる配列決定因子を選 択した。

かくして、プラスチック管中の（前記（Ｃ）に記載処理の後に得られた）結合体 に、（ヘリックス・ポマチア（Ｈｅｌｉｘ　ｐｏａａｔｉａ）から得られた）精 製したβ−Ｄ−マンノンダーゼ酵素０．３単位を含有する０、１Ｍ酢酸ナトリウ ム（ｐＨ４，０）からなる溶液１００μｔを添加して、混合物を形成した。管に 蓋をし、該混合物を３７℃で６時間インキュベートした。０．１Ｍ塩化ナトリウ ム中で洗浄し、次いで、遠心（１０００ｇで１分間）することによって、結合体 を分離した。液体上清を結合体から分離し、収集した。これを繰り返し、全ての 液体上清をプールし、ダウエックスＡＧ３Ｘ　４Ａ（ＯＨ→樹脂領５１Ｎの下の ダウエックスＡＧ５０Ｘ　１２（Ｈ’）樹脂０，５富ｌからなるイオン交換カラ ムを通過させることによって脱塩した。（両樹脂は、共に、バイオ・ラッド（Ｂ ｉｏ　ＲＡＤ）から購入した。）カラムからの溶出液を収集し、回転蒸発乾固し 、チャツプリン（Ｃｈａｐｌｉｎ）の標準的な方法［アナリティカル・バイオケ ミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１２３、第３ ３６頁（１９８２）］に正確に従って１−０−メチルトリメチルシリルグリコシ ドに転換した。得られた１−０−メチルトリメチルシリルグリコシドをＧＣ−Ｍ Ｓによって定量化し、ＧＣの間の保持時間およびマススペクトルに基づいて既知 の標準化合物を参照して同定した。標準単糖類の全イオン電流クロマトグラムを 添付図面の第８図に示し、標準単糖類のマススペクトルを添付図面の第９図〜第 ２７図に示す。β−Ｄ−マンノシダーゼと一緒に結合体をインキュベートした後 に回収した液体上清についての全イオン電流クロマトグラムおよびマススペクト ルを、各々、添付図面の第３８図および第３９図〜第４１図に示す。

この情報から、α−Ｄ−マンノシダーゼの作用は、マンノース２７１ナノモルを 含み、かつ、他の単糖類を含まない結合体から分離させると推論することができ る。

（ｅ）前記（ｄ）で得られた情報を、オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子 の選択手段（該手段は理論的ユニットを含む）と連結して使用して、前記（ｄ） に記載の処理の後に処理の後に得られた結合体に適用されるべきさらなる配列決 定因子を選択した。

かくして、プラスチック管中の（前記（ｄ）に記載の処理の後に得られた）結合 体に（タチナタマメから得られた）精製したβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−へキソサミ ニダーゼ酵素２．５単位を含有する０、１Ｍクエン酸ナトリウム／リン酸塩（ｐ Ｈ４，５）からなる溶液１００μｔを添加して、混合物を形成した。該管に蓋を し、混合物を３７℃で６時間インキュベートした。０．１Ｍ塩化ナトリウム中で 洗浄し、次いで、遠心（１０００ｇで１分間）することによって結合体を分離し た。液体上清を結合体から分ＭＬ、、収集した。これを繰り返し、全ての液体上 清をプールし、ダウエックスＡＧ３Ｘ　４Ａ（ＯＨ’−）樹脂Ｑ、５ｍＡの下の ダｉクエックスＡＧ５０Ｘ　１２（Ｈ”）樹脂Ｑ、５ｓｉ／’からなるイオン交 換カラムを通過させることによって脱塩した（両樹脂は、共に、バイオ・ラッド （ＢｉｏＲＡＤ）から購入した）。該カラムからの溶出液を収集し、回転蒸発乾 固し、チャツプリン（Ｃｈａｐｌｉｎ）の標準的な方法［アナリティカル・バイ オケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　ｌ　２ ３、第３３６頁（］−９８２）］に正確に従って１−０−メチルトリメチルノリ ルグリコンドに転換した。得られた１−０−メチルトリメチルノリルグリコンド をＧＣ−ＭＳによって定量化し、ＧＣの間の保持時間およびマススペクトルに基 づいて既知の標準化合物を参照して同定した。

