ES2254166T3 - Estructura de polisacarido y determinacion de la secuencia. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para el análisis estructural de un sacárido, que comprende: a) proporcionar sobre una superficie de un sustrato, una pluralidad de diferentes agentes de unión esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio con diferentes especificidades de unión, en los que algunos de entre la pluralidad de dichos agentes esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio se encuentran inmovilizados sobre la misma superficie de dicho sustrato; b) poner en contacto dicha superficie con un sacárido a analizar, o con una mezcla que comprende una pluralidad de fragmentos de dicho sacárido; c) lavar o eliminar de otro modo el sacárido o fragmentos de sacárido no unidos; d) añadir a la superficie obtenida en la etapa c) un marcador esencialmente específico de secuencia y/o de sitio, o una mezcla de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio; e) obtener una o más imágenes de los marcadores que se encuentran unidos a dicha superficie; y f) derivar a partir de dicha imagen información relacionada con la identidad del sacárido que se está analizando.
Description
Estructura de polisacárido y determinación de la
secuencia.
La presente invención se refiere al campo de los
análisis estructurales de las cadenas de sacáridos, tales como
aquéllas que se encuentran unidas a proteínas (proteoglicanos,
glicoproteínas) o a lípidos, o como sacáridos libres.
Los oligosacáridos y polisacáridos consisten en
unidades de monosacáridos (azúcares) que se encuentran conectadas
entre sí mediante enlaces glucosídicos. La cadena de sacáridos
presenta, al igual que una cadena de ADN o una proteína, dos
extremos desiguales. En el caso de las cadenas de sacáridos, éstos
son el extremo reductor (correspondiente al grupo aldehído de la
molécula lineal de azúcar), y el extremo no reductor. Sin embargo,
al contrario que las proteínas y el ADN, los sacáridos también
pueden encontrarse ramificados, sirviendo esencialmente cada una de
las unidades de azúcar en el sacárido como un punto opcional de
ramificación.
Existen varias proteínas que se unen a los
sacáridos. Muchas de estas proteínas se unen específicamente a una
secuencia de oligosacárido corta determinada. Las lectinas son
proteínas aisladas de plantas que se unen a sacáridos. Para el
propósito de la presente solicitud, el término "lectina"
también incluye proteínas que se unen a sacáridos procedentes de
especies animales (por ejemplo "lectinas de mamífero"). Los
anticuerpos son proteínas que reconocen específicamente
determinadas estructuras moleculares. Los anticuerpos también
pueden reconocer las estructuras de sacáridos, al igual que lo hacen
las lectinas. Las glucosidasas son enzimas que cortan enlaces
glucosídicos dentro de la cadena sacárida. Además, las glucosidasas
pueden reconocer determinadas secuencias de oligosacáridos de
manera específica. Las glucosiltransferasas son enzimas que cortan
la cadena sacárida, pero que además transfieren una unidad de
azúcar a uno de los extremos nuevamente producidos.
La técnica de determinación estructural de los
polisacáridos no se ha desarrollado con la rapidez de la técnica de
análisis de proteínas y de ADN. Ello se debe al hecho de que al
iniciarse los descubrimientos fundamentales en el campo de la
investigación relacionada con el ADN, se reconoció que se había
subestimado gravemente la importancia del ADN. A consecuencia de
ello, siguieron varias décadas de intensa investigación sobre los
procedimientos de análisis del ADN y sobre el ADN mismo. Además, con
la llegada de procedimientos de análisis del ADN cada vez mejores y
más simples, la técnica de análisis de la estructura y función de
las proteínas empezó a aplicar crecientemente las herramientas
derivadas de la tecnología del ADN. Por ejemplo, la determinación
estructural de una proteína habitualmente se lleva a cabo mediante
técnicas de genética inversa, por ejemplo mediante la obtención de
una fracción pequeña de la secuencia proteica y la deducción de la
secuencia de aminoácidos restante de la proteína a partir de la
secuencia de ARNm correspondiente, que hoy en día se encuentra
fácilmente disponible en la mayoría de casos, ya que una gran parte
de las secuencias de ARNm de varias especies, entre ellas el ser
humano, se encuentra disponible en bases de datos.
El análisis de una parte muy importante de la
mayoría de proteínas de mamífero, es decir, de los sacáridos y
glicanos unidos a las mismas, generalmente ha sido más lento
comparado con los avances realizados en la tecnología de análisis
del ADN y de las proteínas.
La importancia de las glicomoléculas queda
enfatizada por el descubrimiento de la penicilina, un inhibidor de
la síntesis de glicomoléculas en la pared celular bacteriana y
posiblemente el antibiótico con más éxito descubierto hasta el
momento.
Otro ejemplo es la utilización médica de la
heparina, un glicano que inhibe la coagulación de la sangre y que
hoy en día se utiliza ampliamente en medicina. Entre otros ejemplos
de glicomoléculas importantes en medicina se incluyen:
glucosaminoglicanos (GAGs), heparán sulfato, citoquinas (por ejemplo
IL-8, TNF), quimoquinas (por ejemplo el factor de
crecimiento fibroblástico ácido) y diversos factores de crecimiento.
Las citoquinas, quimoquinas y factores de crecimiento anteriormente
indicados también son capaces de unirse a GAGs y a otros
polisacáridos, y por lo tanto también pueden considerarse que son
lectinas.
La determinación estructural de los polisacáridos
es de importancia fundamental para el desarrollo de la
glicobiología. La investigación en la glicobiología se refiere a
sujetos tan diversos como las anteriormente indicadas paredes
celulares bacterianas, los glicanos sanguíneos, las estructuras
receptoras de superficie celular y los factores de crecimiento
implicados en algunas enfermedades víricas, tales como la infección
por VIH, en enfermedades autoinmunológicas, tales como la diabetes
dependiente de insulina y la artritis reumatoide, y en el
crecimiento celular anormal que se produce en el cáncer.
En otros campos de la medicina, tales como la
provisión de lentes de contacto, piel artificial, desarrollo de
prótesis, los polisacáridos son buenos materiales candidatos.
Además, los polisacáridos se utilizan en varios campos no médicos,
tales como la industria del papel. Asimismo, evidentemente la
industria alimentaria y farmacéutica utiliza grandes cantidades de
diversos polisacáridos y oligosacáridos.
En todos los campos anteriormente indicados,
existe una necesidad de tecnologías mejoradas de análisis de
sacáridos para los fines de control de calidad, determinación de
estructura en investigación, y para llevar a cabo análisis de
estructura-función.
Hace varios años que se han introducido
procedimientos avanzados de análisis en los campos de la
secuenciación de proteínas y de ADN. Los componentes que constituyen
el ADN y las proteínas se encuentran conectados entre sí mediante
únicamente un tipo de conexión (el puente de ácido fosfórico 5' a 3'
en el ADN y el enlace peptídico en las proteínas). El ADN contiene
únicamente cuatro componentes diferentes (los ácidos nucleicos),
mientras que las proteínas contienen aproximadamente 20 componentes
diferentes (los aminoácidos). Aunque existen aminoácidos
modificados, en primer lugar debe sintetizarse la proteína de
acuerdo con el código genético mediante la utilización de un molde
de ADN. Por lo tanto, el número y tipo de aminoácidos existentes en
una proteína de nueva síntesis se encuentra restringido a un
repertorio limitado de aminoácidos representados en el código
genético. Este código es universal, sólo con diferencias menores,
para todas las formas de vida.
Por los motivos estructurales anteriormente
indicados, el análisis estructural de proteínas y de ADN hoy en día
constituye un procedimiento simple, rápido y relativamente económico
que no requiere personal altamente cualificado.
En contraste, se ha desarrollado una multitud de
procedimientos para el análisis de las estructuras sacáridas, cada
una con sus propios inconvenientes. Todavía hoy no resulta posible,
con independencia del grado de sofisticación del procedimiento
utilizado, determinar la secuencia completa de un polisacárido, ni
siquiera de un oligosacárido, mediante la utilización de una sola
técnica. Existen varios motivos que explican esta dificultad. En
primer lugar, los sacáridos se sintetizan sin un molde. Por lo
tanto, en ausencia de información estructural, el investigador debe
aceptar que las unidades de construcción se seleccionan de entre
cualquiera de las unidades sacáridas conocidas en la actualidad.
Además, estas unidades podrían resultar modificadas, por ejemplo
mediante la adición de grupos sulfato, durante la síntesis.
En segundo lugar, los enlaces entre las unidades
sacáridas son múltiples. Un sacárido puede encontrarse conectado a
cualquiera de entre los átomos C1, C2, C3, C4 o C6 si la unidad de
azúcar a la que se encuentra conectado es una hexosa. Además, el
enlace con el átomo C1 puede encontrarse en configuración \alpha ó
\beta.
En tercer lugar, los sacáridos pueden encontrarse
ramificados, lo que complica adicionalmente su estructura y el
número de estructuras posibles con el mismo número y tipo de
unidades de azúcar.
Una cuarta dificultad se debe al hecho de que la
diferencia de estructura entre muchos azúcares es mínima, ya que
una unidad de azúcar puede diferir de otra meramente por la posición
de los grupos hidroxi (epímeros).
Se han desarrollado varios procedimientos para el
análisis estructural de los sacáridos.
La patente WO 93/24503 da a conocer un
procedimiento en el que las unidades de monosacáridos se extraen
secuencialmente del extremo reductor de un oligosacárido mediante la
conversión del monosacárido en el extremo reductor en su forma ceto
o en su forma aldehído, y después cortando el enlace glucosídico
entre dicho monosacárido y el siguiente monosacárido en la cadena
oligosacárida mediante la utilización de hidracina. Los
monosacáridos libres se separan de la cadena oligosacárida y se
identifican mediante procedimientos cromatográficos. A
continuación, el procedimiento se repite hasta que se han cortado
todos los monosacáridos.
La patente WO 93/22678 da a conocer un
procedimiento para secuenciar un oligosacárido desconocido haciendo
suposiciones sobre la estructura básica del mismo, y después
seleccionando de entre varias herramientas de secuenciación (tales
como glucosidasas), aquélla que se predice que proporcionará la
mayor cantidad de información estructural. Este procedimiento
requiere algo de información básica sobre la estructura
oligosacárida (habitualmente la composición de monosacáridos). El
procedimiento también ilustra el hecho de que las reacciones
realizadas con reactivos de secuenciación resultan caras y
laboriosas, y por lo tanto existe una necesidad de un procedimiento
que reduzca estos costes.
La patente WO 93/22678 da a conocer un
procedimiento para detectar moléculas mediante el sondeo de una
serie ordenada monolítica de sondas, tales como
oligodesoxinucleótidos, inmovilizados sobre un chip VLSI. La
presente invención da a conocer que un gran número de sondas pueden
encontrarse unidas a una superficie inmovilizada, y que puede
detectarse la reacción de las mismas con un analito mediante una
diversidad de procedimientos utilizando circuitos lógicos en el
chip VLSI.
La patente EP 421.972 da a conocer un
procedimiento para secuenciar oligosacáridos mediante el marcaje de
un extremo de los mismos, dividiendo el oligosacárido marcado en
alícuotas y tratando cada alícuota con una mezcla diferente de
reactivos (por ejemplo de glucosidasas), agrupando las diferentes
mezclas de reacción y después analizando los productos de reacción
mediante procedimientos cromatográficos. Este procedimiento resulta
útil únicamente para glicanos N-ligados, debido a
que presentan una estructura común en el punto en el que la cadena
sacárida se encuentra unida a la proteína. Los glicanos
O-ligados son más variados y el procedimiento
todavía no ha sido adaptado para estos oligosacáridos, con una mayor
variabilidad en su estructura básica.
La patente EP A-0 166 623 da a
conocer un procedimiento para detectar glucoproteínas,
glucopéptidos, carbohidratos o glucolípidos que presentan residuos
de azúcar. Únicamente se requiere un solo componente
inmunológicamente específico para esta detección de la presencia o
ausencia de residuos de azúcar.
P. Laidler y A. Litynska (Int.
J. Biochemistry & Cell Biology, vol. 29, páginas
475-483, 1997) estudiaron los grupos
carbohidrato de la arilsulfatasa A placentaria humana mediante
cromatografía de afinidad secuencial con lectina tras corte
enzimático y marcaje con borohidruro sódico tritiado.
D. F. Smith et al. (J.
Biological Chemistry, vol. 262(25), páginas
12040-12047, 1987) identificaron un nuevo
oligosacárido en la leche humana. La estructura del oligosacárido se
determinó mediante digestión del oligosacárido marcado
radioactivamente mediante exoglucosidasa, unión con anticuerpos
anticarbohidrato específicos y análisis del derivado glucitol
marcado con ^{3}H obtenido tras permetilación e hidrólisis.
A. M. Hutchinson (Analytical
Biochemistry, vol. 220, páginas 303-307,
1994) caracterizaron los grupos carbohidrato de la fetuína
bovina mediante resonancia de plasmón superficial. La presencia o
ausencia de estructuras oligosacáridas específicas se determinó
mediante la unión de un grupo de lectinas no marcadas. Se
determinaron los enlaces y el orden de los monosacáridos mediante
digestión secuencial utilizando un abanico de exoglucosidasas
específicas.
K. Yamashita et al.
(Biochemistry, vol. 27, páginas 5565-5573,
1988) compararon las cadenas de azúcar unidas por la
asparagina de dos peptidasas renales de rata. Se dedujo la
estructura de los oligosacáridos a partir de sus tamaños y
comportamientos moleculares efectivos en cuatro columnas con
lectina, y después se confirmaron mediante digestión secuencial con
exoglucosidasa y análisis de metilación.
K. Yamashita et al.
(Biochemistry, vol. 29, páginas 3030-3039,
1990) compararon las cadenas de azúcar unidas por la
asparagina de SAP-1 purificado a partir de hígado
humano normal y de SAP-1 purificado a partir de
hígado con gangliosidosis GM1. Se estimó la estructura de los
oligosacáridos a partir de datos sobre sus tamaños moleculares
efectivos, a partir de los comportamientos en columnas con lectina
inmovilizada con diferentes especificidades de unión a
carbohidratos, a partir de los resultados de la digestión secuencial
por exoglucosidasas con diferentes especificidades para los
aglucones y a partir de análisis de metilación.
Por lo tanto, es un objetivo de la invención
proporcionar un procedimiento para el análisis estructural de
sacáridos que resuelva todos los problemas asociados con los
procedimientos anteriormente indicados de la técnica anterior.
De esta manera, la invención proporciona el
análisis estructural anteriormente descrito de sacáridos mediante
una sola técnica, sin la necesidad de combinar los resultados
obtenidos con diferentes técnicas a fin de conseguir un resultado
final.
El procedimiento de la presente invención resulta
adecuado para el análisis estructural de oligosacáridos, así como
de polisacáridos.
El procedimiento de la presente invención además
resulta adecuado para su automatización, y de esta manera
proporciona un ensayo simple y rápido que proporciona información
esencialmente suficiente para identificar de manera única un
oligosacárido o polisacárido dado.
