JP4259869B2 - タンパク質及びペプチド末端配列の決定方法 - Google Patents

タンパク質及びペプチド末端配列の決定方法 Download PDF

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【０００１】
著作権表示
この特許書類の開示の一部は、著作権保護を受ける資料を包含する。著作権所有者は、特許商標庁の特許ファイル又は記録に現れるので、誰による特許書類又は特許開示のファクシミリ複製に対しても異議はないが、その他の点では全著作権を留保する。
【０００２】
関連出願に対するクロスライセンス
この出願は、2000年10月19日提出の表題“タンパク質及びペプチド末端配列の決定方法”の同時係属米国特許出願番号60/242,165、2000年2月25日提出の表題“タンパク質配列決定方法”の米国特許出願番号09/513,395、及び2000年2月25日提出の表題“ポリペプチドフィンガープリント法及び生命情報科学データベースシステム”の同時係属米国特許出願番号09/513,907、並びに2000年10月19日提出の表題“タンパク質及びペプチド末端配列の決定方法”の一般譲渡されている同時係属米国特許出願番号60/242,398、代理人案件番号05265.P001Zに関連する。これら出願は、あらゆる目的で、参照によってその全体が取り込まれる。
【０００３】
コンピュータプログラムリスト付属物
この出願は、10ページを超えるコンピュータプログラムリストから成る付属物を包含する。コンピュータリストは、１枚のＣＤ-Ｒで提供し、副本を１枚添付し、全部で２枚のＣＤ-Ｒを添付する。ＣＤ-Ｒに包含される資料は、参照によって本明細書に取り込まれる。コンパクトディスク上の資料は、以下のファイルを包含する：BatComputerPeriodDeconvolveMF cpp；BatComputePeriodDeconvolveMF h；Bfactor cpp；Bfactor h；CDialogMainMF cpp；CDialogMainMF h；CElementsMF cpp；CElementsMF h；CErrorLogMF cpp；CErrorLogMF h；ComputeDriftMF cpp；ComputeDriftMF h；CResiduesMF cpp；CResiduesMF h；CSeqInputMF cpp；CSeqInputMF h；CSeqOutputMF cpp；CSeqOutputMF h；CSequenceMF cpp；CSequenceMF h；CSectroConversionMF cpp；CSectroConversionMF h；CSectroDataMF cpp；CSectroDataMF h；CSectroSubtractionMF cpp；CSectroSubtractionMF h；CTabbedSectroDataMF cpp；CTabbedSectroDataMF ｈ；CTextFileMF cpp；CTextFileMF h；CUserInputMF cpp；CUserInputMF h；CUserMessagesMF cpp；CUserMessagesMF h；DeconvolveMF cpp；DeconvolveMF h；FourierMF cpp；SequencerMF cpp；SequencerMF h；及びTDSpectroDataCommonMF h。
【０００４】
発明の背景
質量分析計では、化学的、電気的（電子ビーム又は中性気体分子による界磁誘起衝突）、又は光学的（エキシマーレーザー）手段によって多くの分子を断片化し、生成した標識イオンフラグメントの質量を用いて元の分子を同定又は再構成することができる。他の場合には、分離プロセスから分子を共溶出し、質量分析計でさらに区別する。いくつかの例では、親分子、又は混合物中の特定分子に標識を結合させて、質量スペクトル中の他の化学的ノイズからの生成標識イオン又はイオンフラグメントの同定を補助する。典型的に、この標識は、既に親分子内に含まれている元素、又は元素の同位体から成る。この方法では、質量スペクトル中に所定相対存在量の２つ以上のピークを見つけることができ、標識フラグメントの同定の確認に使用することができる。しかし、標識が、親分子又は試料マトリックスから生成されたか若しくは他の方法で試料マトリックスに混入した他のイオン内に既に含まれていた元素（又はこれら元素の同位体）を含む場合、その標識フラグメントピークの１本以上がスペクトル中の他の非標識イオンピークと重なり、標識イオンの同定を混乱させうる。歴史的に、エドマン分解のような方法がタンパク質配列決定に広範に使用されている。しかし、衝突誘起解離質量分析（ＭＳ）法による配列決定（ＭＳ/ＭＳ配列決定）が急速に発展し、エドマン法よりも速くかつ必要なタンパク質が少ないことが判ってきた。
【０００５】
ＭＳ配列決定は、ＭＳのイオン化ゾーン内で高電圧を用い、タンパク質消化により単離される単一のペプチドをランダムに断片化するか、又はより典型的には、イオントラップ内での衝突誘起解離によるタンデム型ＭＳによって達成される。いくつかの方法を用いてＭＳ/ＭＳ配列決定で用いるペプチドフラグメントを選択することができ、四重極ＭＳ単位内における親ペプチドフラグメントイオンの蓄積、ＥＳ-ＴＯＦ ＭＳ検出に連結されたキャピラリー電気泳動的分離、又は他の液体クロマトグラフ的分離が挙げられる。ＭＳ中の個々のアミノ酸残基に関連する公表されている質量を用いて、ペプチドの生成ＭＳフラグメントパターンで観察される分子量の差から該のペプチドアミノ酸配列が推論され、かつ半自動ペプチド配列決定アルゴリズムに体系化されている。
【０００６】
例えば、正イオン形態で獲得されたＭＳ/ＭＳ実験で単離された1425.7Daペプチド（HSDAVFTDNYTR）の質量スペクトルでは、完全なペプチド1425.7Daと次に大きい質量のフラグメント（y11、1288.7Da）との差は137Daである。これは、アミド結合で切断されたＮ末端ヒスチジン残基の予想質量に相当する。このペプチドでは、ペプチド骨格に沿ったほとんどすべての残基でのペプチドの切断に相当する大量のフラグメントイオンの生成の結果として完全な配列決定が可能である。上記ペプチド配列において、該ペプチドのどちらかの末端を含む正荷電フラグメントイオンの本質的に完全なセットの生成は、Ｎ-及びＣ-末端残基両方の塩基度の結果である。塩基性残基は、Ｎ-末端及び／又はＣ-末端に位置する場合、正電荷は通常塩基性部位に局在化するするので、衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトル中に生成されるほとんどのイオンは、当該残基を含むだろう。塩基性部位はフラグメンテーションを限定系列の特定娘イオンに方向づけるので、塩基性残基の存在は、通常生成されるスペクトルを単純にする。塩基性残基を欠くペプチドは、フラグメントイオンのより複雑な混合物に断片化する傾向にあり、配列決定をより困難にする。
【０００７】
核酸配列決定は、歴史的に、SangerとColson（Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),74:5463-5467(1977)）及びMaxamとGilbert（Methods in Enzymology,65:499-560(1980)）によって定義されている方法のような親核酸配列からコピーされたランダム数の塩基を含有する核酸フラグメントの合成によって行ってきた。SangerとColsonによって記述されている方法の変形は、不完全ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いてＤＮＡフラグメントのラダーを合成する（Nakamayeら,Nuc.Acids Res,16(21):9947-9959(1988)）。質量分析法は、Koster（US5,691,141及びUS6,194,144）、Monforteら（US5,700,642）、及びButlerら（US6,090,558）によって記述されているように、ＤＮＡラダーのより速い多重分離及び同定のために開発されてきた。これら方法では、核酸フラグメントを質量分析計内に同時に導入し、合成された質量フラグメントラダーの個々元素間の質量差から“ショートタンデムリピート”の配列又は数を推論する。Kosterによって記述されているように（US6,194,144）、十分にユニークな質量の異なるタグを有するユニークな核酸親鋳型から合成される核酸フラグメントを差次的に標識することで、平行して同時にいくつかの核酸の配列を決定することが可能かつ望ましい。ユニークな質量の標識を用いてさえ、生成される質量スペクトルから疑いの余地のない配列が得られるように、質量分析計内におけるイオン化又はイオン伝達の際に配列ラダーの元素のサブフラグメンテーションを回避し、かつ他の外来性核酸及び混乱させるマトリックス混入物から核酸を精製するために注意を払わなければならない。これら参照文献は、あらゆる目的で、参照によってその全体が取り込まれる。
【０００８】
質量分析計内で質量タギング(tagging)法を利用する多糖配列決定法もRademacherら（US5,100,778）及びParekhとPrime（US5,667,984）によって記述されている。これら方法では、ユニークな質量タグを精製多糖試料に結合させ、引き続き等量に分割して酵素的及び／又は化学的切断の異なる措置に供して、多糖親由来の一連の標識オリゴ糖フラグメントを生成する。これらフラグメントを同時に質量分析計内に導入し、ランダム標識オリゴ糖フラグメントから生じた質量スペクトル中の生成質量ラダーから親多糖に含まれる糖の配列を決定する。異なる質量タグを使用してユニークな精製多糖親試料に結合させて、数種の異なる試料を同時に平行して処理することにより、処理能力を高められることがわかる。この場合もやはり、質量スペクトル中のサブフラグメンテーションを避け、かつ非標識オリゴ糖混入物から標識フラグメントを精製して、あいまいな配列決定を回避するためにオリゴ糖試料に注意を払わなければならない。これら参照文献は、あらゆる目的で、参照によってその全体が取り込まれる。
【０００９】
脂肪酸組成の同定及び脂質内の配置は、細胞の状態の重要な指標でありうる。例えば、Oliver及びStringer（Appl.Environ.Microbiol.,4:461(1984)）及びHoodら（Appl.Environ.Microbiol.,52:788(1986)）は共にビブリオ種の飢餓状態についてリン脂質の99.8％の損失を報告している。Cronan（J.Bacteriol.,95:2054(1968)）は、大腸菌K-12のホスホチジルジグリセロール(phosphotidyldglycerol)含量の50％がホスフェート飢餓状態の開始２時間以内でカルジオリピンに転換され、かつ脂肪酸組成も有意にシフトすることを見出した。細胞膜の脂質組成も、薬物及び代謝物摂取、膜貫通タンパク質の固定、細胞表面のビリアル認識、腫瘍増殖及び転移、並びに動脈疾患におけるその潜在的役割のため医学的に関心がある。
【００１０】
同様の質量タグアプローチは、Sugarmanら（US6056926）及びBrennerら（Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),89:5381-5383(1992)）によって組合せ的に合成された化学ライブラリーの個々成分の同定に対して記述されており、ユニークな質量タグ標識が、固体表面上の関心のある化合物と共に同時に合成され、後に該固体表面に施される種々の加工工程を確認するために使用される。質量分析計による固体表面からの切断後、この質量標識を同定することができる。組合せアプローチによって生成可能なライブラリーのサイズの限界は、生成可能なユニークな質量標識の数及びこれら標識を関心化合物から区別する能力である。これら参照文献は、あらゆる目的で、参照によってその全体が取り込まれる。
【００１１】
Nessら（US6027890）は、Schmidtら（WO99/32501）、及びAebersoldら（WO00/11208）はすべて、各ソースに対して異なる質量タグを有する異なるソースから得られる生体分子を差次的に標識するための方法を述べている。標識後、試料を混ぜ合わせ、各試料由来の個々の化合物が混合物内で同一に処理されること保証するように、一緒に分離反応又は親和濃厚化によって処理する。質量スペクトル中の個々の質量タグの相対存在量によって、個々の差次的に標識された生体化合物の相対濃度を決定する。これら方法の限界は、使用する質量標識が、試料混合物のいずれの処理についても、また質量分析計内におけるイオン化及び結果として生じるイオンの輸送に関して実質的に同一に振る舞わなければならないことである。この理由のため、通常、化学的類似体である（例えば、安定な同位体類似体又は相互の単純な誘導体である）標識から選択される。これら方法の限界は、単一の平行分析用に混ざり合うことのできる試料の数であり、ほとんど同一の分離挙動と、イオン化及び伝達能力を有して合成できる質量タグ誘導体の数によって制限される。これら方法の別の限界は、質量標識分子又は切断標識を、非標識生体分子や質量分析計内に導入された試料中にも存在しうるマトリックス混入物から区別する能力である。この後者の限界は、質量スペクトル分析の前に標識試料を広範に精製しなければず、かつ質量分析計内の標識分子のサブフラグメンテーションを回避しなければならないことを意味することが多い。
【００１２】
Schmidtら（WO99/3250(1999年7月1日)）は、切断可能な質量標識中で識別可能な質量欠損元素として水素の代わりにフッ素（Ｆ）を使用することについて述べている。このクレームの基礎は、これら２元素間の0.009422amuの単一同位体質量差である。しかし、このクレームは、いくつかの重大な制限を有する。第１に、これは、非常に小さい質量差であり、非常に高い質量分解能の質量分析計によって、かつこの質量分析計内の最低質量範囲でしか分割できない。質量分析計の分解能は、質量範囲によって決まり、通常百万分率で引用される。例えば、業界で常識の典型的な飛行時間検出器は、百万amuの質量で約10amu（10ppm）の質量分解能を有する。従って、図AAに示されるように、ＦとＨとの間の比較的小さい質量差は、約940amuの質量を超えて、かつずっと低いｍ/ｚにおける実際の見込みから分割できない。
【００１３】
Schmidtらは、さらに過フッ化炭化水素の質量欠損は、単純な炭化水素から区別できることを指摘している。例えば、Ｃ6Ｆ5の最大化学量論を有する多フッ化アリールタグの単一同位体質量は、正確に166.992015amuである。最も近い炭化水素の単一同位体質量は167.179975であり、C12H23の化学量論に相当し、約1125ppmという容易に分解可能な質量差である。最少の多フッ化脂肪族タグは68.995209amuであり、CF3化学量論に相当する。これに最も近い単一同位体炭化水素の質量は69.070425であり、C5H9化学量論に相当し、1089ppmの差である。
【００１４】
しかし、生体分子では一般的であるＮ及びＯのようなヘテロ原子を含む有機分子では、フッ素の質量欠損はそれほど容易には区別されない。例えば、C3HO2の化学量論を有するいずれの分子もCF3の単一同位体質量との差はたった35ppmであり、69amuにおいてさえほとんど区別できない。同様に、C7H3O5の単一同位体化学量論を有するいずれの分子も、167amuにおいて、たった36ppmしかC6F5と差がない。
【００１５】
Ｃ、Ｎ、及びＯの安定な同位体が計算に含まれる場合、C6F5の質量欠損は、[12C]4[13C]2[15N]3[16O]2の化学量論を有する分子と比べ、区別不能な1.4ppmに減少する。同様に、CF3の質量欠損は、[12C]2[13C][16O]2の化学量論を有する分子に比し、たった29ppmに減少する。タグの全質量が200amuを超えて増えるにつれて、多数のフッ素によって導入される質量欠損でさえ、急速に他のヘテロ原子及び安定な同位体の欠損に混じって区別できなくなる。なおさらにフッ素を分子に添加することは、溶解度の制約のため実用的でないことが多い。
【００１６】
関心のある個々のピークを複雑な質量スペクトルデータから脱重畳することの特に時間分解分離法に結合されている場合（例えば、ＧＣ/ＭＳ及びＬＣ/ＭＳ）の一般的な問題は、以前に小分子の複雑な混合物について述べられている（Mallard,G.W.及びJ.Reed,“自動質量スペクトル脱重畳及び同定システム、AMDIS-ユーザーガイド”（米国通商省,Gaithersburg,MD,1997）及びStein,S.E.,“ＧＣ/ＭＳデータからのスペクトル抽出の積分法及び化合物同定”J Am Soc Mass Spect、10:770-781(1999)参照）。しかし、これらの方法は、配列決定目的のための生体高分子（例えば、タンパク質、核酸、及び多糖）のフラグメンテーションスペクトルには適用されていない。実際に、これら方法は、典型的には無処置の化学種を同定することを試みており、一般に質量分析計内における断片化条件の回避に努めている。また、ユニークな質量タグを含有する標識生体分子イオンの同定には連結されていない。
【００１７】
ペプチドのどちらかの末端上に電荷集中部位を含むことによって、ペプチドのＣＩＤスペクトルを単純化するという概念を拡張して、他人が、ハード正電荷のＮ末端への結合は、Ｎ末端における塩基性残基の存否とは無関係に、ＣＩＤ実験で親ペプチドから完全な一連のＮ末端フラグメントイオンの生成を方向づけることを実証した。理論的には、固定−荷電基によって方向づけられる電荷リモートフラグメンテーションによってすべてのフラグメントイオンが生成される。
【００１８】
ジメチルアルキルアンモニウム、置換ピリジニウム、四級ホスホニウム、及びスルホニウム誘導体を含む数種類の固定電荷基でペプチドを標識した。有用な標識の特徴としては、合成のし易さ、標識ペプチドのイオン化効率の向上、及び標識ペプチドから、最少の好ましくない標識フラグメンテーションで特定のフラグメントイオン系列を形成することが挙げられる。Zaiaは、これら基準を満足する標識としては、ジメチルアルキルアンモニウム種類及び四級ホスホニウム誘導体の標識が挙げられると報告した。さらに、置換ピリジニウム誘導体が高エネルギーＣＩＤで有用であることが報告されている。
【００１９】
分析方法論におけるいくらかの進歩にかかわらず、プロテオミクスの分野ではタンパク質同定が主要なネックのままである。例えば、十分な長さのタンパク質配列タグを生成してその予測ゲノム配列から単一の精製タンパク質の同定を可能にするためには、18時間まで必要である。さらに、タンパク質配列タグ（ＰＳＴ）を生成することによって、疑いの余地のないタンパク質の同定を達成できるが、より大きいペプチド及びタンパク質のイオン化効率における限界がＭＳ法の内因性検出感度を制限し、かつ低存在量のタンパク質の同定でのＭＳの使用を妨げている。さらに、飛行時間（ＴＯＦ）検出器の質量精度上の限界も、配列決定前に、タンパク質をタンパク分解及び／又は化学分解手段によってより扱いやすいペプチドに消化することを必要とする現在利用されているＭＳ/ＭＳ配列決定の有用性を制約しうる。さらに、前述したＭＳラダー配列決定アルゴリズムは、タンパク質については、このような大きい分子のＣＩＤの際に生成されるペプチドフラグメントが大量であり、かつ質量ラダーを効率的に暗くする配列を惹起するための適切な親イオンを同定できないので、達成できない。
【００２０】
タンパク質混合物から分離後のタンパク質のＭＳ同定について、２つの基本戦略が提案されている：１）質量プロフィルフィンガープリント法（‘ＭＳフィンガープリント法’）；及び２）ＭＳ/ＭＳによる１つ以上のドメインの配列決定法（‘ＭＳ/ＭＳ配列決定法’）。ＭＳフィンガープリント法は、無処置タンパク質のタンパク質分解消化によって生成された数個のペプチドの質量を正確に測定し、かつ当該ペプチドの質量フィンガープリントを有する既知のタンパク質のデータベースを検索することによって達成される。ＭＳ/ＭＳ配列決定法は、ＭＳ/ＭＳ装置の四重極内における配列特異的フラグメンテーションイオンの生成によるタンパク質の１つ以上のＰＳＴsの実際の決定を含む。
【００２１】
Clauserらは、ゲノムデータベースから決定される理論的な配列への参照を可能にするＰＳＴsの決定を通じてのみ、タンパク質を疑いの余地なく同定することができると示唆している。Liらは、ＭＳフィンガープリント法による個々のタンパク質の確実な同定は、比較的理論的なペプチド質量データベースのサイズが大きくなるにつれて退化したことを発見することによって、この断定を立証したらしい。Liらは、そのマトリックス補助レーザー脱着ＭＡＬＤＩ方法論が、以前に報告されている方法を超えて検出感度を高めることを実証しているとしても、ＭＳの感度の限界のため、ゲル中の最高存在量のタンパク質のペプチド地図を得ることしかできないことも報告している。明らかに、速くかつ費用有効性のタンパク質決定法は、プロテオミクス研究の速度を増し、かつ費用を低減するだろう。同様に、Kosterによって述べられているように、配列決定前の核酸の調製及び精製は、質量分析計によってさえ、核酸配列決定の時間と費用を増やす。平行して多数のタンパク質、核酸、多糖又は他の配列を決定できるように、又は非標識有機物質から特定イオンをより良く区別できるように、質量分析計の識別能力を高めることは、現存の方法を超える相当な有用性を有する。
【００２２】
発明の概要
タンパク質、核酸、脂質又は多糖のようなオリゴマーの配列を導き出すための方法及び装置。一例の方法により、アミノ酸配列の所定セットの質量／電荷値を記憶させる。所定セット中の各質量／電荷値の質量スペクトルデータから存在量値を決定し、多数の存在量値を生成する。多数の存在量値に基づき、第１数のアミノ酸を有する１セットのアミノ酸の各配列について第１順位を計算する。多数の存在量値に基づき、第２数のアミノ酸を有する１セットのアミノ酸の各配列について第２順位を計算する。第１順位と第２順位に基づき、少なくとも第２数のアミノ酸を有する１セットのアミノ酸配列の各配列について累積順位を計算する。配列を決定する他の方法についても述べる。質量スペクトルデータをフィルタリングして周期的な化学ノイズを除去する方法についても述べる。ノイズをフィルタリングする一例の方法は、タンパク質のフラグメントをディテクターに対して加速させることによって生成された質量スペクトルデータ中の実質的に周期的なノイズのブロックを決定する工程と、該質量スペクトルデータから実質的に周期的なノイズのブロックをフィルタリングする工程を包含する。これら方法及び他の方法を達成する装置についても述べる。
【００２３】
本発明の実施形態は、特にタンパク質のＭＳ及びＭＳ/ＭＳ配列決定法の両方で、オリゴマー長の限界を克服する。本発明の特定の実施形態は、好ましくはタンパク質のタンパク質分解的又は化学分解的消化の必要を排除するので、この方法は、先行方法を用いて得られる時間より有意にタンパク質配列決定の時間を減少させる。さらに、配列決定されるタンパク質は、本方法を用いて高度に断片化されるので、生じるフラグメントのイオン化効率及び揮発度が親タンパク質よりも高く、ひいては先行方法を超えて検出感度が高められることになる。
【００２４】
従って、一局面では、本発明は、タンパク質の末端部分の配列決定方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
【００２５】
（ａ）タンパク質を、Ｃ-末端又はＮ-末端標識化部位と接触させ、前記タンパク質のＣ-又はＮ-末端に標識を共有結合させて標識タンパク質を形成する工程；及び
【００２６】
（ｂ）質量分析的フラグメンテーション法を用いて前記標識タンパク質を分析する工程、及び
【００２７】
（ｃ）生成した質量スペクトル中の他の非末端配列フラグメントから、標識末端質量ラダーをアルゴリズム的に脱重畳することによって、少なくとも２個のＣ-末端又は２個のＮ-末端残基の配列を決定する工程。
【００２８】
一群の実施形態では、本方法は、さらに以下の工程を含む。
【００２９】
（ｄ）少なくとも２個のＣ-末端又は２個のＮ-末端残基の配列を用いて該タンパク質を同定し、遺伝子配列データのデータベースから予測タンパク質配列を検索する工程。
【００３０】
別の局面では、本発明は、タンパク質混合物中の一部のタンパク質を配列決定する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
【００３１】
（ａ）タンパク質混合物をＣ-末端又はＮ-末端標識化部位と接触させ、該タンパク質のＣ-又はＮ-末端に標識を共有結合させて標識タンパク質混合物を形成する工程；
【００３２】
（ｂ）標識タンパク質混合物中の個々の標識タンパク質を分離する工程；及び
【００３３】
（ｃ）質量分析的フラグメンテーション法によって、工程（ｂ）から得られた標識タンパク質を分析する工程、及び
【００３４】
（ｄ）生成した質量スペクトル中の他の非末端配列フラグメントから、標識末端質量ラダーをアルゴリズム的に脱重畳することによって、少なくとも２個のＣ-末端又は２個のＮ-末端残基の配列を決定する工程。
【００３５】
一群の実施形態では、本方法は、さらに以下の工程を含む。
【００３６】
（ａ）少なくとも２個のＣ-末端又は２個のＮ-末端残基の配列と、標識タンパク質及び該配列のタンパク質末端位置の分離座標を併用して該タンパク質を同定し、遺伝子配列データのデータベースから予測タンパク質配列を検索する工程。別の局面では、本発明は、オリゴマー又はポリマーの末端タンパク質を配列決定するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：（ａ）オリゴマーを標識化部位と接触させ、該オリゴマーの末端に標識を共有結合させて標識オリゴマーを形成する工程、該標識化部位はオリゴマーを構成する構成モノマーのいずれとも異なる質量を有し；（ｂ）標識オリゴマーを、酵素的、化学的又は質量分析的フラグメンテーション法を用いて断片化し、標識オリゴマーフラグメントを生成する工程；及び（ｃ）標識に隣接する少なくとも２個の末端モノマーの配列を、生成質量スペクトル中の他の非末端配列フラグメントから、標識末端質量ラダーのアルゴリズム的配列決定によって決定する工程。
