JP4467589B2 - オリゴマー配列の決定のための質量欠損標識 - Google Patents
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Description
本出願は、「Methods for Determining Protein and Peptide Terminal Sequences」の表題で、2000年10月19日に提出された、米国仮特許出願番号第60/242,165号、および「Methods for Determining Protein and Peptide Terminal Sequence,」の表題で、2000年10月19日に提出された、米国仮特許出願番号第60/242,398号(代理人登録番号No.05265.P001)の利点を請求する。これらの出願は、すべての目的のためのそれらの全体において参考として援用されている。
なし。
多くの分子は、得られる標識されたイオンフラグメントの質量が、もともとの分子の同定または再構築のために使用され得る質量分析計において、化学的、電気的(電子ビームまたは中性の気体分子との電界誘起衝突)、または光学的(エキシマーレーザー)によってフラグメンテーションされる。他の例では、分子は、質量分析によってさらに識別される、分離プロセスによる共溶出物(coelute)である場合がある。一部の例では、標識は、質量スペクトル中の他の化学的なノイズから、得られる標識イオンまたはイオンフラグメントの同定を補助するために、もとの分子または混合物中の特異的な分子に付着させられる。典型的には、この標識は、もとの分子中にすでに含まれている元素または元素の放射性同位体から構成される。この方法では、質量スペクトルにおいて2個以上の予め決定された相対量のピークを見ることができ、そして標識されたフラグメントの同定を確認するために使用することができる。しかし、標識が、親分子にすでに含まれている元素(もしくはこれらの元素の放射性同位体)、またはサンプルマトリックスから作成されるかもしくはそうでなければサンプルマトリックスを含有している他のイオンを含む場合は、1個以上の標識されたフラグメントのピークは、スペクトル中の他の未標識のイオンのピークと重複する場合があり、これによって標識されたイオンの同定を混乱させる。
in Enzymology,25:60−99(1972);およびThiedeら、FEBS Lett.,357:65−69(1995)を参照のこと。しかし、衝突誘起解離質量分析(MS)法(MS/MS配列決定)は迅速に展開し、そしてエドマン技術よりも速くそして少量のタンパク質を必要とすることが証明された;Shevchenko,A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),93:14440−14445(1996);Wilmら、Nature,379:466−469(1996);Mark,J.,「Protein structure and identification with MS/MS.」(PE/Sciex Seminar Series,Protein Chracterization and Proteomicsで示された研究論文):Automated high throughput technologies for drug discovery,Foster City,CA(March,1988);およびBieman,Methods in Enzymology,193:455−479(1990)を参照のこと。
(1) 以下の工程を包含する、オリゴマーの末端部分を配列決定するための方法:
(a)オリゴマーの末端に標識を共有結合させそして標識されたオリゴマーを形成するように、該オリゴマーを標識部分と接触させる工程であって、該標識部分は、17から77までの原子番号を有している少なくとも1つの元素を含有しており、ただし該元素はイオウまたはリン以外である、工程
(b)標識されたオリゴマーフラグメントを生じるように、酵素的、化学分解、または質量分析フラグメンテーション法を使用して、該標識されたオリゴマーをフラグメンテーションする工程;および
(c)少なくとも2つの末端残基の配列を決定するために、質量分析フラグメンテーション方法を使用して、該標識されたオリゴマーフラグメントを分析する工程。
(2) 前記標識部分が、原子番号35から63までの少なくとも1つの元素を含む、項目1に記載の方法。
(3) 前記標識部分が、原子番号39から58までの少なくとも1つの元素を含む、項目2に記載の方法。
(4) 前記標識部分が、臭素、ヨウ素、ユーロピウム、およびイリウムからなる群より選択される少なくとも1つの元素を含む、項目2に記載の方法。
(5) 前記元素がユーロピウムである、項目4に記載の方法。
(6) 前記元素がイリウムである、項目4に記載の方法。
(7) 前記元素が臭素である、項目4に記載の方法。
(8) 前記元素がヨウ素である、項目4に記載の方法。
(9) 前記オリゴマーが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド、および脂質からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(10) 前記オリゴマーがオリゴヌクレオチドである、項目9に記載の方法。
(11) 前記配列が少なくとも3個の残基である、項目9に記載の方法。
(12) 前記配列が少なくとも4個の残基である、項目9に記載の方法。
(13) 異なる数の質量欠損元素でそれぞれ標識されたいくつかのオリゴマーが、フラグメンテーション工程または分析工程の前に混合される、項目1に記載の方法。
(14) 以下の工程を包含する、オリゴマー混合物中のオリゴマーの一部を配列決定するための、方法:
(a)該オリゴマーの末端に標識を共有結合させ、そして標識されたオリゴマー混合物を形成するように、該オリゴマー混合物を末端標識部分と接触させる工程であって、該末端標識部分は、17から77までの原子番号を有している少なくとも1つの元素を含有しており、ただし、該元素はイオウまたはリン以外である、工程、
(b)該標識されたオリゴマー混合物中の個々の標識されたオリゴマーを分離する工程;ならびに
(c)少なくとも2つの末端残基の配列を決定するために質量分析方法によって工程(b)から該個々の標識されたオリゴマーを分析する工程。
(15) 前記元素が35から63までの原子番号を有する、項目14に記載の方法。
(16) 前記元素が39から58までの原子番号を有する、項目14に記載の方法。
(17) 前記元素が、臭素、ヨウ素、ユーロピウム、およびイリウムからなる群より選択される、項目14に記載の方法。
(18) 生物学的サンプルからのオリゴマーのグループの単離の工程(a)の前にさらに工程を包含する、項目14に記載の方法。
(19) 前記生物学的サンプルが疾患組織サンプル由来である、項目18に記載の方法。
(20) 前記生物学的サンプルが健常組織サンプル由来である、項目18に記載の方法。
(21) 前記分離工程が、標識されたオリゴマー混合物のキャピラリー電気泳動の少なくとも1つの方法によって行われる、項目14に記載の方法。
(22) 前記質量分析方法がESI−TOF MSを使用する、項目14に記載の方法。
(23) 以下の工程を包含する、複数の残基を有しているオリゴマーの構造および機能の分析のための方法:
(a)曝された残基および曝されていない残基を別々に標識し、そして別々に標識されたオリゴマーを生じるように、該オリゴマーを質量欠損標識と接触させる工程であって、ここで、該質量欠損標識試薬は、イオウまたはリン以外である、17から77までの原子番号を有している少なくとも1つの元素を含有している、工程、