La presente invención además proporciona un
procedimiento para identificar la secuencia de un oligosacárido o
polisacárido dado.
Se pondrán de manifiesto objetivos y ventajas
adicionales de la invención a lo largo de la descripción.
Un procedimiento para el análisis estructural de
un sacárido, que comprende:
- a)
- proporcionar sobre una superficie de un sustrato, una pluralidad de agentes de unión esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio con diferentes especificidades de unión, en la que la pluralidad de dichos agentes esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio se encuentran inmovilizados sobre la misma superficie de dicho sustrato;
- b)
- poner en contacto dicha superficie con un sacárido a analizar, o con una mezcla que comprende una pluralidad de fragmentos de dicho sacárido;
- c)
- lavar o eliminar de otra manera el sacárido o fragmentos del mismo no unidos;
- d)
- añadir a la superficie obtenida en la etapa c) un marcador esencialmente específico de secuencia y/o de sitio, o una mezcla de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio;
- e)
- obtener una o más imágenes de los marcadores que se encuentran unidos a dicha superficie; y
- f)
- derivar información relacionada con la identidad del sacárido que se analiza a partir de dicha imagen.
La invención proporciona además un procedimiento
para el análisis estructural de un sacárido, que comprende:
- a)
- proporcionar sobre perlas una pluralidad de diferentes agentes de unión esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio con diferentes especificidades de unión, en el que se inmovilizan sobre dichas perlas algunas de entre la pluralidad de dichas secuencias esencialmente específicas de secuencia y/o de sitio;
- b)
- poner en contacto dichas perlas con un sacárido a analizar, o con una mezcla que comprende una pluralidad de fragmentos de dicho sacárido;
- c)
- lavar o, de otra manera, extraer los sacáridos o fragmentos de sacárido no unidos;
- d)
- añadir a las perlas obtenidas en la etapa c) un marcador esencialmente específico de secuencia y/o de sitio, o una mezcla de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio;
- e)
- obtener una o más imágenes de los marcadores que se encuentran unidos a dichas perlas; y
- f)
- derivar la información relacionada con la identidad del sacárido que se está analizando a partir de dicha imagen.
Preferentemente, dichas perlas comprenden una
multitud de alícuotas de perlas, conteniendo cada alícuota un
primer agente esencialmente específico de secuencia y/o de sitio, y
además caracterizado porque en la etapa (b), las alícuotas de las
perlas se ponen en contacto de manera separada con dichos sacáridos
o fragmentos de sacári-
do.
do.
En una forma de realización preferente del
procedimiento de la invención, los marcadores esencialmente
específicos de secuencia y/o de sitio son agentes de unión
cromogénicos. El término "agente de unión cromogénico" tal
como se utiliza en la presente memoria incluye todos los agentes que
se unen a sacáridos y que presentan un color diferenciado o un
marcador detectable de otro modo, de manera que tras la unión a un
sacárido, dicho sacárido adopta dicho color u otro marcador. Además
de las estructuras químicas que presentan colores intrínsecos
fácilmente observables en el espectro visible, entre otros
marcadores utilizados se incluyen grupos fluorescentes, marcas de
biotina, enzimas (que pueden utilizarse en una reacción que resulte
en la formación de un producto coloreado), marcadores magnéticos e
isotópicos, y otros. La lista anterior de marcadores detectables se
proporciona únicamente a título ilustrativo y de ninguna manera
pretende ser limitativa o exhaustiva. De manera similar, el término
"color" tal como se utiliza en la presente memoria (por ejemplo
en el contexto de la etapa (c) del procedimiento anteriormente
descrito) también incluye cualquier marcador detectable.
En una forma de realización preferente del
procedimiento de la invención, la información estructural se
obtiene mediante simple inspección visual de la superficie y la
comparación con un estándar. Alternativamente, en otra forma de
realización preferente, la etapa (f) comprende la utilización de
filtros ópticos. En una forma de realización preferente adicional,
la imagen de los colores que se desarrollan en la superficie se
captura mediante fotografía y después se digitaliza.
Aunque el procedimiento de la invención puede
llevarse a cabo utilizando cualquier agente de unión esencialmente
específico de secuencia adecuado, la invención se dirige
particularmente a la utilización de lectinas como agentes de unión
esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio. En otra forma
de realización preferente de la invención, los agentes de unión
esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio son
anticuerpos.
Puede utilizarse cualquier sustancia coloreada (o
detectable de otro modo) adecuada que se una a sacáridos de una
manera esencialmente específica para secuencia y/o de sitio como
agente de unión cromogénico esencialmente específico de secuencia
y/o de sitio. Sin embargo, generalmente el agente de unión
cromogénico esencialmente específico de secuencia y/o de sitio es
una lectina cromogénica o un anticuerpo cromogénico. En una forma
de realización preferente de la invención, el agente de unión
cromogénico es una lectina coloreada. Otras formas de realización
preferentes requieren la utilización de lectinas marcadas
fluorescentemente o con biotina o con anticuerpos. En todavía otra
forma de realización preferente, el agente de unión cromogénico
esencialmente específico de secuencia es un anticuerpo marcado con
enzima.
En otro aspecto, el procedimiento de la invención
comprende además el tratamiento del sacárido con un agente
esencialmente específico de secuencia capaz de cortar la cadena
sacárida tras la unión a la misma. Este tratamiento puede llevarse
a cabo antes de que el sacárido se ponga en contacto con la
superficie. Alternativamente, el tratamiento puede llevarse a cabo
tras la eliminación del sacárido no unido, aunque previamente a la
adición de los agentes de unión cromogénicos esencialmente
específicos de secuencia.
En una forma de realización particularmente
preferente del procedimiento de la invención, la superficie es un
papel de filtro, y los agentes esencialmente específicos de
secuencia se disponen en un orden predefinido sobre dicho papel de
filtro.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para construir una tarjeta de identidad de
glicomolécula (GMID), que reúne los datos del análisis estructural
del sacárido obtenidos de acuerdo con la forma de realización que
se acaba de describir con anterioridad del procedimiento de la
invención. En una forma de realización preferente, los reactivos
esencialmente específicos de secuencia utilizados se representan en
la tarjeta GMID mediante números de código. En otra forma de
realización preferente, las combinaciones de reactivos
esencialmente específicos de secuencia utilizados en los análisis se
representan mediante números de código únicos.
La invención también se refiere a un soporte
sólido que comprende en un orden predefinido, una pluralidad de
marcadores visuales, o detectables de otro modo, representativos de
un sacárido o de una secuencia o fragmento sacárido, en el que
dicho soporte sólido es obtenible mediante:
- a)
- la provisión sobre una superficie de un sustrato de una pluralidad de diferentes agentes de unión esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio con diferentes especificidades de unión, en la que algunos de entre una pluralidad de dichos agentes esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio se encuentran inmovilizados sobre la misma superficie de dicho sustrato;
- b)
- la puesta en contacto de dicha superficie con un sacárido a analizar, o con una mezcla que comprende una pluralidad de fragmentos de dicho sacárido;
- c)
- el lavado o eliminación de otro modo de sacáridos o fragmentos de sacáridos no unidos; y
- d)
- la adición a la superficie obtenida en la etapa c) de un marcador esencialmente específico de marcador y/o de sitio, o una mezcla de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio.
En otro aspecto, la invención también abarca un
procedimiento para seleccionar un conjunto de agentes de unión
cromogénicos esencialmente específicos de secuencia para la
utilización en el procedimiento anteriormente descrito, que
comprende las etapas siguientes:
- a)
- obtención de la composición total o parcial de monosacáridos (CM) del sacárido a analizar;
- b)
- selección de un conjunto de n marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio que sean capaces de unirse a los monosacáridos presentes en dicho sacárido;
- c)
- revisión del conjunto de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio obtenido en la etapa b) con el fin de garantizar que ningún par de marcadores en dicho conjunto presente el mismo color o marcador detectable de otro modo;
- d)
- revisión del conjunto de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio seleccionados en la etapa c) con el fin de reducir la reactividad cruzada con los agentes de unión esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio o con otros marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio.
En una forma de realización preferente del
presente procedimiento, la CM del sacárido a analizar se estima a
partir de la CM de un sacárido relacionado. En otra forma de
realización preferente, la CM del sacárido a analizar se obtienen
llevando a cabo un análisis completo de la CM de dicho sacárido. En
otra forma de realización preferente del presente procedimiento, n
presenta un valor comprendido entre 1 y 4.
La presente invención se refiere asimismo a
software para seleccionar un conjunto de marcadores esencialmente
específicos de secuencia para la utilización en el procedimiento
anteriormente descrito de análisis estructural de sacáridos, que
comprende:
- a)
- entrada de datos con la composición de monosacáridos (CM);
- b)
- subprograma de apareamiento para aparear los n marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio que son capaces de unirse a los monosacáridos presentes en dicho sacárido;
- c)
- subprograma de revisión para revisar un conjunto de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio apareados por el subprograma b), siendo capaz dicho subprograma de seleccionar dichos marcadores a partir de su menor reactividad cruzada con los agentes de unión esencialmente específicos de secuencia o de sitio o con otros marcadores esencialmente específicos de secuencia o de sitio;
- d)
- segundo subprograma de revisión capaz de garantizar que ningún par de marcadores en dicho conjunto presenta el mismo color o característica detectable de otro modo.
Los procedimientos de la invención pueden
utilizarse para investigar la estructura de los oligosacáridos o
polisacáridos. También pueden utilizarse cuando estos oligosacáridos
o polisacáridos se encuentran acoplados a otras moléculas, por
ejemplo a péptidos, proteínas o lípidos. Específicamente, el
procedimiento de la invención puede utilizarse para el examen
estructural de los glucosaminoglicanos (GAGs), entre ellos heparina,
heparán sulfato, condroitín sulfato, dermatán sulfato y
similares.
La totalidad de las características y ventajas
anteriormente indicadas de la invención y otras se entenderán
adicionalmente a partir de los siguientes ejemplos ilustrativos y no
limitativos de las formas de realización preferentes de la
misma.
La presente invención se entenderá más claramente
a partir de la descripción detallada de las formas de realización
preferentes en los dibujos adjuntos, en los que:
la fig. 1 es una ilustración de las tarjetas
de identidad de glicomolécula (GMID) obtenidas para la leche de
cabra pasteurizada (A y B), para la leche de cabra no pasteurizada
(C y D) y para la leche bovina (E).
La fig. 2 es una reproducción de las tarjetas
GMID obtenidas para diversas muestras de lipopolisacáridos. Las
tarjetas A y E corresponden a los LPS No. 1, 7, 10, 15 y 16,
respectivamente.
La fig. 3 es un gráfico de flujo lógico de
alto nivel que ilustra un algoritmo para la selección de un
conjunto de lectinas coloreadas.
A fines de clarificación, a continuación se
describen algunos de los términos utilizados en la presente
memoria:
La expresión "agente esencialmente específico
de secuencia" se refiere a un agente capaz de unirse a un
sacárido, la unión habitualmente es específica de una secuencia, es
decir, el agente se une únicamente a una secuencia determinada de
unidades monosacáridas. Sin embargo, esta especificidad de secuencia
puede no ser absoluta, debido a que el agente puede unirse a otras
secuencias relacionadas (tales como las secuencias monosacáridas en
las que uno o más de los sacáridos ha sido eliminado, modificado o
insertado). El agente también puede unirse, además de a una
secuencia dada de monosacáridos, a una o más secuencias o
monosacáridos no relacionados. El agente esencialmente específico
de secuencia habitualmente es una proteína, tal como una lectina,
un anticuerpo específico para un sacárido, una glucosidasa o una
glucosiltransferasa. Entre los ejemplos de lectinas se incluyen las
lectinas aisladas a partir de las especies vegetales siguientes:
\newpage
Además de los ejemplos anteriormente indicados de
lectinas, otros compuestos biológicamente activos, tales como
citoquinas, quimoquinas y factores de crecimiento también poseen la
capacidad de unirse a GAGs y a otros polisacáridos, y por lo tanto,
para los fines de la presente invención se considera que son
lectinas.
Entre los ejemplos de glucosidasas se incluyen
\alpha-galactosidasa,
\beta-galactosidasa,
N-acetilhexosaminidasa,
\alpha-manosidasa,
\beta-manosidasa,
\alpha-fucosidasa y similares. Algunos de estos
enzimas pueden, dependiendo del origen de aislamiento de los mismos,
presentar una especificidad diferente.
Los enzimas anteriormente indicados se encuentran
comercialmente disponibles, por ejemplo de Oxford Glycosystems
Ltd., Abingdon, OX14 1RG, Reino Unido, de Sigma Chemical Co., St.
Louis, Mo., USA, o de Pierce, POB, 117, Rockford, 61105 USA.
La expresión "agente de corte" se refiere a
un agente esencialmente específico de secuencia que corta la cadena
sacárida en su secuencia de reconocimiento. Los agentes de corte
típicos son las glucosidasas, entre ellos las exoglucosidasas y las
endoglucosidasas, y las glucosiltransferasas. Sin embargo, también
los reactivos químicos capaces de cortar un enlace glucosídico
pueden servir como agentes de corte, con la condición de que sean
esencialmente específicos de secuencia. La expresión "agente de
corte" se encuentra dentro del contexto de la presente
especificación como sinónima de la expresión "agente esencialmente
específico de secuencia capaz de cortar".
La expresión "secuencia de reconocimiento"
se refiere a la secuencia de monosacáridos reconocida por un agente
esencialmente específico de secuencia. Las secuencias de
reconocimiento habitualmente comprenden 2 a 4 unidades
monosacáridas. Un ejemplo de una secuencia de reconocimiento es
Gal\beta1-3 GalNAc, reconocida por una lectina
purificada a partir de Arachis hypogaea. Los monosacáridos
libres, cuando resultan reconocidos específicamente por un agente
esencialmente específico de secuencia pueden, para el propósito de
la presente invención, definirse como secuencias de
reconocimiento.
El término "sacárido" se refiere a cualquier
oligosacárido o polisacárido lineal o ramificado. El término se
utiliza en la presente memoria y en lo sucesivo en un sentido
diferente del generalmente utilizado en la técnica, en el aspecto
de que comprende también los polisacáridos y las estructuras
sacáridas de los glicanos y similares.
El término "mapaje" se refiere a la
definición de un orden secuencial de determinados patrones
predefinidos en la cadena polisacárida, un procedimiento que resulta
finalmente en la obtención de la secuencia de un sacárido, es decir
en la determinación completa de la totalidad de los bloques
constructivos del sacárido.
La expresión "mapa de secuenciación" se
refiere a una sucesión ordenada de sitios de reconocimiento tal y
como se encuentran en el sacárido.
El término "monosacárido" se refiere a una
sola unidad de azúcar, tal como por ejemplo una hexosa, una tetrosa
o una pentosa. Entre los ejemplos específicos de monosacáridos se
incluyen galactosa (Gal),
N-acetil-galactosamina (GalNAc),
manosa (Man), glucosa (Glc) y similares.