【００３７】
上記方法の実施形態では、インソースフラグメンテーションによる末端標識タンパク質配列決定用の頑強なアルゴリズムの使用が、従来のＭＳ/ＭＳ配列決定アルゴリズムアプローチを超える利点を与える。特定実施形態の１つの特有な利点は、小さいペプチド又は核酸フラグメントへの事前消化を必要としない、完全なタンパク質及び核酸を配列決定する能力である。特定実施形態の別の利点は、該方法が自己開始し、配列を決定するために親イオンの大きさや組成について如何なる知識をも必要としないことである。特定実施形態の別の利点は、該方法が高度に自動化できることである。特定実施形態の別の利点は、質量スペクトルの低末端で働くことによって得られる改良された絶対質量精度のため、ほとんど疑義のない配列に帰着することである。特定実施形態の別の利点は、より高エネルギーのイオン化条件を使用し、かつ標識の付加を通じてフラグメント上にハード又はイオン性電荷を導入した結果、検出感度に対応する良いイオン化効率が生じることである。標識を通じて電荷を導入することのさらに別の利点は（特定実施形態におけるように）、イオン性アミノ酸残基を含有しえないタンパク質の領域から部分的なタンパク質配列を決定する能力である。
【００３８】
最後に、この方法は、特定実施形態で、Ｎ-又はＣ-末端タンパク質配列に基づき、疑いの余地のないタンパク質同定又は核酸プローブ生成の両方で使用可能な相接タンパク質配列タグ（ＰＳＴ）を提供し、天然細胞又は組織試料から対応するｃＤＮＡを単離するのに有用だろう。
【００３９】
図面の簡単な説明
図１は、典型的な質量スペクトルデータの一例を示す。
【００４０】
図２は、特定タイプの質量スペクトルデータに現れる周期的ノイズを示す。
【００４１】
図３は、重なり周期内の周期的ノイズを示す。
【００４２】
図４は、同位体順位カウントデータの生カウントデータとの比較例を示す。
【００４３】
図５は、本発明の特定実施形態で使用可能な質量分析計の一例を示す。
【００４４】
図６は、本発明の特定実施形態のデータ処理システムに連結された質量分析計の一例を示す。
【００４５】
図７は、本発明の特定実施形態で使用可能な機械読取り可能媒体の一例を示す。
【００４６】
図８は、本発明の配列決定アルゴリズムを実行する前に質量スペクトルデータをフィルタリングするための本発明の一方法を示す。
【００４７】
図９は、タンパク質又はポリペプチド配列の末端部分から得られるイオンフラグメントを決定するための方法を示す。
【００４８】
図１０は、細胞抽出物のようなタンパク質の集合から単離タンパク質試料を得るために数種のタンパク質を分離するための分離方法の一例を示す。
【００４９】
図１１は、本発明の一実施形態の概要を示すフローチャートを示す。
【００５０】
図１２は、本発明の一実施形態のさらに詳細な実施例を示す。
【００５１】
図１３は、タンパク質を配列決定するための本発明の特定実施形態を図解するフローチャートを示す。
【００５２】
図１４Ａ及び図１４Ｂは、タンパク質の末端部分を配列決定するための本発明の一実施形態の特定の計算方法を示す。
【００５３】
図１５は、タンパク質を配列決定するために同一タンパク質に２つの標識を使用する本発明の一実施形態の方法を示す。
【００５４】
図１６及び図１７は、それぞれ、平均フィルター核及びスケーリング係数最適化グラフを示す。
【００５５】
図１８Ａ及び１８Ｂは、１セットのｍ/ｚ値を記憶させ、記憶装置からバスに取り戻すのではなく、必要どおりの基礎に基づいて計算する計算方法の一実施形態の一例を示す。
【００５６】
図１９は、メインメモリ又はハードドライブからでなく、マイクロプロセッサーのキャッシュから直接的に、質量スペクトルからカウントデータを得る、本発明の計算方法の別の実施形態を示す。
【００５７】
図２０Ａ及び図２０Ｂは、質量スペクトルデータをフィルタリングするための、多標識と共に使用できる別のフィルタリング方法を示す。
【００５８】
図２１は、表３の標識１と整合する一例のオリゴ糖組成物の質量スペクトルピークを示す。
【００５９】
図２２は、表３の標識２と整合する一例のオリゴ糖組成物の質量スペクトルピークを示す。
【００６０】
図２３は、表３の標識３と整合する一例のオリゴ糖組成物の質量スペクトルピークを示す。
【００６１】
図２４は、標識１及び標識２と整合する一例の脂肪酸組成物の質量スペクトルピークを示す。
【００６２】
図２５は、光切断性質量欠損タグの一般構造を示し、図中Ｂｒは、タグの残部にアミノ酸（Ｒ）を通じて連結される質量欠損元素である。
【００６３】
図２６は、本発明のアルゴリズムを用い、質量欠損標識ピークを残して化学ノイズを脱重畳した一例の質量スペクトルを示す。
【００６４】
図２７は、質量タグ領域の脱重畳かつピーク限定した質量スペクトルを示す。
【００６５】
図２８は、さらにシングル単一同位体ピークに脱重畳したβ-係数スペクトル中の同位体系列を示す。
【００６６】
図２９は、シフトした単一荷電ｂ型イオンの証拠を示す生質量スペクトルデータを示す。
【００６７】
図３０は、単一荷電ａ１イオン二重線（グリシン）を示す。
【００６８】
図３１は、ｄ２イオン（グリシン−ロイシン）の計算質量に相当する二重線を示す。図３２は、一例の質量スペクトルの脱重畳を示す。図３３は、真の６-残基配列と、競合する５-残基の偽配列との重なりを示す。図３４は、イオン性基と質量欠損元素の組合せを有するコア無水コハク酸反応性部位を例示する一般的な化学構造を示す。図３５は、図３４に提示される一例の無水コハク酸を生成するための一例の合成スキームを示す。図３６は、サンガー法を用いる一例の配列決定法を示す。図３７Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、それぞれ修飾ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、及びｄｄＣＴＰを示す。図３８は、一例の脱重畳ｄｄＡ*及びｄｄＧ*スペクトルを示す。図３９は、一例の脱重畳ｄｄＴ*及びｄｄＣ*スペクトルを示す。
【００６９】
発明の詳細な説明
定義
特に定義しない場合、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、通常、この発明が属する技術の当業者によって普通に理解されるのと同一の意味を有する。通常、本明細書で使用する命名法並びに後述する分子生物学、有機化学及びタンパク質化学における実験手順は、本技術で周知かつ普通に利用されるものである。ペプチド合成には標準的な方法を使用する。通常、酵素反応及び精製工程は、製造業者の説明書に従って行う。方法及び手順は、通常、本技術の従来法及び種々の一般的な参考文献（一般に、参照によって本明細書に取り込まれる、Sambrookら Molecular Cloning：Ａ Laboratory Manual,第２版(1989)Cold Spring Harabor Laboratory Press,Cold Spring Harabor,N.Y.,及びMethods in Enzymology,Biemann,ed.193:295-305,351-360,及び455-479(1993)参照）に従って行い、この文書全体にわたって提供される。本明細書で使用する命名法並びに後述する数学的及び統計的分析、分析化学、及び有機合成における手順は、本技術で公知かつ利用されるものである。化学合成及び化学分析のため、標準的な方法、又はその変形を使用する。
【００７０】
本明細書で使用する場合、用語“オリゴマー”は、いずれのポリマー残基をも指し、残基は、通常同一でないが同様である。一般に、オリゴマーは、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、多糖、脂質などのような天然に存在するポリマーを包含する意である。オリゴマーは、フリーラジカル、合成ソースのアニオン性若しくはカチオン性縮合ポリマーをも指し、限定するものではないが、アクリレート、メタクリレート、ナイロン、ポリエステル、ポリイミド、ニトリルゴム、ポリオレフィン、及びこれら分類の合成ポリマーの異なるモノマーのブロック若しくはランダムコポリマーが挙げられる。本明細書で述べる分析法を受けるオリゴマーは、天然に存在する数を典型とする多数の残基を有する。例えば、オリゴヌクレオチドであるオリゴマーは、数百又は数千の残基さえ有しうる。同様に、タンパク質は、通常百以上の残基（より小さいフラグメント、例えばペプチドの配列決定も有用であるが）を有する。オリゴ糖は、通常３〜100個の糖残基を有する。脂質は、一般に２又は３個の脂肪酸残基を有する。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語タンパク質、ペプチド及びポリペプチドは、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１個以上のアミノ酸が、後翻訳プロセスによって修飾された（例えば、グリコシル化及びリン酸化）アミノ酸を含む、対応の天然に存在するアミノ酸の化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用する。
【００７２】
本明細書で使用する場合、“タンパク質”は、いずれのタンパク質をも意味し、限定するものではないが、ペプチド、酵素、糖タンパク質、ホルモン、レセプター、抗原、抗体、成長因子などが挙げられる。現在好ましいタンパク質としては、少なくとも10個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも25個のアミノ酸残基、さらになお好ましくは少なくとも35個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも50個のアミノ酸残基で構成されるものが挙げられる。
【００７３】
“ペプチド”は、モノマーがアミノ酸であり、かつアミド結合を通じて一緒に結合しているポリマーを指し、代わりにポリペプチドと呼ばれる。アミノ酸がａ-アミノ酸である場合、Ｌ-光学異性体又はＤ-光学異性体を使用できる。さらに、非天然アミノ酸、例えば、ｂ-アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニンも包含される。一般的なレビューのため、Spatola,A.F.,CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS,PEPTIDES AND PROTEINS,B.Weinstein,eds.,Marcel Dekker,New York,p.267(1983)を参照せよ。
【００７４】
本明細書で使用する場合、“タンパク質配列決定タグ”（ＰＳＴ）は、タンパク質の部分的な配列を示す少なくとも２個のアミノ酸の相接系列を指す。好ましいＰＳＴとしては、本発明の標識又は本発明の標識のフラグメント又は本発明の標識のイオン化誘導体が挙げられる。
【００７５】
用語“核結合エネルギー”は、元素の計算質量と実際の核質量との質量差を指す。それは、その構成性単離核子に核を分離するのに必要なエネルギーの等価な質量（相対性理論により）として定義される。
【００７６】
用語“質量欠損”又は“質量欠損標識”は、試料の質量スペクトル中で容易に同定するに十分かつ明確な質量を与える標識の一部又は標識全体を指す。従って、質量欠損は、典型的には、イオウ又はリン以外の17〜77の原子番号を有する元素である。典型的に、生体分子のような典型的な有機分子（基１及び基２ヘテロ原子を含有する有機薬品でさえ）と共に使用するための最も効率的な質量欠損標識は、原子番号35〜63の元素を１個以上取り込む。最も好ましい質量欠損は、元素臭素、ヨウ素、ユーロピウム及びイットリウムである。
【００７７】
用語“脱重畳”は、ランダムノイズと周期的ノイズの両方を含むか、又は別のやり方で電子的若しくは物理的収集法との相互作用によってあいまいにされているデータから関心のある情報を回収するための数学的手順及びアルゴリズムを広く定義する。
【００７８】
用語“アルキル”は、本明細書では、分岐又は不分岐の、飽和又は不飽和の一価炭化水素基を指し、通常、約１〜30個の炭素、好ましくは４〜20個の炭素、さらに好ましくは６〜18個の炭素を有する。アルキル基が１〜６個の炭素原子を有する場合、それは“低級アルキル”と呼ばれる。好適なアルキル基としては、例えば、１個以上のメチレン、メチン(methine)及び／又はメチン(methyne)基を含有する構造を含む。分岐構造は、i-プロピル、t-ブチル、i-ブチル、2-エチルプロピル等と同様の分岐モチーフを有する。本明細書で使用する場合、この用語は、“置換アルキル”、及び“環式アルキル”を包含する。
【００７９】
“置換アルキル”は、例えば、低級アルキル、アリール、アシル、ハロゲン（すなわちアルキルハロ、例えば、ＣＦ3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオアミド、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和及び不飽和環式炭化水素、ヘテロ環などのような１個以上の置換基を含むと記載されるようなアルキルを意味する。これら基は、アルキル部分のいずれの炭素又は置換基に結合していてもよい。さらに、これら基は、アルキル鎖からぶらさがっているか、又はアルキル鎖に必須かもしれない。
【００８０】
用語“アリール”は、本明細書では芳香族置換基を意味し、単一の芳香環或いは一緒に縮合し、共有結合し、又はメチレン若しくはエチレン部分のような共有基に連結している複数の芳香環でもよい。共有連結基は、ベンゾフェノンにおけるようなカルボニルでもよい。芳香環としては、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルメチル及びベンゾフェノン等が挙げられる。用語“アリール”は、“アリールアルキル”及び“置換アリール”を包含する。
【００８１】
“置換アリール”は、低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（例えば、ＣＦ3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、フェノキシ、メルカプト、及び芳香環に縮合し、共有結合し、又はメチレン若しくはエチレン部分のような共有基に連結している飽和及び不飽和環式炭化水素のような１個以上の官能基を含むようなアリールを意味する。連結基は、シクロヘキシルフェニルケトンにおけるようにカルボニルでもよい。用語“置換アリール”は、“置換アリールアルキル”を包含する。
【００８２】
用語“アリールアルキル”は、本明細書では、アリール基が、ここで定義したようなアルキル基によって別の基に結合している“アリール”のサブセットを指す。
【００８３】
用語“置換アリールアルキル”は、置換アリール基が、ここで定義したようなアルキル基によって別の基に結合している“置換アリール”のサブセットを定義する。
【００８４】
用語“アシル”は、ケトン置換基、−Ｃ(Ｏ)Ｒを表すために使用し、式中Ｒは、ここで定義したようなアルキル若しくは置換アルキル、アリール若しくは置換アリールである。
【００８５】
用語“ハロゲン”は、本明細書ではフッ素、臭素、塩素及びヨウ素原子を意味する。
【００８６】
用語“ランタニド系列”は、周期表で原子番号が57〜71の元素を指す。
【００８７】
用語“ヒドロキシ”は、本明細書では基−ＯＨを指す。
【００８８】
用語“アミノ”は、−ＮＲＲ'を表すために使用し、式中Ｒ及びＲ'は、独立的にＨ、アルキル、アリール又はその置換類似体である。“アミノ”は、二級及び三級アミンを表す“アルキルアミノ”及び基ＲＣ(Ｏ)ＮＲ'を示す“アシルアミノ”を包含する。
【００８９】
用語“アルコキシ”は、本明細書では−ＯＲ基を指すために使用され、式中Ｒはアルキル、又はその置換類似体である。好適なアルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、t-ブトキシ等が挙げられる。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語“アリールオキシ”は、酸素原子を通じて別の基に直接結合している芳香族基を表す。この用語は、芳香族基が、“置換アリール”について上述したように置換されている“置換アリールオキシ”部分を包含する。アリールオキシ部分の例としては、フェノキシ、置換フェノキシ、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ等が挙げられる。
【００９１】
本明細書で使用する場合、用語“アリールオキシアルキル”は、ここで定義したように、酸素原子を通じてアルキル基に結合している芳香族基を定義する。用語“アリールオキシアルキル”は、芳香族基が、“置換アリール”について述べたように置換されている“置換アリールオキシアルキル”部分を包含する。
【００９２】
本明細書で使用する場合、用語“メルカプト”は、一般構造−Ｓ−Ｒの部分を定義し、式中、Ｒは、ここで述べたようなＨ、アルキル、アリール又はヘテロ環である。
【００９３】
用語“飽和環式炭化水素”は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル等のような基、及びこれら構造の置換類似体を表す。これら環式炭化水素は、単環−又は多環−構造でよい。
【００９４】
用語“不飽和環式炭化水素”は、シクロペンテン、シクロヘキセン等、及びその置換類似体のような、少なくとも１個の二重結合を有する一価の非芳香族基を示すために使用する。
【００９５】
本明細書で使用する場合、用語“ヘテロアリール”は、芳香環の１個以上の炭素原子が、窒素、酸素又はイオウのようなヘテロ原子で置換されている芳香環を指す。ヘテロアリールは、単一の芳香環、複数の芳香環、又は１個以上の芳香環に結合している１個以上の芳香環でありうる構造を指す。複数の環を有する構造では、環は一緒に縮合し、共有結合し、又はメチレン若しくはエチレン部分のような共有基が結合しうる。共有連結基は、フェニルピリジルケトンにおけるようなカルボニルでもよい。本明細書で使用する場合、チオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドール、フラン等のような環、又はこれら環のベンゾ−縮合類似体は、用語“ヘテロアリール”で定義される。
【００９６】
“ヘテロアリールアルキル”は、ここで定義したようなアルキル基がヘテロアリール基を別の基に連結している“ヘテロアリール”のサブセットを定義する。
【００９７】
“置換ヘテロアリール”は、ヘテロアリール核が、低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（例えば、ＣＦ3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、メルカプト等のような１個以上の官能基で置換されているヘテロアリールを指す。従って、チオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドール、フラン等のようなヘテロ芳香環の置換類似体、又はこれら環のベンゾ−縮合類似体は、用語“置換ヘテロアリール”で定義される。
【００９８】
“置換ヘテロアリールアルキル”は、ここで定義したようなアルキル基が、ヘテロアリール基を別の基に連結している、“置換ヘテロアリール”のサブセットを指す。
【００９９】
用語“ヘテロ環式”は、本明細書では、単一環又は環内の１〜12個の炭素原子及び窒素、イオウ若しくは酸素から選択される１〜４個のヘテロ原子からの複数の縮合環を有する、一価の飽和又は不飽和非芳香環を表すために使用される。このようなヘテロ環は、例えば、テトラヒドロフラン、モルフォリン、ピペリジン、ピロリジン等である。
【０１００】
本明細書で使用する場合、用語“置換ヘテロ環式”は、ヘテロ環核が低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（例えば、ＣＦ3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、メルカプト等のような１個以上の官能基で置換されている、“ヘテロ環式”のサブセットを表す。
【０１０１】
用語“ヘテロ環式アルキル”は、ここで定義したようなアルキル基が、ヘテロ環式基を別の基に連結している、“ヘテロ環式”のサブセットを定義する。
【０１０２】
用語“キレート”は、金属元素又は金属イオンの実質的に有機的な分子に対する非共有手段による強力に会合的な結合を意味する。
【０１０３】
概要
本発明の実施形態は、質量分析計内における標識及び非標識分子又は分子のフラグメントの改良された区別のための質量分析法を包含する。本方法は、配列決定及び質量スペクトル中で区別できる組合せの複雑性を高めるために使用することができる。本方法は、質量欠損を取り込んだ標識化試薬で分子又はオリゴマーの末端を標識し、その結果の質量欠損標識分子を質量スペクトル中の他の非標識分子又は非標識分子フラグメントから区別することによって実施される。
【０１０４】
特定の実施形態では、質量分析計内における標識及び非標識分子又は分子のフラグメントの改良された区別のための質量分析法をオリゴマー配列決定に使用することができる。好ましい実施形態は、タンパク質配列決定に使用可能な質量分析法である。例えば、タンパク質のＮ-又はＣ-末端をユニークな質量タグ（質量欠損標識）で標識し、次いで質量分析計のイオン化ゾーン内（例えば、インソースフラグメンテーション）又はＭＳ/ＭＳ装置の衝突セル内における標識タンパク質のフラグメンテーション後、本明細書で述べるような数学的アルゴリズムを用いてタンパク質の末端配列を決定することができる。別の実施形態では、親鋳型から標識オリゴマーを合成するか、又は化学分解的若しくは酵素分解的に消化して、標識の差次的質量欠損から質量スペクトル内でアルゴリズム的に同定される標識フラグメントの配列決定ラダーを含むフラグメントを形成することができる。標識ペプチドは、生じた質量スペクトル中そのユニークな質量特色によって非標識ペプチドから区別することができ、かつその相対存在量及び／又はユニークな質量特色によって、イオン化マトリックス及び混入タンパク質若しくはペプチドに伴う非標識タンパク質フラグメント及びピークから脱重畳することができる。累積順位システムは、質量ラダーの連続する残基で決定される配列の確実性を高めるためのアルゴリズムによって使用される。いくつかの実施形態では、このプロセスは、精製標識タンパク質について１分未満で達成され、現在のＭＳ/ＭＳタンパク質配列決定法より500〜1000倍の速さを与える。代わりに、本方法をオリゴ糖、オリゴヌクレオチド、脂質などのような他のオリゴマーの配列決定に使用することができる。
【０１０５】
一実施形態では、タンパク質のような標識オリゴマーは、衝突誘起解離（ＣＩＤ）によってＭＳ内で高度に断片化される。ＣＩＤは、イオン化ゾーン内（例えば、インソース）又は衝突ゾーンに導入される非オリゴマー気体による高エネルギー衝撃を通じて衝突セル内で達成することができる。好ましい標識は、親タンパク質に対するペプチドのように、親オリゴマーに対し、結果として生じる標識オリゴマーフラグメントイオンのイオン化効率を高め、かつ揮発性を高め、ひいては全体的な検出感度を向上させる。好ましい標識は、標識が結合しているフラグメントにユニークな質量特色を与える。特に好ましい実施形態では、ユニークな質量特色は、該標識中に取り込まれた１個以上の元素から成り、この元素は、アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質、又は多糖、脂肪酸、ヌクレオチド等のような他のオリゴマー、該オリゴマー由来のフラグメント及びモノマーに伴う元素（例えば、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、及びＳ）の核結合エネルギーとは実質的に異なる核結合エネルギーを含有する。別の実施形態では、質量スペクトル中の関心のあるピークを脱重畳するために使用する、生成した同位体対の相対存在量と共に、同位体的に別異型の標識の混合物を使用することができる。別の実施形態では、１個以上のメチル又はメチレン単位の付加によって異なる標識類似体を使用して、質量スペクトル中関心のあるピークを一意的に区別することができる。別の実施形態では、その相対存在量によって、標識ペプチドに伴うピークを非標識ペプチドから脱重畳することができる。タンパク質の配列又はタンパク質配列タグは、好ましくは質量スペクトルの低分子量末端から構成され、生成する標識ペプチドフラグメントからのＱ及びＫ残基の分割を含む、より大きい絶対質量精度及びより容易な配列決定のような、先行方法を超える利点を提供する。
【０１０６】
この方法に適切なラベルの選択は、いくつかの基準を考慮する必要がある。第１に、標識は、好ましくはＭＳのフラグメンテーション条件に生き残るのに十分頑強である。第２に、標識は、好ましくは、オリゴマーの内部切断から、又は試料中に存在しうる他の非標識有機分子から生成されるペプチドのようないずれの非標識オリゴマーフラグメントからも区別できるユニークな質量/電荷（ｍ/ｚ）特色をも生じさせる。第３に、標識は、イオン性又は永久イオン化基を保有し、フラグメンテーションが、タンパク質の非荷電Ｎ-及びＣ-末端残基のような非荷電末端残基でさえ含む大量のイオンを生成することを保証することもできる。
【０１０７】