(b)3次元構造中に曝されている該オリゴマーの配列、および3次元構造中には曝されていない該オリゴマーの配列を決定するために、質量分析方法によって、該別々に標識されたオリゴマーを分析する工程。
(24) 前記オリゴマーがタンパク質、核酸、またはオリゴサッカライドである、項目23に記載の方法。
(25) 前記質量欠損標識試薬が、35から63までの原子番号の少なくとも1つの元素を含む、項目23に記載の方法。
(26) 前記質量欠損標識試薬が臭素であり、そして前記オリゴマーがタンパク質である、項目26に記載の方法。
(27) 前記質量欠損標識試薬が、原子番号39から58までの少なくとも1つの元素を含む、項目23に記載の方法。
(28) 前記別々に標識されたオリゴマーが、工程(b)の前に酵素的または化学分解法法によってフラグメンテーションされる、項目23に記載の方法。
(29) 前記オリゴマーがタンパク質であり、前記質量欠損が臭素またはヨウ素であり、そして前記曝された残基が該タンパク質中に存在するチロシン残基の一部を含む、項目23に記載の方法。
(30) 前記質量分析方法が、ESI−TOF MSを使用する、項目23に記載の方法。
(31) 前記質量分析方法がESI−TOF MSを使用する、項目29に記載の方法。
(32) 以下の工程を包含する、オリゴマーの末端部分を配列決定するための、方法:
(a)オリゴマーの末端に標識を共有結合させそして標識されたオリゴマーを形成するように、該オリゴマーの第1のサンプルを標識部分と接触させる工程であって、該標識部分は、17から77までの原子番号を有している1つの元素を含有しており、ただし該元素はイオウまたはリン以外である、工程
(b)オリゴマーの末端に標識を共有結合させそして標識されたオリゴマーを形成するように、該オリゴマーの第2のサンプルを標識部分と接触させる工程であって、該標識部分は、17から77までの原子番号を有している2つの元素を含有しており、ただし該元素はイオウまたはリン以外である、工程;
(c)必要に応じて、さらなるサンプルを用いて1から3回工程(b)を繰り返す工程であって、ここで、該標識部分はそれぞれ、17から77までの原子番号を有する3、4、または5個の元素を有し、ただし、該元素はイオウまたはリン以外である、工程;
(d)工程(a)から(c)までの標識されたオリゴマーを混合する工程;
(e)標識されたオリゴマーフラグメントを生じるように、酵素的、化学分解、または質量スペクトルによるフラグメンテーション方法を使用して、該標識されたオリゴマーをフラグメンテーションする工程;ならびに
(f)少なくとも2個の末端残基の配列を決定するために、質量スペクトルによるフラグメンテーション方法を使用して該標識されたオリゴマーフラグメントを分析する、工程。
(33) 前記元素のそれぞれが35から63までの原子番号を有する、項目32に記載の方法。
(34) 前記元素のそれぞれが39から58までの原子番号を有する、項目32に記載の方法。
(35) 前記元素のそれぞれが、臭素、ヨウ素、ユーロピウム、およびイリウムからなる群より選択され、そして前記オリゴマーがタンパク質である、項目32に記載の方法。
(36) 前記元素のそれぞれが、臭素、ヨウ素、ユーロピウム、およびイリウムからなる群より選択され、そして前記オリゴマーがオリゴヌクレオチドである、項目32に記載の方法。
(37) 前記元素のそれぞれが、臭素、ヨウ素、ユーロピウム、およびイリウムからなる群より選択され、そして前記オリゴマーがオリゴサッカライドである、項目32に記載の方法。
(38) 以下の工程を包含するオリゴマーの一部を配列決定するための、方法:
(a)オリゴマーフラグメントを生じるように、1つ以上の特異的な酵素的または化学分解によるフラグメンテーション方法を使用して該オリゴマーのアリコートをフラグメンテーションする工程であって、ここで、種々のフラグメンテーション方法がそれぞれのアリコートに対して適用される、工程;
(b)オリゴマーフラグメントの末端に第1の標識部分を共有結合させそして標識されたオリゴマーフラグメントを形成するように、オリゴマーフラグメントの第1のアリコートを第1の標識部分と接触させる工程であって、該第1の標識部分は、17から77までの原子番号を有している1つの元素を含有しており、ただし、該元素はイオウまたはリン以外である、工程;
(c)必要に応じて、オリゴマーフラグメントの末端に別の標識部分を共有結合させそして標識されたオリゴマーフラグメントを形成するように、オリゴマーフラグメントの他のアリコートを他の別の標識部分と接触させる工程であって、該別の標識部分は、17から77までの原子番号を有している2つ以上の元素を有しており、ただし、該元素はイオウまたはリン以外である、工程;
(d)必要に応じて、標識されたオリゴマーフラグメントのアリコートを混合する工程;ならびに
(e)該オリゴマーの少なくとも2つの残基の配列を決定するために、質量分析フラグメンテーション方法を使用して該標識されたオリゴマーフラグメントを分析する、工程。
(39) 前記オリゴマーが脂質である、項目38に記載の方法。
(40) 前記オリゴマーがタンパク質である、項目38に記載の方法。
(41) 前記オリゴマーが核酸である、項目38に記載の方法。
(42) 前記オリゴマーがオリゴサッカライドである、項目38に記載の方法。
(43) 前記元素が35から63までの原子番号を有する、項目38に記載の方法。
(44) 前記元素が39から58までの原子番号を有する、項目43に記載の方法。
(45) 以下の工程を包含する、2つ以上のサンプルに由来する分析物の相対量を比較するための、方法:
(a)該分析物に対して標識を共有結合させそして標識された分析物を形成するように、第1のサンプルの分析物を標識部分と接触させる工程であって、該標識部分は、17から77までの原子番号を有する1つの元素を有しており、ただし該元素はイオウまたはリン以外である、工程;
(b)それぞれのサンプル中の分析物に対して標識を共有結合させるために、次のサンプルの分析物を標識部分と接触させる工程であって、ここで、それぞれの次のサンプルについて使用される標識部分は、17から77までの原子番号を有しているさらなる元素を含み、ただし該元素は、イオウまたはリン以外である、工程;
(c)標識された分析物のアリコートを混合する工程;および
(d)サンプル間の1つ以上の分析物の相対量を決定するために、質量分析フラグメンテーション方法を使用して該標識された分析物を分析する工程。
() 前記元素が35から63までの原子番号を有する、項目45に記載の方法。
(47) 前記元素が39から58までの原子番号を有する、項目45に記載の方法。
(48) 以下の工程を包含する、合成またはスクリーニングのいずれかの間に、化学的なライブラリーの元素をタグ化するための、方法;
(a)ルートタグに対して標識を共有結合させそして標識されたタグを形成するように、ルートタグを標識部分と接触させる工程であって、該標識部分は、17から77までの原子番号を有している1つの元素を有しており、ただし、上記の元素はイオウまたはリン以外である、工程;
(b)必要に応じて、該ルートタグにさらなる標識を共有結合させそして多標識タグを形成するように、ルートをさらなる標識部分と接触させる工程であって、該標識部分は、17から77までの原子番号を有している1個の元素を有しており、ただし、該元素は、イオウまたはリン以外である、工程;ならびに
(c)17から77までの原子番号を有している元素のその質量および数の両方を決定するために、質量分析方法によって該標識されたタグを分析する工程であって、その結果、元素の質量および数によって、ライブラリーの特異的な化合物に曝した化学的なプロセスを同定し、そしてライブラリー由来の化学実体を同定する、工程。
(49) 前記元素が35から63までの原子番号を有する、項目48に記載の方法。