En una forma de realización preferente de la
invención, los procedimientos descritos anteriormente e ilustrados
posteriormente pueden utilizarse para cribar los agentes
terapéuticos mediante la determinación de la estructura de los
agentes terapéuticamente activos o fragmentos activos de los mismos.
De esta manera, la invención se refiere a la utilización del
procedimiento anteriormente descrito en el cribado de agentes
terapéuticamente activos.
En una forma de realización adicionalmente
preferente, los procedimientos analíticos y de mapaje resultan
adicionalmente útiles en la optimización de agentes terapéuticamente
activos, en cuanto que permiten la evaluación del grado de
glucosilación de diversos agentes terapéuticamente activos y la
comparación entre los mismos. Por ejemplo, es bien conocido en la
técnica que la galactosa en el extremo no reductor de la cadena de
glicano puede estar asociada a la rápida eliminación del sistema
circulatorio de la glucoproteína de la que dicha cadena constituye
una parte integral. Ello a su vez puede afectar radicalmente los
parámetros farmacocinéticos asociados con estas glucoproteínas,
cuando se utilizan como agentes terapéuticamente activos. Por lo
tanto, la invención también se refiere a la utilización de los
procedimientos descritos anteriormente en el desarrollo y
optimización de agentes terapéuticamente activos.
En otra forma de realización preferente, la
invención se refiere a la utilización de los procedimientos
descritos en la presente memoria en el diagnóstico de enfermedades.
Un ejemplo de la utilización diagnóstica de los procedimientos
analíticos de la invención es la comparación y/o identificación de
lipopolisacáridos (LPSs) aislados a partir de bacterias, con el fin
de determinar la identidad de los patógenos microbianos. La
comparación de diferentes muestras de LPS microbiano mediante la
utilización del procedimiento de la presente invención se ilustra
posteriormente, en el Ejemplo 6.
En todavía otra forma de realización preferente,
la invención se refiere a la utilización de los procedimientos de
la invención en el análisis de alimentos y/o de bebidas. Este
análisis puede incluir la utilización del procedimiento GMID para
la comparación de muestras de alimento o de bebida con estándares
conocidos, con el fin de determinar su origen de especie. A título
de ejemplo, el análisis GMID de muestras de leche de diferente
origen se ilustra en el Ejemplo 5, posteriormente. Un ejemplo
adicional es la detección e identificación de contaminantes
bacterianos en preparaciones de alimentos y de bebida, tal como el
análisis de LPS descrito posteriormente en el Ejemplo 6.
En una forma de realización adicionalmente
preferente, la invención proporciona la utilización de los
procedimientos anteriormente descritos en el análisis de cultivos
agrícolas genéticamente modificados (GM) y de los productos
derivados de los mismos. Entre los ejemplos de cultivos GM se
incluyen aquellos que producen anticuerpos humanizados (siendo
dichos anticuerpos, glucoproteínas), así como los cultivos que
producen almidón modificado u otros polisacáridos.
La invención proporciona un procedimiento para el
análisis de cadenas sacáridas. La invención utiliza mecanismos de
reacción biológica, por ejemplo aquellos que implican agentes que
son capaces de reconocer secuencias oligosacáridas cortas, así como
enzimas. En contraste con los procedimientos de la técnica anterior,
la invención utiliza una multitud de reacciones (es decir, un
análisis rico en información). Ello permite que el procedimiento de
la invención evite completamente la utilización de las costosas
tecnologías utilizadas en la mayoría de los procedimientos de la
técnica anterior, tales como, por ejemplo, la espectrometría de
masas del decaimiento post-fuente de
desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (PSD
MALDI-MS), HPLC-NIS o el bombardeo
rápido de átomos acoplado con espectrometría de masas.
De acuerdo con una forma de realización
preferente de la invención, tras la reacción de un sacárido
(marcado en el extremo reductor) con un primer agente esencialmente
específico de secuencia, se lleva a cabo una etapa de detección. La
presencia del marcaje indica la presencia del sitio de
reconocimiento a para el primer agente esencialmente
específico de secuencia en el sacárido. Resulta importante indicar
que esta etapa proporciona al usuario información referente a cuál
de los sitios de unión de la lectina se encuentra presente en el
sacárido. Tras la reacción con un segundo agente esencialmente
específico de secuencia, que corta el sacárido en su secuencia de
reconocimiento b, se repite la etapa de detección. La
ausencia de marcaje muestra que la secuencia del primer y segundo
sitio de reconocimiento es un extremo reductor
a-b.
Con el fin de ilustrar adicionalmente el
procedimiento de la invención, a continuación suponemos que el
primer agente esencialmente específico de secuencia es una lectina,
con un sitio de reconocimiento a. El sacárido a analizar no
se encuentra marcado. En una segunda etapa, se añade un anticuerpo
marcado que reconoce una determinada secuencia sacárida b.
Seguidamente se lleva a cabo una etapa de detección, que muestra si
el anticuerpo ha reconocido el sacárido. En el caso de que lo haya
reconocido, todas las reacciones, con independencia de la lectina
utilizada, resultan positivas. Tras el lavado para desprender los
anticuerpos no unidos, se añade una glucosidasa. La glucosidasa
presenta la secuencia de reconocimiento c. Se lleva a cabo una
segunda etapa de detección. En todas las reacciones en las que se ha
perdido la señal, la secuencia de los sitios de reconocimiento debe
ser b-c-a o
a-c-b. Por otra parte, en los casos
en que se conserva la señal, la secuencia de los sitios de
reconocimiento debe ser c-b-a,
a-b-c,
b-a-c ó
c-a-b.
En la forma de realización anteriormente indicada
de la invención, no se ha establecido la relación de estos sitios
con el extremo reductor. Sin embargo, una combinación de la primera
forma de realización anteriormente descrita, en la que el sacárido
se encuentra marcado, y de la forma de realización que se acaba de
describir con anterioridad, en la que se encuentra marcado el
segundo agente esencialmente específico de secuencia, proporcionará
fácilmente dicha información. De esta manera, en una forma de
realización adicional de la invención, el sacárido se marca en su
extremo reductor. A continuación, en una primera etapa se une a
diversas lectinas. En una segunda etapa, se une el anticuerpo
marcado. La lectina y el anticuerpo se marcan con diferentes
marcajes que pueden detectarse de manera independiente uno de otro.
De esta manera, a continuación ambos marcajes pueden detectarse de
manera independiente uno de otro, en una primera y segunda etapa de
detección. En una tercera etapa, se añade una glucosidasa.
Seguidamente se llevan a cabo una tercera y cuarta etapas de
detección, con el fin de verificar la presencia de ambos marcajes
en cada reacción. Si ambos marcajes se encontraban presentes antes
de la adición de la glucosidasa, existen varias posibilidades. En
primer lugar, si se conservan ambos marcajes tras la adición de la
glucosidasa, la secuencia de los sitios de reconocimiento es un
extremo reductor c-a-b. En
segundo lugar, si se pierden ambos tras la adición de la
glucosidasa, la secuencia de los sitios de reconocimiento debe ser
un extremo reductor a-c-b. En
tercer lugar, si se conserva el marcaje del sacárido y se pierde el
marcaje de anticuerpo, la secuencia de los sitios de reconocimiento
debe ser un extremo reductor
b-c-a. En cuarto lugar, si se
conserva el marcaje de anticuerpo y se pierde el marcaje de
sacárido, la secuencia de los sitios de reconocimiento debe ser un
extremo reductor a-b-c o un
extremo reductor b-a-c.
Puede llevarse a cabo un conjunto análogo de
reacciones en las que en primer lugar el sacárido se digiere con un
agente de corte, y en etapas posteriores se hace reaccionar con
agentes de unión.
Por ejemplo, en una forma de realización
preferente, un sacárido marcado en el extremo reductor se hace
reaccionar con un primer agente esencialmente específico de
secuencia, que puede ser una glucosidasa con la secuencia de
reconocimiento a. En una reacción de control, el sacárido
marcado se deja sin tratar. A continuación, las reacciones se hacen
reaccionar adicionalmente de manera independiente con un segundo
agente inmovilizado esencialmente específico de secuencia, que
puede ser una lectina con la secuencia de reconocimiento b.
Tras el lavado para desprender el sacárido no unido, se lleva a cabo
una etapa de detección. La presencia del marcaje indica que el
sitio b se encuentra presente en el sacárido. Mediante la
comparación de las reacciones en las que se encuentra presente el
primer agente esencialmente específico de secuencia con reacciones
independientes de control en las que el primer reactivo
esencialmente específico de secuencia se encuentra ausente, puede
determinarse el efecto de la glucosidasa sobre la presencia del
marcaje. Por ejemplo, si se detecta el marcaje en la reacción de
control tras la unión con la lectina de la secuencia de
reconocimiento b, pero no se detecta en una reacción en la
que el primer agente esencialmente específico de secuencia es una
glucosidasa con la secuencia de reconocimiento a, la
secuencia de los sitios de reconocimiento es un extremo reductor
b-a. Por otra parte, si el marcaje se
encuentra presente en ambas reacciones, en la reacción de control y
en la reacción de la glucosidasa, ello indica que la secuencia de
los sitios de reconocimiento es un extremo reductor
a-b. El sitio de reconocimiento a
puede no encontrarse situado dentro del sacárido, es decir puede no
encontrarse en la secuencia sacárida.
La forma de realización anteriormente indicada de
la invención puede utilizarse con múltiples primeros agentes
esencialmente específicos de secuencia. Éstos se utilizan
habitualmente en reacciones independientes, junto con una reacción
de control. También resulta posible utilizar más de un primer agente
esencialmente específico de secuencia en una reacción. La
multiplicidad de reacciones incrementa la cantidad de información
relacionada con la estructura que se obtiene.
En una forma de realización adicional de la
invención, se utiliza un sacárido no marcado. Tras la digestión con
una glucosidasa con la secuencia de reconocimiento a, el
sacárido se hace reaccionar con una lectina inmovilizada. Tras el
lavado para desprender el sacárido no unido, se hace reaccionar un
anticuerpo marcado que presenta el sitio de reconocimiento c
con el fragmento de sacárido unido. La detección del marcaje tras
el lavado para desprender el anticuerpo no unido indica que c se
encuentra situado en el fragmento de sacárido que se une a la
lectina. La secuencia de los sitios de unión puede ser
c-b-a o
b-c-a. La situación del
extremo reductor con respecto a la secuencia de los sitios de
reconocimiento no puede determinarse a partir de esta reacción. La
detección del marcaje en la reacción de control (sin glucosidasa),
pero no en la reacción con glucosidasa, indica que la secuencia de
los sitios de reconocimiento es
b-a-c. Además, en esta forma
de realización, las reacciones independientes adicionales con
diferentes glucosidasas, solas y/o en combinación, diferentes
lectinas y/o diferentes anticuerpos,
\hbox{incrementarán la
cantidad de información obtenida.}
Resulta evidente que las formas de realización de
la invención adicionalmente descritas anteriormente, en las que el
tercer agente esencialmente específico de secuencia proporciona la
etapa de corte, y las formas de realización que se acaban de
describir con anterioridad, en las que el primer agente
esencialmente específico de secuencia proporciona la etapa de
corte, son sustancialmente equivalentes. Una diferencia entre ambas
formas de realización de la invención es que, aunque en las formas
de realización adicionalmente descritas anteriormente el efecto del
agente de corte puede observarse mediante la detección de la
presencia de marcaje antes de la reacción con el tercer agente
esencialmente específico de secuencia, en las formas de realización
descritas directamente antes, debe utilizarse una reacción de
control con el tercer agente esencialmente específico de secuencia
con el fin de determinar el efecto de dicho reactivo de corte. Sin
embargo, la cantidad de información obtenida con las diferentes
formas de realización es sustancialmente igual, al igual que los
procedimientos para ordenar dicha información y las secuencias de
los sitios de reconocimiento, es decir los tripletes, a partir de
la misma.
Los ejemplos anteriores se basan en la suposición
de que el sacárido es lineal y de que la glucosidasa presenta un
sitio de reconocimiento dentro de la secuencia del sacárido. Sin
embargo, la presencia de un sitio de reconocimiento para la
glucosidasa dentro del sacárido habitualmente resultará fácilmente
verificable a partir del análisis de las reacciones con otras
lectinas. Si se pierde cualquiera de los dos marcajes en cualquier
reacción con una lectina tras la adición de la glucosidasa, la
glucosidasa debe presentar un sitio de reconocimiento dentro del
sacárido.
Como agente esencialmente específico de secuencia
puede utilizarse una glucosiltransferasa. Una glucosiltransferasa
añadirá una unidad de azúcar en un punto determinado en la secuencia
sacárida, de acuerdo con un patrón específico de secuencia
(secuencia de reconocimiento). Por lo tanto, si el monosacárido
utilizado en la reacción se marca, puede introducirse un nuevo
marcaje en la cadena sacárida indicando la presencia del sitio de
reconocimiento para la glucosiltransferasa. Evidentemente el marcaje
introducido por la glucosiltransferasa debe ser distinguible de
otros marcajes utilizados.
Al llevar a cabo un conjunto de reacciones con un
anticuerpo marcado tal como se ha descrito anteriormente, el
anticuerpo puede unirse en la mayoría de reacciones, pero pueden
permitirse muy pocas excepciones. Ello se debe a la posibilidad de
solapamiento entre las secuencias de reconocimiento del sacárido
para la lectina y para el anticuerpo. En este caso, la reacción con
una lectina determinada resultaría negativa. A continuación esta
información podría utilizarse para deducir un tramo de 3 a 7
unidades de azúcar, ya que las secuencias de reconocimiento de la
lectina y del anticuerpo son de 2 a 4 unidades de azúcar cada
una.
Alternativamente, la primera y segunda etapas de
detección descritas anteriormente pueden llevarse a cabo de manera
simultánea si no existe interferencia entre las dos detecciones.
A título de ejemplo adicional, si en una primera
secuencia de reacciones, la primera reacción con una lectina se
produce en el sitio a en una cadena polisacárida marcada en
un extremo, y la segunda reacción con una glucosidasa se produce en
el sitio b en la cadena polisacárida, la reacción con el
tercer agente esencialmente específico de secuencia, en el sitio
c, introduce entonces un segundo marcaje, que puede
distinguirse del primer marcaje. Por lo tanto, la presencia de ambos
marcajes indicaría que la secuencia de los tres sitios es un
extremo reductor b-a-c o un
extremo reductor b-c-a.
Por otra parte, si únicamente se detecta el
primer marcaje, existen dos posibilidades: (1) el sitio de
reconocimiento para el tercer agente esencialmente específico de
secuencia se encuentra ausente en el polisacárido, o (2) la parte
del polisacárido que contiene el sitio de reconocimiento ha sido
cortada por el segundo agente esencialmente específico de
secuencia.