特定の実施形態では、本方法は、質量スペクトル中の標識オリゴマーフラグメントから、質量欠損標識分子又は分子のフラグメントを同定するため、及びタンパク質配列のようなオリゴマー配列を決定するための頑強なアルゴリズムを取り入れる。このアルゴリズムは、既知標識の質量のみから開始して、タンパク質配列のようなすべての可能なオリゴマー配列のスペクトルデータを検索する。このアルゴリズムは、ペプチドのような標識オリゴマーフラグメントの質量対電荷比と生じるＭＳピークの相対存在量の両方を用いてすべての可能なオリゴマー配列を順位づける。累積（前向き）順位を用いて、質量スペクトル中に見られる連続数の残基、例えばタンパク質配列決定用アミノ酸として配列を除去する。好ましい実施形態では、配列決定アルゴリズムの適用前に質量スペクトルから化学ノイズを選択的に脱重畳する。以前の配列決定アルゴリズムと異なり、本アルゴリズムは、開始、つまり親イオンを定義するため、又は質量スペクトル中で予想される配列ピークを同定若しくは認定するために人の介入なしで実施できるので頑強である。別の実施形態では、遺伝子配列データ、特に該タンパク質を得た生体に限定されている遺伝子配列データから予測される可能なタンパク質配列のデータベース内に存在することで、さらに、最高順位の配列可能性を認定することができる。別の実施形態では、親タンパク質の分離座標（例えば、等電点及び分子量）及び／又はそのアミノ酸組成によって、さらに、最高順位の配列可能性を認定することができる。代替実施形態は、限定するものではないが、核酸、多糖、合成オリゴマー等を包含する他のオリゴマーのデータベースを用いて、さらに、順位オリゴマー配列を認定することができる。
【０１０８】
本発明の実施形態は、他元素の他のストキオメトリック(stochiometric)組合せを持ちえない、スペクトル中のユニークな質量位置に標識の質量を動かす核結合エネルギー（質量欠損）を有する１個以上の元素を標識中に取り込むことができる。このようにして、標識フラグメントが低い相対存在量で存在する場合や複雑な試料混合物中に存在する場合、より容易に化学ノイズから区別し、かつより正確に検出することができる。さらに、本方法を使用して、種々のイオン化法で生じた低存在量の標識フラグメント（例えば、タンパク質及びペプチドフラグメンテーションによって生じたｄ-、及びｗ-イオン）の同定を助けることができる。
【０１０９】
質量欠損の使用は、質量分析計で２種以上のソースから得られた同一分子の相対存在量の定量化にも適用できる（例えば、WO00/11208、EP1042345A1、及びEP979305A1参照）。この特定の方法論を使用すると、ある元素を当該元素の安定な同位体と置換することで他の標識と異なる標識をオリゴマーに結合させることができる。標識化後ソースを混合し、質量スペクトル中、各ソース由来の分子又は標識の相対存在量を数量化することができる。異なる同位体を用いて、各ソース由来の同一分子から生じるピークを一意的に区別する。この方法を標識中に１個以上の質量欠損元素を取り込むように修正すると、生成する標識分子又は標識が、生成する質量スペクトル中のいずれの化学ノイズとも置換されるので、この定量化を改良することができる。
【０１１０】
本発明の実施形態は、逆質量ラダー配列決定（同時係属出願番号60/242165及びPCT公開WO00/11208参照）及び米国特許第6,027,890号、及びPCT公開WO99/3250及びWO00/11208に概要が述べられているような他のＭＳタンパク質配列決定、定量化、及び同定方法のようなタンパク質配列決定法と併用することができる。質量欠損標識化の使用は、米国特許番号5,700,642、5,691,141、6,090,558及び6,194,144に概要が述べられている、ＭＳによるＤＮＡ配列決定法にも適用できる。さらに、本方法は、米国特許番号5,100,778及び5,667,984に概要が述べられている、多糖類の配列決定（タンパク質のグリコシル化パターンのような）に使用することができる。
【０１１１】
より広く、本方法を用いて、天然であれ、合成であれ、質量欠損標識がポリマーに共有結合できるという条件で、異なるソース由来のいずれのポリマーの同定（配列決定）又は定量化も改良することができる。
【０１１２】
本発明は、標識が分子に共有結合できるという条件で、異なるソース由来の非高分子化学種の構造同定又は相対定量化に使用することもできる。例としては、差次的（病気組織対健康組織）アミノ酸解析；差次的ヌクレオチド解析；差次的糖解析；差次的脂肪酸解析及び不飽和かつ分岐脂肪酸の構造決定；脂質解析及び構造決定；及び栄養品質管理適用、及び組合せライブラリータグ（米国特許第6,056,926号に概要が述べられているような）が挙げられる。
【０１１３】
まず核酸の質量欠損標識化を考えると（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、米国特許第6,090,558号と第6,194,144号はそれぞれ、プライマー配列中にユニークな質量標識を組み込んだ合成フラグメントからＤＮＡをいかに配列決定できるかについて述べている。対照的に、本発明は、非標識フラグメントから標識フラグメントを区別し、かつより頑強でありながら感受性の方法を提供するため、質量欠損を有する標識のみを用いて標識化を行うことを条件とする。質量欠損標を使用することの別の利点は、平行して配列決定しうる核酸数の増加である。質量欠損標識化（より一般的な標識化プロセスではなく）の利点は、以前の研究では開示されていなかった。
【０１１４】
同様に、WO00/11208、EP1042345A1、EP979305A1、及び米国特許第6,027,890号は、異なるソース間のタンパク質及びＤＮＡ分子の差次的解析及び定量化のためにユニークな質量標識を使用することについて述べている。しかし、これら各参照文献は、ユニークな質量標識中に質量欠損元素を組み込むという利点を予測も特定もし損なっている。
【０１１５】
次にオリゴヌクレオチド標識化を考えると、EP698218B1は、標識炭水化物の使用及びそれらのアッセイにおける使用について述べており、かつ米国特許第5,100,778号及び第5,667,984号は、オリゴ糖配列をＭＳで決定するための質量標識の使用について述べている。ここで開示されている技術は、ユニークな質量タグによる標識化には適用できるかもしれないが、ＭＳピークをスペクトルの非干渉領域にシフトさせることを目的として標識に質量標識を組み込むことは開示又は評価されていない。従って、本明細書で述べる質量欠損標識化の方法論の適用は、先行技術に記述されているような（標識中の質量欠損の組込みに適切な修正を伴って）又は当業者に利用可能ないずれかの他の方法によって炭水化物を標識化すること、及び質量分析計内で質量欠損標識フラグメントを同定することによって、複雑な炭水化物の糖配列を同定する方法を提供する。炭水化物の構造は、全体的又は部分的に、上述したＤＮＡ及びＭＳ/ＭＳタンパク質配列決定法と同様に、最小標識フラグメントから、質量付加によって決定することができる。この場合もやはり、質量欠損元素の標識中への組込みが、化学ノイズから標識フラグメントを分離するのに有効である。
【０１１６】
次に脂質について考えると、脂質の脂肪酸組成は、グリセロールリン酸骨格を質量欠損含有標識で標識化し、かつランダムに脂肪酸を加水分解して親脂質のフラグメントを生成することによって決定することができる。そして、あらゆる可能な脂肪酸の組合せを斟酌した標識グリセロールリン酸骨格に対する質量付加によって親脂質の脂肪酸組成を決定することができる。
【０１１７】
特定の実施形態では、当業者に一般的に利用可能な方法によって、アミノ酸、脂質、及びヌクレオチドを誘導体化することができる。異なる試料から得られ又は抽出された分子の誘導体化に同位体的に別個の標識を使用し、ＭＳによって差次的定量化解析を行うことができる。しかし、各場合に、質量欠損元素の標識中への組込みは、標識分子をスペクトル中の他の化学ノイズから分離し、かつより正確な相対存在量の測定値を得る能力を改良することができる。しかし、標識中に異なる数の質量欠損元素を組み込むと、生成質量スペクトル中で同時に区別できる試料数を増やすことは先行技術では予測されていない。この方法論を適用して、生体試料中の代謝物の同定及び定量化を改良することができ（例えば、2000年４月19日提出の米国特許出願番号09/553,424，Metomics法参照）、あるソースから同位体富化代謝物の混合物を得、次いで質量欠損含有標識で誘導体化して、同位体富化代謝物の非富化形態からの同定及び定量化を容易にする。
【０１１８】
オリゴマーの配列決定及び同定に加え、質量欠損標識化を用いて生物活性巨大分子（例えば、タンパク質、核酸及びオリゴ糖のようなオリゴマー）の構造及び機能を精査することができる。
【０１１９】
重水素交換方法論（Andersenら,J.Biol.Chem.276(17):14204-11(2001)）は、リガンド結合に関与する二次及び高次タンパク質構造及び領域を精査するのに使用されている。溶媒にさらされ、かつ結合リガンドで埋め込まれ或いは隠されていない部分は、重水の存在下、ずっと速く水素を重水と交換する。続くタンパク質のタンパク質分解と、重水素化及び非重水素化タンパク質分解フラグメントの質量スペクトル解析により、該部分が特異的な高次構造の元素又は結合エピトープに関与しているという情報について導き出すことができる。
【０１２０】
本明細書では改良方法を提供し、重水素の代わりに質量欠損元素を用いて、オリゴマー又は他の巨大分子を標識する。特異的な反応基を標的にすることができる質量欠損を有する元素を組み込んだ小分子を利用し、かつ例えば、無処置又はタンパク質分解されたタンパク質試料のフラグメンテーションパターンを解析することにより、質量欠損標識で標識され又は標識されていない生成物を検索することで構造又は機能についての情報を得ることができる。この情報は、質量欠損標識が与える化学ノイズを減少させることで、容易かつ確実に得られる。具体的には、タンパク質チロシン残基を標的にする臭素又はヨウ素ガスのような質量欠損標識に活性タンパク質をさらすことができる。チロシン残基は、その幾何的遺伝子座（すなわち、表面対埋没）及びリガンド結合性における関与によって差次的に標識する。タンパク質は、前タンパク質分解と共に、又は前タンパク質分解なしで断片化し、臭素又はヨウ素原子の組込みから生じるピークを検索することで、質量分析計内で容易にチロシン標識化パターンを精査することができる。
【０１２１】
代替実施形態では、質量欠損標識が有益な用途を持ちうる領域は、既に質量欠損を有する元素を含まない（ほとんど生物学的に誘導される物質）小分子と巨大分子の両方の組合せ解析にある。この応用では、米国特許第6,056,926号に記述されているようなタギング元素を組み込むことで、組合せライブラリーとして生成されるエンティティー（例えば、抗体と酵素、多糖、ポリヌクレオチド、医薬品、又は触媒を含むタンパク質及びペプチド）の複雑な混合物を活性について精査しかつ同定することができる。タグ数を増やし、かつ質量欠損元素を組み込んだタグを用いることで、より大きい組合せライブラリーを評価することができる。所望の結合特性を有する当該エンティティーは、該質量欠損標識と等しい質量のシフトを表示するだろう。非常に複雑な混合物中でさえ、質量欠損の結果としてシフトしたピークを同定することはわかりやすい。
【０１２２】
実施形態の説明
特定の実施形態では、本発明の方法は、オリゴマー、特にオリゴマーの末端部分の配列決定に使用することができる。一局面では、本発明は、タンパク質の末端部分の配列決定方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
【０１２３】
（ａ）タンパク質を、Ｃ-末端又はＮ-末端標識化部分と接触させ、タンパク質のＣ-又はＮ-末端に標識を共有結合させて標識タンパク質を形成する工程；及び
【０１２４】
（ｂ）質量分析的フラグメンテーション法を用いて標識タンパク質を解析する工程、及び
【０１２５】
（ｃ）生成した質量スペクトル中の他の非末端配列フラグメントから、標識末端質量ラダーをアルゴリズム的に脱重畳することによって、少なくとも２個のＣ-末端又は２個のＮ-末端残基の配列を決定する工程。
【０１２６】
本発明のこの局面では、タンパク質は、本質的にいずれのソースからも得ることができる。好ましくは、タンパク質を単離かつ精製して干渉成分を除去する。単離タンパク質をＣ-末端又はＮ-末端標識化部分と接触させ、タンパク質のＣ-又はＮ-末端に標識を共有結合させて、質量分析フラグメンテーション法による解析に好適な標識タンパク質を形成することができる。
【０１２７】
標識オリゴマー
以下、標識タンパク質に関して本発明を例証するが、本技術の当業者は、使用する標識及び標識化方法を他の標識オリゴマー（例えば、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、合成オリゴマー等）の調製に適合できることが分かるだろう。
【０１２８】
標識タンパク質
水性又は水性／有機混合溶媒環境における種々の物質によるタンパク質の標識化は技術的に公知であり、本発明の実施に有用な種々多様な標識化試薬及び方法は、当業者にとって容易に利用できる。例えば、Meansら,タンパク質の化学的修飾,Holden-Day,San Francisco,1971；Feeneyら,タンパク質の修飾：食品、栄養及び薬理学的局面,Advances in Chemistry Series,Vol.198,American Chemical Society,Washington,D.C.1982；Feeneyら,食品タンパク質：化学的及び酵素的修飾による改良,Advances in Chemistry Series,Vol.160,American Chemical Society,Washington,D.C.,1977；及びHermanson,生物接合技術,Academic Press,San Diego,1996を参照せよ。
【０１２９】
標識化を行い、該タンパク質のＮ-又はＣ-末端のどちらかからＰＳＴを決定することができる。約59〜90％の真核生物タンパク質は、Ｎ-末端アセチル化されているので、Ｎ-末端標識化に不応性である。しかし、このようなタンパク質の自然Ｎ-アセチル基は、時にはこの発明の目的で標識として使用することができるが、Ｎ-末端の４残基中１個以上のアミノ酸がイオン化できるか（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、又はグルタミン酸残基である）、又はイオン化可能に誘導できる（例えば、チロシン、セリン、及びシステイン残基）場合のみである。従って、Ｎ-又はＣ-末端のどちらかを標識するための戦略は、いずれの任意タンパク質についても最高度の配列決定能力を与えるように提供される。一旦標識を決定すると、脱重畳アルゴリズムを修飾して、どの修飾残基にも対応する集団を検索することができる。
【０１３０】
フラグメンテーションスペクトルの特徴
飛行時間型質量スペクトル（図１）は、基本的にディテクタープレートに突き当たるイオンの数（カウント）である。イオンがディテクタープレートに突き当たる時間が、プレートに突き当たるイオンの質量電荷（ｍ/ｚ）比を決定する。ディテクタープレートを既知のｍ/ｚ分子で較正する。一般に、検出器でカバーされる大きさの範囲の精度は、ｍ/ｚ値の平方根として変化する。これは、質量分析計のｍ/ｚを増やすと絶対質量精度が減少することを意味する。従って、シグナルは常に各大きさのビン内でゼロ以上である。
【０１３１】
断片化タンパク質の質量スペクトルのいくつかの特徴は、本発明のアルゴリズムによって脱重畳される標識ペプチドの相対シグナル長によるが、真のタンパク質配列を同定又は正しく順位づける能力を阻害しうる。相対シグナル長は、質量スペクトル中の他のイオン及びノイズの存在量に対する標識ペプチドフラグメントイオン存在量として定義される。第１の特徴は、親タンパク質の多電荷状態であり、かつ標識ペプチドフラグメントの生成物による非標識切断は、全ｍ/ｚにおけるカウントに寄与する。早くからディテクタープレートに達するイオンの電荷の寄与は、ディテクタープレートに突き当たるより高いｍ/ｚのイオンの基線をさらにドリフトさせうる。このことは、質量スペクトルの明白な基線シフトとして観察される（図１）。親タンパク質の多電荷状態は、約1000amuより高いｍ/ｚ位置で同様に局所的な基線の変化にも寄与しうる。このことは、図１中、約2000amuより高いｍ/ｚ位置で、さらに明瞭に観察される。
【０１３２】
観察される第２の特徴は（図２）、高度に断片化する条件は（例えば、インソースフラグメンテーションのための高ノズル電位）、質量分析計内の周期的な質量対電荷位置におけるフラグメントイオンの存在量を増やすこととなる。12.000000として定義される12Ｃの質量較正スケールに基づき、これらタンパク質フラグメントは、約１amuの間隔をあけた特徴的パターンのピークを形成する。高度に効率的なフラグメンテーション条件では、質量スペクトル中ほぼ１amu間隔でピークが現れる。ピークとピークの平均間隔は、断片化される特定タンパク質によってわずかに異なって観察される。これは、各amuのピークで表されるタンパク質又はフラグメントの元素組成のわずかな相異によると考えられる。
【０１３３】
高度に断片化する条件では、事実上質量スペクトル中のすべてのピークが、このほぼ１amuのパターンをオーバレイする（図３）。本発明の主要な局面を可能にするのは、この観察である。第１に、大部分のピークがこのパターン（又はこのパターンの多電荷状態類似体）をオーバレイするので、標識が独特な核結合エネルギーを有する１個以上の元素を含む標識フラグメントのような、この周期的間隔から少し離れている標識フラグメントからシグナルピークを容易に区別することができる。第２に、周期性は、スペクトルを局所ノイズについて補正できるように、質量スペクトル中の局所的な最小及び最大の決定を可能にし、質量スペクトル中の各質量対電荷位置におけるカウントの実際の存在量をより良く決定できる。第３に、高度に断片化する条件における望ましくないスペクトルノイズについては、平均的又は特徴的なピーク形状を決定し、このノイズを質量スペクトルの残りから脱重畳又は取り去ることによって、その順位アルゴリズムに対する寄与を軽減し、かつ本発明のアルゴリズムで実現される配列決定の信頼を高めることができる。示されているこの主要パターンに加え、他のより大きな周期性パターンもデータ中に見られ、同様に適用して配列脱重畳を補助しうることは、当業者には明かである。
【０１３４】
標識
上述したように、以下の考慮すべき事項は、標識化物質の選択に妥当である。
【０１３５】
（ｉ）標識の質量は、好ましくはユニークであり、かつ好ましくはスペクトルの低いバックグラウンドの領域にフラグメントをシフトさせ；
【０１３６】
（ii）標識は、好ましくは固定した正又は負電荷を含み、Ｎ-又はＣ-末端における遠隔電荷フラグメンテーションを方向づけ；
【０１３７】
（iii）標識は、好ましくはフラグメンテーション条件下で頑強であり、かつ好ましくないフラグメンテーションを受けず；
【０１３８】
（iv）標識化化学は、好ましくは一連の条件、特に変性条件下で効率的であり、それによってＮ-又はＣ-末端を再現的かつ均一に標識化し；
【０１３９】
（ｖ）標識タンパク質は、好ましくは選択したＭＳ緩衝液系内で可溶性の状態のままであり；かつ
【０１４０】
（vi）標識は、好ましくはタンパク質のイオン化効率を高め、又は少なくともイオン化効率を抑制せず；
【０１４１】
（vii）標識は、２個以上の同位体的に異なる種の混合物を含み、各標識フラグメント位置でユニークな質量スペクトルパターンを生成することができる。
【０１４２】
標識選択基準を考慮して、好ましい標識化部分は検出促進成分、イオン質量特色成分及びＣ-末端又はＮ-末端反応性官能基を有するものである。反応基は、他の２つの標識成分のどちらか又は両方と直接結合することができる。
【０１４３】
一実施形態では、標識を対で用い、質量スペクトル中の他のピークから質量ラダーを同定する能力をさらに高めることができる。混合同位体標識の使用は、大量の同位体対は質量スペクトル中標識フラグメントについてだけ存在し、かつ同位体は通常同様のイオン化及びフラグメンテーション効率を示すので、特に標識フラグメントピークのさらなる脱重畳に適する。１個以上のメチル若しくはメチレン基、又は電荷状態が異なる標識の類似体を使用することもできる。さらに２つの化学的に異なる分子を二重標識化状態で使用して標識フラグメント質量ラダーの同定を促進することができる。一実施形態では、単一の試料を二重標識で同時に標識し、混合質量スペクトルを生成することができる。好ましい実施形態では、二組の試料を独立的に標識し、ＭＳによるフラグメンテーション前にほぼ同割合で混合物することができる。この実施形態は、側残基も標識される場合に、シグナル希釈の可能性を最少にするので好ましい。別の実施形態では、二組の試料を別個の標識で標識し、ＭＳで別々に断片化し、かつ質量スペクトルを一緒に合わせて仮想的な二重標識スペクトルを形成する。
【０１４４】
別の実施形態では、反応性官能基を、検出促進成分及びイオン質量特色成分の一方又は両方からリンカーで分離する。リンカーは、好ましくは化学的に安定かつ不活性であり、また該反応基と、タグの他の２成分の少なくとも１つとを有効に分離できるように設計する。本発明の好ましい実施形態では、リンカーは、炭化水素鎖、又は最も好ましくはアリール若しくはヘテロアリール環に結合している炭化水素鎖で構成され、好ましくはイオン性基と連結基との間をさらに分離する。
【０１４５】
本技術の当業者には理解されるように、本発明では種々の炭化水素鎖及び修飾炭化水素鎖を利用できる。フェニル環に結合している好ましい炭化水素鎖は、アルカンのファミリーに見られ、特に好ましいリンカーは炭素原子数が２〜約20の範囲の長さである。本発明の好ましい実施形態では、リンカーはフェネチル基である。
【０１４６】
検出促進成分
本明細書で使用する場合、検出促進成分は、質量分析計でタンパク質フラグメントの検出を促進する標識化部分の一部を指す。従って、検出促進成分は、質量分析計のイオン化チャンバー内でフラグメンテーション条件下、正荷電イオン種を与え、又はこの成分は、質量分析計のイオン化チャンバー内でフラグメンテーション条件下、負荷電イオン種を与えうる。多くの検出促進成分では、存在するイオン化種の量は、タンパク質を可溶化するために用いる媒体によって決まる。好ましい検出促進成分（すなわち、正又は負の電荷を生成できる種）は、以下の３カテゴリーに分類することができる：１）“ハード”電荷を保有する成分、２）“ソフト”電荷を保有する成分、及び３）電荷を与えないが、“ソフト”電荷を保有するタンパク質残基に近似している成分。
【０１４７】
“ハード”電荷を保有する成分は、媒体のｐＨと関係なく、すべての条件下で実質的にイオン化される原子の配置である。“ハード”正荷電検出促進成分としては、限定するものではないが、テトラアルキル又はテトラアリールアンモニウム基、テトラアルキル又はテトラアリールホスホニウム基、及びＮ-アルキル化又はＮ-アシル化ヘテロ環式及びヘテロアリール（例えば、ピリジニウム）基が挙げられる。“ハード”負荷電検出促進成分としては、限定するものではないが、ホウ酸テトラアルキル又はホウ酸テトラアリール基が挙げられる。
【０１４８】
“ソフト”電荷を保有する成分は、そのｐＫａより高いか又は低いｐＨで、それぞれイオン化される原子の配置である（すなわち、塩基及び酸）。本発明の文脈では、“ソフト”正電荷は、８より大きい、好ましくは10より大きい、最も好ましくは12より大きいｐＫａを有する塩基が挙げられる。本発明の文脈では、“ソフト”負電荷は、4.5未満、好ましくは２未満、最も好ましくは１未満のｐＫａを有する酸が挙げられる。極度なｐＫａでは、“ソフト”電荷は“ハード”電荷としての分類に近づく。“ソフト”正荷電検出促進成分としては、限定するものではないが、１°、２°、及び３°アルキル又はアリールアンモニウム基、置換及び無置換ヘテロ環式及びヘテロアリール（例えば、ピリジニウム）基、アルキル又はアリールシッフ塩基又はイミン基、及びグアニド基が挙げられる。“ソフト”負荷電検出促進成分としては、限定するものではないが、アルキル若しくはアリールカルボキシレート基、アルキル若しくはアリールスルホネート基、及びアルキル若しくはアリールホスホネート基又はホスフェート基が挙げられる。
【０１４９】
“ハード”及び“ソフト”の両荷電基では、本技術の当業者には理解されるように、該基は、反対電荷の対イオンを伴うだろう。例えば、種々の実施形態で、正荷電基の対イオンとしては、低級アルキル有機酸（例えば、酢酸）、ハロゲン化有機酸（例えば、トリフルオロ酢酸）、及び有機スルホネート（例えば、Ｎ-モルフォリノエタンスルホネート）のオキシアニオンが挙げられる。負荷電基の対イオンとしては、例えば、アンモニウムカチオン、アルキル若しくはアリールアンモニウムカチオン、及びアルキル若しくはアリールスルホニウムカチオンが挙げられる。
【０１５０】
中性であるが、“ソフト”電荷を保有するタンパク質残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸）に近似する成分を検出促進成分として使用することができる。この場合、標識はイオン化又はイオン性基を保有せず、検出促進は、電荷を保有する近接タンパク質残基によって与えられる。本発明の文脈では、近似は、該タンパク質の標識末端の約４残基以内として、さらに好ましくは該タンパク質の標識末端の約２残基以内として定義される。
【０１５１】
標識の検出促進成分は、多荷電であり或いは多荷電になりうる。例えば、多数の負電荷を有する標識は、単一荷電種（例えば、カルボキシレート）を取り込み、又は１個以上の多荷電種（例えば、ホスフェート）を取り込むことができる。本発明のこの実施形態の代表例では、例えばポリアミノカルボキシレートキレート剤（例えば、ＥＤＴＰ、ＤＴＰＡ）のような多数のカルボキシレートを持っている種をタンパク質に結合する。ポリアミノカルボキシレートをタンパク質及び他の種に結合する方法は技術的に周知である。例えば、Mearesら,“インビボキレート−標識タンパク質及びポリペプチドの特性”,タンパク質の修飾：食品、栄養、及び生理学的局面“,Feeneyら,Eds.American Chemical Society,Washington,D.C.,1982,pp.370-387；Kasinaら,Bioconjugate Chem.,9：108-117(1998)；Songら,Bioconjugate Chem.,8：249-255(1997)を参照せよ。
【０１５２】