(50) 前記元素が39から58までの原子番号を有する、項目48に記載の方法。
本発明は、広範囲の種々の分子への質量欠損標識の適用を提供する。本発明の方法は、「インソースでの(in−source)」または四重極子でのオリゴマー衝突誘導性解離のいずれかの間に適用され得るので、この方法は、オリゴマーフラグメントの化学合成(例えば、化学分解消化によるかまたは酵素的消化、あるいは、SangerまたはPCR配列決定フラグメント合成)の必要性を優先的に排除する。従って、本発明の方法は、他の方法を使用して得ることができる時間よりも有意に減少したオリゴマー配列決定時間を提供する。この方法はまた、より伝統的なオリゴマー配列決定アプローチ(例えば、ペプチドのMS/MS配列決定、質量分析によるSangerおよびPCR配列決定(KosterおよびButlerらによって記載されているような)、ならびにRademacherらおよびParekhらによって記載されているようなポリサッカライド配列決定)を上回る改良として適用され得る。平行して同時に処理されるサンプルの数を増加させることによる、1回の質量スペクトルで多数のタグを識別する能力の増大は、さらに大きな組み合わせライブラリーが合成またはスクリーニングされることを可能にする。さらに、配列決定されるオリゴマーが本発明の方法を使用して高度にフラグメント化されるので、イオン化効率および得られるフラグメントの変動性は、親オリゴマーのものよりも高く、従って、他の方法を上回って改善される検出感度を導く。
(a)オリゴマーの末端に標識を共有結合させ、そして標識されたオリゴマーを形成するように、上記のオリゴマーを標識部分と接触させる工程であって、この標識部分は、17から77までの原子番号を有する少なくとも1つの元素を含有しており、ただし、上記の元素はイオウまたはリン以外であり;そしてこのオリゴマーはその構造中に、イオウまたはリンを除いて、17から77の間の原子番号を有する元素を含まない、工程
(b)標識されたオリゴマーフラグメントを生じるように、酵素的、化学的溶解、または質量分析によるフラグメント化方法を使用して標識されたオリゴマーをフラグメント化する工程;ならびに
(c)標識の付近の少なくとも2つの単量体エレメントの配列を決定するための質量分析配列決定方法またはアルゴリズムを使用して、標識されたオリゴマーフラグメントを分析する工程。
(d)遺伝子配列データのデータベースから予想される配列を検索するために、少なくとも2つの末端残基の配列を使用して、タンパク質または遺伝子を同定する工程。
(a)オリゴマーの1つの末端に標識を共有結合させ、そして標識されたオリゴマー混合物を形成するように、オリゴマー混合物を標識部分と接触させる工程であって、この標識部分は、17から77までの原子番号を有する少なくとも1つの元素を含有しており、ただし、上記の元素はイオウまたはリン以外であり;そしてオリゴマーはその構造中に、イオウまたはリンを除く、17から77の間の原子番号を有する元素を含まない、工程、
(b)オリゴマー混合物中の個々の標識されたオリゴマーを分離する工程;ならびに
(c)少なくとも2つの末端残基の配列を決定するために質量分析方法によって工程(b)による標識されたオリゴマーを分析する工程。
(d)遺伝子配列データのデータベースから予想されるタンパク質配列を検索するために、標識されたタンパク質およびその配列のタンパク質末端位置の分離座標(separation coordinate)と組み合わせて、少なくとも2つのC末端または2つのN末端の残基の配列を使用することによって、タンパク質を同定する工程。
(a)曝されたモノマーおよび曝されていないモノマーを差示的に標識し、そして差示的に標識されたオリゴマーを生じるように、オリゴマーを質量欠損標識試薬と接触させる工程であって、ここで、質量欠損標識試薬は、イオウまたはリン以外である、17から77までの原子番号を有する少なくとも1つの元素を含有しており;そしてこのオリゴマーはその構造中に、イオウまたはリンを除く、17から77の間の原子番号を有する元素を含まない、工程、
(b)3次元構造中に曝されているオリゴマーの配列、および3次元構造中には曝されていないオリゴマーの配列を決定するための質量分析方法によって、差示的に標識されたオリゴマーを分析する工程。
(a)生体分子に標識を共有結合させそして標識された生体分子混合物を形成するように、1つのサンプルから得られた生体分子を標識部分と接触させる工程、生体分子に標識を共有結合させそして標識された生体分子を形成するように、少なくとも1つの他のサンプルから得られた生体分子の同様のセットを標識部分と接触させる工程であって、第1の標識部分は、17から77までの原子番号を有する少なくとも1つの元素を含有しており、そしてそれぞれの連続する標識部分は、17から77までの原子番号を有する少なくとも1つのさらなる元素を含有しており;ただし、上記の元素は、イオウまたはリン以外であり;そしてこの生体分子はその構造中に、イオウまたはリンを除く17から77の間の原子番号を有する元素を含まない、工程;
(b)それぞれの供給源に由来する差示的に標識された生体分子サンプルを混合する工程;
(c)必要に応じて、親和性または他の手段によって生体分子を分離する工程;ならびに
(d)個々の標識された生体分子、または上記の標識された生体分子から切断された標識の相対量を決定するために、質量分析方法によって差示的に標識された生体分子を分析する工程。
(a)合成表面が曝され、そして標識された合成表面を形成する化学的プロセスを同定するために、合成表面をタグ単量体と接触させる工程であって、このタグ単量体は、17から77までの原子番号を有する少なくとも1つの元素を含有する、工程、
(b)必要に応じて、合成表面が曝され、そして連続して標識された合成表面を形成する引き続く化学的プロセス工程を同定するために、合成表面を連続タグ単量体と接触させる工程であって、このタグ単量体は、17から77までの原子番号を有する少なくとも1つの元素を含有する、工程、
(c)単一の多タグ化分子または個々のタグのセットのいずれかとして、合成表面から単量体タグを切断する工程、
(d)表面の化学処理歴を決定するために、質量分析方法によってタグの組成を分析する工程。
(定義)
他に定義されない限りは、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、一般的には、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。一般的には、本明細書中で使用される名称、および以下に記載されている分子生物学、有機化学、およびタンパク質化学の研究室手順は、当該分野で周知でありそして一般的に使用されているものである。ペプチド合成のための標準的な技術が使用される。一般的には、酵素反応および精製工程は、製造業者の説明書に従って行われる。これらの技術および手順は、一般的には、当該分野での従来の方法、および種々の一般的な参考文献(一般的には、Sambrookら、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor N.Y.、およびMethods in Enzymology,Biemann編、193:295−305、351−360および455−479(1993)(これらは本明細書中で参考として援用されている)を参照のこと)に従って行われる。これらは、この文献を通じて提供される。本明細書中で使用される名称、ならびに以下に記載される数学的および統計学的分析、分析化学、および有機合成の手順は当業者に公知であり、そして当該分野で使用されている。化学合成および化学的分析については、標準的な技術、またはその改変が使用される。