Lo anterior puede verificarse mediante una
segunda secuencia de reacciones, en la que el segundo agente
esencialmente específico de secuencia se omite o se utiliza bajo
condiciones de tamponado que no permitan el corte. Si, en esta
segunda secuencia de reacciones, no se detecta el segundo marcaje
tras la reacción con el tercer agente esencialmente específico de
secuencia, ello indica que el tercer agente esencialmente específico
de secuencia carece de un sitio de unión en el sacárido. Por otra
parte, la presencia del segundo marcaje indica que el sitio de
corte se encuentra situado entre el sitio para el primer y para el
tercer agente esencialmente específico de secuencia, es decir, la
secuencia de sitios en el sacárido es un extremo reductor
c-b-a.
En el procedimiento de la invención, no hay
necesidad de llevar a cabo dichas reacciones de manera sucesiva, al
depender la última reacción de los resultados de la primera. Al
contrario, la invención proporciona un procedimiento en el que se
llevan a cabo una multitud de reacciones, de manera que resultan
posibles las deducciones anteriormente indicadas en un solo
conjunto de reacciones. Por ejemplo, en un conjunto de reacciones,
se utilizan diferentes primeros agentes esencialmente específicos de
secuencia conjuntamente con segundo y tercer agentes esencialmente
específicos de secuencia que son iguales para cada reacción. Se
lleva a cabo en paralelo un segundo conjunto de reacciones, en el
que las reacciones son iguales a las reacciones del primer conjunto
excepto por el segundo agente esencialmente específico de secuencia,
el cual se omite o se inactiva.
Sin embargo, la información obtenida en una etapa
intermedia de detección puede utilizarse ventajosamente para
excluir una selección determinada de agentes esencialmente
específicos de secuencia en las etapas siguientes. Resulta evidente
que un agente esencialmente específico de secuencia que no presente
un sitio de reconocimiento en el sacárido a analizar no
proporcionaría información si se utilizase como segundo o tercer
agente esencialmente específico de secuencia. Por lo tanto, en una
forma de realización en la que el sacárido se haya marcado, los
resultados de un ensayo de detección realizado tras la unión del
sacárido con el primer agente esencialmente específico de
secuencia, podrán utilizarse para seleccionar, de entre varios
primeros agentes esencialmente específicos de secuencia que se han
unido a sacáridos, el segundo agente esencialmente específico de
secuencia.
En todavía otra forma de realización de la
invención, la adición de un tercer agente esencialmente específico
de secuencia se repite con un agente diferente, tras completar las
etapas de detección y obtener la información tal como se ha
descrito anteriormente. Para las reacciones en las que se
conservaron ambos marcajes tras la adición del tercer agente en la
primera ocasión, se aplican las mismas consideraciones para la
interpretación de los resultados que las indicadas anteriormente. En
el caso de que únicamente se conservase uno de los marcajes,
todavía puede deducirse si el agente de corte corta entre el sitio
de reconocimiento del primer agente esencialmente específico de
secuencia y el sitio de reconocimiento del agente esencialmente
específico de secuencia que porta el marcaje (o el extremo
reductor). En este caso, el marcaje que queda también se perderá
tras la reacción con un tercer agente esencialmente específico de
secuencia diferente.
En una forma de realización adicional de la
invención, puede añadirse un segundo agente diferente esencialmente
específico de secuencia, que puede portar un marcaje diferente o
igual al marcaje del segundo agente esencialmente específico de
secuencia añadido en el primer conjunto de reacciones. La adición de
otro tercer agente esencialmente específico de secuencia que corte
la cadena sacárida entonces proporcionará información adicio-
nal.
nal.
En todavía otra forma de realización de la
invención, se añaden dos o más agentes esencialmente específicos de
secuencia diferentes, cada uno con su propio marcaje, que pueden
detectarse de manera independiente de cualquier otro marcaje
utilizado. El tipo de marcaje perdido tras la adición del agente de
corte proporcionará entonces información sobre la posición de los
sitios de unión del segundo agente esencialmente específico de
secuencia, de manera similar a las consideraciones anteriormente
indicadas para los experimentos en los que se utiliza únicamente un
solo segundo agente esencialmente específico de secuencia.
Como resultará evidente al experto en la materia,
mediante la realización de un número suficientemente grande de
reacciones tales como las indicadas anteriormente, puede obtenerse
una huella digital de las reacciones que es específica de un
sacárido determinado. Además, resulta posible "agrupar" la
información parcial de secuencias obtenidas tal como anteriormente
se ha descrito de manera general con el fin de obtener la secuencia
completa del sacárido. Debido a que el número de reacciones puede
ser muy grande (tal como se indica posteriormente), el
procedimiento de la invención no se encuentra limitado, tal como los
procedimientos de la técnica anterior, al análisis de
oligosacáridos. También puede utilizarse para determinar la
estructura de polisacáridos, es decir sacáridos grandes con muchas
unidades de monosacáridos.
En una forma de realización de la invención, el
primer agente esencialmente específico de secuencia es una lectina.
El primer agente esencialmente específico de secuencia también puede
ser un anticuerpo u otro agente específico de secuencia.
Otra forma de realización de la invención
proporciona una multitud de lectinas o anticuerpos específicos de
un sacárido con diferentes especificidades de secuencia que se
encuentran inmovilizados formando una serie ordenada sobre un
sustrato, tal como un circuito con integración a escala muy grande
(VLSI) de manera similar a los chips utilizados en la actualidad
para formar series ordenadas de oligonucleótidos. Los procedimientos
para producir estos chips y para los reactivos de unión a los
mismos se describen, por ejemplo, en la patente WO 93/22678.
En otra forma de realización, la invención
proporciona una serie ordenada virtual de primeros agentes
esencialmente específicos de secuencia inmovilizados. En la
solicitud PCT IL-97/00105, publicada como patente
WO 97/35201, el presente inventor describe un ejemplo de dicha serie
ordenada virtual utilizando partículas MASDA. Dichos primeros
agentes esencialmente específicos de secuencia se inmovilizan en
reacciones separadas sobre partículas MASDA, por ejemplo en 25
reacciones diferentes. Cada parte de la serie ordenada virtual a
continuación puede hacerse reaccionar con uno cualquiera del mismo
segundo agente esencialmente específico de secuencia,
preferentemente mediante la extracción de una alícuota de cada
reacción MASDA, mezclando dichas alícuotas y haciendo reaccionar la
mezcla con dicho segundo agente esencialmente específico de
secuencia. Si se desea hacer reaccionar partes de la serie ordenada
virtual con diferentes segundos agentes esencialmente específicos
de secuencia, pueden dejarse separadas todas las reacciones MASDA, o
combinarse una fracción de la serie ordenada virtual en una mezcla
para la reacción con un solo segundo agente esencialmente específico
de secuencia, dejando separadas otras partes de dicha serie
ordenada virtual para la reacción con diferentes segundos agentes
esencialmente específicos de secuencia. De la misma manera, también
pueden combinarse las partes de la serie ordenada virtual o dejarse
separadas para la reacción con el tercer agente esencialmente
específico de secuencia.
Alternativamente, pueden utilizarse perlas como
agentes inmovilizantes. Se han descrito en la técnica una multitud
de diferentes perlas para el propósito de unión de péptidos y de
proteínas, ver por ejemplo, el catálogo de Pierce, páginas
O-222 a O-231 y páginas
T-155 a T-200. El primer agente
esencialmente específico de secuencia, que preferentemente es una
lectina, puede encontrarse unido a perlas. Una ventaja de este
procedimiento es que las perlas posteriormente pueden dividirse en
alícuotas y hacerse reaccionar con diferentes segundo y/o tercer
agentes esencialmente específicos de secuencia, incrementando
adicionalmente de esta manera la cantidad de información
proporcionada por el procedimiento de la invención.
Las condiciones de reacción para los diversos
agentes esencialmente específicos de secuencia son conocidas en la
técnica. Alternativamente, el experto puede llevar a cabo con
facilidad una serie de ensayos con cada uno de los agentes
esencialmente específicos de secuencia, midiendo la actividad de
unión de los mismos, bajo diversas condiciones de reacción.
Ventajosamente, el conocimiento de las condiciones de reacción bajo
las que reaccionará un agente esencialmente específico de secuencia
determinado, y de las condiciones bajo las que permanecerá
inactivo, pueden utilizarse para controlar las reacciones en las que
se encuentran presentes varios reactivos esencialmente específicos
de secuencia. Por ejemplo, pueden añadirse el segundo y tercer
reactivos específicos de secuencia a la reacción de manera
simultánea, pero a través de un cambio en las condiciones de
reacción, únicamente permitirse que se encuentre activo el segundo
agente esencialmente específico de secuencia. A continuación, puede
seleccionarse un cambio adicional de las condiciones de reacción
con el fin de inactivar el segundo agente esencialmente específico
de secuencia y activar el tercer agente esencialmente específico de
secuencia. En la Tabla 1 posteriormente se listan algunos ejemplos
ilustrativos de las condiciones de reacción. Además de los datos de
pH y de temperatura listados en la Tabla 1, puede investigarse otro
factor, por ejemplo la presencia de metales, tales como Zn, o sales
de cationes, tales como Mn, Ca, Na, tal como la sal cloruro sódico,
con el fin de encontrar las condiciones de reacción óptimas o las
condiciones bajo las que un agente esencialmente específico de
secuencia determinado se encontrará activo, mientras que otros se
encontrarán inactivos.
\vskip1.000000\baselineskip
| códigos para los conjuntos | número de serie | pH | Temp. | Enzima o enzimas |
| de condiciones | de condición | (ºC) | ||
| \ding{168} \hskip1,3cm \ding{170} | 1 | 3,5 | 30 | \beta-galactosidasa de haba blanca |
| \hskip1,65cm \ding{170} | 2 | 5,0 | 37 | Endo a-N-acetilgalactosidasa |
| \alpha-1,2-fucosidasa | ||||
| \beta-1,2-galactosidasa | ||||
| \ding{168} \hskip2,8cm \ding{171} | 3 | 5,0 | 25 | \alpha-fucosidasa de riñón bovino |
| \hskip1,65cm \ding{170} \hskip1,07cm \ding{171} | 4 | 7,2 | 25 | \alpha-galactosidasa del grano del café |
| \ding{168} \hskip1,3cm \ding{170} \hskip1,07cm \ding{171} | 5 | 5,8 | 55 | Endo-\beta-galactosidasa de B. fragilis |
| 6 | 6,2 | 25 | Lisozima de huevo de pollo | |
| 7 | 4,3 | 37 | \beta-1-3,4-6-galactosidasa de testículo bovino |
| códigos para los conjuntos | número de serie | pH | Temp. | Enzima o enzimas |
| de condiciones | de condición | (ºC) | ||
| de Biodiversa | 2 a 9,5 | 50 | Gly 001-02 | |
| de Biodiversa | 3,0 a 8,0 | 50 | Gly 001-04 | |
| de Biodiversa | 2 a 11 | 50 | Gly 001-06 | |
| \bullet los símbolos representan los grupos de enzimas que son separables a partir de las condiciones externas. | ||||
| \bullet \begin{minipage}[t]{158mm} Diversa Corp. produce endoglucosidasas y exoglucosidasas termofílicas con una amplia variedad de actividades a diversos pHs y temperaturas. \end{minipage} | ||||
| \bullet también son condiciones posibles la presencia de metales y otros: Zn, Mn, Ca, NaCl. |
\vskip1.000000\baselineskip
La inmovilización del primer agente esencialmente
específico de secuencia puede hacer uso de grupos funcionales de la
proteína, tales como los grupos amino, carboxi, hidroxi o tiol. Por
ejemplo, puede funcionalizarse un soporte de vidrio con un grupo
epóxido mediante la reacción con epoxi silano, tal como se describe
en la publicación PCT anteriormente indicada. El grupo epoxi
reacciona con los grupos amino, tales como los grupos de
\varepsilon-amino libres de los residuos de
lisina. Otro mecanismo consiste en el recubrimiento de una
superficie con materiales electrometálicos, tales como el oro, como
también se describe en dicha publicación PCT. Debido a que estos
materiales forman conjugados estables con los grupos tiol, una
proteína puede unirse a dichos materiales directamente mediante los
grupos tiol libres de los residuos de cisteína. Alternativamente,
los grupos tiol pueden introducirse en la proteína mediante química
convencional, o mediante reacción con una molécula que contenga uno
o más grupos tiol y un grupo que reaccione con los grupos amino
libres, tal como el N-hidroxi succinimidil éster de
cisteína. Además, los grupos entrecruzantes hendibles por el tiol,
tales como el propionato de ditiobis(succinimidilo), pueden
hacerse reaccionar con los grupos amino de una proteína. A
continuación, una reducción con agente sulfhidrilo expondrá los
grupos tiol libres del entrecruzante.
El marcaje puede introducirse en un agente o
sacárido esencialmente específico de secuencia mediante un medio
convencional. Entre los marcajes se incluye cualquier grupo
detectable unido al sacárido o al agente esencialmente específico
de secuencia que no interfiera con su función. Los marcajes pueden
ser enzimas, tales como peroxidasa y fosfatasa. En principio,
también podrían utilizarse enzimas tales como la glucosa oxidasa y
la \beta-galactosidasa. A continuación debe
tenerse en cuenta que el sacárido puede modificarse si contiene las
unidades de monosacárido que reaccionan con dichos enzimas. Entre
otros marcajes que también pueden utilizarse se incluyen los
marcajes fluorescentes, tales como fluoresceína, rojo de Texas,
amarillo lucifer, rodamina, rojo Nilo,
tetrametil-rodamina-5-isotiocianato,
1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno,
ácido cis-parinárico, ficoeritrina, aloficocianina,
4',6-diamidino-2-fenilindol
(DAPI), Hoechst 33258, 2-aminobenzamida y similares.
Otros marcajes adicionales incluyen los metales electrodensos,
tales como el oro, ligandos, haptenos, tales como biotina, marcajes
radioactivos, y simi-
lares.
lares.
Entre los ejemplos de marcaje de sacáridos se
incluyen:
- 1.
- Utilización de marcajes de color para el extremo reductor (por ejemplo Coumarin-120)
- 2.
- Utilización de azúcar marcado radioactivamente con ^{14}C + glucosidasa (síntesis de sacárido específica de secuencia)
- 3.
- Utilización de azúcar marcado radioactivamente con ^{3}H + glucosidasa (síntesis de sacárido específica de secuencia)
- 4.
- Utilización de azúcar marcado fluorescentemente + glucosidasa (síntesis de sacárido específica de secuencia)
- 5.
- Utilización de lectina marcada fluorescentemente o mAbs
- 6.
- Utilización de mAbs marcado fluorescentemente coloreado o ligado a enzima
- 7.
- Utilización de marcaje terminal con biotina.
- 8.
- Producción de una secuencia sacárida especial y utilización de anticuerpos o lectinas que los reconocen específicamente.
La detección de marcajes enzimáticos es bien
conocida en la técnica de ELISA y en otras técnicas en las que se
utiliza rutinariamente la detección enzimática. Los enzimas se
encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo de compañías
tales como Pierce.