同様の様式で多数の正電荷を有する標識を購入し、又は当業者が利用しやすい方法で調製することができる。例えば、２個の正電荷を持つ標識化部分は、ジアミン（例えば、エチレンジアミン）から迅速かつ容易に調製することができる。代表的な合成経路では、ジアミンを技術的に公知の方法で単一保護し、次いで未保護アミン部分を、１個以上の正電荷を持つ種（例えば、(2-ブロモエチル)トリメチルアンモニウムブロミド(Aldrich)）でジアルキル化する。技術的に認められている方法で脱保護して、少なくとも２個の正電荷を持つ反応性標識化種を与える。多荷電標識化種に対する多くのこのような簡単な合成経路は、本技術の当業者には明かだろう。
【０１５３】
イオン質量特色成分
イオン質量特色成分は、好ましくは質量スペクトル分析でユニークなイオン質量特色を示す標識化部分の一部である。イオン質量特色成分としては、タンパク質がイオン化する条件下で効率的にイオン化しない部分（例えば、芳香族炭素化合物）及びタンパク質イオン化条件下で容易にイオン化して多荷電イオン種を生成する分子が挙げられる。両タイプの化学エンティティーを使用して、標識に結合しているアミノ酸及びペプチドのイオン／質量特色を質量スペクトル中でシフトさせることができる。結果として、標識アミノ酸及びペプチドは、生成質量スペクトル中のイオン／質量パターンによって、非標識アミノ酸及びペプチドから容易に区別される。好ましい実施形態では、イオン質量特色成分は、質量分析フラグメンテーション時に生じるタンパク質フラグメントに、20種の天然アミノ酸のどの残基質量とも一致しない質量を与える。
【０１５４】
一実施形態では、イオン質量特色成分は、タンパク質の主要構成要素とは異なる核結合エネルギーを示すいずれの元素でもよい。タンパク質の主要構成要素は、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、及びＳである。12Ｃ＝12.000000質量基準というかたちで核結合エネルギーを定義すると、ユニークなイオン質量特色を有する好ましい元素は、周期表で原子番号１７(Ｃｌ)〜７７（Ｉｒ）の元素である。標識のイオン質量特色成分として使用するのに特に好ましい元素は、原子番号３５(Ｂｒ)〜６３(Ｅｕ)の元素である。イオン質量特色成分として使用するのに最も好ましい元素は、原子番号３９(Ｙ)〜５８(Ｃｅ)の元素である。Ｂｒ及びＥｕは、両者ともほぼ同割合の２つの安定な同位体及び質量分析計内で断片化されるタンパク質で観察される周期的なピークパターンとは有意に異なる核結合エネルギーを示すので、標識の特に好ましい成分である。元素Ｉ及びＹも、質量スペクトル中の周期的なタンパク質フラグメントピークとは核結合エネルギーで大きな相異を示し、かつ容易に標識中に取り込まれるので、特に好ましいイオン質量特色成分である。ユニークなイオン質量特色元素の好ましいかつ最も好ましいリスト内には多くの遷移金属があることが認められる。多くの又はすべてのこれら物質は、公知のＹ及びＥｕキレートと同様にキレートとして標識中に容易に取り込めることが当業者には容易に分かるだろう。
【０１５５】
Ｆの質量欠損元素としての限定された用途と対照的に（Schmidtら,WO99/32501（1999年7月1日））、本発明は、ずっと大きな質量差ひいては広い用途を示す質量欠損元素を使用する。例えば、アリール上の単一のヨウ素置換は、５個のアリールＦ置換の質量欠損の５倍を超えて向上する0.1033amuの質量欠損を生じさせる。アリール環（Ｃ6Ｈ4Ｉ）上の単一のＩは、202.935777amuの単一同位体質量を示す。これは、202.974687amuで安定の同位体とヘテロ原子含有有機分子（[12Ｃ]9[15Ｎ][16Ｏ]5）の最も近い組合せと192ppm異なる。従って、Ｉの質量欠損と同様の質量欠損を示すいずれの元素（すなわち、原子番号35〜63）の単一置換も、どの組合せの有機ヘテロ原子でも総質量3891amuに識別可能な質量欠損（10ppmレベルで）を生じるだろう。２つのこのような元素は、総質量7782amuに識別可能な質量欠損を示すだろう。３つのこのような元素は、総質量11673amuに識別可能な質量欠損を示すだろう。代わりに、単一、二つ、及び三つのＩ（又は等価な質量欠損元素）の付加は、10ppmの質量分解能を有する質量分析計内で総質量4970amuに対して相互に区別することができる。
【０１５６】
別に実施形態では、多荷電標識を用いてユニークなイオン質量特色成分を生じさせることができる。このような多荷電標識は、異なる核結合エネルギーを取り込むことができ、又は主要タンパク質構成成分と同様の核結合エネルギーの元素のみから成りうる。このような電荷状態は、標識中に取り込まれた“ハード”若しくは“ソフト”電荷又は“ハード”と“ソフト”電荷の組合せで形成されうる。２〜４の“ハード”多電荷状態が好ましい。標識がＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、及びＳと同様の核結合エネルギーを有する元素のみから成る場合、３の“ハード”多電荷状態が最も好ましい。標識がＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、及びＳと異なる核結合エネルギーを示す少なくとも１個の元素を含む場合、２の“ハード”多電荷状態が最も好ましい。
【０１５７】
当業者には理解されるように、非標識アミノ酸及びペプチドのフラグメンテーションからのみならず、試料及び／又はマトリックス中の不純物からも偽質量スペクトルピークが生じうる。標識のイオン質量特色の一意性をさらに高め、かつ“ノイズ”から所望標識フラグメントを同定できるようにするため、標識の質量を最適化することでスペクトルノイズの少ない領域に標識フラグメントをシフトさせることが好ましい。例えば、標識質量が、100amuより大きく、かつ700amu未満のイオン生成することが好ましい。これは、低分子量標識の分子量を大きくするか、又は高分子量標識上の電荷数を増やすことによって為しうる。
【０１５８】
標識化部分にさらにユニークな質量特色を与えるための別の方法は、標識に安定な同位体を取り込むことである（例えば、Gygiら,Nature Biotechnol.17:994-999(1999)参照）。例えば、標識化部分内に８個の重水素原子を取り込み、かつ該タンパク質を重水素化標識と非重水素化標識の50:50混合物で標識することによって、その結果の該標識を含む単一荷電フラグメントは、等しい強度の二重線として容易に；一方は非重水素化標識を有する種に相当する質量で、他方は８amuの間隔を空けて重水素化標識を有する種に相当する質量で同定される。好ましい実施形態では、質量差は、単一電荷状態で約１amuより大きい。最も好ましい実施形態では、質量差は、単一電荷状態で約４〜約10amuである。Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、及びＳと有意に異なる核結合エネルギーを示す元のを多数の同位体の取り込みが好ましい。Ｂｒ及びＥｕ元素は、約50:50の２天然同位体存在比を示すので、最も好ましい。
【０１５９】
標識化部分にさらにユニークな質量特色を与える別の方法は、質量スペクトル中、対応するセットのフラグメントピークを認識できるように、標識上にアルキル及び／又はアリール置換を混合して取り入れることである。例えば、トリメチルアンモニウム基を含む標識と、トリメチルアンモニウム基に代えてジメチルエチルアンモニウム基を含む同一標識との混合物でタンパク質を標識することができる。この標識化部分は、配列中相互に14amuだけ異なる各アミノ酸の２つのフラグメントイオンピークを生成する。当業者には、多くのこのような組合せが得られることが明白である。
【０１６０】
反応性基
標識化部分の第３成分は、関心のあるポリマーの末端と反応性の官能基である。特定の実施形態では、官能基は、Ｎ-末端アミノ基、Ｃ-末端アミノ基又はＮ-若しくはＣ-末端アミノ酸の別の構成成分で、タンパク質と反応性である。
【０１６１】
反応性官能基は、タグ上のいずれの位置にも配置することができる。例えば、アリール核上又はアリール核に結合したアルキル鎖のような鎖上に配置することができる。反応性基がアルキル、又はアリール核につながれた置換アルキル鎖に結合している場合、反応性基は、好ましくはアルキル鎖の末端位に配置される。本発明の実施に有用な反応性基及び反応の種類は、バイオ複合化学の分野で一般的に周知なものである。現在好ましい種類の反応は、水性又は水性／有機混合溶媒環境中比較的穏やかな条件下で進行する反応である。
【０１６２】
タンパク質中の一級アミノ基（Ｎ-末端を含む）を標的にする特に好ましい化学としては、以下のものが挙げられる：フッ化アリール、塩化スルホニル、シアネート、イソシアネート、イミドエステル、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｏ-アシルイソウレア、クロロカーボネート、カルボニルアジド、アルデヒド、及びハロゲン化アルキル及び活性化アルケン。タンパク質のカルボキシル基と反応する化学成分の好ましい例は、ハロゲン化ベンジル及び特にＮ-ヒドロキシスクシンイミドで安定化されていればカルボジイミドである。これら両カルボキシル標識アプローチは、Ｃ-末端のカルボキシルと一緒にアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）を含有するカルボキシルを標識すると予測される。これら及び他の有用な反応は、例えば、March,最新有機化学,第３版,John Willey & Sons,New York,1985；Hermanson,バイオ複合技術,Academic Press,San Diego,1996；及びFeeneyら,タンパク質の修飾；化学の進歩シリーズ,198巻,American Chemical Society,Washington,D.C.,1982で論じられている。
【０１６３】
反応性官能基を選択して、タグを構築するのに必要な反応に関与せず、又は相互作用しないようにすることができる。代わりに、保護基の存在によって反応の関与から反応性官能基を保護することができる。
【０１６４】
当業者は、特定の官能基を保護して選択した所定の反応条件と干渉しないようにする方法を知っている。有用な保護基の例のため、例えば、Greeneら,有機化学合成の保護基,John Willey & Sons,New York,1991を参照せよ。
【０１６５】
当業者は、多数の標識化部分に対して標識化法を簡単に利用できることを知っている。本発明の例示として、Ｎ-末端標識化基（塩化ダンシル）及びＣ-末端標識化基（カルボジイミド）を、その使用のさらに完全な説明を参照しながら提供する。この２つの標識化部分に焦点を合わせたのは、説明の明瞭さのためであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１６６】
塩化ダンシルは、アルカリ性ｐＨでタンパク質中のアミンによる求核攻撃を受け、芳香族スルホンアミドを生成する。しかし、ｐＨによっては塩化スルホニルは二級アミンとも反応することができる。芳香族構成成分は、反応生成物の分光学的（例えば、蛍光）検出を可能にする。塩化ダンシルは、リジンのε-アミノ基とも反応する。α-及びε-アミンとの間のｐＫの差を利用して、これら基の一方を他方に優先的に修飾することができる。
【０１６７】
カルボジイミドがカルボキシル基と反応し、水性溶液中では非常に不安定であるが、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドの添加の結果、一級アミンと反応してアミドを生成できる酸安定性中間体の生成によって安定化されるＯ-アシルイソウレア中間体が生じる。代わりに、良い求核試薬（例えば、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド又は他のアミン）の非存在下では、不安定なＯ-アシルイソウレア中間体は、再配列されてＮ-アシルイソウレアを形成しうる。この種は、直接タンパク質標識として使用できる。カルボキシル末端、グルタミン酸及びアスパラギン酸残基は、すべて酸性ｐＨ（4.5〜５）でタンパク質中のカルボジイミドの標的である。カルボジイミド化学は、タンパク質のＣ-末端を標識するのに有用である。カルボジイミド化学を利用する場合、一般に過剰のアミンをタンパク質溶液に添加して架橋反応を阻止することが好ましい。別の例示実施形態では、タンパク質アミンを２段階プロセスで標識する；アミン含有蛍光分子をタンパク質又はタンパク質に結合しているスペーサーアームのＮ-ヒドロキシスクシンイミド中間体を通じてタンパク質につなぐ。
【０１６８】
合成
反応性基、リンカー、及びイオン性基を選択すれば、当業者は、標準的な有機化学反応を利用して最終化合物を合成することができる。本発明で使用するのに好ましい化合物は、PETMA-PITC、つまり類似薬剤である。この化合物は、カップリングでフェニルイソチオシアネートの優れた特性を保持している。さらに、この化合物は、フェニル環の電子構造がエチルリンカーによって四級アンモニウム基から十分離れており、イソチオシアネートが四級アンモニウム基に邪魔されずに反応できるので、分析法の標識としてよく機能する。PETMA-PITC、C5 PETMA-PITC及びPITC-311の調製については、1996年7月9日発行のAebersoldらの米国特許第5,534,440号で述べられている。
【０１６９】
適切な標識化部分の選択では、標識をオリゴマーに結合させる条件は、末端が均一に標識され、かつオリゴマーが適宜のＭＳ緩衝系内で可溶性のままであることを保証すべきである。例えば、タンパク質に標識を結合させる条件は、タンパク質のＮ-又はＣ-末端が均一に標識され、かつその標識タンパク質が適宜のＭＳ緩衝系内で可溶性のままであることを保証すべきである。典型的に、標識化は、変性条件（例えば、界面活性剤又は８Ｍウレア）で行われる。界面活性剤及びウレアは、両方ともＭＳイオン化を抑制し、標識タンパク質試料の迅速な除去かつ適切なＭＳ緩衝液への移動を与える方法も利用すべきである。
【０１７０】
検出可能部分
別の好ましい実施形態では、例えばタンパク質精製及び分離プロセス（例えば、電気泳動法）でその検出性を高める部分でタンパク質を標識する。この検出可能部分は、例えば、分光法（例えば、ＵＶ/Ｖis、蛍光、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）等）、放射性同位体の検出等によって検出することができる。タンパク質がＵＶ/Ｖisで検出される場合、通常、該タンパク質に発色団標識（例えば、フェニル、ナフチル等）を結合させることが望ましい。同様に、蛍光分光法による検出では、好ましくはタンパク質に発色団を結合する。例えば、Quantum DyeTMは、蛍光Ｅｕキレートであり、5-カルボキシ-2',4',5',7'-テトラブロモスルホンフルオレッセインスクシンイミジルエステルはＮ-末端反応性の臭素含有発色団である（それぞれ、Research Organicsからカタログ#0723Q及びMolecular Probesからカタログ#C-6166で商業的に入手可能）。ＥＳＲでは、検出可能部分は、ニトロキシド基を含む部分のようなフリーラジカルでよい。タンパク質がＮＭＲで検出される場合、検出可能部分は、フッ素、13Ｃ等のようなＮＭＲアクセス可能な核を富化することができる。
【０１７１】
好ましい実施形態では、検出可能部分が発蛍光団である。例えば、SIGMA化学会社（Saint Louis,MO）、Molecular Probes（Eugene,R）、R&D systems（Minneapolis,MN）、Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway,NJ)、CLONTECH Laboratories,Inc.（Palo Alto,CA）、Chem Geness Corp.,Aldrich Chemical Company（Milwaukee,WI）、Glen Reserch,Inc.,GIBCO BRL Life Technologies,Inc.（Gaithersburg,MD）、Fluka Chemica-Biochemika Analytika（Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland）、及びPE-Applied Biosystems（Foster City,CA）、並びに当業者に公知の他の多くの供給元から、多くの反応性蛍光標識が商業的に入手可能である。さらに、当業者は、特定用途に適切な発蛍光団の選択の仕方を認識しており、かつ商業的に容易に入手できない場合は、必要な発蛍光団を新規に合成するか、又は商業的に入手可能な発蛍光団化合物を合成的に修飾して所望の蛍光標識に達することができる。
【０１７２】
以下の参照文献で例示されるように、特定のタグに適切な発蛍光団を選択するため、文献で利用可能な多くの実施ガイダンスがある：Pasceら,Eds.蛍光分光法（Marcel Dekker,New York,1971）；Whiteら,蛍光分析：実施アプローチ（Marcel Dekker,New York,1970）等。文献は、リポーター-クエンチャー対を選択するための蛍光及び色素生成分子及びその関連する光学特性の網羅的リストを提供する参照文献も含む（例えば、Berlman,芳香族分子の蛍光スペクトルのハンドブック,第２版（Academic Press,New York,1971）；Griffiths,有機分子の色と構成（Academic Press,New York,1976）；Bishop,Ed.,指示薬（Pergamon Press,Oxford,1972）；Haugland,蛍光プローブ及び研究化学薬品のハンドブック（Molecular Probes，Eugene,1992）Pringsheim,蛍光とリン光（Interscience Publishers,New York,1949）等。さらに、文献には、分子に添加できる容易に入手可能な反応性基による共有結合のためにリポーター及びクエンチャー分子を誘導体化するための高度なガイダンスがある。
【０１７３】
発蛍光団を他の分子及び表面に結合させるのに利用可能な化学の多様性及び有用性は、発蛍光団で誘導体化される核酸の調製に関する文献の広範な本文によって例示されている。例えば、Haugland（前出）；Ullmanら,米国特許第3,996,345号；Khannaら,米国特許第4,351,760号を参照せよ。従って、特定の適用のためにエネルギー交換対を選択すること、及び例えば小分子生物活性物質、核酸、ペプチド又は他のポリマーのようなプローブ分子にこの対のメンバーを結合させることは、本技術の当業者の十分能力内である。
【０１７４】
直接タンパク質に結合させる発蛍光団に加え、間接的手段で発蛍光団を結合させることもできる。一例示実施形態では、好ましくはタンパク質にリガンド分子（例えば、ビオチン）を共有結合させる。このリガンドは、本質的に検出可能であるか、又は本発明の蛍光分子のようなシグナル系に共有結合している別の分子（例えば、ストレプトアビジン）、或いは非蛍光化合物の転換によって蛍光化合物を生成する酵素に結合する。標識として関心のある有用な酵素としては、例えば、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、又はオキシダーゼ、特にペルオキシダーゼが挙げられる。蛍光化合物としては、上述したように、フルオレッセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が挙げられる。使用可能な種々の標識化又はシグナル生成系のレビューには、米国特許第4,391,904号を参照せよ。
【０１７５】
本発明の方法と共に使用可能な発蛍光団としては、限定するものではないが、フルオレッセイン、及びローダミン染料が挙げられる。そのフェニル部分上にタンパク質に発蛍光団を結合させるための結合官能性として使用できる置換基を有する、これら化合物の多くの適切な型が広く商業的に入手可能である。代わりに、α又はβ位にアミノ基を有するナフチルアミンのような蛍光化合物を、本明細書で述べる方法と共に使用することができる。このようなナフチルアミノ化合物には、1-ジメチルアミノナフチル-5-スルホネート、1-アニリノ-8-ナフタレンスルホネート及び2-p-トルイジニル-6-ナフタレンスルホネートが挙げられる。他の供与体としては、3-フェニル-7-イソシアナトクマリン、9-イソチオシアナトアクリジン及びアクリジンオレンジのようなアクリジン；N-(p-(2-ベンズオキサゾリル)フェニル)マレイミド；ベンズオキサジアゾール、スチルベン、ピレン等が挙げられる。
【０１７６】
有用な蛍光検出可能部分は、例えば、光又は電気化学エネルギーで、技術的に公知のいずれかの様式でそれらを励起させることで、蛍光を生じさせうる（例えば、Kulmalaら,Analytica Chimica Acta 386;1(1999)参照）。蛍光標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、適切な波長の光で発蛍光団を励起させ、生成する蛍光を検出することで、蛍光標識を検出することができる。蛍光は、写真フィルムを用い、電荷結合素子（ＣＣＤs）又は光電子増倍管などのような電子ディテクターを用いて視覚的に検出することができる。同様に、酵素的標識は、該酵素に適切な基質を与え、生じる反応生成物を検出することによって検出することができる。
【０１７７】
分離法とＭＳ配列決定法との間の処理工程が少ないほど、速くタンパク質を同定することができ、かつプロテオミック研究のコストが下がる。典型的な電気泳動緩衝液（例えば、Hochstasserら及びO'Farrel）は、質量分析計内でタンパク質のイオン化を抑制する成分（例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液及びドデシル硫酸ナトリウム）を含有する。これら成分は、ＭＳ内でイオン化を抑制しない他のさらに揮発性成分（例えば、モルフォリノアルキルスルホネート緩衝液及び短命な界面活性剤）と交換することができる。別の実施形態では、試料を重炭酸アンモニウム又は酢酸アンモニウム緩衝液で希釈して、質量分析計用の揮発性プロトン源を供給する。別の実施形態では、試料が分離プロセスの出口からＭＳの入口に移動するとき、クロマトグラフ的に、又は接線流透析を通じて緩衝液交換を行う。
【０１７８】
標識化手順
いくつかの場合、電気泳動緩衝液中に存在する塩（例えば、TRIS及びSDS）及び尿素が標識タンパク質のイオン化を抑制し、配列分析を潜在的に混乱させる小さい質量／電荷イオンを生成しうる。従って、スピン透析手順を利用して、ＭＳ分析前に迅速に緩衝系を交換することができる。代わりに、脱塩カラム（例えば、Milliporeから販売されているZipTipTM）を試料除去及び緩衝液交換に使用することができる。脱塩試料は、Wilm及びMannによって記述されているような最少のメタノールを添加した0.1Ｍ重炭酸アンモニウム、又はMarkによって記述されているような最少のアセトニトリルを添加した0.01Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（0.1％ギ酸を有する）に再懸濁させることができる。
【０１７９】
化合物のカップリング速度を調べ、化合物がポリペプチドの配列決定に確実に適するようにすることができる。一般に、カップリング速度が速いほど、その化合物は好ましい。50℃〜70℃で２〜10分のカップリング速度が特に好ましい。同様に、長時間にわたって反応混合物にさらされると、ペプチド結合が加水分解されるか、又はポリペプチド残基との非能率的かつ不可逆的な副反応をもたらし、質量スペクトルの脱重畳を複雑にしうるので、速い反応速度も好ましい。
【０１８０】
別の好ましい実施形態では、ポリペプチドに標識を結合させる前に、タンパク質混合物の１種以上の成分を可逆的に固体保持体に結合させる。固体保持体として、例えば、多数の樹脂、膜又は紙を含む種々の物質を使用することができる。これら保持体をさらに誘導体化して切断可能な官能性を取り込むことができる。この目的で使用できる多数の切断可能基としては、ジスルフィド（-Ｓ-Ｓ-）グリコール（-ＣＨ[ＯＨ]-ＣＨ[ＯＨ]-）、アゾ（-Ｎ=Ｎ-）、スルホン（-Ｓ[=Ｏ]-）、及びエステル（-ＣＯＯ-）結合が挙げられる（Tae,Methods in Enzymology,91:580(1983)）。特に好ましい保持体としては、Sequolon TM（Milligen/Biosearch,Burlington,Mass.）のような膜が挙げられる。これら保持体構成用の代表的な材料としては、とりわけ、ポリスチレン、多孔性ガラス、ポリフッ化ビニリデン及びポリアクリルアミドが挙げられる。特に、ポリスチレン保持体として、とりわけ以下が挙げられる：（１）(2-アミノエチル)アミノメチルポリスチレン（Laursen,J.Am.Chem.Soc.88：5344(1966)参照）；（２）アリールアミノ基を有する番号（１）と同様のポリスチレン（Laursen,Eur.J.Biochem.20:89(1971)参照）；（３）アミノポリスチレン（Laursenら,FEBS Lett.21:67(1972)参照）；及び（４）トリエチレンテトラミンポリスチレン（Hornら,FEBS Lett.36:285(1973)）。多孔性ガラス保持体としては、以下が挙げられる：（１）3-アミノプロピルガラス（Wachterら,FEBS Lett.35:97(1973)参照）；及び（２）N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルガラス（Bridgenら,FEBS Lett.50:159(1975)参照）。これら誘導体化多孔性ガラス保持体のp-フェニレンジイソチオシアネートとの反応が、活性化イソチオシアナトガラスを導く（Wachterら,全出）。ポリアクリルアミドベース保持体も有用であり、架橋β-アラニルヘキサメチレンジアミンポリジメチルアクリルアミド（Athertonら,FEBS Lett.64:173(1976)参照）、及びN-アミノエチルポリアクリルアミド（Cavadoreら,FEBS Lett.66:155(1976)参照）が挙げられる。