本発明は、質量分析計での標識された分子および未標識の分子または分子のフラグメントの識別を改善するための、質量分析方法にある。この方法は、オリゴマーの配列決定に関して、および質量スペクトルで識別され得る組み合わせの複雑さの増大に関して、使用され得る。本方法は、質量欠損を取り込んでいる標識試薬で分子またはオリゴマーの末端を標識すること、そして質量スペクトルにおいて、得られた質量欠損標識分子を他の未標識の分子または未標識のオリゴマーフラグメントから識別することによって、実行される。
(オリゴマーの末端部分の配列決定)
上記を参照して、本発明は、1つの局面において、以下の工程を包含する、オリゴマーの末端部分を配列決定するための方法を提供する:
(a)オリゴマーの末端に標識を共有結合させそして標識されたオリゴマーを形成するように、上記のオリゴマーを標識部分と接触させる工程であって、標識部分は、17から77までの原子番号を有している少なくとも1つの元素を含有しており、ただし、上記の元素はイオウでもリンでもない、工程
(b)酵素的、化学分解、または質量分析法フラグメンテーション法によってオリゴマーをフラグメンテーションする工程;および
(c)少なくとも2つの末端残基の配列を決定するために、質量分析フラグメンテーション方法を使用して、フラグメンテーションされた標識されたオリゴマーを分析する工程。
(a)オリゴマーの1つの末端に標識を共有結合させ、そして標識されたオリゴマーの混合物を形成するように、オリゴマー混合物を標識部分と接触させる工程であって、標識部分は、17から77までの原子番号を有している少なくとも1つの元素を含有しており、ただし、上記の元素はイオウでもリンでもない、工程、
(b)上記のオリゴマー混合物中の個々の標識されたオリゴマーを分離する工程;および
(c)少なくとも2つの末端残基の配列を決定するために、質量分析方法によって工程(b)による標識されたオリゴマーを分析する工程。
(a)オリゴマーの末端に標識を共有結合させ、そして標識されたオリゴマーを形成するように、第1のオリゴマーサンプルを標識部分と接触させる工程であって、標識部分は、17から77までの原子番号を有している1つの元素を有しており、ただし、上記の元素はイオウでもリンでもない、工程;
(b)オリゴマーの末端に標識を共有結合させ、そして第2の標識されたオリゴマーを形成するように、第2のオリゴマーサンプルを標識部分と接触させる工程であって、標識部分は、17から77までの原子番号を有している2つの元素を有しており、ただし、上記の元素は、同じかまたは異なり得るが、イオウでもリンでもない、工程;
(c)必要に応じて、さらなるオリゴマーサンプルを用いて工程(b)を1回から3回繰り返す工程であって、ここでは、標識部分はそれぞれ、17から77までの原子番号を有している3個、4個、または5個の元素を有しており、ただし、上記の元素はイオウでもリンでもない、工程;
(d)工程(a)から(c)までによる標識されたオリゴマーを混合する工程;
(e)標識されたオリゴマーフラグメントを生じるように、酵素的、化学分解、または質量分析フラグメンテーション方法を使用して、標識されたオリゴマーをフラグメンテーションする、工程;および
(f)少なくとも2つの末端残基の配列を決定するために、質量分析フラグメンテーション方法を使用して、標識されたオリゴマーフラグメントを分析する、工程。
(a)オリゴマーフラグメントを生じるように、1つ以上の特異的な酵素的または化学分解によるフラグメンテーション方法を使用して、オリゴマーのアリコートをフラグメンテーションする工程であって、ここで、異なるフラグメンテーション方法がそれぞれのアリコートに対して適用される、工程;
(b)オリゴマーフラグメントの末端に第1の標識部分を共有結合させ、そして標識されたオリゴマーフラグメントを形成するように、オリゴマーフラグメントの第1のアリコートを第1の標識部分と接触させる工程であって、第1の標識部分は、17から77までの原子番号を有している1つの元素を含有しており、ただし、上記の元素はイオウでもリンでもない、工程;
(c)必要に応じて、オリゴマーフラグメントの末端に別の標識部分を共有結合させ、そして標識されたオリゴマーフラグメントを形成するように、オリゴマーフラグメントの他のアリコートを他の異なる標識部分と接触させる工程であって、別の標識部分は、17から77までの原子番号を有している2つ以上の元素を含有しており、ただし、上記の元素はイオウでもリンでもない、工程;
(d)必要に応じて、標識されたオリゴマーフラグメントのアリコートを混合する、工程;および
(e)オリゴマーの少なくとも2つの残基の配列を決定するために、質量分析フラグメンテーション方法を使用して、標識されたオリゴマーフラグメントを分析する、工程。
(a)オリゴマーサンプルのいくつかのアリコートを調製する工程;
(b)オリゴマーの一方の末端に標識を共有結合させ、そして標識されたオリゴマーの混合物を形成するように、それぞれのアリコート中のオリゴマーを標識部分と接触させる工程であって、ここで、それぞれのアリコートは、17から77までの原子番号を有している異なる数の元素を含有している標識で標識され、ただし、上記の元素はイオウでもリンでもない工程;
(c)異なる酵素的または化学分解法法によって、それぞれのアリコート中の標識されたオリゴマーをフラグメンテーションする工程;
(d)それぞれのアリコートに由来する反応産物を混合する工程;
(e)少なくとも2つの末端残基の配列を決定するために、質量分析フラグメンテーション方法を使用して、フラグメンテーションされた標識されたオリゴマーの混合物を分析する、工程。
(a)オリゴマーサンプルのいくつかのアリコートを調製する工程;
(b)異なる酵素的または化学分解法によってそれぞれのアリコート中のオリゴマーをフラグメンテーションする工程;
(c)反応産物の一方の末端に標識を共有結合させ、そして標識された反応産物の混合物を形成するように、それぞれのアリコート中の反応産物を標識部分と接触させる工程であって、ここで、それぞれのアリコートは、17から77までの原子番号を有している異なる数の元素を含有している標識で標識され、ただし、上記の元素はイオウでもリンでもない、工程;
(d)それぞれのアリコートに由来する標識された反応産物の混合物を混合する工程;および
(e)オリゴマー中の少なくとも2つの単量体の配列を決定するために、質量分析方法を使用して、工程(d)の混合された標識された反応産物の混合物を分析する工程。
(a)それぞれのプライマーの一方の末端に標識を共有結合させ、そして標識されたプライマー混合物を形成するように、それぞれのプライマーを標識部分と接触させることによって合成プライマーを標識する工程であって、ここで、それぞれのプライマーは、17から77までの原子番号を有している異なる数の元素を含有している標識で標識され、ただし、上記の元素はイオウでもリンでもない、工程;
(b)標識されたプライマー混合物に対してサンプル鋳型を添加する工程;
(c)酵素的または化学的方法によって、サンプル鋳型から複数の標識されたオリゴマーを合成する工程;および
(d)サンプル鋳型の配列を決定するために、質量分析方法を使用して工程(c)で合成された標識されたオリゴマーを分析する工程。