Los marcajes fluorescentes requieren la
excitación a una longitud de onda determinada y la detección a una
longitud de onda diferente de ésta. Los procedimientos para la
detección fluorescente son bien conocidos en la técnica y han sido
publicados en muchos artículos y libros de texto. Puede encontrarse
una selección de publicaciones sobre este tema en las páginas
O-124 a O-126 en el catálogo de 1994
de Pierce. Los marcajes fluorescentes se encuentran disponibles
comercialmente en compañías tales como SIGMA, o la anteriormente
indicada Pier-
ce.
ce.
La unión de marcajes a proteínas y a azúcares
constituyen técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los
kits comerciales para el marcaje de sacáridos con marcajes
fluorescentes o radioactivos se encuentran disponibles de Oxford
Glycosystems, Abingdon, Reino Unido. Los reactivos y las
instrucciones para su utilización para el marcaje de proteínas se
encuentran disponibles en la anteriormente indicada Pierce.
La unión habitualmente se lleva a cabo mediante
la utilización de grupos funcionales, tales como hidroxi, aldehído,
ceto, amino, sulfhidrilo, ácido carboxílico o grupos similares. Se
dispone comercialmente de varios marcajes, tales como los marcajes
fluorescentes, capaces de reaccionar con estos grupos. Además,
pueden utilizarse entrecruzantes bifuncionales que reaccionan con el
marcaje en un lado y con la proteína o sacárido en el otro. La
utilización de entrecruzantes puede resultar ventajosa a fin de
evitar la pérdida de función de la proteína o del sacárido. Sin
embargo, igualmente puede utilizarse cualquier otra técnica
adecuada de unión que permita conservar la función nativa de la
proteína o del sacárido.
Sin embargo, resulta evidente para el experto que
puede utilizarse una amplia diversidad de procedimientos publicados
para unir una proteína a un soporte dado, o para unir un marcaje a
una proteína o a un sacárido.
La detección del marcaje puede llevarse a cabo
mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Algunos
procedimientos de detección se describen en la patente WO 93/22678
anteriormente indicada. Particularmente adecuado para el
procedimiento de la presente invención es el procedimiento del
detector CCD, descrito en dicha publicación. Este procedimiento
puede utilizarse en combinación con marcajes que absorben luz a
determinadas frecuencias, y de esta manera bloquean el camino de una
fuente de luz experimental hasta la superficie del VLSI, de manera
que los sensores CCD detectan una reducción de la cantidad de luz en
el área donde se ha unido el agente marcado. El procedimiento
también se ha utilizado con marcajes fluorescentes, haciendo uso
del hecho de que estos marcajes absorben luz a la frecuencia de
excitación. Alternativamente, los sensores CCD pueden utilizarse
para detectar la emisión del marcaje fluorescente, tras la
excitación. La separación de la señal de emisión respecto de la luz
de excitación puede conseguirse mediante la utilización de sensores
con diferentes sensibilidades para las diferentes longitudes de
onda, o mediante resolución temporal, o mediante una combinación
de
ambos.
ambos.
A continuación, se ilustrará adicionalmente la
presente invención mediante los ejemplos siguientes.
El presente ejemplo ilustra adicionalmente las
técnicas para analizar las glicomoléculas de acuerdo con la
invención. Como primer y segundo agentes específicos de secuencia,
se utilizan anticuerpos. Las tablas siguientes muestran los
resultados de las reacciones con dos sacáridos diferentes que a
fines ilustrativos se designan como HS y NS.
\newpage
La estructura de los azúcares es la
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 2 muestra los resultados de la reacción
entre el sacárido y el primer y segundo agentes esencialmente
específicos de secuencia, que son anticuerpos contra el antígeno T,
contra el antígeno Lewis^{x} (Le^{x}) o contra el antígeno
Lewis^{b} (Le^{b}). El primer agente esencialmente específico de
secuencia se inmoviliza sobre una matriz, preferentemente una
micropartícula de fase sólida. El segundo agente esencialmente
específico de secuencia se marca con un agente fluorescente, es
decir rojo Nilo o color verde. Además, el extremo reductor del
sacárido se marca, utilizando un marcaje claramente distinguible del
rojo Nilo o del marcaje de color verde, que actúan como marcadores
para los segundos agentes esencialmente específicos de secuencia.
La Tabla 2 muestra las reacciones para el sacárido HS, mientras que
la Tabla 3 muestra las reacciones para el sacárido NS.
\vskip1.000000\baselineskip
| Sobre la matriz | anti-antígeno T | anti-Le^{x} | anti-Le^{b} |
| Sacárido unido | HS | HS | |
| Segundo mAb | anti-Le^{x} rojo Nilo | ||
| Señal | rojo Nilo, extremo reductor | extremo reductor | ninguno |
\vskip1.000000\baselineskip
| Sobre la matriz | anti-antígeno T | anti-Le^{x} | anti-Le^{b} |
| Sacárido unido | NS | NS | |
| Segundo mAb | anti-Le^{b} verde | anti-Le^{x} rojo Nilo | |
| Señal | verde, extremo reductor | rojo Nilo, extremo reductor |
\newpage
En resumen, las señales siguientes ahora son
detectables en las reacciones del sacárido HS o del sacárido NS
(filas) cuando se utilizan los anticuerpos indicados como primer
agente esencialmente específico de secuencia (columnas):
\vskip1.000000\baselineskip
| Sobre la matriz | anti-antígeno T | anti-Le^{x} | anti-Le^{b} |
| HS | rojo Nilo, extremo reductor | extremo reductor | |
| NS | verde, extremo reductor | rojo Nilo, extremo reductor | |
| NS | verde, extremo reductor | rojo Nilo, extremo reductor |
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la detección del marcaje y el registro del
resultado para cada reacción, se añade un tercer agente
esencialmente específico de secuencia. En este ejemplo, se utilizan
dos reacciones independientes con un tercer agente esencialmente
específico de secuencia. La fase sólida que porta la molécula
sacárida puede ahora dividirse ventajosamente en alícuotas, para la
reacción con \alpha1-2-fucosidasa
o con exo-\beta-galactosidasa
(terceros agentes esencialmente específicos de secuencia).
Alternativamente, pueden llevarse a cabo tres conjuntos de
reacciones con un primer y un segundo agentes esencialmente
específicos de secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
| reacciones tras la aplicación de \alpha1-3,4-fucosidasa: | |||
| Sobre la matriz | anti-antígeno T | anti-Le^{x} | anti-Le^{b} |
| HS | extremo reductor | ||
| NS |
\vskip1.000000\baselineskip
| reacción tras la aplicación de exo-\beta-galactosidasa procedente de D. pneumoniae (EC 3.2.1.23, número de catálogo | |||
| 1088718 de Boehringer Mannheim, 68298 Mannheim, Alemania) | |||
| Sobre la matriz | anti-antígeno T | anti-Le^{x} | anti-Le^{b} |
| HS | rojo Nilo | ||
| NS | verde | rojo Nilo |
\vskip1.000000\baselineskip
| reacciones tras la aplicación de \alpha1-2-fucosidasa: | |||
| Sobre la matriz | anti-antígeno T | anti-Le^{x} | anti-Le^{b} |
| HS | rojo Nilo, extremo reductor | extremo reductor | |
| NS | extremo reductor |
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de los datos recogidos tal como se ha
explicado anteriormente, puede crearse una tarjeta de identidad de
glicomolécula (GMID). Se muestra en la Tabla 8 un ejemplo de esta
información para el sacárido HS y en la Tabla 9, para el sacárido
NS.
| Sobre la matriz | anti-antígeno T | anti-Le^{x} | anti-Le^{b} |
| 0 | rojo Nilo, extremo reductor | extremo reductor | |
| 1 | extremo reductor | - | - |
| 2 | rojo Nilo | ||
| 3 | rojo Nilo, extremo reductor | extremo reductor |
\vskip1.000000\baselineskip
| Sobre la matriz | anti-antígeno T | anti-Le^{x} | anti-Le^{b} |
| 0 | verde, extremo reductor | rojo Nilo, extremo reductor | |
| 1 | - | - | - |
| 2 | verde | rojo Nilo | |
| 3 | extremo reductor |
\vskip1.000000\baselineskip
No resulta necesario que se den a conocer en una
lista de datos del tipo anterior la identidad del segundo y tercer
agentes esencialmente específicos de secuencia. A fines de
comparación, resulta suficiente que un número de código determinado
(1, 2 ó 3 en las tablas anteriores) identifique siempre una
determinada combinación de reactivos.
Tal como se ha indicado en la descripción y
ejemplo anteriores, el procedimiento de la invención utiliza
ventajosamente el marcaje del sacárido a investigar en su extremo
reductor. Sin embargo, esta técnica de marcaje puede extenderse a
sitios dentro del sacárido y contribuir de esta manera al
procedimiento de la invención proporcionando más información.
Debido a que resulta posible marcar el sacárido dentro de la cadena
mediante el corte con una endoglucosidasa, seguido del marcaje del
extremo reductor, resulta por tanto posible obtener un extremo
reductor marcado dentro de la cadena sacárida. Debido a que este
extremo reductor se encuentra necesariamente más cerca de los
sitios de unión para el primer, segundo y tercer agentes
esencialmente específicos de secuencia, en comparación con el
extremo reductor original, la utilización de un extremo reductor
marcado creado internamente proporciona información adicional.
Además, resulta posible mediante el marcaje secuencial de extremos
reductores de acuerdo con el procedimiento descrito adicionalmente
después, identificar en orden secuencial en la cadena del sacárido
a investigar los sitios para diferentes glucosidasas.
El procedimiento de marcaje secuencial de
extremos reductores se describe a continuación en más detalle en
las etapas siguientes:
Se incuba un polisacárido que presenta un extremo
reductor en una solución que contiene NaBH_{4} / NaOH a pH
11,5.
Este tratamiento bloquea el extremo reductor, de
manera que el polisacárido ahora carece de un extremo reductor
(ER).
El polisacárido de la etapa 1 se trata con una
endoglucosidasa. Si el sitio de reconocimiento para esta
endoglucosidasa se encuentra presente dentro del polisacárido, se
creará un nuevo extremo reductor mediante el corte del
polisacárido. Ahora la solución contiene dos sacáridos: el fragmento
con el ER nuevamente expuesto en el sitio de la endoglucosidasa, y
el segundo fragmento cuyo ER ha sido bloqueado.
Esta reacción puede llevarse a cabo utilizando,
por ejemplo, 2-aminobenzamida (disponible
comercialmente en forma de kit para el marcaje de sacáridos de
Oxford Glycosystems Inc., catálogo de 1994, p. 62). Tras completar
la reacción bajo condiciones de elevada concentración de hidrógeno y
a temperatura elevada (H+/T), seguido de reducción, la mezcla
contiene dos fragmentos, uno de los cuales se encuentra marcado en
su extremo reductor, mientras que el otro permanece sin marcar
debido al hecho de que su extremo reductor ha sido bloqueado.
Otra manera de marcar los extremos reductores es
mediante aminación reductora. Los compuestos fluorescentes que
contienen grupos arilamina se hacen reaccionar con la funcionalidad
polialdehído del extremo reductor. El doble enlace CH=N resultante
seguidamente se reduce a enlace sencillo CH_{2}-N,
por ejemplo utilizando borohidruro sódico. Esta tecnología es parte
del kit FACE (electroforesis de carbohidratos asistida por
fluóforos) disponible de Glyko Inc., Novato, CA, USA, tal como se
detalla, por ejemplo, en el catálogo de Glyco, Inc., p. 8 a 13.
A continuación puede hacerse reaccionar una
segunda endoglucosidasa con la mezcla de sacáridos. La nueva mezcla
de reacción ahora contiene tres fragmentos, uno con un extremo
reductor intacto, un segundo fragmento presenta un extremo reductor
marcado con 2-aminobencimida, y un tercero con un
extremo reductor bloqueado.
El presente ejemplo ilustra adicionalmente el
procedimiento de la invención, es decir, la producción de datos
relacionados con la estructura del sacárido mediante la utilización
de un conjunto de reacciones, tal como se ha descrito en detalle
anteriormente. El ejemplo demuestra adicionalmente que la
información de secuencia puede deducirse a partir de dicho conjunto
de reacciones.
En algunos casos, los reactivos utilizados pueden
no reaccionar exactamente según las predicciones en los datos
publicados, por ejemplo en los catálogos. Por ejemplo, la lectina
aglutinina de Datura stramonium, tal como se describe
adicionalmente después, en el catálogo de Sigma se indica que puede
unirse a GlcNac. Sin embargo, en las reacciones detalladas
adicionalmente después, se muestra que DSA se une a Glc derivatizada
por Coumarin-120 (Glc-AMC).
Aparentemente Glc-AMC actúa como GlcNac a todos los
efectos, debido a la similitud estructural entre estos compuestos.
Además, como resulta evidente a partir de los resultados descritos
posteriormente, la endogalactosidasa utilizada corta no sólo en los
residuos de galactosa, sino también en el enlace que une el grupo
Glc-AMC con el resto del sacárido.
Resulta evidente que los agentes esencialmente
específicos de secuencia utilizados en la práctica de la invención
pueden en algunos casos presentar especificidades finas que varían
respecto a las especificidades de estos agentes proporcionadas en
el material publicado, por ejemplo en los catálogos. Estas
reacciones pueden identificarse rápidamente mediante la utilización
del procedimiento de la invención con sacáridos de estructura
conocida. A continuación, los resultados pueden compararse con los
resultados esperados, y las diferencias pueden permitir la
identificación de las especificidades de las variantes de los
agentes esencialmente específicos de secuencia utilizados. Estas
variaciones en los datos publicados respecto a las especificidades
finas de los agentes esencialmente específicos de secuencia
seguidamente puede almacenarse para análisis futuros de estructuras
de sacárido desconocidas que hagan uso de estos agentes.
A continuación se ilustra el procedimiento de la
invención utilizando un pentasacárido marcado terminalmente y
diversas lectinas y glucosidasas. El pentasacárido presenta la
estructura
Gal-\beta(1,4)[Fuc-\alpha(1,3)]-GlcNAc-\beta(1,3)-Gal\beta(1,4)-Glc.
El pentasacárido se ramifica en la posición GlcNAc, con fucosa y
galactosa unidas en las posiciones 3 y 4, respectivamente. El
pentasacárido se marca en su extremo reductor (Glc) con
Coumarin-120
(7-amino-4-metil-coumarina,
disponible, por ejemplo, de Sigma, No. de catálogo A 9891). La
reacción de unión puede llevarse a cabo tal como se ha descrito
anteriormente para el marcaje de los extremos reductores mediante la
utilización de funcionalidades arilamina. El
Coumarin-120, cuando se excita a 320 nm emite
fluorescencia azul. Como primer y segundo agentes específicos de
secuencia se utilizan la
endo-\beta-galactosidasa (EG,
Boehringer Mannheim) y la
exo-1,3-fucosidasa (FD, New England
Biolabs). Las condiciones de reacción para ambos reactivos son tales
como las descritas en el catálogo NEB para la
exo-1,3-fucosidasa.