標準単糖類の全イオン電流クロマトグラムを添付図面の第８図に示し、標準単糖 類のマススペクトルを添付図面の第９図〜第２７図に示す。β−Ｎ−アセチル− Ｄ−へキソサミニダーゼと一緒に結合体をインキ、ベートした後に回収した液体 上清についての全イオン電流クロマトグラムおよびマススペクトルを添付図面の 第３４図および第３５図〜第３７図に示す。この情報から、β−Ｎ−アセチル− Ｄ−へキソサミニダーゼの作用は、Ｎ−アセチルグルコサミン２ロアナノモルを 含み、かつ、他の単糖類を含まない結合体から分離させると推論することができ る。

この実施例における前記に従って得られた情報および使用したエキソグリコンダ ーゼのよく知られている特異性から、単糖類が、以下の順序および割合で結合体 から放出されたことが明らかである。

Ｄ−ガラクトースβ１→４　・　残基２個Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンβ１ →２　：　残基２個マンノースα１→６，３　残基２個 マンノースβ１→４　残基１個 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンβ１→４　残基１個樹脂に出発オリゴ環を付着 している単糖類は、Ｏ−グリコシド結合によって付着されないので、エキソグリ コンダーゼ酵素に影響されない。したがって、この末端Ｎ−アセチルグルコサミ ン（Ｇ　１ｃｎａｃ）は、存在すると解される。この情報から、最初のオリゴ環 の配列は、明らかに、添付図面の第２８図に示すものだけである。

この配列は、オリゴ環の溶液形態のＮＭＲ実験と一致する。

実施例２ この実施例では、添付図面の第４２図で示される構造のオリゴ環からなるオリゴ 糖体を使用して、本発明の使用を示した。

オリゴ環の予備分析を行い、以下の単糖単位を同定した：Ｇａ１（２単位）、Ｇ ｌｃｎａｃ　（５単位）、Ｍａｎ（３単位）、Ｆｕｃ（１単位）。

実施例１の記載に従って、該オリゴ環（０，６ｕ）を支持体に付着させて結合体 を得た。

オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段（該手段は論理的ユニット を含む）と連結して予備分析の結果を使用して、候補の構造を同定し、結合体に 適用されるべき配列決定因子を選択した。

結合体を、種々の配列決定因子（この実施例ではエキソグリコンダーゼ酵素）に よる連続処理に付した。各連続配列決定因子の選択は、分析の結果およびオリゴ 糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段（該手段は論理的ユニットを含む ）の使用に基づいている：この実施例で使用した方法は、実施例１に記載の方法 と実質的に同様であった。

種々の配列決定因子（この実施例ではエキソグリコシダーゼ）を適用する順序お よび結果を第２表に示す。

第２表 単糖類放出の順番および割合は、以下のとおりである。

Ｄ−ガラクトースβ１→４　残基２個 Ｎ−アセチル−Ｄ−へキソサミンβ１→２　（Ｍａｎα１→３）、残基１個Ｎ− アセチル−Ｄ−ヘキソサミンβ１→２　（Ｍａｎα１→６）　残基１個Ｎ−アセ チル−Ｄ−へキソサミンβ１→４　（Ｍａｎβ１→４）　残基１個Ｎ−アセチル −Ｄ−へキソサミンβ１　→４　残基１個この情報から、明らかに、最初のオリ ゴ環は、添付図面の第４２図に示される体を使用して、本発明の使用を示した。

オリゴ環の予備分析を行い、以下の単糖類単位を同定した　Ｍａｎ（３単位）、 Ｇｌｃｎａｃ（３単位）。

実施例１の記載に従って、オリゴ環（０，３１９）を支持体に付着させて、結合 体を得た。

オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段（該手段は論理的ユニ・ス トを含む）と連結して、予備分析の結果を使用して、候補の構造を同定し、結合 体に適用されるべき配列決定因子を選択した。

該結合体を種々の配列決定因子（この実施例ではエキソグリコンダーゼ酵素）に よる連続処理に付した。各連続配列決定因子の選択は、分析結果および第１ノゴ 糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段（該手段は論理的ユニ・ットを含 む）の使用に基づく、この実施例で使用した方法は、実施例１に記載の方法と実 質的に同一であった。