水性の溶媒、または混合した水性/有機溶媒環境下での異なる試薬でのタンパク質の標識は当該分野で公知であり、そして本発明の実行に有用である広範囲の標識試薬および技術を、当業者が容易に利用することができる。例えば、Meansら、CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS、Holden−Day,San Francisco,1971;Feeneyら、MODIFICATION OF PROTEINS:FOOD,NUTRITIONAL AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS,Advances in Chemistry Series,第198巻、American Chemical Society,Washington,D.C.,1982;Feeneyら、FOOD PROTEINS:IMPROVEMENT THROUGH CHEMICAL AND ENZYMATIC MODIFICATION,Advances in Chemistry Series,第160巻、American Chemical Society、Washington,D.C.,1977;およびHermanson,BIOCONJUGATE TECHNIQUES,Academic Press,San Diego,1996を参照のこと。
質量スペクトル(図1)は、基本的には、検出装置のプレートに衝突するイオンの数(総数)である。イオンが検出装置のプレートに衝突する時間によって、プレートに衝突するイオンの質量対電荷(m/z)比を決定する。検出装置のプレートは、m/zが既知である分子を用いて較正される。検出装置のプレート上のビンのそれぞれのスキャン時間は、次いで、平均のm/z値に割り当てられ、そして機器の特定の設計形態に基づいて定義された範囲のm/z比を有するイオンを回収する。一般的には、それぞれの検出装置のビンによってカバーされる大きさの範囲は、ビンのm/z値の平方根に変換される。これは、絶対的な質量の精度が、質量分析計でのm/zの増大に伴って減少することを意味する。質量分析計のノイズは、常にポジティブである。従って、シグナルは、常に、それぞれのビン中でゼロよりも大きいかまたはゼロである。
上記のように、以下の考慮が、標識試薬の選択に関係する:
i)標識の質量は好ましくは特有であり、そして好ましくは、低いバックグラウンドを有するスペクトルの領域にフラグメントの質量をシフトさせる;
ii)標識は、好ましくは、N末端またはC末端に電荷のフラグメンテーションを直接移動させるように、一定の正または負電荷を含む;
iii)標識は、好ましくは、フラグメンテーション条件下で強く、そして好ましくないフラグメンテーションを受けない;
iv)標識の化学的性質は、好ましくは、条件の範囲(特に、変性条件)のもとで十分であり、それによってN末端またはC末端を再生可能にそして均一に標識する;
v)標識されたタンパク質は、好ましくは、選択されたMS緩衝液システム中で可溶なままである;
vi)標識は好ましくは、オリゴマーのイオン化効率を増大させるか、またはそれを少なくとも抑制はしない;そして
vii)標識は、それぞれの標識されたフラグメントの位置で特有の質量分析パターンを作成するように、2つ以上の同位体によって異なる種の混合物を含み得る。
本明細書中で使用される場合、検出強化成分は、質量分析計でのタンパク質フラグメントの検出を容易にする標識部分の一部をいう。従って、検出強化成分は、質量分析計のイオン化室中のフラグメンテーション条件下で正に荷電したイオン種を提供し得るか、またはこの成分は、質量分析計のイオン化室中のフラグメンテーション条件下で負に荷電したイオン種を提供し得る。多くの検出強化成分について、存在するイオン化された種の量は、タンパク質を可溶化するために使用される媒体に依存する。好ましい検出強化成分(すなわち、正電荷または負電荷を生じ得る種)は、3つのカテゴリーに分類され得る:1)「硬い」電荷を保有している成分、2)「軟らかい」電荷を保有している成分、および3)電荷は提供しないが、「軟らかい」電解を保有しているタンパク質残基に密接に近接している成分。
イオン質量特徴成分は、好ましくは、質量スペクトル分析において特有のイオン質量特徴を示す、標識部分の一部である。イオン質量特徴成分には、タンパク質がイオン化される条件下では効率よくイオン化されない部分(例えば、芳香族炭素化合物)ならびに多価イオン種を生成するタンパク質イオン化条件下で容易にイオン化する分子が含まれる。両方のタイプの化合物が、質量スペクトルにおいて標識に連結させられたアミノ酸およびペプチドのイオン/質量特徴をシフトさせる(標識されたタンパク質のフラグメンテーションの後)ために使用され得る。結果として、標識されたアミノ酸およびペプチドは、得られる質量スペクトルにおけるそれらのイオン/質量パターンによって、標識されていないアミノ酸およびペプチドとは容易に識別される。好ましい実施形態においては、イオン質量特徴成分は、20個の天然のアミノ酸の全てについての残基の質量とは一致しない質量を、質量分析フラグメンテーションの間に産生されるタンパク質フラグメントに与える。
標識部分の第3の成分は、N末端アミノ基、C末端アミノ基、またはNもしくはC末端アミノ酸の別の構成成分と反応性の官能基である。
一旦、反応基、リンカー、およびイオン化が可能な基またはイオン質量特徴成分が選択されると、最終的な化合物が、標準的な有機化学反応を利用して合成される。本発明での使用に好ましい化合物は、5−ブロモ−3−ピリジル酢酸(5−Br−3−PAA)のNHSエステルまたは同様の試薬である。
別の好ましい実施態様においては、タンパク質は、例えば、タンパク質の精製および分離プロセス(例えば、電気泳動)においてその検出される能力を増進する部分で標識される。検出可能な部分は、例えば、分光光度計(例えば、UV/Vis、蛍光、電子スピン共鳴(ESR)、核磁気共鳴(NMR)など)、放射性同位体の検出などによって検出され得る。タンパク質がUV/Visによって検出される場合は、一般的には、タンパク質に対して色素形成性標識(例えば、フェニル、ナフチルなど)を連結することが所望される。同様に、蛍光顕微鏡による検出のためには、蛍光団が、好ましくはタンパク質に連結される。例えば、Quantum Dye(登録商標)は、蛍光Euキレートであり、そして5−カルボキシ−2’,4’,5’,7’−テトラブロモスルホンフルオレセインスクシンイミジルエステルは、N末端反応性の臭素を含有している蛍光団である(それぞれ、Research Organics,カタログ#0723QおよびMolecular Probes、カタログ#C−6166から商業的に入手することができる)。ESRについては、検出可能な部分はフリーラジカル(例えば、一酸化窒素基を含む部分)であり得る。タンパク質がNMR法によって検出される場合は、検出可能な部分は、NMRに利用可能な核(例えば、フッ素、13Cなど)を用いて富化され得る。
Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland)、およびPE−Applied Biosystems(Foster City,CA)、ならびに当業者に公知の多くの他の商業的な供給源。さらに、当業者は、特定の適用について適切な蛍光団を選択する方法を認識しており、そしてそれを商業的に容易に入手することができない場合は、必要な新しい蛍光団を合成するか、または所望される蛍光標識になるように商業的に入手することができる蛍光化合物を合成によって改変することができる。
一部の例においては、電気泳動緩衝液中に存在する塩(例えば、TRISおよびSDS)ならびに尿素は、標識されたタンパク質のイオン化を抑制し得、そして配列分析を混乱させる可能性のある小さい質量/電荷のイオンを作製し得る。従って、スピン透析手順が、MS分析の前に迅速に緩衝液システムを交換するために使用され得る。あるいは、脱塩カラム(例えば、Milliporeから販売されているZipTip(登録商標)チップ)が、サンプルの浄化および緩衝液交換に使用され得る。脱塩されたサンプルは、WilmおよびMann(Wilmら(前出)を参照のこと)によって記載されているように、メタノールの最少量が添加された0.1Mの重炭酸アンモニウム中に、またはMark(「Protein structure and identification with MS/MS」、PE/Sciex Seminar Seriesで示される紙,Protein Characterization and Proteomics:Automated high throughput technologies for drug discovery,Foster City,CA(March,1998)を参照のこと)によって記載されているように、最少量のアセトニトリルが添加されている0.01Mの酢酸アンモニム緩衝液(0.1%の蟻酸を含有する)中に、再懸濁され得る。