Se llevaron a cabo tres reacciones. La primera
incluía fucosidasa (FD) y endogalactosidasa (EG), la segunda,
únicamente FD, y la tercera, únicamente EG. Una cuarta reacción sin
enzimas sirvió de control.
Con el fin de determinar que los enzimas habían
digerido el sacárido, las diversas reacciones se separaron según
tamaño utilizando cromatografía en capa fina (TLC).
Tras la separación, los sacáridos en la placa de
TLC pueden detectarse mediante la exposición de la placa a luz
ultravioleta. Los resultados se muestran en la ilustración
siguiente.
En la reacción nº 4, no se añadió glucosidasa, de
manera que el sacárido quedó intacto y se desplazó sólo una corta
distancia en la placa. El fragmento de la reacción nº 2 era el
segundo en peso molecular, mientras que los fragmentos de las
reacciones nº 1 y 3 aparentemente eran iguales. A partir de estos
datos puede concluirse que la secuencia de los sitios de
glucosidasa en el sacárido era FD- -EG- -extremo
reductor (marcaje con coumarina).
A continuación se sometió a ensayo el
pentasacárido anteriormente indicado mediante un conjunto de
reacciones tal como se ha descrito en detalle anteriormente. Como
primer y segundo agentes esencialmente específicos de secuencia, se
utilizaron lectinas. Las lecitinas (aglutinina de Anguilla
anguilla (AAA), No. de catálogo L4141, aglutinina de Arachis
hypogaea (PNA), No. de catálogo L0881, aglutinina de Ricinus
communis (RCA I) No. de catálogo L9138, aglutinina de Lens
culinaris (LCA, No. de catálogo L9267, aglutinina de Arbus
precatorius (APA), No. de catálogo L9758) se encuentran
disponibles de Sigma. Las lectinas también se encuentran
disponibles de otras compañías. Por ejemplo, RCA I puede obtenerse
de Pierce, No. de catálogo 39913. Las lecitinas se inmovilizan
mediante transferencia sobre filtros de nitrocelulosa.
El tampón de reacción era solución salina
tamponada con fosfato (PBS), con adición de CaCl_{2} 1 mM y de
MgCl 1 mM. Tras la unión de las lectinas, el filtro se bloqueó con
BSA al 1% en tampón de reacción. Como controles se utilizaron
reacciones sin lectina y con 10 \mug de BSA como proteína
inmovilizada.
En la Tabla 9 se muestran los resultados de las
reacciones. Un símbolo "+" indica la presencia de
fluorescencia a 312 nm, lo que indica la presencia del extremo
reductor marcado con coumarina. Los numerales 1 a 4 en la tabla
indican reacciones tales como las definidas anteriormente.
| AAA | PNA | LCA | DSA | RCAI | |
| 1 | ++ | ||||
| 2 | ++ | ++ | ++ | ||
| 3 | ++ | ||||
| 4 | ++ | ++ | ++ | ++ |
A partir de los resultados mostrados en la Tabla
9 (reacción nº 4 - control) resulta evidente que las lectinas AAA,
PNA, DSA y RCA-1 se unen al sacárido. Por lo tanto,
fucosa, gal(1-3)GlcNAc, GlcNAc, y
galactosa/galNAc deben encontrarse presentes en el sacárido, debido
a que las estructuras de sacárido respectivas resultan reconocidas
por AAA, PNA, DSA y RCA-1. Además, resulta evidente
que las glucosidasas anteriormente indicadas fucosidasa y
endo-\beta-galactosidasa reconocen
secuencias de corte en el sacárido. Estas secuencias son
Fuc(1-3/1-4) GlcNAc y
GlcNAc\beta(1-3)Gal\beta(1-3/4)Glc/GlcNAc,
respectivamente.
Además puede deducirse que ambos sitios de
glucosidasa se encuentran situados entre el azúcar fucosa y el
extremo reductor, debido a que dicho extremo se corta con cualquiera
de las dos glucosidasas cuando se utiliza AAA (que se une a la
fucosa) como lectina inmovilizada. La reacción con DSA, por otra
parte, permite deducir que el monosacárido GlcNAc se encuentra
situado entre los sitios de glucosidasa y el extremo reductor, o
que Glc se encuentra directamente unido a la coumarina, debido a que
ninguna de las glucosidasas corta el extremo reductor cuando se
utiliza DSA como agente inmovilizado.
Además, la reacción con PNA como agente
inmovilizado muestra que el extremo reductor se corta únicamente si
se utiliza
endo-\beta-galactosidasa
(reacciones 1 a 3). Ello indica que el sitio de la
endo-\beta-galactosidasa se
encuentra situado entre el sitio para PNA y el extremo reductor. Por
otra parte, el sitio de la fucosidasa debe encontrarse situado
entre el sitio PNA y el otro extremo del sacárido.
Al considerar los datos anteriores, ahora resulta
posible proponer para el sacárido la secuencia siguiente:
Fuc\alpha(1-3,1-4)GlcNAc(1-3)Gal(1-4)Glc/GlcNAc-\sim\sim\sim\sim\sim
extremo \
reductor
El experimento anterior demuestra claramente que
el procedimiento de la invención puede proporcionar una diversidad
de datos, incluyendo la información de secuencia, basada en
relativamente pocas reacciones. Algunos detalles de la información
de secuencia pueden no ser completos, tales como el enlace
(1-3) o (1-4) entre la fucosa y
GlcNAc en el sacárido anterior. En el caso de que se hubiese
conocido la composición de monosacáridos del pentasacárido, el
análisis anterior habría proporcionado todos los detalles de dicho
pentasacárido. Sin embargo, la información obtenida incluso en
ausencia de los datos de composición de monosacáridos es muy
precisa en comparación con los procedimientos de la técnica
anterior.
El procedimiento de la invención resulta adecuado
para la automatización. De esta manera, las etapas descritas
anteriormente, por ejemplo en los ejemplos 1 a 3, pueden llevarse a
cabo utilizando un sistema automatizado para la mezcla, extracción
de alícuotas, reacción y detección. Los datos obtenidos mediante
este procedimiento automatizado seguidamente pueden procesarse
adicionalmente con el fin de "agrupar" la información de
mapaje para obtener información parcial o completa de secuencia. El
procedimiento para este procesamiento de los datos se describe con
más detalle posteriormente.
Tras la recolección de todos los datos, se lleva
a cabo una comparación entre las señales de detección obtenidas de
las reacciones anteriores a la adición de glucosidasa, y las señales
obtenidas tras la adición de (o reacción con) la glucosidasa. Las
señales que desaparecen tras la reacción con la glucosidasa se
marcan. Ello puede realizarse ventajosamente mediante la
preparación de una lista de aquellas señales, referidas en lo
sucesivo como una primera lista. La identidad de los dos sitios en
el polisacárido a continuación puede establecerse para cada una de
estas entradas de datos. La posición en la serie ordenada
(opcionalmente virtual) indica el primer agente esencialmente
específico de secuencia. Si se ha detectado una señal antes de la
reacción con la glucosidasa, el sitio de reconocimiento para ese
agente debe encontrarse presente en el polisacárido. La
desaparición de una señal, por ejemplo de la señal asociada con el
segundo agente esencialmente específico de secuencia, ahora indica
que la glucosidasa corta entre los sitios de reconocimiento del
primer y segundo agente esencialmente específico de secuencia. Por
lo tanto, la secuencia de los sitios de reconocimiento es (primer
agente esencialmente específico de
secuencia)-(glucosidasa)-(segundo agente esencialmente específico
de secuencia). Si la señal para el extremo reductor todavía se
encuentra presente tras la digestión con la glucosidasa, entonces
resulta posible establecer el orden relativo de las secuencias de
reconocimiento con respecto al extremo reductor; de otro modo,
deben tenerse en cuenta ambas posibilidades
(a-b-c y
c-b-a). A fines ilustrativos, el
término "sitio de reconocimiento del primer agente esencialmente
específico de secuencia" se indicará en lo sucesivo como
"primer sitio de reconocimiento", el término "sitio de
reconocimiento para el segundo agente esencialmente específico de
secuencia" se indicará como "segundo sitio de
reconocimiento", y el término "sitio de reconocimiento para
glucosidasa" se indicará como "glucosidasa".
Ahora resulta posible crear una segunda lista de
tripletes de sitios de reconocimiento de los tipos anteriormente
indicados (tripletes de tipo 1):
(primer sitio de
reconocimiento)-(glucosidasa)-(segundo sitio de
reconocimiento)
Por la misma razón, ahora puede crearse una
tercera lista que relaciona las localizaciones dentro de la serie
ordenada (opcionalmente virtual) en las que se conservan todas las
señales tras la adición de glucosidasa (tripletes de tipo 2):
(glucosidasa)-(primer sitio de
reconocimiento)-(segundo sitio de
reconocimiento)
Evidentemente un número suficiente de tripletes
define una molécula en términos de su secuencia, es decir,
únicamente puede existir una secuencia de sacáridos que contenga
todos los tripletes encontrados. Puede resultar necesario un número
menor de tripletes cuando se encuentre disponible información sobre
la longitud de la molécula. El número de tripletes requeridos puede
ser incluso menor si se conoce el contenido total de monosacáridos
de la molécula. Tanto el peso molecular del sacárido como el
contenido total de monosacáridos pueden derivarse a partir de
procedimientos de la técnica anterior bien conocidos por el
experto.
El procedimiento de obtención de la información
de secuencia, es decir de agrupación de los tripletes para formar
un mapa de los sitios de reconocimiento, se describe a
continuación.
La segunda y tercera listas de los
tripletes-sitios de reconocimiento se evalúan para
identidad (tres de tres sitios de reconocimiento iguales),
similitud elevada (dos de tres sitios de reconocimiento iguales) y
similitud baja (uno de tres sitios de reconocimiento iguales). A
fines de ilustración, a continuación se supone que el polisacárido
es un polisacárido lineal, tal como por ejemplo, la parte sacárida
del glicano heparina.
A continuación, se utilizan la segunda y tercera
listas anteriormente indicadas para preparar a partir de las mismas
un conjunto de listas de tripletes en los que cada lista en dicho
conjunto de listas contenga tripletes que compartan la misma
secuencia de reconocimiento de glucosidasa. Mediante la comparación
de todos los tripletes que contienen una determinada secuencia de
reconocimiento de glucosidasa con todos los tripletes que contienen
una segunda secuencia de reconocimiento de glucosidasa, ahora
resulta posible dividir la secuencia polisacárida en cuatro áreas,
desde el primer extremo de la molécula hasta la glucosidasa 1
(fragmento a), desde la glucosidasa 1 hasta la glucosidasa 2
(fragmento b), y desde la glucosidasa 2 hasta el segundo extremo de
la molécula (fragmento c):
<primer
extremo><glucosidasa 1><glucosidasa 2><segundo
extremo>
Los sitios de reconocimiento idénticos dentro de
los tripletes de tipo 2 con diferentes sitios de glucosidasa, en
los que dichos sitios de reconocimiento se encuentran situados en la
misma dirección en relación al sitio de glucosidasa respectivo,
constituyen candidatos para la localización dentro del área a
o del área c, dependiendo de dicha localización. Los sitios
de reconocimiento idénticos dentro de los tripletes de tipo 2 con
diferentes sitios de glucosidasa, en los que dichos sitios de
reconocimiento se encuentran situados en direcciones diferentes
(por ejemplo uno en la dirección del extremo reductor; el otro
triplete en la dirección del extremo no reductor) son candidatos
para la localización dentro del área b, es decir, entre los
dos sitios de glucosidasa.
Los sitios de reconocimiento idénticos dentro de
los tripletes de tipo 1 con diferentes sitios de glucosidasa son
candidatos para la localización de un sitio de entre el primer y el
segundo sitios de reconocimiento en el área a (o en el área
c), y estando localizado el otro sitio de entre dichos primer
y segundo sitios de reconocimiento, en el área c (o en el
área a). Es decir, si un sitio de entre el primer o segundo
sitios de reconocimiento se encuentra situado en el área a,
entonces el otro sitio de entre dichos primer o segundo sitios de
reconocimiento debe encontrarse localizado en el área b, y
viceversa. Ninguno de dichos primer o segundo sitios de
reconocimiento puede encontrarse situado en el área b.
Los sitios de reconocimiento idénticos dentro de
los tripletes de tipo 1 con diferentes sitios de glucosidasa, en
los que un sitio de reconocimiento dado se encuentra situado en uno
de los tripletes en la dirección del extremo reductor, y en el otro
triplete en la dirección del extremo no reductor, son candidatos
para la localización de dicho sitio de reconocimiento dentro del
área b.
Tras el establecimiento de las anteriormente
indicadas relaciones de posición para varios sitios de
reconocimiento dentro de los tripletes, seguidamente puede
organizarse el total de secuencias de reconocimiento en un orden
determinado mediante razonamiento lógico. Se hace referencia a esta
etapa como de mapaje de secuenciación. Si se organiza un número
suficiente de secuencias de reconocimiento, resulta posible derivar
la secuencia completa del sacárido a partir de las mismas. Debido a
que el procedimiento no determina el peso molecular del sacárido,
se desconoce la longitud de la cadena. Por lo tanto, si resulta
insuficiente el grado de solapamiento entre los diversos sitios de
reconocimiento, pueden existir regiones en la secuencia en las que
resulta posible encontrar unidades sacáridas adicionales. Estas
unidades sacáridas pueden no detectarse si no se encuentran
localizadas dentro de un sitio de reconocimiento de cualquiera de
los agentes esencialmente específicos de secuencia utilizados. Sin
embargo, en este caso también resulta posible obtener la información
completa de secuencia obteniendo en primer lugar el peso molecular
del sacárido, lo que indica su longitud de cadena, y en segundo
lugar, su contenido total de monosacáridos.
Otra posibilidad para cerrar huecos en el mapa de
secuenciación es el procedimiento del Ejemplo 2, en el que se
utiliza la degradación secuencial con glucosidasa para derivar la
información de secuencias.
La existencia de puntos de ramificación en el
sacárido puede complicar el procedimiento tal como se ha descrito
de manera general anteriormente. Un remedio para ello consiste en
utilizar glucosidasas para preparar fracciones de la molécula y
analizar estas estructuras parciales. El grado de ramificación en
estas estructuras parciales evidentemente es inferior al de la
molécula completa. Además, pueden utilizarse reactivos que
reconozcan específicamente los puntos de reconocimiento. Constituyen
ejemplos de estos reactivos, por ejemplo, los anticuerpos
utilizados en el Ejemplo 1, anteriormente. Cada uno de estos
anticuerpos se une a una secuencia sacárida que contiene por lo
menos un punto de ramificación. Además, se encuentran disponibles
determinados enzimas y lectinas que reconocen estructuras sacáridas
ramificadas. Por ejemplo, el enzima pululanasa (EC 3.2.1.41)
reconoce una estructura ramificada. Además, los anticuerpos pueden
producirse mediante la utilización como antígenos de estructuras
sacáridas ramificadas. Además, resulta posible producir péptidos que
se unan a determinadas estructuras sacáridas, incluyendo a
estructuras ramificadas (ver, por ejemplo, Deng SJ, MacKenzie CR,
Sadowska J, Michniewicz J, Young NM, Bundle DR, Narang; Selection of
antibody single-chain variable fragments with
improved carbohydrate binding by phage display. J. Biol. Chem.