【０１８１】
当業者は、適切な化学を利用してポリペプチドを上記固体保持体に容易に結合させるだろう（一般的にMachleidt及びWachter,Methods in Enzymolzy:[29]固相配列決定での新しい保持体,263-277(1974)参照）。好ましい保持体及びカップリング法は、ＥＤＣカップリングを有するアミノフェニルガラス繊維紙（Aebersoldら,Anal.Biochem.187:56-65(1990)参照）；ＤＩＴＣガラスフィルター（Aebersoldら,Biochem.27:3860-6867(1988)参照）及び膜ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）（Immobilon P TM,Milligen/Biosearch,Burlington,Mass.）のSequeNet TM化学（Pappinら,タンパク質化学の最新の研究,Villafranca J.(ed.),pp.191-202,Academic Press,San Diego,1990参照）との併用を包含する。
【０１８２】
本発明の実地では、ポリペプチドの固体保持体への結合は、ポリペプチドと固体保持体との間の共有又は非共有相互作用によって起こりうる。ポリペプチドの固体保持体への非共有結合では、ポリペプチドが非共有相互作用によって固体保持体に結合するように、固体保持体を選択する。例えば、ガラス繊維固体保持体を、ポリブレン、ポリマー四級アンモニウム塩（Tarrら,Anal.Biochem.,84:622(1978)参照）で被覆して、ポリペプチドに非共有結合する固体保持体表面を与えることができる。他の適切な吸着固相が商業的に入手可能である。例えば、溶液中のポリペプチドを、ポリ二フッ化ビニリデン（PVDF,Immobilon CD,Millipore Corp.,Bedford,Mass.）又はカチオン表面で被覆したPVDF(Immobilon CD,Millipore Corp.,Bedford,Mass.）のような合成ポリマー上に固定化することができる。これら保持体は、ポリブレンと共に又は無しで使用することができる。代わりに、電気ブロッティングと呼ばれる方法でポリアクリルアミドからポリペプチドを直接抽出して配列決定するためにポリペプチド試料を調製することができる。電気ブロッティング法は、溶液中に存在しうる他のペプチドからのポリペプチドの単離を排除する。好適な電気ブロッティング膜としては、Immobilon及びImmobilon CD（Millipore Corp.,Bedford,Mass.）が挙げられる。
【０１８３】
さらに最近、非共有的な疎水性相互作用によって固体保持体上にポリペプチドを固定化する化学を可能にする自動化方法が開発されている。このアプローチでは、塩と変性剤を含みうる水性緩衝液中の試料を、固体保持体を含有するカラム上に加圧充填する。そして、結合したポリペプチドを加圧すすぎして干渉成分を除去し、標識化用の結合ポリペプチドを残す（Hewlett-Packard Product Brochure 23-5091-5168E（1992年11月）及びHorn,米国特許第5,918,273号(1999年6月29日)参照）。
【０１８４】
結合ポリペプチドを、ポリペプチドの末端アミノ酸と標識化部分との間でカップリングが起こるのに十分な条件下及び十分な時間反応させる。保持体の物理的性質を選択して特定の標識化部分のための反応条件を最適化することができる。例えば、PETMA-PITCの強い極性は、ポリペプチドの共有結合に影響する。好ましくは、ポリペプチドのアミノ基とのカップリングは、塩基性条件、例えば、トリメチルアミン、又はN-エチルモルフォリンのような有機塩基の存在下で起こる。好ましい実施形態では、メタノール：水（75:25v/v）中５％N-エチルモルフォリンの存在下、標識を結合ポリペプチドと反応させる。結合の態様の理由から、過剰の試薬、カップリング塩基及び反応副生物は、質量分析による標識ポリペプチドの除去及び配列決定の前に、非常に極性の洗浄溶剤によって除去することができる。洗浄溶剤として種々の試薬が適し、例えば、メタノール、水、メタノールと水の混合物、又はアセトンが挙げられる。
【０１８５】
PITC-311のような低極性試薬は、固体保持体に結合しているポリペプチドと、好ましくは疎水的な非共有相互作用で反応させることができる。この場合、ヘプタン、酢酸エチル、クロロホルムのような低極性洗浄剤が好ましい。洗浄サイクル後、50％〜80％の水性メタノール又はアセトニトリルを含有する溶剤による溶離によって固体保持体から標識ポリペプチドを分離する。
【０１８６】
標識化反応を全体的に液相内で行う場合、反応混合物は、好ましくは透析、ゲル浸透クロマトグラフィー等のような精製サイクルに委ねる。
【０１８７】
別の局面では、本発明は、以下の工程を含む、タンパク質混合物中の一部のタンパク質を配列決定するための方法を提供する。
【０１８８】
（ａ）タンパク質混合物をＣ-末端又はＮ-末端標識化部分と接触させ、タンパク質のＣ-又はＮ-末端に標識を共有結合させて標識タンパク質混合物を生成する工程であって、Ｃ-末端又はＮ-末端標識化部分は、原子番号17〜77の少なくとも１個の元素を含み、但し前記元素はイオウ以外である、工程；
【０１８９】
（ｂ）タンパク質混合物中の個々の標識タンパク質を分離する工程；及び
【０１９０】
（ｃ）工程（ｂ）の標識タンパク質を、質量分析法で分析して、少なくとも２個のＣ-末端又は２個のＮ-末端残基の配列を決定する工程。
【０１９１】
１群の実施形態では、本方法はさらに以下の工程を含む。
【０１９２】
（ｄ）少なくとも２個のＣ-末端又は２個のＮ-末端残基の配列を、標識タンパク質の分離座標及び配列のタンパク質末端位置と併用してタンパク質を同定し、遺伝子配列データのデータベースから予想タンパク質を検索する工程。
【０１９３】
分離
好ましい実施形態では、タギング手順は、タンパク質の混合物について行う。タギング手順後、タンパク質の混合物を、好ましくはタンパク質混合物を別個のフラクションに分離させる分離プロセスに委ねる。各フラクションは、好ましくは、実質的にタンパク質混合物の１種のみの標識タンパク質に富んでいる。
【０１９４】
本発明の方法を利用してポリペプチドの配列を決定する。本発明の好ましい実施形態では、ポリペプチドは“実質的に純粋”であり、ポリペプチドは約80％相同性であり、好ましくは約99％以上相同性であることを意味する。ポリペプチドのアミノ酸配列を決定する前に、当業者に周知の多くの方法を用いてポリペプチドを精製することができる。代表例としては、ＨＰＬＣ、逆相-高圧液相クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動法、又は多数のペプチド精製法のいずれも挙げられる（一般的には、表題“タンパク質配列分析の方法”の一連の巻を参照せよ）。
【０１９５】
さらに好ましくは、キャピラリー電気泳動法、特に表題“多次元電気泳動法によるタンパク質分離”2000年2月25日提出の共通に譲渡されている同時係属米国特許出願番号09/513,486に記述されている方法のような多次元キャピラリー電気泳動法の使用である。
【０１９６】
ここで述べる方法では、好ましくは実質的に純粋なポリペプチドを使用するが、ポリペプチド混合物の配列を決定することもできる。簡単に述べると、一実施形態では、混合物中のあるポリペプチドの観測質量に等しい計算質量を有する仮説配列のすべてを決定するためのアルゴリズムを使用する。Johnsonら,Protein Science 1:1083-1091(1992)を参照せよ。このようなアルゴリズムを用いて、各配列がペプチドのタンデム型質量スペクトル中のフラグメントイオンをいかにうまく斟酌するかに従って、これら配列に性能係数を割当て、混合物内のペプチドの配列を容易に決定することができる。
【０１９７】
上述したように、本明細書の方法は、健康又は病気組織試料からタンパク質を同定するのに特に有用である。１群の実施形態では、本方法は、健康組織試料由来タンパク質の混合物と、病気組織試料由来タンパク質の混合物の両方に適用される。従って、本発明のこの局面で使用するタンパク質混合物は、基本的にいずれのソースからも得ることができる。組織試料からタンパク質を単離する方法は周知である。
【０１９８】
本発明では、誘導体化末端アミノ酸を有するポリペプチドを質量分析計で配列決定する。本発明では、種々の質量分析計を使用できる。代表例としては、三重四極質量分析計、磁気セクター装置（磁気タンデム型質量分析計,JEOL,Peabody,Mass.）；イオン-スプレー質量分析計,Bruinsら,Anal.Chem.59:2642-2647(1987)；エレクトロスプレー質量分析計,Fennら,Science 246:64-71(1989)；レーザー脱着飛行時間型質量分析計,Karasら,Anal.Chem.60:2299-2301(1988)、及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（Extrel Corp.,Pittsburgh,Mass.）が挙げられる。好ましい実施形態では、エレクトロスプレー質量分析計（MarinerTMモデル,PE Biosystems,Foster City,California）を利用して誘導体化末端ポリペプチドを断片化し、かつ50ppmより良い質量精度を有する飛行時間ディテクターを用いて標識フラグメントの質量から配列を決定する。
【０１９９】
当業者は、本発明の方法を用いて得られる配列情報を、分析中タンパク質の他の特徴と組合せ、該タンパク質の可能なアイデンティティ数をさらに減らすことさえできる。従って、好ましい実施形態では、本発明の方法は、タンパク質配列タグ由来の情報と、１つ以上の他のタンパク質特性とを組合せてタンパク質を同定する。配列データを補うために有用なデータとしては、限定するものではないが、アミノ酸組成、特定残基（例えば、システイン）の数とアイデンティティ、切断情報、タンパク質分解性（例えば、トリプティック(tryptic)）及び／又は化学的分解ペプチド質量、細胞内配置、及び分離座標（例えば、保持時間、ｐI、2-D電気泳動座標等）が挙げられる。タンパク質を同定するため、本発明のＰＳＴからの情報と組合せることのできる特定タンパク質又は特定種類のタンパク質の他の形のデータ特性は、当業者には明かである。特定タンパク質のデータ特性の主部がより包括的になるほど、より短いタンパク質配列タグを用いて分析中のタンパク質を同定することができる。
【０２００】
従って、さらに別の好ましい実施形態では、タンパク質の１つ以上の特性に関する情報を、長さ約４個のアミノ酸、好ましくは長さ約３個のアミノ酸、さらになお好ましくは長さ約２個のアミノ酸のＰＳＴからの情報と併用して、該タンパク質を同定する。
【０２０１】
標識化法及び配列決定法に関するさらなる詳細は、すべて参照によって本明細書に取り込まれる、以下の３つの同時係属出願から得られる：（ａ）2000年2月25日提出、表題“タンパク質配列決定方法”の米国特許出願番号09/513,395；（ｂ）2000年2月25日提出、表題“ポリペプチドのフィンガープリント法及び生物情報データベースシステム”の米国特許出願番号09/513,907；及び（ｃ）2000年10月19日提出、発明者Luke V.Schneider及びMichael P.Hall、表題“タンパク質配列決定方法”の米国特許出願番号 （代理人案件番号020444-000310US）。
【０２０２】
配列決定アルゴリズム
本発明の一実施形態は、断片化された標識タンパク質の質量スペクトルから直接タンパク質配列タグを決定する数学的アルゴリズムの使用を含む。配列決定される末端にユニークな質量タグ標識が結合されているという条件で、アルゴリズムを用いてオリゴマー配列、好ましくはタンパク質のどちらかの末端からのタンパク質配列タグを決定することができる。アルゴリズムを使用するための開始質量スペクトルは、オリゴマー、好ましくはタンパク質又はペプチドを断片化できるいずれの質量分析計によっても生成することができる。さらに、質量分析計内に導入する前に、ヒドラジンによってのようにペプチド及びタンパク質を部分的に消化することができる。飛行時間型質量スペクトルは、他の質量分析計検出システムを越えて質量精度が改良されているので好ましい。しかし、特に、ペプチドが結合していない断片標識のような内部質量標準物質を用いて生成される質量スペクトルの質量精度を改良すれば、他の質量精度の低い質量分析計検出システムを使用することができる。タンパク質フラグメンテーションは、タンデム型質量分析計の衝突セル内のＣＩＤによって、又はエレクトロスプレー内のインソースフラグメンテーション若しくはＭＡＬＤＩイオン化ソースによって行うことができる。
【０２０３】
本アルゴリズムは、シグナルの質量対電荷位置と、その相対存在量の両方の使用を必要とする。一実施形態では、シグナルの相対存在量をすぐ隣の質量対電荷位置の相対存在量と比較し、かつシグナルの相対存在量を用いてピークが関心のある質量対電荷位置に存在する相対確率を数量化する。この実施形態では、ピークが存在する相対確率をすべての競合配列間で比較する。別の実施形態では、関心のある各質量対電荷位置のシグナルを直接すべての競合配列の質量対電荷位置のシグナルと比較する。後者の方法について、さらに平明に述べる。当業者には、この方法が、各競合配列に関連する質量対電荷位置のシグナルの相対存在量に基づいて競合配列を順位づける同様のシステムを提供するための多くの方法に適合できることが明白である。
【０２０４】
本アルゴリズムは、さらに一実施形態の累積配列順位システムにあり、各可能配列から生じると予測されるイオンの相対存在量を、次の残基から生じると予測されるイオンの相対存在量と乗積又は加算によって合わせる（方程式１）。このように、イオン化又はフラグメンテーション効率における配列特異的な相異及びポリペプチド鎖内の各残基位置における正しい配列割当を混同させる外来性マトリックス又は重なりノイズピークを除去することができる。次の残基位置に順方向に伝わる一定の残基位置における誤った配列割当の確率も、真の配列に伴う確率より低い。それで、各可能配列ｊの全体的な順位を下記式で決定することができる。
Figure 0004259869
式中、Ｒj,nは、残基長ｎの一定の配列ｊに与えられる累積順位であり、Ｐj,nは、残基長ｉのそのｊ仲間間の配列に割当てられる相対順位である。多くの方法を用いて、各競合質量対電荷位置におけるシグナルの相対存在量と一致している、残基長ｉの各配列ｊに対して相対順位（ｐ）を割り当てることができることは、当業者には明白である（前出）。好ましい実施形態では、各残基長（ｉ）の競合配列可能性の相対順位（ｐ）は、可能性をオートスケーリングすることによって決定できる。この方法の特定の変形では、順位（ｐ）は、正規（ガウス）確率分布又は対数正規（ポアソン）確率分布のような仮想又は実証確率分布に基づいて、各配列の相対順位が０と１の間で変化するように順位（ｐ）が割り当てられる。例えば、
Figure 0004259869
式中；
Figure 0004259869
及び
Figure 0004259869
【０２０５】
ｉ個のアミノ酸残基を含有する配列ｊに対応するシグナル（Ｃi,j）は、質量スペクトル中の相対シグナル存在量にこのシグナルの背景を関係づけるいずれの方法によっても決定できることが当業者は知っている。質量分析計内の衝突誘起フラグメンテーションの結果、１より多いタイプのイオンが生成されうる。タンデム型質量分析計内でのＣＩＤ法の結果、通常、Ｎ-末端からはａ、ｂ、及びｃイオンタイプ、Ｃ-末端からはｘ、ｙ、及びｚイオンタイプが生じる。さらに、標識及び特定アミノ酸残基は、“ソフト”電荷の数によって決まる、スペクトル中の１より大きい質量対電荷位置に標識ペプチドフラグメントの生成となる。本方法の変形では、各イオンタイプに伴うシグナルと可能な電荷状態を組合せて、一定の配列ｊに伴う累積シグナルを生成することができる。
Figure 0004259869
式中、ｃは、各イオンタイプ（ｌ）と電荷状態（ｋ）の（ｍ/ｚ）を計算し、質量スペクトルデータ中の対応するカウント（ｃi,j,k,l）を調べることによって決定される。
Figure 0004259869
【０２０６】
残基長ｉ、配列ｊ、電荷状態ｋ、及びイオンタイプｌの質量対電荷比の計算は、前述した方法によって、配列中のアミノ酸及び結合標識の化学量論と可能な電荷状態から決定される。
【０２０７】
前述した基本的な配列決定法については多くの変更を行うことができる。例えば、好ましい実施形態では、一定の配列に伴う全体的なシグナルの決定に用いられる電荷状態の数及びイオンタイプを、フラグメンテーション法に付随して最も多く経験的に見られる特定のサブセットに限定することができる。タンデム型質量分析計内でのＣＩＤフラグメンテーションは、優先的に最大存在量のｂイオンとｙイオン及び最小存在量のｃイオンとｘイオンを生成する。インソースフラグメンテーションでは、有意存在量のａ、ｂ、及びｙイオンしか生じないことが分かる。この場合、アルゴリズムは、ｃ及びｘイオン又はｃ、ｘ及びｚイオンを無視するように優先的に適合させることができる。両ＣＩＤ及びインソースフラグメンテーションで、ペプチドフラグメントのより高い可能電荷状態ではイオン存在量も減少すると思われる。この現象は、アルギニン及び他のアミン（例えば、リジン又はヒスチジン残基）より電荷を保持する可能性が高い他のイミノ“ソフト”電荷種に特異的な配列でもありうる。別の変形では、配列ｊに伴う全体的なシグナルを決定するとき、配列特異的根拠に基づき、より高い数の電荷状態に伴う質量対電荷位置を無視することができる。
【０２０８】
一変形では、二重配列決定アプローチを用いるアルゴリズムに多数の標識（同位体的及び非同位体的の両方）を取り込むことができる。このアプローチでは、各標識タイプについて１つ（いずれの標識残基でも）の２残基表を定義する。そして、第１標識に伴うカウント（ｃi,j,k,l）が第２標識のカウント（ｄi,j,k,l）とは関係なく決定されるように、各残基表を独立的に用いて配列決定アルゴリズムを適用する。
Figure 0004259869
Figure 0004259869
【０２０９】
全方程式１〜６はｃとｄの両方に適用し、かつ以下のように定義できる。
Figure 0004259869
Figure 0004259869
Figure 0004259869
Figure 0004259869
【０２１０】
各標識で得られる各配列ｊの相対確率を掛け合わせることによって、配列の複合順位を得ることができる。
Figure 0004259869
【０２１１】
この変形は、１つより多くの標識に容易に拡張することができる。この多標識化アプローチで使用される質量分析計ファイルは、２つ以上の標識の既知混合物を含有するタンパク質試料の同時フラグメンテーションによって作成できることは明白である。同様に、この方法による分析のため、個々の単一標識タンパク質フラグメンテーションからの質量分析計データを一緒に加えて、仮想の多標識質量分析計ファイルを作成できることも明白である。この変形が、いずれのタイプの多標識化戦略（前出）でも使用できることは、当業者には明かである。
【０２１２】
別の好ましい実施形態において、天然の同位体存在量又は既知の相対同位体存在量の多標識のどちらかの同位体標識では、同位体系列の予想存在量に一致することで、本アルゴリズムを適合して競合配列のピークを認定又は順位づけることができる。例えば、既知の相対存在量、βの２つの同位体的に別個の標識を利用する場合、両標識同位体について、各配列の質量対電荷比、質量スペクトルデータから決定される対応カウント値、及び決定された予想存在量（β）に調和する順位又は確率を決定できる。
【０２１３】
例えば、これを実現できる１つの方法は、ｎ質量/電荷単位によって異なり、かつ相対存在量β1とβ2を有する２つの同位体型を有する標識を利用する単純なケースを取ることである。順位係数、αは、以下のような２つの同位体質量フラグメント由来の質量フラグメントカウントデータ（生又は変換された）の変換として構成される。
α＝１−{|Ｃ1(β2/β1)−Ｃ2|÷[Ｃ1(β2/β1)＋Ｃ2]} [１]

【０２１４】
式中、α、β1及びβ2は、上述したように、かつ２つの同位体ピークについて定義され、
【０２１５】
Ｃ1＝同位体ピーク１について、生又は変換カウントデータ、
【０２１６】
Ｃ2＝同位体ピーク２について、生又は変換カウントデータ、
【０２１７】
順位係数、αは、各質量フラグメント対のカウントが、選択した同位体の天然の存在量比、すなわちβ1/β2に密接に整合するカウントの比（Ｃ1/Ｃ2）を有するときは、高い順位を与える。順位係数（α）は、質量フラグメントカウント比が２つの同位体質量フラグメントの相対存在量比と顕著に異なるときは、低い又は乏しい順位を与える。従って、同位体対の生のカウント比が同位体存在量比に近づくにつれ、同位体順位係数、αが１の値に近づく。αがゼロに達するまで、カウント比の差が大きいほど、低い順位となる。
Ｃ1/Ｃ2→β1/β2，α→１ [２]
かつ次の通り Ｃ1又はＣ2→０，α →０ [３]
【０２１８】
同位体順位係数の典型的な適用では、各同位体の質量/電荷単位と相対存在量の差が決定される。各同位体の相対存在量データを[１]に組み入れる。同位体順位アルゴリズムで質量スペクトルカウントデータ（生又は変換した）を通し、ｎ質量/電荷単位離れた質量位置のカウントサイズに対する各質量位置のカウントサイズを評価し、かつ対の最小質量フラグメントに順位（ａ）を割り当てる。割り当てられた質量フラグメントのカウントを順位係数に掛け、２つの同位体の同位体存在量比にそのカウントデータの比がいかにうまく整合するかに基づいて順位づけ又はスケールした新しいカウント値を生成する。その結果は、同位体的整合のないピークのカウントの減少であり、同時にカウント値の全部でなくても多くを保持するピークのカウントである。正味の効果は、本アルゴリズムがデータを通すとき、整合する同位体ピーク下流を有するピークのシグナル対ノイズの相対的な増加である。
【０２１９】
例えば、図４は、ある元素の約２質量/電荷単位だけ異なり、かつほぼ等しい相対存在量を有する２つの同位体を含有する試料から収集したデータに基づいて同位体順位アルゴリズムを実行した場合に起こることを示す。213質量/電荷単位に近い生カウントは、質量単位で２質量/電荷単位アップを生じるほぼ等しいサイズのピーク、すなわち215質量/電荷単位近くに生じるピークを有する。従って、同位体順位係数が、213と215近傍のピーク間の共鳴で厳密な適合を反映する少量だけ、213のピークのカウント値を調整する。対照的に、214近傍ピークは、カウント（又は同位体存在量）で等しい２質量/電荷単位下流に位置する整合同位体ピークを持たない。214近傍ピークの生カウント値は、216近傍ピークのほぼ４倍である。結果として、同位体順位係数は、カウントサイズの不一致を反映するため小さく、かつ214のピークは、当該差を反映する定量的な量によってサイズが率に応じて減じられる。同位体データファイルを同位体順位アルゴリズムで処理すると、関心のある同位体質量フラグメントについて、より高いシグナル対ノイズ比を生じるように人工的に変換されたデータとなる。
【０２２０】
配列決定前のスペクトルノイズ低減
真の配列を決定するための配列決定法の能力は、質量スペクトル中の他の混同ノイズと比較した標識ペプチドフラグメントの相対的なシグナル強度によって決まる。このノイズは、少なくとも２つの部分から構成される：（１）残存する非断片化タンパク質及びディテクターノイズ多荷電イオンフラグメントによって生じる基線からのオフセット（図１）及び（２）各質量位置、特により高エネルギーフラグメンテーション条件で現れる内部切断フラグメント。質量スペクトル中の“ノイズ”は、常にポジティブなので、本方法の好ましい変形では、配列決定アルゴリズムを適用する前に、ノイズ低減アプローチを利用して、これら“ノイズ”成分のどちらか又は両方をスペクトルから除去することができる。本方法が分離法又はパルス試料添加と連結する場合に特に好ましい別の変形では、フーリエ及び他の時間分解型脱重畳法を利用して、配列決定アルゴリズムを適用する前に質量スペクトル中の“ノイズ”混乱を減らすことができる。
【０２２１】
一実施形態では、オートスケーリングを使用してノイズに起因する基線シフトの除去を助ける。別の実施形態では、脱重畳核の発生を通じてシグナルからノイズを脱重畳することができる。このアプローチについては、後述する。当業者には、多くの他の“ノイズ”低減アプローチが明白である。
【０２２２】
図５は、本発明の種々の方法を遂行するために使用できる質量分析計の一例を示す。この質量分析計は、タンパク質試料を受け、かつタンパク質試料を荷電ノズル13Aに方向づけるキャピラリー11を含む。試料中のイオンは、ノズル13Aとスキマー(skimmer)13Bとの間で加速される。チャンバー12内で、気流11Aを用いてインソース衝突誘起解離を引き起こし、それによってキャピラリー11を通じて導入されたタンパク質の末端部分から荷電フラグメントを生じさせる。インソースフラグメンテーションにより、これら荷電フラグメントは、スキマー13Bから出て、ディテクタープレート16にタンパク質フラグメントを方向づける２枚の電荷プレート15A及び15Bによって方向づけられる。先行技術で周知なように、任意の四重極14を用いて特定のイオンタイプを捕捉して気流14Aで解離させることができる。質量分析計10は、通常、ディテクタープレート16によって得られたデータ試料を処理するデータ処理システムに連結される。
【０２２３】