Supports in Splid−Phase Sequencing 263−277(1974)を参照のこと)。好ましい支持体および結合方法には、EDC結合を有するアミノフェニルガラス繊維紙(Aebersoldら、Anal.Biochem.,187:56−65(1990);DITCガラス繊維(Aebersoldら、Biochem.27:6860−6867(1988)およびポリビニリデンフルオライド(PVDF)膜(SequeNet TM chemistryとともに、Immobilon P TM Milligen/Biosearch,Burlington,Mass.(Pappinら、CURRENT RESEARCH IN PROTEIN CHEMISTRY,Villafranca J.(編)、191−202頁、Academic Press,San Diego,1990を参照のこと))の使用が含まれる。
23−5091−5168E(1992年11月)およびHorn,米国特許第5,918,273号(1999年6月29日)を参照のこと)。
別の局面においては、本発明は、以下の工程を包含する、タンパク質混合物中のタンパク質の一部を配列決定するための方法を提供する:
(a)タンパク質のC末端またはN末端に標識を共有結合させ、そして標識されたタンパク質混合物を形成するように、タンパク質混合物をC末端またはN末端標識部分と接触させる工程であって、C末端またはN末端標識部分は、17から77まで、より好ましくは35から77までの原子番号を有している少なくとも1つの元素を含有しており、ただし、上記の元素はイオウ以外である、工程、
(b)上記のタンパク質混合物中の個々の標識されたタンパク質を分離する工程;および
(c)少なくとも2つのC末端またはN末端の残基の配列を決定するために、質量分析方法によって工程(b)による標識されたタンパク質を分析する工程。
(d)遺伝子配列データのデータベースから予想されるタンパク質配列を検索するために、標識されたタンパク質および配列のタンパク質の末端位置の分離座標と組み合わせて少なくとも2つのC末端または2つのN末端の残基の配列を使用して、タンパク質を同定する工程。
好ましい実施形態においては、タグ化手順がタンパク質の混合物に対して行われる。タグ化手順後に、タンパク質の混合物は分離プロセスに供される。分離プロセスは、好ましくは、タンパク質混合物を別々の画分に分離する。それぞれの画分は好ましくは、タンパク質混合物の1つの標識されたタンパク質だけを実質的に多く含む。
本発明は、一部の実施形態においては、フラグメンテーションされた標識されたタンパク質の質量スペクトルから直接タンパク質配列タグを決定するための数学的アルゴリズムの使用を含む。特有の質量タグ標識が配列決定される末端に連結されるという条件で、タンパク質のいずれかの末端からタンパク質配列タグを決定するためのアルゴリズムが使用され得る。このアルゴリズムでの使用のための出発質量スペクトルは、標識されたタンパク質またはペプチドがフラグメンテーションされ得る任意の質量分析計によって産生され得る。飛行時間型質量スペクトルは、他の質量分析計の検出システムを上回るそれらの改良された質量精度に起因して、好ましい。しかし、他の精度の低い質量分析計の検出システムが、特に、内部質量標準(例えば、連結されたペプチドを有さないフラグメンテーションされた標識)が、得られる質量スペクトルの質量精度を改善するために使用される場合に、使用され得る。タンパク質のフラグメンテーションは、タンデムな質量分析計の衝突セル中でCIDによって、または電子スプレーもしくはMALDIイオン化源中でのインソースフラグメンテーションによってのいずれかで行われ得る。
本発明は、標識されたタンパク質に関して上記に記載されているが、当業者は、使用される複数の標識および標識方法が、他の標識されたオリゴマー(例えば、標識されたオリゴヌクレオチド、標識されたオリゴサッカライドなど)の調製に適応可能であることを認識する。
本発明はオリゴマーに関して上記に記載されているが、当業者は、使用される複数の標識および標識方法が、他のサンプルについて特有の質量「タグ」(例えば、組み合わせ化学ライブラリーについてのタグ、種々のサンプルから得られた代謝物についてのタグなど)の調製に適応可能であることを認識している。このような方法によって、質量分析計によるいくつかのサンプルの同時の分析および比較が可能である。
なお別の局面においては、本発明は、以下の工程を包含する、複数の残基を有しているオリゴマーの構造および機能の分析のための方法を提供する:
(a)曝された残基および曝されていない残基を差示的に標識し、そして差示的に標識されたオリゴマーを生じるように、オリゴマーを質量欠損標識試薬と接触させる工程であって、ここでは、質量欠損標識試薬は、イオウまたはリン以外である17から77までの原子番号を有している少なくとも1つの元素を含有している、工程;
(b)三次元構造に曝されているオリゴマーの配列、および三次元構造に曝されていないオリゴマーの配列を決定するために、質量分析方法によって差示的に標識されたオリゴマーを分析する工程。
なお別の局面においては、本発明は、以下の工程を包含する、2つ以上のサンプル由来の分析物の相対量を比較するための方法を提供する:
(a)第1のサンプルの分析物を標識部分と接触させて、分析物に対して標識を共有結合させ、そして標識された分析物を形成させる工程であって、標識部分は、17から77までの原子番号を有する1つの元素を有しており、ただしこの元素はイオウでもリンでもない、工程;
(b)次のサンプルの分析物を標識部分と接触させて、それぞれのサンプル中の分析物に対して標識を共有結合させる工程であって、ここでは、次のサンプルのそれぞれについて使用される標識部分は、17から77までの原子番号を有しているさらなる元素を含み、ただしこの元素は、イオウでもリンでもない、工程;
(c)標識された分析物のアリコートを混合する工程;および
(d)質量分析フラグメンテーション方法を使用して標識された分析物を分析して、サンプル間の1つ以上の分析物の相対量を決定する工程。
質量欠損標識の別の適用は、組み合わせ化学物質ライブラリーについてのタグとしてである。例示的な用途は、組み合わせライブラリーの合成と同時の、質量欠損タグの作製である。典型的な合成には、ウェルに対して種々の組み合わせまたは化学物質を順次添加することによって、ビーズまたはウェル表面に係留された組み合わせライブラリーを組み立てることが含まれる。BrennerおよびLerner(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),89:5381−5383(1992))およびSugarmanら(2000年5月2日に発行された米国特許第6,056,926号)によって記載されているように、化学物質ライブラリーの合成の間に、処置工程について特異的な質量タグ、または特定の化学物質の化学物質組成物を同時に合成することもまた可能である。このようなタグは、ルートタグ上への異なる反応基の連続的な付加によって作製され得る。このようなルートタグは、1級アミンであり得る。この場合、1つの反応基はルートに添加されて2級アミンを作製し得、ここで、反応基の質量が変化して、化学物質の特定の化学物質の正体またはこのライブラリー由来の化学物質が曝露された処理工程を示す。続く工程では、第2の反応基が、ルートタグ上の2級アミンに付加されて、3級アミンが作製される。この第2の基のこの質量は、組み合わせライブラリー中の特定の化学物質の同定において、第2の化学処理工程または変化を示す。さらに多くのルートタグの組み合わせを可能にする同様のアプローチは、オリゴマーのルートタグに対する種々の単量体単位の連続的な付加である(例えば、Merrifieldペプチド合成)。