269:9533-38, 1994).
Además, el conocimiento de la estructura de los
carbohidratos existentes en muchos casos predecirá con exactitud la
existencia de puntos de ramificación. Por ejemplo, los glicanos
N-ligados poseen un número limitado de estructuras,
tal como se indica en la página 6 del catálogo de Oxford
Glycosystems. Estas estructuras van desde las que presentan una
antena hasta las que presentan cinco antenas. Las estructuras más
complicadas se asemejan a estructuras más simples con la adición de
residuos sacáridos adicionales. Por lo tanto, si se identifica una
estructura de una antena, resulta posible predecir todos los puntos
de ramificación en una estructura más complicada simplemente
mediante la identificación de los residuos adicionales y comparando
estos datos con un biblioteca
\hbox{de estructuras de glicano
N-ligado.}
Además, con frecuencia resultará posible deducir
la existencia y localización de los puntos de ramificación de
manera lógica mediante el análisis de los datos recogidos de acuerdo
con el procedimiento de la invención. Por ejemplo, si dos sitios de
reconocimiento, llamados a y b, se localizan en ramas
diferentes, la digestión con una glucosidasa cuyo sitio se encuentra
situado entre el extremo reductor y el punto de ramificación dará
como resultado la pérdida del marcador del extremo reductor. Sin
embargo, se conservarán los marcadores para ambos sitios de
reconocimiento a y b. Si se utiliza una glucosidasa
situada entre el punto de ramificación y el sitio de
reconocimiento, el marcador para el sitio de reconocimiento b
y el marcador del extremo reductor resultarán cortados. Sin
considerar la posibilidad de puntos de ramificación, ello indicaría
que el sitio de reconocimiento b se encuentra situado entre
el sitio de reconocimiento a y el extremo reductor. Sin
embargo, si se utiliza una glucosidasa situada entre el sitio de
reconocimiento b y el punto de ramificación, el marcador de
extremo reductor y el sitio de reconocimiento a resultarán
cortados. Nuevamente, sin tener en cuenta la posibilidad de
ramificaciones, ello indicaría que el sitio de reconocimiento
a se encuentra situado entre el extremo reductor y el sitio
de reconocimiento b. Estas deducciones evidentemente son
incompatibles entre sí, y únicamente pueden resolverse si se supone
que los sitios de reconocimiento a y b se encuentran
situados en dos ramas diferentes. El punto de ramificación se
encuentra situado entre los sitios de reconocimiento a y
b y la primera de las glucosidasas anteriores. Las otras
glucosidasas anteriores utilizadas se encuentran situadas en una
rama cada una, entre el punto de ramificación y el sitio de
reconocimiento respectivo (a o b).
Por lo tanto, al utilizar en el procedimiento de
la invención agentes que reconocen estructuras ramificadas como
agentes esencialmente específicos de secuencia, resulta posible
derivar información sobre la existencia y situación de los puntos
de ramificación en la molécula sacárida. A continuación, esta
información puede utilizarse para construir mapas de secuenciación
de cada rama de la estructura, proporcionando un mapa de
secuenciación de la estructura ramificada completa. Los huecos en
una estructura de estas características seguidamente pueden
cerrarse en el caso de los sacáridos no ramificados, de acuerdo con
la invención, es decir mediante la utilización de reacciones
adicionales, tras la digestión con glucosidasas, de manera que las
regiones de la molécula en la que existen huecos se aíslen
específicamente para su análisis adicional de acuerdo con el
procedimiento de la invención, y mediante digestión secuencial con
glucosidasas, tal como se ha descrito en detalle anteriormente.
En resumen, un procedimiento para determinar la
secuencia de un sacárido y/o para el mapaje de la estructura de
dicho sacárido de acuerdo con la invención comprende las etapas
siguientes:
- 1.
- recopilar los tripletes de tipo 1 y de tipo 2.
- 2.
- clasificar dichos tripletes de acuerdo a similitud.
- 3.
- comparar los tripletes con diferentes sitios de reconocimiento de glucosidasa.
- 4.
- organizar los tripletes en el orden de aparición en el sacárido.
- 5.
- organizar los sitios de reconocimiento de glucosidasa.
- 6.
- comprobar la compatibilidad con los tripletes.
- 7.
- organizar las secuencias de reconocimiento de las glucosidasas y del primer y segundo agentes esencialmente específicos de secuencia en un solo orden de fila.
- 8.
- traducir las secuencias (sitios) de reconocimiento en secuencia polisacárida.
- 9.
- corregir los problemas de "solapamiento".
- 10.
- producir una secuencia.
- 11.
- comprobar frente a todos los datos disponibles.
Tras llevar a cabo la etapa nº 5 anterior, se ha
establecido un orden preliminar de sitios de glucosidasa. En la
etapa nº 6, a continuación se comprueba para cada triplete que las
predicciones basadas en los mismos son consistentes con dicho
orden. A continuación, basándose en las contradicciones en los
datos, se produce un nuevo modelo que se ajusta a los datos de
triplete. Este modelo seguidamente se contrasta con los datos de
todos los tripletes. Además, pueden llevarse a cabo reacciones
adicionales, con el fin de extraer información vectorial adicional
sobre los sitios de reconocimiento que implican dicho triplete.
Tras la etapa nº 8 anterior, en la que los sitios
de reconocimiento organizados secuencialmente se traducen en una
secuencia de unidades monosacáridas reales, resulta posible proponer
un modelo de la secuencia sacárida. Con el fin de contrastar dicho
modelo, resulta necesario responder a varias preguntas. La primera
de éstas es, ¿cuál es la secuencia mínima que todavía conservaría el
mismo mapa de secuenciación?. Llegados a esta etapa, la información
de peso molecular y de composición de monosacáridos, si se encuentra
disponible, ya no se tiene en cuenta. Este enfoque sirve meramente
para crear una secuencia que incorpora todos los datos disponibles
con el menor número posible de contradicciones. A este respecto, la
segunda pregunta a responder es, ¿sigue siendo consistente la
secuencia mínima con todos los datos disponibles en este punto
(excluyendo los datos opcionales de peso molecular y de composición
de monosacáridos)?. La tercera pregunta a responder es: ¿existen
otras secuencias que encajarían en el mapa de secuenciación tal como
se ha determinado?. En caso afirmativo, las secuencias adicionales
pueden contrastarse seguidamente a partir de la pregunta: ¿en qué
grado el modelo de secuencia concuerda con la información de
tripletes, y con los datos opcionales adicionales, tales como la
información sobre peso molecular, sobre composición de
monosacáridos, y las estructuras sacáridas modelo conocidas de la
biología?.
Finalmente, la secuencia modelo que se ha
encontrado que es la mejor de acuerdo con las etapas 1 a 10
indicadas anteriormente, se contrasta seguidamente con todos los
tripletes, composición de monosacáridos, conocimiento previo sobre
el peso molecular y composición estructural del sacárido, y las
predicciones sobre estructuras similares biológicamente existentes.
Mediante estas pruebas repetidas, se identifican las contradicciones
entre los datos disponibles y la secuencia modelo, y si resulta
posible, se adapta la secuencia modelo para representar mejor los
datos.
El objetivo del presente ejemplo es demostrar la
aplicación de la técnica GMID al análisis y comparación de muestras
de leche.
La superficie de soporte utilizada en los
experimentos descritos a continuación es una membrana de
nitrocelulosa. Las membranas se prepararon de la manera
siguiente:
- 1.
- Se cortaron membranas de nitrocelulosa y sus superficies superiores se rotularon formando una red de 9x6 cuadrados (de 3 mm^{2} cada cuadrado). A continuación se colocaron las membranas sobre papel absorbente y se marcó el cuadrado superior izquierdo de cada uno con un rotulador.
- 2.
- Se resuspendieron lectinas liofilizadas en agua hasta una concentración final de 1 mg/ml. Las lectinas resuspendidas (y una solución de control: albúmina de suero bovino al 5%) se mezclaron con vórtex y 1 \mul de cada solución se añadió a uno de los 28 cuadrados en la membrana de transferencia, indicado por el sombreado en la representación ilustrativa siguiente de una membrana de transferencia típica:
En la tabla 11 se indican las lectinas utilizadas
en el presente experimento.
| Lectina | Fabricante | Nº de cat. |
| WGA | Vector | MK2000 |
| SBA | Vector | MK2000 |
| PNA | Vector | MK2000 |
| DBA | Vector | MK2000 |
| UEA I | Vector | MK2000 |
| CON A | Vector | MK2000 |
| RCA I | Vector | MK2000 |
| BSL I | Vector | MK3000 |
| SJA | Vector | MK3000 |
| LCA | Vector | MK3000 |
| Lectina | Fabricante | Nº de cat. |
| Swga | Vector | MK3000 |
| PHA-L | Vector | MK3000 |
| PSA | Vector | MK3000 |
| AAA | - | - |
| PHA-E | Vector | MK3000 |
| PNA | Leuven | LE-408 |
| LCA | Sigma | L9267 |
| DSA | Sigma | L2766 |
| APA | - | - |
| WGA | Leuven | LE-429 |
| Jacalina | Leuven | LE-435 |
| BSA al 5% | Savyon | M121-033 |
- 3.
- Las membranas de transferencia preparadas se introdujeron en placas de Petri de 90 mm.
- 4.
- Las membranas de transferencia se bloquearon mediante la adición a cada placa de Petri de 10 ml de cualquier solución de bloqueo adecuada bien conocida por el experto en la materia (por ejemplo albúmina de suero bovino al 5%).
- 5.
- Las placas que contenían las membranas de transferencia en la solución de bloqueo se agitaron suavemente mediante rotación en una mesa giratoria (50 rpm) durante 2 horas a temperatura ambiente (o durante la noche a 4ºC sin rotación).
- 6.
- A continuación las membranas de transferencia se lavaron mediante la adición de 10 ml de solución de lavado a cada placa de Petri. Puede utilizarse cualquier solución tamponada (por ejemplo solución salina tamponada con fosfato) disponible comúnmente para llevar a cabo las etapas de lavado. Las placas se lavaron mediante rotación suave (50 rpm) durante 5 minutos. El procedimiento se llevó a cabo un total de tres veces, descartando la solución de lavado vieja y sustituyéndola con solución nueva en cada ocasión.
Las muestras de leche utilizadas fueron las
siguientes:
- 1.
- Leche bovina UHT de larga duración (3% de grasa) obtenida de las granjas lecheras Ramat haGolan, Israel (lote nº 522104);
- 2.
- Leche de cabra pasteurizada, obtenida de las granjas lecheras Mechek, Israel (lotes nº 1 y 2);
- 3.
- Leche de cabra no pasteurizada obtenida tal como en 2 (lotes nº 3 y 4).
Las muestras de leche se diluyeron hasta el 10%
v/v y se aplicaron aproximadamente 5 ml de cada muestra a membranas
de transferencia separadas.
Se prepararon membranas de transferencia por
duplicado para cada una de las muestras de leche anteriormente
indicadas. Además, se preparó un par adicional de membranas de
transferencia sin la adición de sacáridos (control negativo).
A continuación las membranas de transferencia se
incubaron a temperatura ambiente con agitación durante una
hora.
A partir del conocimiento previo de la
composición de monosacáridos de las leches sometidas a ensayo, y
mediante la aplicación de un programa informático basado en el
algoritmo descrito más adelante en el Ejemplo 7, se seleccionaron
las lectinas coloreadas siguientes: ConA y VVA.
Se preparó una mezcla de dichas dos lectinas en
solución de lavado, de manera que la concentración de cada lectina
coloreada fuese de 2 mg/ml.
Se incubaron 500 \mul de cada mezcla de
lectinas sobre las membranas de transferencia tal como se ha
descrito anteriormente. Cada membrana de transferencia se leyó
midiendo la fluorescencia de la fluoresceína a 520 nm y en el caso
de la lectina biotinilada, midiendo la señal del color azul TMB
producido por la reacción de la biotina con una solución de
HRP-estreptavidina.
Los resultados obtenidos para las lectinas
marcadas con FITC y con biotina se proporcionan en las Tablas 12 y
13, respectivamente. Los resultados presentados en estas tablas se
miden en una escala de 0 a 3, en la que 0 representa una señal que
se encuentra por debajo del nivel de ruido, y en la que los
resultados de 1 a 3 representan señales positivas (por encima del
nivel de ruido) tras la resta de los resultados obtenidos en el
control sin sacáridos.
Las tarjetas de identidad de glicomolécula (GMID)
obtenidas a partir de estos resultados para la leche de cabra
pasteurizada (lotes nº 1 y 2), leche de cabra no pasteurizada (lotes
nº 3 y 4) y leche bovina se muestran en la fig. 1 (A a E,
respectivamente). Las posiciones de las lectinas nº 1 a nº 24 se
muestran en una fila de izquierda a derecha en la parte superior de
cada tarjeta 1.
La muestra de leche bovina proporcionó un GMID
indicativo de que el polisacárido en la muestra contenía sacáridos
que proporcionaban resultados positivos para las lectinas
específicos para:
- a.
- glucosa/manosa (ConA, PSA y LCA);
- b.
- GlcNac (WGA y DSA).
Las muestras de leche de cabra pasteurizada
proporcionaron resultados positivos para:
- a.
- glucosa/manosa (ConA, PSA y LCA);
- b.
- GlcNac (DSA).
No se observaron diferencias en reactividad de
las lectinas en los lotes sometidos a ensayo.
La muestra de leche de cabra no pasteurizada
proporcionó una reacción positiva para:
- a.
- glucosa/manosa (ConA, PSA y LCA);
- b.
- GlcNac (DSA).
En resumen, la leche bovina difería de la leche
de cabra únicamente en que la primera reaccionaba con WGA. No se
observó esencialmente ninguna diferencia entre las muestras de leche
de cabra pasteurizada y no pasteurizada, con la excepción de que la
intensidad de señal era significativamente inferior en las muestras
de leche pasteurizada.
Se llevó a cabo un análisis de GMID sobre cinco
lipopolisacáridos bacterianos diferentes obtenidos de Sigma
Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA) (LPS nº 1, 7, 10, 15 y 16),
utilizando esencialmente el procedimiento tal como se describe en
el Ejemplo 5, anteriormente. Las lectinas coloreadas utilizadas
fueron ECL, WGA, VVA y SBA.
Las tarjetas GMID obtenidas para las muestras LPS
nº 1, 7, 10, 15 y 16 se muestran en la fig. 2 (A a E,
respectivamente). Puede observarse a partir de esta figura que las
tarjetas GMID proporcionan "huellas digitales" únicas para
cada uno de los diferentes lipopolisacáridos, y pueden utilizarse
para identificar la presencia de estos compuestos en muestras que
contienen bacterias o mezclas de sus productos.