種々の配列決定因子（この実施例では、エキソグリコシダーゼ）を適用した順序 および結果を第３表に示す。

単糖類放出の順序および割合は、以下のとおりである。

Ｄ−マンノースａ１→３　：残基１個 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンβ１→２　残基１個Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ サミンβ１→４　：残基１個この情報から、最初のオリゴ糖の配列は、明らかに 、添付図面の第４３図に示すものだけである。

実施例４ この実施例では、添付図面の第４４図に示す構造のオリゴ糖からなるオリゴ糖体 を使用して、本発明の使用を示した。

第３表 オリゴ糖の予備分析を行い、以下の単糖単位を同定した：ＮＡＮＡ（シアル酸） （２単位）、Ｇａ１（２単位）、Ｇｌｃｎａｃ　（４単位）、Ｍａｎ（３単位） 。

実施例１の記載に従って、オリゴ糖（０，４ｕ）を支持体に付着させて、結合体 を得た。

オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段（該手段は論理的ユニ・ノ ドを含む）と連結して、予備分析の結果を使用して、候補の構造を同定し、結合 体に適用されるべき配列決定因子を選択した。

該結合体を種々の配列決定因子（この実施例ではエキソグリコンダーゼ酵素）で 連続処理に付した。各連続配列決定因子の選択は、分析結果およびオリゴ糖体に 適用されるべき配列決定因子の選択手段（該手段は論理的ユニットを含む）の使 用に基づく；この実施例で使用した方法は、実施例１に記載の方法と実質的に同 一であった。

種々の配列決定因子にの実施例では、エキソグリコノダーゼ）を適用した順序お よび結果を第４表に示す。

第４表 放出された単糖類の順序および割合は、以下のとおりである。

Ｄ−ＮＡＮＡα２→６　、残基２個 り−ガラクトンダーゼβ１→４　：残基２個Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンβ １→２　：残基２個マンノースα１→６，３：残基２個 マンノースβ１→４　、残基１個 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンβ１→４　残基１個この情報から、明らかに、 最初のオリゴ糖の配列は、添付図面第４４図に記載のものだけである。

ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、１０ ＦＩＧ、　１１ ＦＩＧ、１２ ＦＩＧ、１３ ＦＩＧ、１４ ＦＩＧ、１５ ＦＩＧ、１７ ＦＩＧ、１８ ＦＩＧ、１９ ＦＩＧ、２１ ＦＩＧ、　２２ ＦＩＧ、２３ ＦＩＧ、２４ 強度　１７３ ＦＩＧ、　２５ ＦＩＧ、２６ ＦＩＧ、２７ 強度 ＦＩＧ、３０ ＦＩＧ、３１ ＦＩＧ、　３２ ＦＩＧ、３３ 強度 ＦＩＧ、３５ ＦＩＧ、３６ 強度　２０４ ＦＩＧ、３９ ＦＩＧ、４０ ＦＩＧ、４１ 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、ＪＰ、　 ＵＳ （７２）発明者　プライム、サリイ・バーバライギリス、オーエックス４・１エ ツクスエツクス、オックスフォードシャー、オックスフォード、パードルマス・ ロード２番

