DE3347617C2 - Verfahren zur Verhinderung der Verminderung der Aktivität eines Enzyms - Google Patents
Verfahren zur Verhinderung der Verminderung der Aktivität eines EnzymsInfo
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Abstract
Beschrieben wird ein Verfahren zur Verhinderung der Verminderung der Aktivität eines Enzyms durch ein Substrat in einer Enzymreaktion in wäßriger Phase, das darin besteht, ein mit Wasser nicht-mischbares, jedoch mit dem Substrat mischbares organisches Lösungsmittel dem Reaktionssystem zuzusetzen und hierdurch die Konzentration des Substrats in der wäßrigen Phase unter die Konzentration zu verringern, bei der die Aktivität des Enzyms wesentlich inhibiert wird.
Description
Die Erfindung betrifft das mit dem Patentanspruch definierte Verfahren.
Bei einer Reaktion unter Verwendung eines Enzyms ist Wasser das beste Reaktionsmedium für das Enzym,
und daher wird eine derartige Reaktion gewöhnlich in einer wäßrigen Phase durchgeführt Einige Substrate
weisen jedoch eine geringe Löslichkeit in Wasser auf. Im Falle der Verwendung eines derartigen Substrats
werden verschiedene Maßnahmen getroffen, um eine Substratmenge sicherzustellen, die für die Reaktion in
einer wäßrigen Phase, die das Enzym enthält, erforderlich ist (manchmal als Enzym enthaltende Flüssigkeit
bezeichnet), und die Reaktion wird glatt durchgeführt. Beispielsweise ist es bekannt, die Reaktion unter Verwendung
eines organischen Lösungsmittels durchzuführen. Die JP-Patentveröffentlichung 34 153/1972 beschreibt,
daß Toluol, Butanol, Ethanol oder Aceton als Reaktionspromotor bei einem Verfahren zur Herstellung
von L-Tryptophan aus Indol und Serin unter Anwendung eines Bakteriums vom Genus Aerobaterium
verwendet wird. Die GB-Patentveröffentlichung 13 134 beschreibt, daß bei der Oxidation von Decan ein wasserunlösliches
Substrat in Anwesenheit eines Decan-oxidierenden Enzyms, mit Wasser mischbarem Dimethylformamid
und dem Substrat verwendet wird.
Bei diesen Verfahren werden die organischen Lösungsmittel verwendet, um die Auflösung der Substrate
in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit zu unterstützen und die Reaktionen zu fördern.
Bei Reaktionen unter Verwendung von Enzymen sollte die Wirkung der Konzentration eines Substrats auf
ein Enzym in Betracht gezogen werden. Wenn bei einer Enzymreaktion die Konzentration eines Substrats in der
Reaktionsphase groß ist, so kann die Aktivität des Enzyms beträchtlich unter Verzögerung der Reaktion verringert
werden. Es ist beispielsweise bekannt, daß bei der Erzeugung von Tryptophan in Anwesenheit eines
Enzyms, unter Verwendung von Anthranilsäure als Vorläufer die Konzentration der Anthranilsäure in der wäßrigen
Phase die Verminderung der Aktivität des bei der Reaktion verwendeten Enzyms beeinflußt (US-PS
43 63 875); daß bei der Produktion von L-DOPA aus L-Serin und Brenzkatechin unter Verwendung von Erwinia
herbicola die Anwesenheit von Brenzkatechin als ein Substrat in hoher Konzentration in der wäßrigen
Phase die Enzymaktivität verringert (Agric. Biol. Chem,
Band 37, 493-499; 725-735, 1973); und daß bei der Erzeugung von Tryptophan aus Indol und Serin, Indol
als eines der Substrate die Aktivität der Tryptophansythetase verringert (U. Behrendt, The First European
Congress on Biotechnology, 2/186-2/189,1978).