図６は、インターネット又はイーサネット（登録商標）ローカルエリアネットワークのようなローカルエリアネットワークでよいネットワーク105を通じて質量分析計101に連結されたデータ処理システム108の一例を示す。質量分析計101は、ネットワーク105に連結されているネットワークインタフェース装置103に、質量スペクトルを示すデータを与えるディテクタープレート16を含む。このデータが、ネットワークインタフェース103及びネットワーク105を通じてデータ処理システム108のネットワークインタフェース107に送られる。順次、ネットワークインタフェース107が、このデータを、バス109を通じて主メモリ111又はマスメモリ119に供給する。マイクロプロセッサー113がこのデータについて、本発明で述べるような処理方法のような種々の処理方法を行う。処理システム108は、一般的な目的のデジタル処理システム又は質量スペクトルデータをフィルタリングし、かつ当該データから配列を決定するという専用機能を提供する特異的にプログラムされた処理システムのような通常のコンピュータシステムでよい。図６は、コンピュータシステムの種々のコンポーネントを図示しているが、このような細部が本発明に妥当でないような、コンポーネントを相互接続する如何なる特定アーキテクチャ又は様式を意味するものではないことに留意せよ。また、より少ないか又はおそらくもっと多くのコンポーネントを有するネットワークコンピュータ及び他のデータ処理システムも本発明で使用できることも明かである。図６のコンピュータシステムは、例えば、Unix（登録商標）ベースワークステーションでよい。
【０２２４】
図６に示されるように、データ処理システム108は、マイクロプロセッサー113と、動的ランダムアクセスメモリ（DRAM）でよい主メモリ111と、磁気ハードドライブ若しくは磁気光学ドライブ若しくは光学ドライブ若しくはDVD RAM又は電源がシステムからはずされた後でさえ、データを維持する他のタイプのメモリシステムでよいマスメモリ119とに連結されるバス109を含む。マイクロプロセッサー113は、任意に、マイクロプロセッサー113で使用するためのデータ及びソフトウェアを記憶させるLevel２（L2）キャッシュに連結され、かつマイクロプロセッサー113は、マイクロプロセッサーである集積回路上のL1キャッシュを含むことができる。図６は、マスメモリ119がデータ処理システムの残りのコンポーネントに直接連結された局所装置であることを示しているが、本発明は、モデム又はイーサネット（登録商標）インタフェースのようなネットワークインタフェースを通じてデータ処理システムに連結されるネットワーク記憶装置のようなシステムから離れた不揮発性メモリを利用できることは、明かである。バス109は、技術的に周知なように、相互に種々のブリッジ、コントローラー、及び／又はアダプターを通じて連結される１つ以上のバスを含むことができる。バス109は、マウス、キーボード、又はプリンター等のような種々のI/O装置（入力／出力）121を援助するI/Oコントローラー117にも連結されている。さらに、本データ処理システムは、ディスプレイコントローラー及び通常のCRT又は液晶ディスプレイのようなディスプレイ装置115を含む。
【０２２５】
この説明から、本発明の局面は、少なくとも部分的にソフトウェアに具体化されうることが分かる。すなわち、本技術は、主メモリ111及び／又はマスメモリ119又は遠隔記憶装置のようなメモリ内に含まれるコンピュータプログラム命令のシーケンスを実行するコンピュータシステム又はマイクロプロセッサーのようなそのプロセッサーに応じる他のデータ処理システムで実施することができる。種々の実施形態では、本発明を実施するためのソフトウェア命令と組合せて配線回路機構を使用することができる。従って、本技術は、如何なる特有の組合せの配線回路機構及びソフトウェアにも、またデータ処理システムで実行される命令の如何なる特定ソースにも限定されない。
【０２２６】
図７は、機械読取り可能媒体の形態であるコンピュータ読取り可能媒体の一例を示しており、本発明の一実施形態のデータ処理システムで使用することができる。コンピュータ読取り可能媒体は、データと、デジタル処理システムのようなデータ処理システムで実行されるとき、システムに本発明の種々の方法を実行させる実行可能ソフトウェアとを含む。上述したように、この実行可能ソフトウェア及びデータは、例えば、ＤＲＡＭ111及び／又はマスメモリ119を含む種々の場所、又はネットワークインタフェースを通じてデータ処理システムに連結された遠隔データ記憶装置内に記憶させることができる。このソフトウェア及び／又はデータの一部は、これら記憶装置のいずれか１つに記憶させることができる。媒体151は、例えば、主にＤＲＡＭ115と、データ処理システムの実メモリとして働くマスメモリ119でよい。オペレーティングシステム153は、技術的に周知なように、Unix（登録商標）オペレーティングシステム又はWindows（登録商標）オペレーティングシステム又はMacintoshオペレーティングシステムでよい。任意のフィルタリングソフトウェア157は、実行可能コンピュータプログラム命令を含み、一実施形態では、質量スペクトルデータから周期的ノイズをフィルタリングする。図８は、このフィルタリング操作を実行するための一方法の例を示す。配列決定ソフトウェア163は、タンパク質の少なくとも一部分、典型的には、質量標識で標識されたタンパク質の末端部分の配列を決定する種々の方法の１つを実行するコンピュータプログラム命令を含む。図13、14A、及びA8Bは、配列決定ソフトウェア163によって実行可能な配列決定方法の例を示す。ｍ/ｚデータ155は、すべての可能なタンパク質の標識末端部分のすべての可能な予想フラグメントに対するすべての可能な質量/電荷値のような、アミノ酸配列の所定セットの質量/電荷値を表す１セットのデータである。このデータは、理論的及び経験的に決定できる。図９は、すべての可能なタンパク質の標識末端部分の種々の可能な予想フラグメントの例を示す。このデータは、一実施形態で質量分析計から入力される質量スペクトルデータ161と共に使用される。すべての必要なｍ/ｚデータ（例えば、データ155のような）を記憶させることに代えて、本発明の一実施形態は、飛行中必要なｍ/ｚデータを決定する（必要どおりの基礎に基づいて）。すなわち、質量スペクトルデータ中で検索される各配列について（例えば、図14Aの検索操作351）、プロセッサーは、必要どおりの基礎に基づき、配列の“基礎”分子量（ＭＷ）、種々異なるイオンタイプ（例えば、ａ又はｂ又はｘ又はｙ）のＭＷs、及び種々異なる電荷状態のＭＷsを含む一定の配列（例えば、標識-Ala又は標識-Ala-Try）のすべての可能なｍ/ｚデータ値を決定する。代替案については、図18と共にさらに後述する。
【０２２７】
図７のコンピュータ読取り可能媒体を使用する典型的な実施形態では、フィルタリングソフトウェア157が、質量スペクトルデータ161についてフィルタリング操作を実行し、フィルターデータを得る。このフィルターデータを配列決定ソフトウェア163で処理し、データ159として記憶されるタンパク質配列の出力を導き出す。
【０２２８】
図10は、タンパク質を単離するための本発明の特定方法で利用するシステムの例を示す。本発明の一実施形態では、生体物質から組織抽出物を得、この組織抽出物は多数のタンパク質（例えば、100〜1,000を超えるタンパク質）を含む。これらタンパク質を、各分離タンパク質単独で解析できるように分離する。図10に示される特定例は、３種の独立的な方法を用いる（初期、中間及び最終方法）。実施する方法の特定のタイプ及び数は変えることができるが、最も典型的には、少なくとも１つの電気泳動分離法を使用する。図10に示されるシステムで使用できる種々の方法は、表題“多次元電気泳動によるタンパク質分離”で2000年2月25日提出の同時係属米国特許出願番号09/513,486にさらに記述されており、この出願は、参照によって本明細書に取り込まれる。逆相ＨＰＬＣ又はサイズ排除のような他のクロマトグラフィー法を任意に使用することができる。
【０２２９】
図11は、本発明の特定実施形態の概要を示す。操作201は、細胞又は組織抽出物を得る一方法の典型的な開始を表し、この抽出物は、100より多くのタンパク質を含む。これらタンパク質は、上記質量標識のような共有結合性質量標識203で標識されている。これら質量標識は、通常、それらが結合するフラグメントにユニークな質量特色を与えるために使用できるユニークな質量を備えるように設計される。操作205で、標識タンパク質が分離される。この分離操作を実施する電気泳動のような使用可能な種々の慣習的な方法がある。図11は、分離操作の特定例を示す。操作207は、各分離された標識タンパク質について質量分析を行い、図１に示される試料のような質量スペクトルデータを得ることで、完全又は一部のタンパク質配列を決定する。
【０２３０】
図12は、タンパク質配列を決定するための本発明の特定実施形態のさらに詳細な実施例を示す。操作251は、タンパク質又はポリペプチドを標識し、各標識タンパク質又はポリペプチドを単離する。操作253は、標識された各単離タンパク質について衝突誘起型インソース質量分析を行う。その結果の質量スペクトルデータ試料が、質量分析計から操作255のデータ処理システムに送られる。質量スペクトルデータは、操作257でフィルタリングされ、周期的ノイズが除去される。操作257で使用可能なフィルタリング方法の一例は図８に示さる。最後に、図12に示されるように、操作259が、フィルターデータをデータ処理システムで処理し、完全なタンパク質配列を推測するために使用できるタンパク質配列タグのようなタンパク質配列の少なくとも一部を得る。技術的に公知なように、タンパク質の末端部分で４又は５アミノ酸タグを同定できれば、既存のタンパク質データベースから完全なタンパク質配列を推論することが可能である。
【０２３１】
図９は、アミノ酸配列の１セットの質量/電荷値を決定する方法を示す。これは、図13の操作301として示される。本発明の特定実施形態に従って行われる衝突誘起解離で、タンパク質又はポリペプチドのＮ-末端部分801は、通常３つのフラグメント802、803、及び804を生成する。これらフラグメント802、803、及び804は、ぞれぞれ上記質量標識のような質量標識を含む。ポリペプチド806のＮ-末端の最初の３残基から得られる種々の異なるフラグメントも図９に示される。特に、第１残基は、一次的にフラグメント807、808、及び809を生成し、フラグメント808及び809は810として示される質量を有する。フラグメント811及び812は、２個のアミノ酸／残基を含有するフラグメントの衝突誘起解離から生じる一次フラグメントを表す。これらフラグメント811及び812は、813として示される質量を有する。３個のアミノ酸残基を有するフラグメントでは、２個の一次フラグメント814と815があり、816として示される質量を有する。これら質量/電荷値を用いて、図13の操作301で用いる所定セットを決定する。
【０２３２】
図13は、タンパク質の末端標識部分のようなアミノ酸の配列を決定するための本発明の一実施形態に従う１つの特定方法を示す。操作301は、所定セットの質量/電荷値を決定し、任意に記憶させる。これは、通常、すべての可能なタンパク質の標識末端部分のすべての可能な予想フラグメントに対するすべての可能な質量/電荷値を決定し、及び／又は記憶させることを包含する。図９は、１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、及び３個のアミノ酸の長さを有するフラグメントの例を示す。特定のフラグメントは、経験的な検査で明かな量で見出されないという事実のため、予想フラグメントがすべての可能なフラグメントのサブセットでありうることが分かる。操作303は、存在量値が所定セットの質量/電荷値における各質量/電荷値の質量スペクトルデータから決定される検索を含む。次に、操作305で、第１数のアミノ酸を有する１セットのアミノ酸配列の各配列の存在量値に基づき、確率のような第１順位が計算される。それぞれ図14A及び14Bに示される操作357及び359は、操作305を実行するための１つの特定方法を表す。操作307は、第２数のアミノ酸を有する１セットのアミノ酸配列の各配列の存在量値に基づき、確率のような第２順位を計算する。通常、第２数は第１数と異なることは明かである。操作357及び359は、配列中のアミノ酸の数がアミノ酸の第２数である場合の第２順位を計算するための特定実施形態を示す。操作307の後、操作309で累積順位づけが行われる。この累積順位づけは、第１順位及び第２順位の両者に基づき、少なくとも第２数のアミノ酸を有する１セットのアミノ酸配列の各配列について行われる。図14Bの操作361は、累積順位づけを行う方法の一例を示す。累積順位づけの結果を評価して、最高順位（例えば、累積確率）を有する最もありそうな配列を決定することができる。累積順位づけの結果として決定された配列を確証するため他の方法を考慮できることは明白である。例えば、タンパク質のあるパラメーターを特定する電気泳動データを、累積順位づけの結果の配列決定を確証するため決定配列又は決定タンパク質と比較することができる。
【０２３３】
図14A及び図14Bは、本発明の一実施形態の特定の計算方法を示す。操作351は、操作303で述べた検索操作(lookup operation)を含む。この検索は、通常、操作301で記憶させた所定セットの各質量/電荷値について行われる。各フラグメントは異なるイオンタイプと異なる電荷状態を含みうるので、それぞれ特定の配列について操作353でマスターカウントが決定される。このマスターカウントは、図13の第１及び第２順位づけを行うために使用される操作357及び359で、与えられた配列長のそれぞれ特定の可能な配列について使用される。そして、操作361で累積順位づけが行われ、操作363で最高の累積順位を有する配列を選択することができる。
【０２３４】
図15は、本発明の一実施形態の多標識の使用例を示す。例えば、操作1101、1103、1105、1107、1109、及び1111は、一標識についての図14A及び14Bに示される方法と同様である。操作1121、1123、1125、1127、1129、及び1131は、図14A及び14Bに示される操作と同様であるが、それらは異なる標識（図15中、標識２として示される）について行われる。結果の両標識についての累積順位又は確率が、操作1135で計算され、かつ操作1135から導かれた確率のリストから最高確率の配列を決定することができる。
【０２３５】
図８は、質量スペクトルデータから配列の決定を試みる前に質量スペクトルデータをフィルタリングする特定の方法を示し、以下、図２、３、16及び17を参照してこの方法について説明する。
【０２３６】
質量スペクトル（図２）は、基本的にディテクタープレートに突き当たるイオンの数（カウント）である。イオンがディテクタープレートに突き当たる時間が、プレートに突き当たるイオンの質量/電荷（ｍ/ｚ）比を決定する。未知分子で実験する前に既知のｍ/ｚ分子でディテクタープレートを較正する。ディテクタープレート上の各時間を平均ｍ/ｚ値に割当て、定義範囲の大きさのｍ/ｚ比を有するイオンを集める。
【０２３７】
各ディテクタービンでカバーされるサイズ範囲は、ビンのｍ/ｚ値の平方根として変化する（約0.000707amu0.5）。これは、質量分析計ではｍ/ｚを増やすについれて絶対質量精度が下がることを意味する。質量分析計内のノイズは常に正であることに留意することが重要である。従って、シグナルは、常に各ビン内でゼロ以上である。これは、３連続ゼロカウント長より大きい一連のゼロカウントデータの範囲内にある如何なるゼロカウントデータをも除去することによって、データファイルを圧縮するＭＳソフトウェアのビルトイン“特徴”を生じさせる。従って、これらゼロを再挿入する１つのコードを組み込んだ。これは、データファイルが相互に加減されるときの問題でしかない。ビンの較正は実験間でドリフトしうるので、ビンと共にデータファイルを調整してからそれぞれ直列に調整したビンとの結合操作を行うことが重要である。
【０２３８】
試料の質量スペクトルのさらに詳細に観察すると（図２）、“ノイズ”が無秩序でないことをが分かる。スペクトルノイズには約１amuの周期性がある。この“ノイズ”は、より高いノズル電位（高いフラグメンテーション条件）でのみ明かである。
【０２３９】
この“ノイズ”の間隔は、１amuよりわずかに大きく−１amu間隔上のスペクトル中全ピークのオーバレイから明かなように（図３）−かつタンパク質ごとにわずかに変化する。質量スペクトルは炭素＝12.000000amu標準に基づいて較正され、かつ、スケーリング係数はタンパク質ごとに変わるので、わずかなオフセットは、タンパク質中のアミノ酸組成（水素、窒素、酸素、及びイオウの相異）に起因すると考えられる。
【０２４０】
しかし、ピーク間の間隔は一定である。従って、ｍ/ｚ値をスケーリング係数で除すことで、データを再スケールし、完全な１amu間隔に整合させることができる。最適再スケーリング係数（ｆ）は、タンパク質ごとに変化すると考えられる。
【０２４１】
質量スペクトルデータファイルを脱重畳し、又はフィルタリングする必要があるのは、“ノイズ”中のこの特徴的なピーク形状である。特徴的なピーク形状（脱重畳核）を定義し、かつこれをデータファイルの残りから減算するため、データをｍ/ｚドメイン内で等間隔にする必要がある。これを行うため、開始ｍ/ｚを定義し、ｍ/ｚが終了ｍ/ｚ値に適合するまで一定値ずつｍ/ｚを増やす。現在のＭＳの最高精度は、ｍ/ｚ範囲の低限界においてであり、約0.01amuである、従って、間隔は0.01amu以下であるべきと考える。配列決定の結果、0.01〜0.001amu間隔の無視できる相異があるので、0.01amuは使用するのに最高の値に近いと思われる。より小さい間隔は、データファイルのサイズ及び配列決定速度を劇的に増やす。
【０２４２】
一度ｍ/ｚ値を計算すれば、当該ｍ/ｚ値に伴うカウントは、最初のデータファイル内の最も近い隣接値間の直線補間（当該ｍ/ｚを一括して扱う）によって得られる。
Figure 0004259869
【０２４３】
特徴的なピーク形状に基づく非直線補間法を用いて、より良い補間結果を得ることができる。
【０２４４】
ＭＳデータファイル（図１及び２）のいくつかの明かな特徴は、基線のシフトである。基線シフトは、主に非断片化タンパク質及び／又は大きいタンパク質フラグメントの存在が原因であると考えられる。配列決定アルゴリズムは、配列代替物をその相対ピーク高さに基づいて順位づけするので、基線のバックグラウンドシフトを除去することが望ましい。質量スペクトルには、長い範囲の基線シフトと、より短い範囲のシフトがあることが分かる。
【０２４５】
この場合もやはり、データ中の固有の周期性を用いてカウントデータを正規化する。これを行うため、まずＭＳデータの各１amuブロック内の局所的な最小及び
最大カウントを見つける。そして、同じ１amuブロック内の各カウント値から局所的な最小値を減算し、各ピークをゼロ基線に戻して引く。この場合もやはり、特により小さいピークでは、単一の値よりもむしろ特徴的ピーク形状に基づいて最小を定義して、無秩序なノイズの問題を回避する方がよい。
【０２４６】
一度データファイルを正規化すれば、脱重畳核になるであろう特徴的ピーク形状を決定することができる。各ピークは異なる高さを有するので（基線補正後でさえ）、最小及び最大値間の各１amuブロック内のカウントデータを再スケールする必要がある。これは正規化データから開始し、下記式で達成される。
Figure 0004259869
図16は、タンパク質フラグメンテーション条件（ノズル電位）の強度の関数として決定される平均的な脱重畳核の形状を示す。
【０２４７】
明らかに、平均核形状は、データを再スケールするのに用いる係数によって決まる。核のすべてのビンについて標準偏差（誤差）の合計を最小にすることでスケーリング係数を最適化する。
Figure 0004259869
【０２４８】
最適なスケーリング係数を決定するため、２つのアプローチ：二分法及びニュートン・ラフソン法を試みた。二分法アプローチは、最適なスケーリング係数についてニュートン・ラフソン法より強く磨くようである。ニュートン・ラフソン法がだまされてしまう多数の浅い局所最小があると思われる。幸運にも、全体的な最小は、最も関心のある高いフラグメンテーション条件（ノズル電位）で非常に鋭いようである（図17）。
【０２４９】
図18A及び18Bは特定の計算方法を示しており、好ましい実施形態によれば、全部の質量スペクトルデータをマイクロプロセッサーのＬ２キャッシュ内にロードし、必要どおりの基礎に基づいてｍ/ｚ値のセットの必要な値だけを計算して使用し、かつＬ２キャッシュ内に記憶させる。これは、すべての可能なｍ/ｚ値を含有する大きなデータファイルにアクセスすることを回避するために行う。ＲＡＭ又はハードドライブ内にすべての可能なｍ/ｚ値を記憶させることは、20ギガバイトを超える記憶スペースを必要とすることが分かっている。ハードドライブ内で及びコンピュータのバスによってこのようなデータファイルにアクセスすることは、本明細書で述べるような検索操作を実行するためにｍ/ｚ値を必要どおりの基礎に基づいて計算するより何倍もの時間がかかる。従って、図18A及び18Bに示される方法は、特定配列の基礎的な分子割合値を計算してから、操作453で示されるような質量調整係数を用いて質量を調整し、かつ操作455で電荷状態調整により質量を調整して現配列の完全なセットを導くことによって、必要どおりの基礎に基づいて特定の残基配列の分子量を計算し、操作457で一時的にＬ２又はＬ１キャッシュにセーブする。そして、操作457で、計算したばかりのｍ/ｚ値を用いて検索操作を行い、Ｌ２内の質量スペクトルデータ中、対応するｍ/ｚ値の存在量値を検索する。そして、操作461で現セットのｍ/ｚ値を消去するか、又は新しい現ｍ/ｚ値を書き込んで次の繰り返しに入る。操作463が続き、次の可能な配列のｍ/ｚの計算を行い、当該ｍ/ｚ値に関する検索操作を行う。このように、すべての可能なｍ/ｚ値をハードドライブ又は主メモリ（例えば、ＤＲＡＭ）内に記憶させるのではなく、必要どおりの基礎に基づいて値を計算し、Ｌ２キャッシュに一時的に記憶させる。これら操作を、７アミノ酸のような所望長さまですべての可能な末端配列について繰り返す。このようにして、一定長さのアミノ酸まで、それぞれ次の配列について操作463から操作を操作451に戻す。
【０２５０】
図18A及び18Bに示される方法は、マイクロプロセッサーが必要なｍ/ｚ計算を繰返し行わなければならないとしても、記憶装置から既に計算した値を検索するより全体的な計算速度を非常に速くする。
【０２５１】
図19は、中間結果用の記憶領域を最小にするための方法を示す。この方法では、ｍ/ｚ値を２回使用して２つの異なる検索操作で存在量値を検索する。従って、両セットの検索操作のため、図18A及び18Bに示される操作を２回繰り返す。第１セットの検索操作は操作501及び503で行われ、カウントの合計とカウントの二乗の合計を蓄積する。これら値は、最大長が４アミノ酸の場合、４つの合計値及び４つの合計二乗値しかないので、Ｌ２キャッシュに記憶させることができることが分かる。すべての可能なｍ/ｚ値について各検索操作を繰り返した後、操作505が平均標準偏差を計算し、操作507でそれを用いて順位を決定する。操作507は、検索操作中の第２パスであり、この場合もやはり、好ましい実施形態では、図18A及び18Bに示されるように、飛行中に必要どおりの基礎に基づいてｍ/ｚ値を計算する。それぞれ可能な配列の順位をセーブし、上述したように累積順位を計算する。
【０２５２】
図20A及び図20Bは、ノイズ除去に使用できる、多標識を用いて二重線を与えるための方法を示す。質量スペクトルダータ1901は、真のデータを表す二重線1904及び1905を含み、一方位置1902のシグナルは偽である。これは、二重線間に存在すべき距離に留意し、かつデータ中の該距離を捜すことによって検出される。特に、位置1902のピークを位置1903における存在量データと比較し；1903にピークが存在しないと決定される場合、1902のピークに０という順位を与え、このノイズをシグナル又は図20Bで1906として示される質量スペクトルから除去する。一方、ｍ/ｚ値1904のピークは、位置1905で示される所定の二重線の距離から分離され、これは、フィルタリングアルゴリズムに、１という順位が与えられるシグナルの有効な存在を認識させ、それによってシグナル1906として示されるフィルター質量スペクトルデータを生じさせ、図20Bで示されるように、位置1904のピークを保持する。
【０２５３】
実施例
実施例１
この実施例では、この発明の方法を利用して高マンノース型オリゴ糖を配列決定する。Parekhら（米国特許第5667984号）によって記述された方法の変形では、シアノホウ化水素ナトリウム（ＮａＢＨ3ＣＮ）の存在下、質量欠損標識2-アミノ-6-ヨード-ピリジン（標識１）を該オリゴ糖の還元末端に結合させる。これは単一の質量欠損元素（Ｉ）を親オリゴ糖中に組み込む。質量欠損元素の付加は、標識オリゴ糖フラグメントを非標識フラグメント及び質量スペクトル中のマトリックスイオンから区別することを可能にする。
【０２５４】
標識１結合オリゴ糖を、適切な反応緩衝液中の異なるサッカラーゼ（表２及び３に示されるような）を含有する反応管に等分する。完了するまで反応させる。反応が完了したら、反応生成物を、引き続き、各酵素について示される（表３）質量欠損標識との反応で生成されたフラグメントの還元末端と、シアノホウ化水素ナトリウムの存在下結合させる。これら標識は異なる数の質量欠損元素を含有するので、消化フラグメントは、元のオリゴ糖の末端フラグメントから区別することができる。
【表２】
Figure 0004259869
Figure 0004259869
【表３】
Figure 0004259869
【０２５５】
一定分量の標識３結合反応混合物（すなわち、酵素＃３で消化した）をさらに酵素１で消化する。前述したように、この反応で生じた反応還元糖末端を引き続き標識２に結合させる。
【０２５６】
これら全反応を混合し、メタノール中２％酢酸の50％v/v混合物を添加して酸性にし、質量分析に供する。酸性溶液中のアセタール抱合体の低い安定性のため、質量分析は酸性化直後に行わなければならない。代わりに、ハード電荷を取り込む異なる標識系列（例えば、Ｎ-アルキル-ヨード-ピリジン系列）は、酸性にしないで質量分析に供することができる。結果の質量スペクトルをこの発明の方法により脱重畳し、質量欠損標識ピークを含まないすべての化学ノイズを除去する。この発明の方法により、結果の脱重畳質量欠損スペクトルを、用いた各質量欠損標識に結合しうるすべての可能なオリゴ糖配列を予測することによってアルゴリズム的に検索する。