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段からなることを特徴と するオリゴ糖の配列決定用装置。
2. ２．装置が、オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段、および配列 決定因子によってオリゴ糖体から放出されたオリゴ糖体の成分について分析する ための分析手段からなる請求項１記載の装置。
3. ３．オリゴ糖体がオリゴ糖、またはオリゴ糖の生成物、またはオリゴ糖部分を有 する種である請求項１または２記載の装置。
4. ４．装置が、オリゴ糖体への配列決定因子適用手段、オリゴ糖体に配列決定因子 を適用することによって得られた生成物を分析するための分析手段、オリゴ糖体 に適用されるべき配列決定因子の選択手段、および分析手段からの分析結果の、 オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段への供給手段からなる請求 項１〜３のいずれか１項記載の装置。
5. ５．装置が、オリゴ糖体への適用手段、配列決定因子選択手段によって選択され る配列決定因子からなる請求項１〜４のいずれか１項記載の装置。
6. ６．装置がオリゴ糖体の予備分析を行うための手段からなる請求項１〜５のいず れか１項記載の装置。
7. ７．装置が、配列決定因子選択手段への予備分析結果供給手段からなる請求項６ 記載の装置。
8. ８．装置が配列決定因子およびオリゴ糖体を一緒に接触させるための手段からな る請求項１〜７のいずれか１項記載の装置。
9. ９．装置が、配列決定因子の、配列決定因子およびオリゴ糖体を一緒に接触させ るための手段への供給手段からなる請求項８記載の装置。
10. １０．配列決定に付されるべきオリゴ糖体を固定化する支持体が供給される請求 項１〜９のいずれか１項記載の装置。
11. １１．オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段が論理的選択を行う ことができるユニットである請求項１〜１０のいずれか１項記載の装置。
12. １２．ユニットが、分析手段によって生じた結果を判断することができ、かつ、 オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子または配列決定因子の組合せを選択す ることができる請求項１１記載の装置。
13. １３．装置が、オリゴ糖体への配列決定因子適用手段、オリゴ糖体に配列決定因 子を適用することによって得られた生成物の検出手段、およびオリゴ糖体に適用 されるべき配列決定試薬の選択手段からなり、その配置が、実施において、反復 サイクルが達成され得、これによって、配列決定因子選択手段によって選択され た配列決定因子の適用結果が生成物検出手段を経由して配列決定因子選択手段に フィードバックされ、これによって配列決定因子選択手段がさらなる配列決定因 子をオリゴ糖体またはその生成物に適用させるようにされていることを特徴とす る請求項１〜１２のいずれか１項記載の装置。
14. １４．オリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子の選択手段の使用を含むオリゴ 糖の配列決定方法。
15. １５．方法がオリゴ糖体に適用されるべき配列決定因子を選択し、かつ、配列決 定因子によってオリゴ糖体から放出されたオリゴ糖の成分またはオリゴ糖体の生 成物の成分について分析するための手段の使用を含む請求項１４記載の方法。
16. １６．方法がオリゴ糖体に配列決定因子または配列決定因子の組合せを適用する ことを含む請求項１４または１５記載の方法。
17. １７．オリゴ糖体がオリゴ糖、その生成物、またはオリゴ糖部分を有するオリゴ 糖である請求項１４〜１６のいずれか１項記載の方法。
18. １８．反復方法が使用され、これによって、分析、配列決定因子または配列決定 因子の組合せの適用、および次なる分析からなるサイクルが繰り返される請求項 １４〜１７のいずれか１項記載の方法。
19. １９．方法が、配列決定に付されるべきオリゴ糖体が固定化される支持体の使用 を含む請求項１４〜１８のいずれか１項記載の方法。
20. ２０．支持体が１，１′カルボニルジイミダゾール活性化アガロースからなる固 体支持体である請求項１９記載の方法。
21. ２１．溶液中、遊離状態のままで、配列決定因子が適用されるか、または配列決 定因子の組合せもしくは多数の配列決定因子が適用される請求項１４〜１８記載 の方法。
22. ２２．方法が、オリゴ糖体を分析し、オリゴ糖体に配列決定因子を適用し、オリ ゴ糖体に配列決定因子を適用することによって得られた生成物を分析し、得られ た分析結果を、オリゴ糖体と接触させるべき配列決定因子の選択手段に供給する ことを含む請求項１４〜２１のいずれか１項記載の方法。
23. ２３．方法が、さらに、オリゴ糖体に、配列決定因子選択手段によって選択され た配列決定因子を適用する工程を含む請求項２２記載の方法。
24. ２４．配列決定因子が物理的因子または化学的因子である請求項１４〜２３のい ずれか１項記載の方法。
25. ２５．配列決定因子がエキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼからな る酵素である請求項２４記載の方法。
26. ２６．酵素がアフリカマイマイβマンノシダーゼ、アスペルギルス・サイトイ（ Ａ．ｓａｉｔｏｉ）αマンノシダーゼ、タチナタマメαマンノシ外ゼ、ウシの睾 丸βガラクトシダーゼ、タチナタマメβガラクトシダーゼ、シー・ラムバス（Ｃ ．ｌａｍｐａｓ）βキシロシダーゼ、ストレプトコッカス・ニューモニエβＮ− アセチルヘキソサミニダーゼ、タチナタマメβＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ 、ウシの副睾丸αフコシダーゼ、シー・ラムバスαフコシダーゼ、コーヒー豆α ガラクトシダーゼ、またはアーモンドαフコシダーゼである請求項２５記載の方 法。