Dementsprechend sollte, falls in einer Reaktion unter Verwendung eines Enzyms ein Substrat die Aktivität
ίο des Enzyms verringern kann, die Reaktion unter Halten
der Konzentration des Substrats in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit unter der Konzentration durchgeführt
werden, bei der die Aktivität des Enzyms vermindert wird (die inhibitorische Konzentration), um die Reaktion
glatt verlaufen zu lassen, selbst wenn das Substrat in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit vollständig
löslich ist Um Reaktionen dieses Typs industriell durchführen zu können, muß ein kontinuierlicher Analysator
zur kontinuierlichen Analyse der Substratkonzentration während der Reaktion entwickelt werden, um die Konzentration
des Substrats in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit unter der inhibitorischen Konzentration zu
halten. Darüber hinaus ist zur Beschickung des Substrats in kontinuierlicher Weise ein Materialbeschikkungssystem
erforderlich, das direkt mit dem kontinuierlichen Analysator verbunden ist. Auf diese Weise
werden die Vorrichtung und der Reaktionsbetrieb unvermeidlich kompliziert Wenn bei Reaktionen dieser
Art ein großer Enyzmüberschuß verwendet wird und die Geschwindigkeit des Substratverbrauchs der Reaktion
größer ist als die Mischgeschwindigkeit des Substrats mit Wasser, so kann die Reaktion selbstverständlich
bei einer wesentlich geringeren Substratkonzentration als die inhibitorische Konzentration durchgeführt
werden. Da jedoch die Menge des bei der Reaktion verwendeten Enzyms in der Praxis sehr groß ist, weist
eine derartige Verfahrensweise keine industrielle Bedeutung auf.
Aus Indol durch eine Enzymreaktion oder Fermentationsreaktion erhaltenes Trytophan sollte günstig frei von dem nicht-umgesetzten Indol sein, wenn es in Arzneimitteln oder Nahrungsmittelzusätzen verwendet wird, da das nicht-umgesetzte Indol einen ihm zu eigenen unangenehmen Geruch abgibt.
Aus Indol durch eine Enzymreaktion oder Fermentationsreaktion erhaltenes Trytophan sollte günstig frei von dem nicht-umgesetzten Indol sein, wenn es in Arzneimitteln oder Nahrungsmittelzusätzen verwendet wird, da das nicht-umgesetzte Indol einen ihm zu eigenen unangenehmen Geruch abgibt.
Bisher war die Dampfdestillation als Methode zur Entfernung des nicht-umgesetzten Indols aus der Reaktionslösung
bei der Herstellung von L-Tryptophan aus Indol durch Enzymreaktion bekannt (JP-Patentveröffentlichung
800/1982). Da jedoch der Dampfdruck von Indol geringer als der von Wasser ist, ist eine große
Dampfmenge zur Entfernung von Indol durch Destillation erforderlich. Dies trägt zu den Energiekosten bei,
und eine derartige Verfahrensweise ist gewerblich nicht durchführbar. Es besteht daher ein starkes Bedürfnis zur
Lösung diese Problems.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Verhinderung der Verminderung
der Aktivität eines Enzyms durch ein Substrat in einer Enzymreaktion.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird dieses Ziel erreicht.
Im folgenden sind Beispiele für Ausführungsformen der vorstehenden Verfahrensweise gemäß der Erfindung
aufgeführt:
A) Ein Verfahren, das darin besteht, eine Enzymreaktion durchzuführen, unter Verwendung von Indol
als ein Substrat in einer wäßrigen Phase, in Anwe-
senheii eines organischen Lösungsmittels, das mit Wasser nicht mischbar, jedoch mit Indol mischbar
ist. Gewinnen des organischen Lösungsmittels aus dem Reaktionsgemisch und Entfernen des Enzyms,
Extrahieren des nicht-umgesetzten Indols aus der resultierenden wäßrigen L-Tryptophanlösung, wobei
das organische Lösungsmittel wiedergewonnen wird und erneute Verwendung des Extrakts in der
Reaktion; und
B) eine Methode, die darin besteht, eine Enyzmreaktion
unter Verwendung von Indol als ein Substrat in einer wäßrigen Lösung in Anwesenheit eines organischen
Lösungsmittels durchzuführen, das mit Wasser nichtmischbar, jedoch mit Indol mischbar
ist und das nicht-umgesetzte Indol als eine organisehe
Lösungsmittelschicht aus dem Reaktionsgemisch
abzutrennen.