【０２５７】
検索アルゴリズムは、あらゆる分岐組合せのヘキソース（Hex）、及びＮ-アセチルアミノヘキソース（HexNAC）の質量を計算する。各Hexモノマー単位は、179.055565amuという単一同位体質量単位を推定フラグメント質量の重さに加える。各HNACモノマー単位は、220.082114amuという単一同位体質量を推定フラグメント質量に加える。フラグメントに含まれる各糖（ｎ）について（ｎ−１）×17.00274amuの正味の損失がある。標識１、２、及び３の検索基準に整合するピークのオリゴ糖組成は、それぞれ図21、22、及び23に示される。これらピークに対応するヘキソース及びＮ-アセチルアミノヘキソースの数は、表４に示される。
【表４】
Figure 0004259869
Figure 0004259869
【０２５８】
標識１に結合したフラグメントから形成される質量ラダーは、外側のほとんどの糖はヘキソースにちがいないことを示唆している。標識１に結合している最高質量フラグメントは、親オリゴ糖に対応するにちがいないので、酵素１と酵素３は共にα-マンノースしか切断しないことから、第１標識１結合フラグメントに対する４ヘキソース質量差が４α-マンノースに対応するにちがいないと推論できる。ピークＤは、図22中の唯一の標識２抱合体整合なので、還元末端からの外側のほとんどの糖の４個は１α２結合マンノースであり、内側１α２マンノースはないと推論できる。
【０２５９】
標識１質量ラダーの次のフラグメント（図21、ピークＡ）は、前のフラグメントとは、４ヘキソース付加によって異なる。これは、酵素３で消化した試料に対応するにちがいない。唯一の整合している標識３結合フラグメント（図23）は、Ｅ（１ヘキソースフラグメント）、Ｆ（２ヘキソースフラグメント）及びＧ（３ヘキソースフラグメント）である。ピークＦとピークＧで総計５ヘキソースなので、これらフラグメントの少なくとも１個は、１α２結合マンノースを含むにちがいないと推論できる。酵素３は、１α３及び１α６結合を切断するだけなので、さらに構造中に少なくとも２個の別の１α３及び／又は１α６結合マンノースがあり、これらマンノースは４個の１α２結合マンノースの内側にあるにちがいないと推論できる。この情報から、以下の部分配列を推論できる。
{Man4−１α２}−{Hex2、Man2−１α３,６}−{HexNAC2,Hex1}-ｒ
式中、ｒは、オリゴ糖の還元末端を示す。
【０２６０】
完全な配列が決まるまで、このプロセスを表２の種々の酵素について繰返す。例えば、酵素３の後、酵素８で消化すると、最初の配列が以下であると決定できる。
−Man−１β４−{HNAC2}-ｒ
オリゴ糖の還元末端の全配列は、酵素３の後酵素７との反応によって決まる。
【０２６１】
実施例２
この実施例では、脂質中の脂肪酸組成と配列の同定（本明細書では脂質シークエンシングと定義する）のために質量欠損標識を用いる。本実施例は、ホスファチジルコリンに限定される；しかし、当業者には、代替分離方法、スポット、及びリパーゼ選択と共に、Lehninger（生化学(Worth,NY,1975)）によって定義されているような鹸化可能ないずれの脂質にも当該技術を適用できることが明かである。
【０２６２】
脂質抽出物は、Hanson及びPhillipsの方法によって大腸菌K-12細胞ペレットのエーテル抽出により調製する（一般細菌学の方法のマニュアル,p328,(Amer.Soc.Microbiol.,Washington,DC,1981)）。エバポレーションでエーテルを除去し、脂質ペレットを65：25：5のメタノール：クロロホルム：ギ酸溶剤系（0.1％ブチル化ヒドロキシトルエンを含有して酸化を阻止）に再懸濁させる。半量をそれぞれ２レーンのスクライブド(scribed)シリカＨＬプレート（Altech,Deerfield,IL）に点在させ、乾燥させた。脂質を同一の溶剤系を用いてWaters及びHuestisによって記述された方法で分離した（赤血球及び血小板との両親媒性相互作用,博士論文(Stanforad University,Stanford,CA,Dept.of Chemistry,1992)）。この方法は、脂質をヘッドグループで分離する。１レーンを取りだし、ヨウ素蒸気にさらして各脂質フラクションの相対位置を決定した（図24）。ホスファチジルコリンスポットに対応する未展開レーン内の領域からシリカマトリックスをこすり取って微量遠心管に入れた。
【０２６３】
このシリカペレットを、Cottrell（Meth.Enzymology,71:698(1981)）によって記述されているような100μlのホスホリパーゼ反応緩衝液（100μl）に再懸濁させ、激しくボルテックスした。アリコート（50μl）のシリカ懸濁液を第２微量遠心管に移した。選択的にＣ２脂肪酸を加水分解する、Apis mellifera由来のホスホリパーゼA2（Sigma-Aldrich,St.Louis,MO）を１IU添加して第１アリコートを処理した。第２アリコートは、選択的にホスホグリセリドのＣ３脂肪酸を加水分解するNovozyme871（Sigma-Aldrich,St.Louis,MO）１IUを添加して処理した。両反応混合物を室温で一晩中インキュベートした。
【０２６４】
反応混合物をエバポレートして真空乾燥し、約25μlのジクロロメタンに再懸濁させた。質量欠損標識１（2-アミノ-5-ヨード-ピリジン）をホスホリラーゼA2反応混合物に添加した（ジクロロメタン中１Ｍ溶液20μl）。質量欠損標識２（2-アミノ-3,5-ヨード-ピリジン）をNovozyme871反応混合物に添加した（ジクロロメタン中１Ｍ溶液20μl）。アリコート（1,3-ジクロロヘキシルカルボジイミドの１Ｍ溶液20μl）を両管に添加し、２時間インキュベートした。カルボジイミドは、酵素遊離脂肪酸の質量欠損標識への結合を触媒する。ABI Mariner MSのマイクロスプレーによって質量分析する直前に、１％ギ酸（v/v）を添加して反応混合物を酸性にして混ぜ合わせた。
【０２６５】
本発明のアルゴリズムによって、生成した質量スペクトルから化学ノイズを脱重畳し、脱重畳した質量スペクトルは図24に示されている。ホスファチジルコリン脂質骨格上のＣ２及びＣ３の種々の脂肪酸の同定及び相対存在量は、各標識への質量付加によって決定した。天然脂肪酸末尾の長さは、─ＣＨ2ＣＨ2─（28.031300amu）又は─ＣＨ＝ＣＨ─（26.015650）単位の倍数で存在する。１個のＨの質量（1.007825amu）を各予測鎖長に加えて、末端メチル基の化学量論を完成する。分岐脂肪酸は、分岐点における質量から１個の水素の損失が、その新しい分岐の末端での化学量論を完成するために必要な余分のＨによって埋め合わされるので、単一鎖類似体と区別できない。
【０２６６】
Ｃ２位の種々の脂肪酸の相対存在量は、種々の標識１結合ピークの単一同位体ピーク高さから推定できる（Ａ1→Ｆ1、図25）。ホスファチジルコリンのＣ３位の種々の脂肪酸の相対存在量は、種々の標識２結合ピークの単一同位体ピーク高さから推定できる（Ａ2→Ｆ2、図24）。その結果、大腸菌のホスファチジルコリンの平均配列は表５に示される。
【０２６７】
当業者には、第２の薄層クロマトグラフィー次元又は脂肪酸の疎水性を利用して脂質を分解する他の分離法の使用によって、さらなる脂質配列分解能が得られることは明白である（Morris,L.J.,J.Lipid Res.,7,:717-732(1966)）。
【表５】
Figure 0004259869
Figure 0004259869
【０２６８】
本出願は、付属物として、本発明の一実施形態を実施するために使用可能なソフトウェアリスト及び関連データファイルを包含する。特に、配列決定アルゴリズムの一実施形態を実施する配列コードが含まれる。本発明の一実施形態のフィルタリングアルゴリズムを実施するためのフィルタリングコードも含まれる。付属物は、配列コードに伴う入力及び出力を詳細に述べるシークエンサー入出力仕様書をも包含し、かつ配列コードと共に使用するデータファイルを示す特定例のファイルをも包含する。
【０２６９】
前述の明細書では、本発明の特有例の実施形態に関連して本発明について述べた。特許請求の範囲で述べるような本発明の広い精神及び範囲から逸脱することなく、さらに種々の変更を為しうることは明白である。従って、本明細書及び図面は、限定の意味ではなく例示の意味で考慮されるものである。
【０２７０】
実施例３
臭素化又はヨウ素化アリールエーテル種類の光切断性質量欠損標識調製の一実施形態を例示する。このような標識は、それがなければ質量分析計内で低いイオン化又は検出効率を示すであろう生体分子（例えば、核酸、タンパク質、又は代謝物）の相対存在量を数量化するのに有用である。質量欠損標識は、質量分析計内でその結合生体分子の代理マーカーとして働く。末端化学の変化は、生体分子を含有する一級アミン、スルフヒドリル、及びカルボン酸への結合手段を提供する。標識中に質量欠損元素を含むと、試料中に存在しうる重なり化学ノイズから、また異なる数の質量欠損元素が２標識中に取り込まれている場合は相互に２試料から、疑いの余地なく標識を分離することができる。
【０２７１】
合成は、Schmidtら[WO99/32501(1999年7月1日)]によって記述されているように調製される化合物4-(tert-ブチルジメチルシリル)-フェニルボレートエーテル（FT106）で出発する。この出発原料を、表3.1に示される商業的に入手可能な対応するブロモ-又はヨード-フェノールと混合し、Schmidtら[WO99/32501(1999年7月1日)]によって記述されている方法で反応させ、対応する臭素化又はヨウ素化質量欠損標識前駆体を生成する。Schmidtら[WO99/32501(1999年7月1日)]から、商業的に入手可能なヒドロキノン又は4,4'-ジヒドロキシフェニルエーテルの添加後、FT106生成に用いる同一の方法によるフェノールホウ素酸末端の生成を通じて末端フェノールを再活性化することで、FT106とアリール基を含有する末端質量欠損との間に、さらにアリールエーテル結合を挿入できることは明かである。同様に、商業的に入手可能な1,2,4-ベンゼントリオールの添加及び再活性化によって分岐アリールエーテルを生成することができる。
【０２７２】
塩化メチレン中の１モル過剰のフッ化トリメチルスルホニウム又は技術的に一般公知の他の適切な手段で、質量欠損標識前駆体（MDP1〜MDP5、表3.1）のtert-ブチル-ジメチルシラン保護基を除去する。対応する脱保護フェノールをさらに適宜ブロックしたアミノリンカーと反応させ[GB 9815163.2(1998年7月13日)]、その後Schmidtら[WO99/32501(1999年7月1日)]によって記述されているように一級アミンに変換させる。アミンをさらにいずれかの適切なフェニルビニルスルホンと反応させる。適切なフェニルビニルスルホンの例としては、限定するものではないが、フェニル環上のブロックした一級アミン（例えば、その後アニリンに還元されうるニトロ基）、カルボン酸（例えば、トリフルオロ酢酸エステル）、又はチオール（例えば、ジスルフィド結合）置換を有するものが挙げられる。次いで、リンカーの２oアミノ基を無水トリフルオロ酢酸又はメタンスルホニルクロライドと反応させて標識に光切断性を与える。最後に、技術的に一般公知の方法でブロック化剤を除去し、光切断性質量タグを、いずれかの適切な一般公知の結合方法によって、遊離アミン、カルボン酸、又はチオール基を通じて分子又は巨大分子に結合させ、光切断性質量欠損タグ結合分子を得る。
【表６】
Figure 0004259869
【０２７３】
実施例４
この実施例は、異なる試料から得られたアフィニティー精製質量欠損標識化合物の迅速かつ定量的分析のため、本発明をどのようにしてアフィニティー結合型質量標識中に取り込むことができるかを示す（Aebersoldら,WO00/11208(2000年3月2日)）。この実施例はタンパク質を用いるが、異なる試料から共-精製されるいずれの分子の比較のための分析にも拡張できることは、当業者には明白である。
【０２７４】
標識の合成は、いずれかの適切なヘテロ二官能性臭化アリール又はヨウ化アリール（表７に示される商業的に入手可能な例のような）で出発する。MDP4とMDP5（表６）は、追加の実施例を提供する。アニリン前駆体を、化学量論的に過剰な、商業的に入手可能な無水アセトニトリル中NHS-イミノビオチン又はビオチン分子のようなアフィニティー試薬のＮ-ヒドロキシスクシミド（NHS）エステルと反応させる。反応混合物を少なくとも２時間インキュベート後、水を添加していずれの未反応NHS-エステルをも加水分解する。溶媒をエバポレートして乾燥する。
【０２７５】
触媒としてＳｎＣｌ2を有する希ＨＣｌのような、本技術で一般的に承認されている方法を用いてニトロフェニル官能を一級アミンに還元する。反応生成物（式Ｉ）をアフィニティークロマトグラフィーで精製し、エバポレートして乾燥する。第２アニリン基（ニトロフェノールの還元によって生じた）を別の適切な架橋剤（例えば、無水ヨード酢酸）と反応させるか、又はカルボジイミド化学を用いて標的分子含有カルボン酸に結合するために直接使用することができる。当業者には、多くのこのような結合化学が一級アミンにできることが明かである。
【０２７６】
任意に、Aebersoldら[WO00/11208(2000年3月2日)]によって記述されているように、第２アニリン末端を水素化及び過重水素化ポリエチレングリコールとの反応によって伸長し、差次的標識化のための同位体的に別個の質量欠損タグを生成することができる。同様に、同位体的に純粋な臭化アリール又はヨウ化アリール出発原料を用いて同位体-結合型アフィニティータグを直接生成することができる。
【０２７７】
式Ｉは、質量欠損標識イミノビオチンアフィニティータグを示し、式中、Ｘは質量欠損元素（例えば、臭素又はヨウ素）を表し、ｎは質量欠損元素数を表す。リンカーは、質量欠損アフィニティー-結合型タグを標的分子に結合するのに使用可能な結合化学である。例としては、アニリン（カルボジイミド化学によってカルボン酸に結合できる）、及びヨードアセトアミド（アニリンと無水ヨード酢酸との反応で生成される）が挙げられる。
式Ｉ
【化１】
Figure 0004259869
【表７】
Figure 0004259869
【０２７８】
２人の各患者から血漿試料（１ml）を得、別々の微量遠心管に入れる。各管を次のように処理する。トリフルオロ酢酸を添加して巨大分子を沈殿させ、最終濃度を10％w/vにし、管を氷上で20分間インキュベートする。沈殿物を遠心分離（14,000ｇ）でペレットにし、上清を除去する。ペレットを真空下乾燥する。乾燥ペレットを、100IUのトリプシンと0.1％w/vトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンハイドロクロライドを含有する100マイクロリットルの適切なトリプシン消化緩衝液に再懸濁させる。溶液を一晩中37℃でインキュベートする。
【０２７９】
MDA1の同位体的に純粋なアリコートをヨードアセトアミドリンカーで調製する。10mgの[79Br]-MDA1を含有する微量遠心管に、試料１のアリコート（50マイクロリットル）のトリプシン消化物を加える。10mgの[81Br]-MDA1を含有する微量遠心管に試料２の同じ50マイクロリットルアリコートのトリプシン消化物を加える。両管を３時間インキュベートし、内容物を一緒に混ぜ合わせる。アフィニティー-標識分子を製造業者の推奨手順に従ってストレプトアビジン-アガロースアフィニティーカラム（Sigma-Aldrich,St.Louis,MO）を通してクロマトグラフィーで精製する。非標識ペプチドから生じた化学ノイズから本発明の方法で脱重畳した質量欠損ピークによって、回収した標識ペプチド混合物を質量分析計で分析する。すべての残存する同位体的に別個のピーク対をその相対存在量について数量化した。
【０２８０】
実施例５
Nessら(US6027890(2000年2月22日))は、質量分析計による標識分子の代理分析用の、2-アミノメチル-ニトロフェニル酸（例えば、安息香酸又はフェニル酢酸）に基づく光切断性質量タグについて記述しており、実施例３に記載されているタグの代替物を与える。Nessらは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｈ、Ｆ、Ｓ、及びＰを含む元素の許容リストの一部として標識の質量範囲調整成分中にヨウ素を組み込むことを許容しているが、質量欠損元素としてヨウ素の重要性を教示していない。具体的には、彼らは、Ｈ、Ｆ、及びＩは、質量タグの質量範囲調整部分の原子価要求を満足させるための手段として加えると教示している。Nessらは、“有意存在量の１つより多くの同位体を有する原子を当該タグが取り込んでいると、質量分析でタグを区別することはかなり困難である”と主張している。
【０２８１】
具体的には、本発明の方法を用い、Nessら記載の光切断性質量タグの質量範囲調整成分中に、臭素及びユーロピウムのような質量欠損元素を組み込む。これら元素によって与えられる質量欠損は、試料中に存在しうる他の有機分子から生じる化学ノイズから質量欠損標識を脱重畳することを可能にする。さらに、この実施例は、高い天然存在量の安定同位体を有する質量欠損元素を使用する場合に、本明細書で述べるピーク対合脱重畳アルゴリズムをどのように用いてスペクトル中の低いシグナルピークをさらに認定できるかを示す。
【０２８２】
合成は、工程Ｈで添加されるＲ1-36化合物が、鎖長が変わるアミノ酸のブロモフェニルアミド誘導体から成ることを除き、Nessら(US6027890(2000年2月22日))の実施例５に記載されている通りである。ブロモフェニルアミド誘導体は以下のように調製する。約５ｇの3-ブロモ安息香酸と、５ｇの1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミドを100mlの乾燥トルエンに溶解する。この溶液約10mlを10本の反応バイアルにそれぞれ等分する。各10mlアリコートに、表８中のアミノ酸のtert-ブチルエステル１種をブロモ安息香酸に対して化学量論量添加する。異なるアミノ酸のtert-ブチルエステルを各管に添加する。tert-ブチルエステルを技術的に公知の方法で調製する。一晩中室温で反応を進行させる。トリフルオロ酢酸を添加してtert-ブチルエステルを除去する。溶媒をエバポレーションで除去し、ブロモフェニルアミド誘導体を勾配溶出による逆相クロマトグラフィーを用いて調製逆相ＨＰＬＣで精製する。
【０２８３】
ブロモフェニルアミド誘導体を溶解し、YMCブランドＣ8又はＣ18固定相（寸法〜25cm×６mmI.D.,5-15μm,120-150Å）及び最初アセトニトリル及び／又は50/50比のメタノールと水の混合物から成り；流速と勾配は分析者によって特有のブロモフェニルアミド誘導体用に調整される勾配移動相を用いてクロマトグラフ処理する。水相を任意に変更して0.1モル酢酸アンモニウム、ジエチルアミン、トリエチルアミン、又は水酸化アンモニウムを含ませ、極端なテーリングが生じたり又はピークがブロードになった場合の移動相内における分析物の溶解を助けることができる。有機部分は、任意に、１〜10％（容量で）のイソプロピルアルコール、ジイソプロピルアルコール、又はテトラヒドロフランを添加することによって強度を変更して、分析混合物中の構成成分間の選択性を変化させ、かつその不純物から所望のブロモフェニルアミド標識物質を単離させることができる。10〜20分の間経時的に全体の溶媒強度を約50％有機（容量で）から約90〜100％有機に変えることで勾配を与える。移動相構成成分の精製、流速、初期及び最終溶媒強度、及び勾配速度は、各誘導体に対して当業者が普通に行うであろう通りに行う。所望のブロモフェニルアミド物質の単離フラクションを混ぜ合わせ、質量タグ中に組み込む前にエバポレートする。
【０２８４】
この手順により、図25に示される一般組成を有する一連の標識が生成し、これは、Nessらによって記述されているように、テトラフルオロフェニル-ブロックド酸部分を通じて、標的分子を含有するいずれの一級アミンとも反応することができる。
【表８】
Figure 0004259869
【０２８５】
実施例６
この実施例は、実施例５で生成した光切断性質量欠損標識の用途を示す。この実施例では、3-ブロモ安息香酸とアラニンの抱合質量タグ標識を、技術的に一般に承認されている方法を用いてペプチドブラジキニンのＮ-末端に結合させる。標識ペプチドを容量で50：50：1のアセトニトリル：水：トリエチルアミン溶液中に約１ng/μlに希釈する。溶液を約１μl/分で、標準的なマイクロスプレーヘッドを備えたApplied Biosystems Mariner ESI-TOF質量分析計中に注入し、負イオンモードで実験した。スプレーと質量分析計の設定を、5000より高いピーク分解能で達成できる最高相対存在量の３-電荷状態のオリゴヌクレオチドｄＴ6について最適化した。Ａｒ-ポンプ静置波染料レーザー（コヒーレント）を350nmにし、試料スプレーをレーザー光に完全にさらして質量タグを切断するように質量分析計のスプレー先端とノズルとの間の間隙に向けた。
【０２８６】
質量タグ標識試料を３秒の持続時間のスキャンを30回累積することで分析した。本発明のアルゴリズムを用いて質量スペクトル中の化学ノイズを脱重畳し、質量欠損標識ピークを残した（図26）。
【０２８７】
これら脱重畳ピークを、さらに以下のアルゴリズムを用い、その同位体対の相対存在量によって限定した。
Figure 0004259869
より低い質量ピークの相対存在量を、この計算によるβ-係数と置き換えた。その結果の質量タグ領域の脱重畳かつピーク限定された質量スペクトルは、図27に示される。最後に、β-係数スペクトル中の同位体系列（図28）を、さらにBioSpec Data Explorerソフトウェア（バージョン4.0,Applied Biosystems,Framingham,MA）で実施されるように技術的に公知のアルゴリズムを用いて単一の単同位体ピークに脱重畳した。
【０２８８】
実施例７
この実施例は、質量欠損標識、5-ブロモニコチン酸のＮ-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルのウマアポミオグロビン（Myo）への結合を示す。
【０２８９】
Myo（配列決定グレード）（Cat#A8673）、5-ブロモニコチン酸（5-BrNA）（Cat#228435）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（Cat#L6026）、及び尿素（Cat#U0631）をSigma-Aldrichから購入し、供給されたまま使用した。無水ジメチルスルホキシド（DMSO）（Cat#20864）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノフェニル)-カルボジイミドハイドロクロライド（EDC）（Cat#22980）、及びNHS（Cat#24500）をPierceから購入し、供給されたまま使用した。
【０２９０】
5-BrNAのNHS-エステルは、0.657mLのDMSOに20.8mgの5-BrNA、52.7mgのNHS、及び154.1mgのEDCを溶解してインサイツ調製した。浴超音波処理器内で試料を簡単に超音波処理し、急速にすべての固体を溶解した。混合物を一晩中４℃でインキュベートした。生成混合物の質量スペクトル分析は、標準的な付加による5-BrNAのNHSエステル（NHS-5-BrNA）への93％転換を示した。
【０２９１】
Myoを５％(w/v)SDS水溶液中5.35mg/mL濃度で20分間95℃で加熱することで変性させた。周囲温度に冷却後、Myoを、最終濃度１％(w/v)SDS及び6.4Ｍ尿素を含有する、80mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ7.0中1.07mg/mLに希釈した。上述したように調製した0.353mL（50μmol）のNHS-5-BrNAを２mL（2.14mg）の変性ミオグロビンに添加することによって、MyoをNHS-5-BrNAで標識した。試料を暗闇で一晩中周囲温度でインキュベートした。試料を大規模に50％(v/v)水性酢酸で透析し、エレクトロスプレー質量スペクトル分析に有害な影響を及ぼす尿素とSDSを除去した。大規模透析時にタンパク質の損失が明かだったが、数量化しなかった。最終透析後、試料をスピード真空クリーナー（Savant）内で乾燥して完成した。
【０２９２】
実施例８
この実施例は、周期的化学ノイズからシフトしている、5-BrNA標識ミオグロビン由来の配列決定質量スペクトルフラグメントイオン種のIMLSによる生成を示す。
【０２９３】
乾燥5-BrNA標識ミオグロビンを、１容量％酢酸を含有する0.1mLの50％アセトニトリル水溶液に溶解して質量分析用試料を調製した。この標識タンパク質を、Schneiderら(WO 00/63683,2000年10月26日)によって記述されているようなエレクトロスプレー-飛行時間型質量分析計（MarinerTM,PE Biosystems,Inc.）内のインソースフラグメンテーションに供した。製造業者の使用説明書に従い、試料を注入する直前に質量分析計の設定を最適化し、装置を較正した。50μm I.D.キャピラリーにより１μL/分の速度でエレクトロスプレーソース中に試料を連続注入した。ノズル電位を300Ｖに設定してインソースフラグメンテーションを誘起した。スペクトルを蓄積し、345秒間50〜2000質量/電荷単位の範囲で合計した。
【０２９４】