(a)ルートタグを標識部分と接触させて、ルートタグに対して標識を共有結合させ、そして標識されたタグを形成させる工程であって、上記の標識部分は、17から77までの原子番号を有している1つの元素を有しており、ただし、上記の元素はイオウでもリンでもない、工程;
(b)必要に応じて、ルートタグをさらなる標識部分と接触させて、ルートタグにさらなる標識を共有結合させ、そして多標識タグを形成させる工程であって、上記の標識部分は、17から77までの原子番号を有している1個の元素を有しており、ただし、上記の元素は、イオウでもリンでもない、工程;ならびに
(c)標識されたタグを質量分析方法によって分析して、17から77までの原子番号を有している元素の質量および数の両方を決定する工程であって、その結果、元素の質量および数によって、ライブラリーの特定の化学物質が暴露された化学的なプロセスを同定し、そしてライブラリーの化学物質の正体が同定される、工程。
(実施例1)
この実施例においては、高マンノース型オリゴサッカライド(図7)を標識し、そして配列決定する。このオリゴサッカライドを、Perekhら、米国特許第5,667,984号に記載されている方法と同様の方法を使用して標識する。簡潔には、質量欠損標識(2−アミノ−6−ヨード−ピリジン(標識1))を、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN)の存在下でオリゴサッカライドの還元末端に共有結合させる。これによって、親のオリゴサッカライド中に単一の質量欠損元素(ヨウ素)を取り込む。質量欠損元素の付加によって、標識されたオリゴサッカライドフラグメントが、質量スペクトルにおいて未標識のフラグメントおよびマトリックスイオンとは識別されることが可能になる。
{Man4−1α2}−{Hex2、Man2−1α3,6}−{HexNAC2,Hex1}−r
ここではrは、オリゴサッカライドの還元末端を示す。
−Man−1β4−{HNAC2}−r。
この実施例では、質量欠損標識を、脂肪酸の組成の同定、および脂質の配置、または「脂質の配列決定」に使用する。この実施例は、ホスファチジルコリンを利用する;しかし、当業者は、代替の分離方法、スポット、およびリガーゼ選択と組み合わせたこれらの方法を、Lehninger(BIOCHEMISTRY(Worth,NY,1975)を参照のこと)によって定義されるような、鹸化が可能な任意の脂質に対して適応することができることを認識している。
FOR GENERAL BACTERIOLOGY、328頁、Amer.Soc.Microbiol.,Washington,DC,1981を参照のこと)の方法を使用して、E.coli K−12の細胞ペレットのエーテル抽出を通じて脂質抽出物を調製する。エーテルを、蒸発によって抽出物から除去し、そして脂質ペレットを、65:25:5のメタノール:クロロホルム:ギ酸溶媒系(酸化を阻害するために0.1%のブチル化ヒドロキシトルエンを含有している)中に再懸濁した。容量の半分を、印付き(scribed)二酸化ケイ素HLプレート(Altech,Deerfield,IL)の2つのレーンのそれぞれにスポットし、そして乾燥させた。脂質を、WatersおよびHuestis、AMPHIPATHIC INTERACTIONS WITH ERYTHROCYTES AND PLATELETS,DOCTORAL DISSERTATION(Stanford University,Stanford,CA,Dept.of Chemistry,1992)によって記載されている溶媒系を使用して分離した。このプロセスは、ヘンド基によって脂質を分離する。1つのレーンを取り出し、そしてヨウ素蒸気に曝して、それぞれの脂質画分の相対的な位置を決定した。二酸化珪素マトリックスを、ホスファチジルコリンスポットに対応している発色していないレーン中の領域から掻き取り、そして微量遠心チューブに入れた。
この実施例は、臭素置換基またはヨウ素置換基を有している光で切断され得る質量欠損標識の調製を記載する。これらの標識は、別な方法では質量分析計において低いイオン化または検出効率を示し得る、生体分子(例えば、核酸、タンパク質、または代謝物)の相対量の定量に有用である。質量欠損標識は、質量分析計においてその結合体生体分子についての代用マーカーとして作用する。末端化学のバリエーションは、1級アミン、スルフヒドリル、およびカルボン酸を含有している生体分子への連結のための手段を提供する。質量欠損元素を標識中に含むことによって、サンプル中に存在し得る重複している化学物質のノイズから標識を、および異なる数の質量欠損元素が2つの標識中に取り込まれる場合2つのサンプルを互いに、明らかに分離することが可能である(実施例1をもまた参照のこと)。
(市販のブロモ−フェノールおよびヨード−フェノール)
この実施例は、種々のサンプルから得た親和性精製した質量欠損標識化合物の迅速な定量分析のための、親和性結合性質量標識の使用を例示する。この実施例では、タンパク質を使用するが、この方法を、異なるサンプルから同時に精製した任意の分子の比較のための分析に適応させ得ることを、当業者は理解している。
(親和性結合性質量欠損標識の例)
この実施例は、配列決定方法において光切断可能な質量タグの使用を例示する。
約5gの3−ブロモ安息香酸および5gの1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミドを、100mlの乾燥トルエン中に溶解させる。約10mlのこの溶液を、10個の反応バイアル各々に等分する。各10mlアリコートに、表5.1のアミノ酸のtert−ブチルエステルのうちの1つ、そのブロモ安息香酸に対する化学量論量を、添加する。種々のアミノ酸tert−ブチルエステル(標準的な方法によって調製した)を、各管に添加する。この反応を、室温で一晩進行させ、そして未反応のtert−ブチルエステルを、トリフルオロ酢酸の添加によって除去する。次いで、溶媒を蒸発によって取り除き、そしてそのブロモフェニルアミド誘導体を、勾配溶出を用いる逆相クロマトグラフィーを使用して、分取逆相HPLCによって精製する。
(表5.1)
(質量タグについてのグループVI可変重量成分の調製における使用のためのアミノ酸)
この実施例は、ウマのアポミオグロビン(Myo)への、質量欠損標識(5−ブロモニコチン酸のN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル)の結合を例示する。
#22980)、およびNHS(Cat # 24500)をPierceから購入し、そして供給されるままで使用した。
この実施例は、定期的な化学物質ノイズからシフトされる、IMLSによる5−BrNA標識ミオグロビン(実施例7に記載したように調製した)に由来する配列決定質量スペクトルフラグメントイオン種の生成を例示する。
この実施例は、ウマアポミオグロビン(Myo)への、質量欠損標識である5−ブロモ−3−ピリジル酢酸(5−Br−3−PAA)のN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルの結合体化を説明する。
この実施例は、周期的な化学的ノイズからシフトされる、IMLSによる、5−Br−3−PAAで標識したミオグロビン(実施例9で調製した)に由来する、配列決定質量欠損スペクトルフラグメントイオン種の生成を説明する。