Deben tenerse en cuenta varios factores al
seleccionar las lectinas coloreadas para la utilización en el
procedimiento de análisis de polisacáridos ilustrado en los Ejemplos
5 y 6. Entre estas consideraciones se encuentra la necesidad de que
cada una de las lectinas seleccionadas presente un color
distinguible, u otro marcador detectable, y la necesidad de reducir
las interacciones entre lectinas. En la fig. 3 se muestra un
gráfico de flujo que ilustra un algoritmo para la utilización en la
selección de marcadores coloreados. El algoritmo mostrado en la
fig. 3 se inicia con la selección de n lectinas coloreadas (u otros
marcadores detectables) 101, realizandose dicha selección inicial
de acuerdo con la información obtenida sobre la composición parcial
o total de monosacáridos del sacárido a analizar. En la etapa
siguiente 102, se examinan los colores de las lectinas
seleccionadas con el fin de comprobar la
identidad/no-identidad de los colores seleccionados.
Si se observan colores idénticos en el grupo seleccionado, el
procedimiento continúa hasta la etapa 103, en caso contrario el
flujo sigue con la etapa 104. En la etapa 103, una de las lectinas
que se ha encontrado que presenta un color no único se sustituye
por otra lectina que pertenece a la misma categoría de unión (es
decir, una que presente la misma especificidad de unión a
monosacárido); el flujo continúa hasta la etapa 102. En la etapa
104, las n lectinas seleccionadas se someten a ensayo con el fin de
detectar cualquier reactividad cruzada entre sí y con las lectinas
no coloreadas utilizadas en la primera etapa del procedimiento
descrito anteriormente en el Ejemplo 5. Si se encuentra reactividad
cruzada, el procedimiento continúa hasta la etapa 105, en caso
contrario el flujo continúa hasta la etapa 106, en la que el
algoritmo termina. En la etapa 105, una de las lectinas que se ha
determinado que presenta reacción cruzada con otra lectina es
sustituida por una lectina que no reaccione cruzadamente; a
continuación el flujo continúa hasta 104. El algoritmo termina con
la etapa 106.
Debe destacarse que, aunque para valores pequeños
de n, y para sacáridos con una composición de monosacáridos simple,
el operador mismo puede aplicar el algoritmo anteriormente descrito
de manera manual, siguiendo cada etapa del procedimiento de
selección. Alternativamente (y especialmente para casos en los que
n es un número grande o la composición de monosacáridos es más
compleja), los procedimientos algorítmicos descritos anteriormente
pueden llevarse a cabo mediante un programa informático diseñado
para ejecutar dichos procedimientos.
Los ejemplos anteriores han demostrado la
utilidad del procedimiento descrito en la presente memoria. Sin
embargo, se han añadido únicamente a título ilustrativo. Resulta
evidente para el experto que pueden llevarse a cabo muchas
variaciones en los agentes esencialmente específicos de secuencia
utilizados, en las condiciones de reacción de los mismos, en la
técnica de inmovilización, y en la secuencia de las etapas de
marcaje, reacción y detección, siempre sin apartarse del alcance de
la invención.
Claims (35)
1. Procedimiento para el análisis
estructural de un sacárido, que comprende:
- a)
- proporcionar sobre una superficie de un sustrato, una pluralidad de diferentes agentes de unión esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio con diferentes especificidades de unión, en los que algunos de entre la pluralidad de dichos agentes esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio se encuentran inmovilizados sobre la misma superficie de dicho sustrato;
- b)
- poner en contacto dicha superficie con un sacárido a analizar, o con una mezcla que comprende una pluralidad de fragmentos de dicho sacárido;
- c)
- lavar o eliminar de otro modo el sacárido o fragmentos de sacárido no unidos;
- d)
- añadir a la superficie obtenida en la etapa c) un marcador esencialmente específico de secuencia y/o de sitio, o una mezcla de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio;
- e)
- obtener una o más imágenes de los marcadores que se encuentran unidos a dicha superficie; y
- f)
- derivar a partir de dicha imagen información relacionada con la identidad del sacárido que se está analizando.
2. Procedimiento según la reivindicación
1, en el que los marcadores son agentes de unión cromogénicos, y en
el que las imágenes de los marcadores son colores que se desarrollan
en la superficie.
3. Procedimiento según la reivindicación
2, en el que los agentes de unión esencialmente específicos de
secuencia y/o de sitio son lectinas coloreadas, lectinas
fluorescentes, lectinas marcadas con biotina, anticuerpos
fluorescentes, anticuerpos marcados con biotina o anticuerpos
marcados enzimáticamente.
4. Procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que la etapa e) comprende fotografiar
y/o digitalizar la imagen.
5. Procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que la etapa f) comprende la
inspección visual de la superficie y la comparación con un
estándar, o en el que la etapa f) comprende la utilización de
filtros ópti-
cos.
cos.
6. Procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que los agentes de unión
esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio son lectinas o
anticuerpos.
7. Procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que el sacárido se marca en el
extremo reductor.
8. Procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, que comprende además el tratamiento del
sacárido con un agente esencialmente específico de secuencia y/o de
sitio capaz de cortar la cadena sacárida.
9. Procedimiento según la reivindicación
8, en el que el sacárido se trata:
- a)
- antes de ponerse en contacto con la superficie; o
- b)
- después de la eliminación del sacárido no unido, pero antes de la adición del marcador esencialmente específico de secuencia y/o de sitio.
10. Procedimiento según la reivindicación
8, en el que dicho agente esencialmente específico de secuencia y/o
de sitio capaz de cortar la cadena sacárida se añade después de la
etapa (e), y después se lleva a cabo una segunda etapa de detección
con el fin de identificar si dicho marcador o marcadores unidos se
han perdido.
11. Procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que las etapas (d) a (f) se repiten
con un marcador específico de secuencia y/o de sitio diferente.
12. Procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, que comprende además el tratamiento del
sacárido o fragmentos de sacárido con un agente esencialmente
específico de secuencia y/o de sitio capaz de detectar un punto de
ramificación de dicho sacárido o fragmentos de sacárido con el fin
de determinar si dicho punto de ramificación se encuentra
presente.
13. Procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que la superficie es un papel de
filtro, y en el que los agentes esencialmente específicos de
secuencia y/o de sitio se encuentran organizados en un orden
predefinido sobre dicho papel de filtro.
14. Procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que dichos agentes de unión no
presentan una especificidad de secuencia absoluta para una
secuencia sacárida particular.
15. Procedimiento según la reivindicación
14, en el que dichos agentes se unen a una o más secuencias
sacáridas relacionadas, y opcionalmente también se unen a una o más
secuencias sacáridas no relacionadas.
16. Procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que dichos agentes esencialmente
específicos de secuencia y/o de sitio se encuentran organizados en
un orden predefinido sobre dicha superficie, comprendiendo el
procedimiento además:
- g)
- construir una tarjeta de identidad de glicomolécula (GMID) que muestra los datos del análisis estructural de sacárido obtenidos en la etapa (f).
17. Procedimiento según la reivindicación
16, en el que los agentes esencialmente específicos de secuencia
y/o de sitio utilizados se encuentran representados por números de
código, preferentemente en los que los números de código son
números de código únicos.
18. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que los agentes esencialmente
específicos de secuencia y/o de sitio se organizan en un orden
predefinido sobre dicha superficie, comprendiendo el procedimiento
además:
- g)
- construir una tarjeta de identidad de glicomolécula (GMID), que comprende un patrón de unión de dicho agente inmovilizado a dicho sacárido o a dichos fragmentos de sacárido, y un patrón de unión de dichos marcadores a dicho sacárido o a dichos fragmentos de sacárido, en el que dicho patrón es una característica identificativa de dicho sacárido o de dichos fragmentos de sacárido.
19. Procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, que comprende analizar la estructura de
dicho sacárido mediante digestión secuencial utilizando una
glucosidasa o un equivalente de la misma, comprendiendo dicho
procedimiento:
- a)
- bloquear el extremo reductor de dicho sacárido;
- b)
- exponer un extremo reductor adicional mediante incubación de dicho sacárido con una glucosidasa o con un equivalente de la misma;
- c)
- marcar dicho extremo reductor adicional;
- d)
- opcionalmente repetir las etapas a) a c) utilizando diferentes glucosidasas o equivalentes de las mismas.
20. Procedimiento según la reivindicación
19, en el que los datos se recogen de acuerdo con el método según
la reivindicación 19, y dichos datos se utilizan en combinación con
el fin de obtener a partir de los mismos información estructural
sobre dicho sacárido.
21. Procedimiento para el análisis
estructural de un sacárido, que comprende:
- a)
- proporcionar sobre perlas una pluralidad de diferentes agentes de unión esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio con diferentes especificidades de unión, en los que algunos de entre una pluralidad de dichos agentes esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio se inmovilizan sobre dichas per- las;
- b)
- poner en contacto dichas perlas con un sacárido a analizar, o con una mezcla que comprende una pluralidad de dichos fragmentos de sacárido;
- c)
- lavar o eliminar de otro modo el sacárido o fragmentos de sacárido no unidos;
- d)
- añadir a las perlas obtenidas en la etapa c) un marcador esencialmente específico de secuencia y/o de sitio, o una mezcla de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio;
- e)
- obtener una o más imágenes de los marcadores que se encuentran unidos a dichas perlas; y
- f)
- derivar a partir de dicha imagen información relacionada con la identidad del sacárido que se está analizando.
22. Procedimiento según la reivindicación
21, caracterizado porque dichas perlas comprenden una
multitud de alícuotas de perlas, llevando cada alícuota un primer
agente esencialmente específico de secuencia y/o de sitio
diferente, y caracterizado además porque en la etapa (b), las
alícuotas de perlas se ponen en contacto separadamente con dicho
sacárido o con dichos fragmentos de sacárido.
23. Utilización del procedimiento según
cualquier reivindicación anterior en:
- a)
- el desarrollo de agentes terapéuticamente activos;
- b)
- el cribado de agentes terapéuticamente activos;
- c)
- el diagnóstico de enfermedades;
- d)
- el análisis de alimentos y/o de bebidas; o
- e)
- el análisis de cultivos agrícolas genéticamente modificados (GM) y/o de productos derivados de los mismos.
24. Soporte sólido que comprende en un
orden predefinido una pluralidad de marcadores detectables
visualmente o de otro modo, representativos de un sacárido o de una
secuencia o fragmento sacárido, en el que dicho soporte sólido se
obtiene a partir de:
- a)
- proporcionar sobre una superficie de un sustrato una pluralidad de diferentes agentes de unión esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio con diferentes especificidades de unión, en el que algunos de entre una pluralidad de dichos agentes esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio se encuentran inmovilizados sobre la misma superficie de dicho sustrato;
- b)
- poner en contacto dicha superficie con un sacárido a analizar, o con una mezcla que comprende una pluralidad de fragmentos de dicho sacárido;
- c)
- lavar o eliminar de otro modo el sacárido o fragmentos de sacárido no unidos; y
- d)
- añadir a la superficie obtenida en la etapa c) un marcador esencialmente específico de secuencia y/o de sitio, o una mezcla de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio.
25. Soporte sólido según la reivindicación
24, en el que dicho orden predefinido permite la detección de un
patrón de unión, determinado mediante una interacción de dichos
marcadores detectables con dicho sacárido, o secuencia o fragmento
sacárido.
26. Soporte sólido según la reivindicación
25, en el que dicho patrón de unión se determina mediante una
combinación de unión de dichos agentes de unión inmovilizados con
dicho sacárido o secuencia o fragmento sacárido, y unión de dichos
marcadores con dicho sacárido o secuencia o fragmento sacárido.
27. Procedimiento para seleccionar un
conjunto de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o
de sitio para la utilización en el procedimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 22, que comprende las etapas de:
- a)
- obtener la composición total o parcial de monosacáridos (CM) del sacárido a analizar;
- b)
- seleccionar un conjunto de n marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio que sean capaces de unirse a los monosacáridos presentes en dicho sacárido;
- c)
- revisar el conjunto de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio obtenidos en la etapa b) con el fin de garantizar que ningún par de marcadores en dicho conjunto presente el mismo color o característica detectable de otro modo;
- d)
- revisar el conjunto de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio seleccionados en la etapa c) con el fin de reducir la reactividad cruzada con los agentes de unión esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio o con otros marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de si- tio.
28. Procedimiento según la reivindicación
27, en el que la CM del sacárido a analizar se estima a partir de
la CM de un sacárido relacionado.
29. Procedimiento según la reivindicación
27, en el que la CM del sacárido a analizar se obtiene llevando a
cabo un análisis completo de CM de dicho sacárido.
30. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 27 a 29, en el que n se encuentra comprendido
entre 1 y 4.
31. Software para la selección de un
conjunto de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o
de sitio para la utilización en el procedimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 22, que comprende:
- a)
- la entrada de datos para proporcionar la composición de monosacáridos (CM);
- b)
- subprograma de apareamiento que aparea n marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio que son capaces de unirse a los monosacáridos presentes en dicho sacárido;
- c)
- subprograma de revisión que revisa el conjunto de marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio apareados por el subprograma b), siendo capaz dicho subprograma de seleccionar dichos marcadores a partir de la menor reactividad cruzada con los agentes esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio o con otros marcadores esencialmente específicos de secuencia y/o de sitio;
- d)
- segundo subprograma de revisión capaz de garantizar que ningún par de marcadores en dicho conjunto presenta el mismo color u otra característica detectable de otro modo.
32. Procedimiento para determinar por lo
menos parcialmente la secuencia de un sacárido, que comprende:
- a)
- determinar los patrones de unión de una pluralidad de diferentes agentes de unión inmovilizados con diferentes especificidades de unión con dicho sacárido o con dichos fragmentos de sacárido y de unión de una pluralidad de marcadores con dicho sacárido o con dichos fragmentos de sacárido, en el que dichos patrones se determinan de acuerdo con el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22; y
- b)
- obtener información por lo menos parcial de secuencia mediante la combinación de dichos patrones de unión.
33. Procedimiento según la reivindicación
32, que además comprende:
- c)
- obtener una huella digital de dicho sacárido o fragmentos de sacárido.
34. Sistema automatizado para determinar
por lo menos parcialmente la secuencia de un sacárido, que
comprende el procesamiento automatizado de datos para:
- a)
- determinar los patrones de unión de una pluralidad de agentes de unión inmovilizados con dicho sacárido o con dichos fragmentos de sacárido y de unión de una pluralidad de marcadores con dicho sacárido o con dichos fragmentos de sacárido, en el que dichos patrones se determinan de acuerdo con el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22;
- b)
- obtener información por lo menos parcial de secuencia mediante la combinación de dichos patrones de unión.
35. Sistema automatizado según la
reivindicación 34, que comprende además el procesamiento
automatizado de datos para:
- c)
- obtener una huella digital de dicho sacárido o fragmentos de sacárido.
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