生の質量スペクトルデータの検査は、約１amuの周期で現れる周期的化学ノイズの一部であるピークの左に約0.15amuシフトしている、標識自体の単荷電ｂ-タイプイオン（単一同位体質量 183.94）の明白な証拠を示す（図29）。このピークのアイデンティティは、臭素の高質量同位体（81Br）を取り込んだ標識フラグメントイオンに対応する、第１ピークの約２amu上流である第２ピーク（185.94）の出現によって確証される。この２ピークの相対強度はほぼ同等であり、臭素同位体の約１：１の天然存在量比を反映している。従って、IMLSの際にタンパク質（強い質量欠損を示さない元素で構成されている）から生じる化学ノイズから分割できる質量欠損元素（例えば、ここでは臭素）を取り込んだ標識特異的フラグメントイオン生成の実行可能性が示される。
【０２９５】
ミオグロビンＮ-末端のフラグメントイオンに対応する質量欠損-シフトピークの証拠についてスペクトルデータを調査した。単荷電ａ1イオン二重線（グリシン）が212.97及び214.96ｍ/ｚに現れる（図30）。さらに、ｄ2イオン（グリシン-ロイシン）の計算質量に対応する二重線（284.05及び286.05ｍ/ｚ）が現れる（図31）。このように、いくつかの配列決定イオンが生成される。この標識で観察される配列決定イオンピークの一般的に低い存在量は、該標識カルボニルとピリジル環の結合によって高度に安定化されている標識自体の生成イオンの高い強度の結果である（図29）。当業者には明かなように、この高度に結合した種の生成が、タンパク質アミド骨格上の標識アミド結合の優先的な切断につながり、有意な配列決定イオンの損失となる。従って、１個以上のメチレンによって芳香環から標識カルボニルを離して、タンパク質アミド骨格の結合エネルギーと同様の結合エネルギーの標識アミド結合を生成することが好ましい。
【０２９６】
実施例９
この実施例は、質量欠損標識、5-ブロモ-3-ピリジル酢酸（5-Br-3-PAA）のＮ-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルのウマアポミオグロビン（Myo）への結合を示す。
【０２９７】
5-Br-3-PAA（Cat#13579）をLancaster Synthesisから購入し、供給されたまま使用した。Myo（配列決定グレード）（Cat#A8673）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（Cat#L6026）、及び尿素（Cat#U0631）をSigma-Aldrichから購入し、供給されたまま使用した。無水ジメチルスルホキシド（DMSO）（Cat#20864）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドハイドロクロライド（EDC）（Cat#22980）、及びNHS（Cat#24500）をPierceから購入し、供給されたまま使用した。
【０２９８】
12.7mgの5-Br-3-PAA、7.4mgのNHS、及び12.5mgのEDCを0.235mLのDMSOに溶解して、5-Br-3-PAAのNHS-エステル（NHS-5-Br-3-PAA）をインサイツ調製した。混合物を暗闇で24時間周囲温度でインキュベートした。その結果の混合物の質量スペクトル分析は、標準付加による5-Br-3-PAAの53％転換を示した。転換が完了に近くなかったので、さらにNHS（7.2mg）とEDC（7.5mg）を添加し、さらに24時間インキュベートした。この第２インキュベーション時間後に生じた混合物の質量スペクトル分析は、出発原料の93％転換を示した。
【０２９９】
0.54mLの５％(w/v)SDS水溶液中1.89mgのMyoを20分間95℃で加熱して変性させた。周囲温度に冷却後、20mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ7.0中、1.89mLの９Ｍ尿素を試料に添加した。NHS-5-Br-3-PAA（0.24mL,約19mMの最終濃度）を変性ミオグロビンに添加した。試料を暗闇で一晩中周囲温度でインキュベートした。0.1％(w/v)SDSを含有する25mMトリス、ｐＨ8.3緩衝液に対して反応混合物をスピン透析し、尿素とNHS-5-Br-3-PAA反応副生物を除去した。標識ミオグロビンを含有する最終保持液（〜0.6mL）をクロロホルム抽出手順に供し、結合しているSDSを除去した（Puchadesら(1999),Rap.Comm.Mass.Spec.13,344-349）。試料に、2.4mLのメタノール、0.6mLのクロロホルム、及び1.8mLの水を添加した。一度管を反転させて試料を混ぜ合わせた。試料を遠心分離して（3743ｇ、20分、周囲温度）相分離を助け、上層の大部分を捨てた。残存する低相及び界面で沈殿しているタンパク質にメタノール（1.8mL）を加えた。管を激しくボルテックスし、沈殿タンパク質を遠心分離（3743ｇ、40分、周囲温度）でペレット化した。上清をデカントして捨て、残存タンパク質ペレットを窒素気流で乾燥させた。乾燥標識Myoを0.4mLの10％(v/v)酢酸水溶液に再懸濁させた。タンパク質濃度（2.6mg/mL）は、標準物質としてBSAを用いてBCAアッセイにより測定した。
【０３００】
実施例10
この実施例は、上述したようにESI-TOF質量分析計でインソース断片化された5-Br-3-PAA標識ミオグロビンのＮ-末端配列を見出すための、この発明の自動脱重畳及び配列決定アルゴリズムの使用を示す。
【０３０１】
データ収集システムからASCIIフォーマットで、質量スペクトル生成に使用する生のデータをエクスポートする。この生データから、付属物に示される“脱重畳”コードを用いて化学ノイズの自然周期を決定し、1.000575amuであることが分かる。この自然周期を用いてスペクトルの基線を決め（出力ファイル*.bsl）、ＭＳ内で常に正である装置エラーを補正する（図32）。基線決めは、各1.000575amuブロックのデータ中の最小データ値を、該ブロックのデータ中のあらゆるデータ点から減じてゼロに調整することを意味する。次いで、この基線決めデータファイルを、[79Br]ピークから1.997954amu下流の整合[81Br]ピークを常に有するであろう質量欠損（Br-含有）ピークを認定する手段として“β係数”で処理する。その結果の*.bfcファイルを、最初の４残基の中で最高順位解である真のＮ-末端ミオグロビン配列（5-Br-3-PAA-GLSDGE）を有する、付属物に示される“シークエンサー”コードによって処理する。この実施例では、“シークエンサー”コードは、ｂ-イオンの最初の電荷状態の検索に限定した。
【０３０２】
“シークエンサー”コードを実行して最初の５残基の配列を決定すると、756.1993という理論質量を与える配列GLSDWが、真の配列（756.1840のGLSDGE）の第６残基の質量欠損位置に対応するピークと重なる（図33）。この結果、GLSDWが５残基で最高順位配列となる。しかし、６残基の間で“シークエンサー” を実行すると、GLSDWが第６残基の競合配列を伝達し損なうので、真の配列GLSDGEが再び最高順位になる。これは、累積確率アルゴリズムの利点を示している。
【０３０３】
実施例11
この実施例は、この発明の質量欠損元素（すなわち、臭素）、イオン性基（すなわち、ピリジル）及びポリペプチド若しくは他の種のＮ-末端又は他の所望一級若しくは二級アミノ基に結合させるため無水コハク酸結合部分を取り込んだ一般的な質量欠損標識の合成を示す。無水コハク酸、及び表面上のその誘導体は、ほぼ定量的な効率で反応してポリペプチドアミノ基になることが分かっている（Munchbachら,Anal.Chem.72:4047-4057(2000)）。当業者には、どの組合せのイオン性基（A1…An）、質量欠損元素（B1…Bn）、及び中心の無水コハク反応部分（SA）を含む他の類似の脂肪族／芳香族種も容易に合成できることが明かである（図34）。
【０３０４】
排他的戦略ではないが、一例として、図35は、もっともらしい[(A1…An)-(B1…Bn)-SA]質量欠損標識の全体的な合成スキームの概要を示す。初めに、水を除去した酸触媒の存在下、5-ブロモ-3-ピリジル酢酸（Lancaster,Cat#13579）をエタノールとの反応によってエチルエステルに転換させる。次いで、生成したエステルを、エタノール中ナトリウムエトキシドの塩基性溶液中で元素の臭素と反応させてα-臭素化する。臭素化α-炭素を、テトラヒドロフランのような無水有機溶媒中、商業的に入手可能なブロモアセトアルデヒドジメチルアセタール（Aldrich,Cat#242500）のリチウムとの反応で調製された有機銅物質リチウムジ-(ブロモアセトアルデヒドジメチルアセタール)銅塩と選択的に反応させて、Cu(II)Iとの反応で銅塩に転換される有機リチウム種を生成する。結果の生成物を水性酸で処理してアセタール部分を除去し、かつエステルを加水分解して遊離酸に戻す。標準的な酸化剤（例えば、Ag+）で遊離アルデヒドを対応するカルボン酸に酸化し、生じた２個のカルボン酸基の環化及び脱水により所望の無水コハク酸誘導体が生成して合成が完了する。
【０３０５】
実施例12
この実施例は、DNA配列決定アプリケーションにおける質量欠損標識の使用を示す。提示スキーム（図36）は、サンガー法を用いた配列決定法の一例を示すが；マクサムギルバート法若しくはPCR又は他の当業者に公知の戦略のような他のDNA配列決定戦略に同様の方法論を適用できる。
【０３０６】
初めに、クローン化された未知のDNA配列（例えば、d(GTTACAGGAAAT)）を保有するM13プラスミドを、3'末端にrAで標識されているM13複製起点プライマー（d(AGTCACGACGACGTTGT)rA）でハイブリダイズし、RNAseで選択的に切断可能なプライマーを作る（Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,Iowa）。反応体積を半分に分割し、２本の管に移した。一方の管に、ポリメラーゼ、dNTPs、dGTP、質量欠損標識ddATP*（図37A）及びddGTP*（図37B）を加える。他方の管に、ポリメラーゼ、dNTPs、質量欠損標識ddTTP*（図37C）及びddCTP*（図37D）を加える。図37A〜Dに示される修飾ddNTPsは例示であり、標準的な手順に従って調製される（Krika,L.J.,“非同位体DNAプローブ技術”,Academic Press,New York(1992);Keller,G.H.及びManak,M.M.,“DNAプローブ”,Stochen,New York(1989)）。当業者には明かなように、質量欠損標識部分と共に誘導体化され、かつ大分類の異なる長さ及び／又は組成を有する架橋剤で分離されるプリン及びピリミジン塩基を含有する多くの他の修飾ddNTPsがもっともらしいと思われる。唯一の必要条件は、それらがDNAポリメラーゼによって認識され、かつ成長フラグメント中に取り込まれうることである。DNA複製及び鎖伸長は、37℃のインキュベーションで開始される。質量ラダーは、ddNTPsによる連鎖停止反応によって生成される。反応の最後のRNAseによる変性及び切断工程は、鋳型から連鎖停止生成物を除去し、かつハイブリダイゼーションによって選択的に除去できるプライマーを遊離させる。DNAフラグメントを質量分析計適合性緩衝液に溶解し、ESI-TOF質量分析計内を負イオンモードで流す。装置製造業者（Applied Biosystems）供給の標準アルゴリズムを用いて、各フラグメントについて一連の多荷電イオンに対応するピークを脱重畳し、ゼロ電荷質量のみを含有するスペクトルを生成する。次いで、装置供給業者のアルゴリズムを用いて、そのゼロ電荷スペクトルの中心軌跡を描く。
【０３０７】
質量スペクトルデータは、以下のように分析する。ddA*-及びddG*-含有試料からのスペクトルを脱重畳し、化学ノイズを除去して臭素又はヨウ素原子を取り込んだピークだけを残す（図38）。ddT*-及びddC*-含有試料からのスペクトルを同様に処理する（図39）。両方の脱重畳スペクトルを調べると、ddA*/ddG*スペクトル中に最高質量フラグメント（4114.733）が見られる（図38）。さらに、同位体対がないので、このフラグメントはヨウ素質量元素を含むと推論でき；それゆえに、“未知”配列中の最後のヌクレオチドはＡである。次に低質量の質量フラグメントは、3695.611と3697.609の二重線であり、ddT*/ddC*スペクトル中に見られる（図39）。この二重線は臭素原子の取り込みを示すので、配列中の次のヌクレオチドはＴである。このプロセスを最後のピークが見つかるまで繰返し、この場合はddT*/ddC*スペクトル中の748.1850の一重線ピークであり、ゆえにＣに対応する。このようにして、配列ATTTCCTGTAACが決定され、かつ逆にしてヌクレオチド補体を置換すると、“未知”配列GTTACAGGAAATが決定される。
【０３０８】
この実施例では、この発明の明細書内である約4000MWのDNAセグメントを配列決定する。１個の質量欠損原子を取り込む質量欠損種を区別する能力は、5000を超える質量で低下するので、本明細書で提示した実施例より大きいDNAセグメントは、終結ddTNPsに多くの質量欠損元素を用いるか、又は代わりに“ローリングプライマー”の方法を用いることで配列決定することができる。“ローリングプライマー”法では、上記手順を用いて、配列決定すべき所望DNAの短いセグメントを得、かつこの推論配列から新しいプライマーを作り、大きいDNA鎖に沿って配列決定を続ける。最後に、短いフラグメントの端と端をつないで配置し、未知DNAの配列を明らかにすることができる。
【０３０９】
実施例13
この実施例では、質量欠損標識（5-Br-3-PAA）を用いてウシユビキチン（Sigma-Aldrich）を配列決定する。タンパク質標識化工程を100％ジメチルスルホキシド内で行うことを除き、ミオグロビンについて上述した同一手順でユビキチンを標識した。上述したように、標識ユビキチン試料を調製し、ESI-TOF質量分析計に導入した。上述したように、生成質量スペクトルを脱重畳し、配列決定した。
【０３１０】
“シークエンサー”を２、３、及び４残基に実行し、真のユビキチンＮ-末端配列（GenBankから得られるMQIFVK）を正確に決定した。この正確な配列は、第１残基における19の競合確率の中から第２位を占めた。この正確な配列は、第５残基でも第２位を占めた（MQIFRに対し）。
【０３１１】
この出願は、この出願と同一の３名の発明者により2001年10月19日に提出され、表題“オリゴマー配列決定のための質量欠損標識化”の同時係属米国特許出願番号 （代理人案件番号20444-000800US/PCT）にも関連し、この同時係属出願は、すべての目的のためその全体が参照によって本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 典型的な質量スペクトルデータの一例を示す。
【図２】 特定タイプの質量スペクトルデータに現れる周期的ノイズを示す。
【図３】 重なり周期内の周期的ノイズを示す。
【図４】 同位体順位カウントデータの生カウントデータとの比較例を示す。
【図５】 本発明の特定実施形態で使用可能な質量分析計の一例を示す。
【図６】 本発明の特定実施形態のデータ処理システムに連結された質量分析計の一例を示す。
【図７】 本発明の特定実施形態で使用可能な機械読取り可能媒体の一例を示す。
【図８】 本発明の配列決定アルゴリズムを実行する前に質量スペクトルデータをフィルタリングするための本発明の一方法を示す。
【図９】 タンパク質又はポリペプチド配列の末端部分から得られるイオンフラグメントを決定するための方法を示す。
【図１０】 細胞抽出物のようなタンパク質の集合から単離タンパク質試料を得るために数種のタンパク質を分離するための分離方法の一例を示す。
【図１１】 本発明の一実施形態の概要を示すフローチャートを示す。
【図１２】 本発明の一実施形態のさらに詳細な実施例を示す。
【図１３】 タンパク質を配列決定するための本発明の特定実施形態を図解するフローチャートを示す。
【図１４Ａ】 タンパク質の末端部分を配列決定するための本発明の一実施形態の特定の計算方法を示す。
【図１４Ｂ】 タンパク質の末端部分を配列決定するための本発明の一実施形態の特定の計算方法を示す。
【図１５】 タンパク質を配列決定するために同一タンパク質に２つの標識を使用する本発明の一実施形態の方法を示す。
【図１６】 平均フィルター核を示す。
【図１７】 スケーリング係数最適化グラフを示す。
【図１８Ａ】 １セットのｍ/ｚ値を記憶させ、記憶装置からバスに取り戻すのではなく、必要どおりの基礎に基づいて計算する計算方法の一実施形態の一例を示す。
【図１８Ｂ】 １セットのｍ/ｚ値を記憶させ、記憶装置からバスに取り戻すのではなく、必要どおりの基礎に基づいて計算する計算方法の一実施形態の一例を示す。
【図１９】 メインメモリ又はハードドライブからでなく、マイクロプロセッサーのキャッシュから直接的に、質量スペクトルからカウントデータを得る、本発明の計算方法の別の実施形態を示す。
【図２０Ａ】 質量スペクトルデータをフィルタリングするための、多標識と共に使用できる別のフィルタリング方法を示す。
【図２０Ｂ】 質量スペクトルデータをフィルタリングするための、多標識と共に使用できる別のフィルタリング方法を示す。
【図２１】 表３の標識１と整合する一例のオリゴ糖組成物の質量スペクトルピークを示す。
【図２２】 表３の標識２と整合する一例のオリゴ糖組成物の質量スペクトルピークを示す。
【図２３】 表３の標識３と整合する一例のオリゴ糖組成物の質量スペクトルピークを示す。
【図２４】 標識１及び標識２と整合する一例の脂肪酸組成物の質量スペクトルピークを示す。
【図２５】 光切断性質量欠損タグの一般構造を示し、図中Ｂｒは、タグの残部にアミノ酸（Ｒ）を通じて連結される質量欠損元素である。
【図２６】 本発明のアルゴリズムを用い、質量欠損標識ピークを残して化学ノイズを脱重畳した一例の質量スペクトルを示す。
【図２７】 質量タグ領域の脱重畳かつピーク限定した質量スペクトルを示す。
【図２８】 さらにシングル単一同位体ピークに脱重畳したβ-係数スペクトル中の同位体系列を示す。
【図２９】 シフトした単一荷電ｂ型イオンの証拠を示す生質量スペクトルデータを示す。
【図３０】 単一荷電ａ１イオン二重線（グリシン）を示す。
【図３１】 ｄ２イオン（グリシン−ロイシン）の計算質量に相当する二重線を示す。
【図３２】 一例の質量スペクトルの脱重畳を示す。
【図３３】 真の６-残基配列と、競合する５-残基の偽配列との重なりを示す。
【図３４】 イオン性基と質量欠損元素の組合せを有するコア無水コハク酸反応性部位を例示する一般的な化学構造を示す。
【図３５】 図３４に提示される一例の無水コハク酸を生成するための一例の合成スキームを示す。
【図３６】 サンガー法を用いる一例の配列決定法を示す。
【図３７】 Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、それぞれ修飾されたｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、及びｄｄＣＴＰを示す。
【図３８】 一例の脱重畳ｄｄＡ*及びｄｄＧ*スペクトルを示す。
【図３９】 一例の脱重畳ｄｄＴ*及びｄｄＣ*スペクトルを示す。

Claims (20)

  1. 対象となる長さｉのペプチド配列について相対順位を導き出すための機械実施方法であって、以下の工程：
    （ｉ）タンパク質又はタンパク質フラグメントの質量スペクトルデータを生成する工程；
    （ii）長さｉの第１のペプチド配列について第１セットの質量／電荷（ｍ/ｚ）値を計算し、該第１セットのｍ/ｚ値を前記機械のメモリシステム内に記憶させる工程；
    （iii）前記第１セットのｍ/ｚ値及び前記質量スペクトルデータを用いて前記第１のペプチド配列について第１の存在量値を決定し、前記メモリシステム内の前記第１セットのｍ/ｚ値を消去する工程；
    （iv）長さｉの第２のペプチド配列について第２セットのｍ/ｚ値を計算し、該第２セットのｍ/ｚ値を前記メモリシステム内に記憶させる工程；
    （ｖ）前記第２セットのｍ/ｚ値及び前記質量スペクトルデータを用いて前記第２のペプチド配列について第２の存在量値を決定する工程；
    （vi）前記第１の存在量値と前記第２の存在量値とを数学的に組み合わせて、前記第１のペプチド配列及び前記第２のペプチド配列について存在量値の組合せを形成し、前記メモリシステム内の前記第２セットのｍ/ｚ値を消去する工程；
    （vii）複数の長さｉのペプチド配列について工程（iv）〜工程（vi）を繰り返して、複数の長さｉのペプチド配列について存在量値の組合せを累積する工程；
    （viii）前記質量スペクトルデータ及び長さｉの第３のペプチド配列について計算された第３セットのｍ/ｚ値を用いて長さｉの前記第３のペプチド配列について存在量値を決定する、検索操作を行う工程；
    （ ix ）該第３のペプチド配列の順位を、前記第３のペプチド配列についての前記存在量値及び前記存在量値の組合せから形成される確率分布関数を用いて決定する工程；
    を含む、前記方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、
    （ａ）工程（vi）における前記数学的に組み合わせる工程は、前記第１の存在量値と前記第２の存在量値とを合計して、前記第１のペプチド配列及び前記第２のペプチド配列についての合計を累積する工程、及び、前記第１の存在量値の二乗と前記第２の存在量値の二乗とを合計して、前記第１のペプチド配列及び前記第２のペプチド配列についての合計二乗を累積する工程からなり；
    （ｂ）工程（vii）における前記存在量値の組合せは、前記複数の長さｉのペプチド配列についての合計、及び、前記複数の長さｉのペプチド配列についての合計二乗からなり；
    （ｃ）工程（viii）における前記確率分布関数を用いる工程は、前記合計及び前記合計二乗を用いて前記複数の長さｉのペプチド配列について平均存在量及び標準偏差を計算する工程からなる；
    前記方法。
  3. 前記複数の長さｉのペプチド配列の可能な長さの各々について工程（ii）〜（viii）を実行し、前記対象となるペプチド配列についてｉ個の相対順位を累積し、前記ｉ個の相対順位に基づいて、前記対象となるペプチド配列について累積順位を導出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 追加の対象となるペプチド配列について工程（vii）〜（viii）を実行し、追加の累積順位を導出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記確率分布はガウス分布である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記確率分布はポアソン分布である、請求項１に記載の方法。
  7. ｉは７又はそれより小さい、請求項１に記載の方法。
  8. 前記タンパク質又はタンパク質フラグメントの末端に標識を結合させる、請求項１に記載の方法。
  9. 前記標識は、前記質量スペクトルデータを生成する工程に先立って前記タンパク質に共有結合される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記タンパク質は、フラグメントを生成するための衝突誘起解離によって断片化し、このフラグメントを次いでディテクターに向けて加速させて前記質量スペクトルデータを生成する、請求項８に記載の方法。
  11. 前記タンパク質を、試料から抽出された他のタンパク質から単離し、かつ前記方法を実施する前記機械が、コンピュータプログラミング命令を実行するデジタル処理システムを含む、請求項８に記載の方法。
  12. 前記方法を、生体物質から抽出された１セットのタンパク質中の各タンパク質について行い、かつ前記セットのタンパク質が、１００より多い異なるタンパク質である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記第１の存在量値を決定する前記工程に先立って、前記質量スペクトルをデジタル的にフィルタしてスペクトルノイズを最小にする、請求項１に記載の方法。
  14. 断片化する前に前記タンパク質を標識する、請求項１に記載の方法。
  15. 前記タンパク質を断片化し、得られたフラグメントを標識する、請求項１に記載の方法。
  16. 前記タンパク質は、少なくとも１つの原子番号１７〜７７の質量欠損元素を含む標識部分で標識される、請求項１に記載の方法。
  17. 請求項１６に記載の方法であって、前記第１セットの質量／電荷（ｍ/ｚ）値を計算する工程に先立って、
    （ａ）標識されたタンパク質に関連する質量スペクトルピークと、標識されていないタンパク質に関連する質量スペクトルピークとを区別する工程であって、前記標識部分の核結合エネルギに基づく前記工程；及び
    （ｂ）前記標識されたタンパク質に関連する質量スペクトルピークを、前記標識されていないタンパク質に関連する質量スペクトルピークから脱重畳する工程；
    を含む、前記方法。
  18. 前記タンパク質は、少なくとも１つの同位体元素を含む標識部分で標識される、請求項１に記載の方法。
  19. 前記第１の存在量値及び前記第２の存在量値を、同位体順位係数を用いて決定する、請求項１８に記載の方法。
  20. 請求項１に記載の方法であって、前記タンパク質は、少なくとも１つの同位体元素及び少なくとも１つの原子番号１７〜７７の質量欠損元素を含む標識部分で標識され、
    （ａ）前記第１セットの質量／電荷（ｍ/ｚ）値を計算する工程に先立って、
    （１）標識されたタンパク質に関連する質量スペクトルピークと、標識されていないタンパク質に関連する質量スペクトルピークとを区別する工程であって、前記標識部分の核結合エネルギに基づく前記工程；及び
    （２）前記標識されたタンパク質に関連する質量スペクトルピークを、前記標識されていないタンパク質に関連する質量スペクトルピークから脱重畳する工程；
    を含み、
    （ｂ）前記第１の存在量値及び前記第２の存在量値を、同位体順位係数を用いて決定する、
    前記方法。
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