この実施例は、4−ブロモベンズアルデヒドで標識したアポミオグロブリンのIMLSのための1つの方法を記載する。
この実施例は、5−ブロモニコチン酸で標識したユビキチンのIMLSを説明する。
この実施例は、6−ブロモ−2−ヒドロキシ−キノリン−4−カルボン酸(BHQC)で標識したアポミオグロビンのIMLSを説明する。
この実施例は、6−ブロモ−2−ヒドロキシ−キノリン−4−カルボン酸(BHQC)で標識したユビキチンのIMLSを説明する。
この実施例は、実施例5に記載したESI−TOF質量分析計でのインソースでフラグメント化した5−Br−3−PAA標識ミオグロビンのN末端配列を見出すための、本発明の自動デコンボリューション(deconvolution)および配列決定アルゴリズムの使用を説明する。
この実施例は、本発明の質量欠損元素(例えば、臭素)、イオン化が可能な基(すなわち、ピリジル)、およびポリペプチドまたは他の種のN末端または他の所望される第1級もしくは第2級アミノ基への連結のための無水コハク酸連結部分を組み込む、一般的な質量欠損標識の合成を説明する。無水コハク酸、および見かけ上のその誘導体は、ポリペプチドのアミノ基とほぼ定量的に効率よく反応することが実証されている(Munchbachら、Anal.Chem.72:4047−4057(2000)を参照のこと)。イオン化が可能な基(A1....An)、質量欠損元素(B1....Bn)、および中心部の無水コハク酸反応部分(SA)(図18aを参照のこと)の任意の組み合わせを含む、他の匹敵する脂肪族/芳香族種が、容易に合成され得る。
この実施例は、DNA配列決定適用での質量欠損標識の使用を説明する。示したスキーム(図19)は、Sangerの方法を使用する例示的な配列決定技術を示す;しかし、同様の方法論を、当業者に公知のMazam−Gilbertのような他のDNA配列決定ストラテジーあるいはPCRまたは他のストラテジーに対して適応することが可能である。
この実施例では、本発明者らは、ウシユビキチン(Signa−Aldrich)を配列決定するために質量欠損標識(5−Br−3−PAA)を使用する。ユビキチンを、タンパク質標識工程を100%のアセトニトリル中で行ったことを除いて、ミオグロビンについて実施例7で記載したものと同じ手順によって標識した。標識されたユビキチンサンプルを調製し、そして実施例8に記載するESI−TOF質量分析計に導入した。得られた質量スペクトルをデコンボリュートし、そして実施例10に記載するように配列決定した。
Claims (19)
- サンプル中の標識された分子または標識された分子のフラグメントの質量と標識されていない分子または標識されていない分子のフラグメントの質量を識別するための方法であって、ここで、該標識された分子または標識された分子のフラグメントの質量と該標識されていない分子または標識されていない分子のフラグメントの質量は、1原子質量単位(amu)未満の違いがあり、該方法は、以下の工程:
(a)質量分析計を使用することにより、該標識された分子または標識された分子のフラグメントの質量および該標識されていない分子または標識されていない分子のフラグメントの質量の質量スペクトルを蓄積する工程であって、ここで、該該標識された分子または標識された分子のフラグメントが、標識部分で標識されており、ここで、該標識部分は、17〜77の原子番号を有している少なくとも1つの質量欠損元素を含んでいる、工程;ならびに
(b)該標識部分の核結合エネルギーに基づいて、該標識された分子または標識された分子のフラグメントの質量と該標識されていない分子または標識されていない分子のフラグメントの質量を識別する工程
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記標識部分が、原子番号35〜63の少なくとも1つの質量欠損元素を含む、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記標識部分が、原子番号39〜58の少なくとも1つの質量欠損元素を含む、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記標識部分が、臭素、ヨウ素、ユーロピウム、およびイットリウムからなる群より選択される少なくとも1つの質量欠損元素を含む、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、前記質量欠損元素が、ユーロピウムである、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、前記質量欠損元素が、イットリウムである、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、前記質量欠損元素が、臭素である、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、前記質量欠損元素が、ヨウ素である、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記標識分子および前記標識分子フラグメントが、標識オリゴマーフラグメントである、方法。
- 請求項9に記載の方法であって、ここで、前記標識オリゴマーが、標識タンパク質、標識オリゴヌクレオチド、標識オリゴサッカリド、標識脂質および合成物の標識ポリマーからなる群より選択され、標識オリゴマーフラグメントが、標識タンパク質フラグメント、標識オリゴヌクレオチドフラグメント、標識オリゴサッカリドフラグメント、標識脂質フラグメント、および合成物フラグメントの標識ポリマーからなる群より選択される、方法。
- 請求項10に記載の方法であって、前記合成物の標識ポリマーは、標識アクリレート、標識メタクリレート、標識ナイロン、標識ポリエステル、標識ポリイミド、標識ニトリルゴム、および標識ポリオレフィン、標識アクリレートフラグメント、標識メタクリレートフラグメント、標識ナイロンフラグメント、標識ポリエステルフラグメント、標識ポリイミドフラグメント、標識ニトリルゴムフラグメント、および標識ポリオレフィンフラグメントからなる群より選択される、方法。
- 請求項9に記載の方法であって、前記標識オリゴマーは、標識オリゴヌクレオチドであり、該標識オリゴマーフラグメントが、標識オリゴヌクレオチドフラグメントである、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、各々が異なる数の質量欠損元素で標識されている数個の標識分子が前記質量スペクトルの蓄積の前に混合される、方法。
- 請求項9に記載の方法であって、前記標識オリゴマーフラグメントが、酵素的方法、化学分解法、または質量分析断片化法を使用して生成される、方法。
- 請求項14に記載の方法であって、前記質量分析計の断片化法が、インソース衝突誘起解離、および衝突セル衝突誘起解離から選択される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、各々が異なる数の安定同位体を有する数個の標識分子が、前記質量スペクトルの蓄積の前に、混合される、方法。
- 請求項16に記載の方法であって、ここで、前記安定同位体が、独立して、H、C、N、O、Cl、BrおよびSの同位体からなる群より選択される、方法。
- 請求項16に記載の方法であって、前記安定同位体が、79Brおよび81Brから独立して選択される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記サンプルが、コンビナトリアルライブラリーとして生成された分子の複合混合物を含む、方法。
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