Das Grundprinzip der Erfindung liegt darin, daß die Konzentration eines Substrats in einer wäßrigen Phase
unter einer bestimmten festgesetzten Konzentration entsprechend dem Verteilungsverhältnis des Substrats
zwischen einer organischen Lösungsmittelphase, in der das Substrat gelöst ist, und der wäßrigen Phase, gehalten
wird.
Im allgemeinen muß bei einer Reaktion, bei der die Aktivität eines Enzyms durch ein Substrat verringert
wird, die Konzentration des Substrats in einer wäßrigen Phase immer niedrig gehalten werden, und für diesen
Zweck wird eine Methode angewendet, bei der bis zu einem gewissen Ausmaß das Substrat nach und nach
entweder kontinuierlich oder intermittierend zu dem das Enzym enthaltenden Reaktionssystem gefügt wird.
Diese Methode erfordert jedoch eine komplizierte Verfahrensweise und Vorrichtung zur Steuerung der Reaktion
derart, daß, wenn das Substrat zu dem Reaktionsmedium gefügt wird, dessen Konzentration in der Enzym
enthaltenden Flüssigkeit niedrig gehalten wird.
Im Gegensatz hierzu wird gemäß der erfir»dungsgemäßen
Verfahrensweise ein mit einem Substrat mischbare, jedoch mit Wasser nicht mischbares organisches
Lösungsmittel zu der Enzym enthaltenden Flüssigkeit zur fast vollständigen Auflösung des Substrats in der
organischen Lösungsmittelphase gefügt. Als Ergebnis kann die Konzentration des Substrats in der wäßrigen
Phase im wesentlichen unter der inhibitorischen Konzentration entsprechend dem Verteilungsverhältnis des
Substrats zwischen der organischen Lösungsmittelphase und der wäßrigen Phase gehalten werden. Hierbei ist
es unbeachtlich, ob das Reaktionsprodukt in der organisehen Lösungsmittelphase oder der Enzym enthaltenden
Phase aufgelöst oder ausgefällt ist.
Nach der erfindungsgemäßen Verfahrensweise wird das Substrat in der Enzym enthaltenden flüssigen Phase
kontinuierlich aus der organischen Lösungsmittelphase je nach dem Verteilungsverhältnis des Substrats zwischen
den beiden Phasen im Verlauf der Reaktion und mit dem Verbrauch des Substrats zugeführt. Das organische
Lösungsmittel zur Auflösung des Substrats kann auf einmal oder intermittierend oder kontinuierlich zugesetzt
werden, solange die Konzentration des Substrats in der wäßrigen Phase niedriger gehalten werden
kann als die inhibitorische Konzentration. Falls erforderlich, kann die Geschwindigkeit der Bewegung des
Substrats durch Verändern der Kontaktfläche zwischen der organischen Phase und der wäßrige Phase durch
einen Arbeitsgang, wie Rühren, verändert werden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren können die Enzyme allein oder als ein Gemisch von zwei verwendet
werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme müssen nicht immer rein sein, sondern es können auch rohe sein.
Beispielsweise können die Enzyme lebende Zellen sein, die aus einer Kulturbrühe eines Enzym erzeugenden
Mikroorganismus durch Zentrifugieren usw. gesammelt wurden, Zellen, die durch Frieren oder Trocknen der
lebenden Zellen erhalten wurden; behandeltes Produkte dieser Zellen, erhalten durch Behandlungen, wie Vermählen,
Selbst-Digestion und Ultraschallbehandlung, Extrakte dieser Zellen und aus den Extrakten erhaltene
Enzyme.
Das bei der erfindungsgemäßen ''erfahrensweise verwendete
organische Lösungsmittel st mit den Substraten mischbar, jedoch mit Wasser nicht mischbar. In der
Praxis ist es notwendig, je nach den verwendeten Enymen,
solche organische Lösungsmittel auszuwählen, die die Aktivitäten der Enzyme unter den Reaktionsbedingungen
nicht verringern.
Ein organisches Lösungsmittel, das für ein bestimmtes Substrat und ein Enzym anpaßbar ist, wird ausgewählt,
und seine Menge wird wie nachstehend gezeigt bestimmt. Speziell werden ein Enzym und ein umzusetzendes
Substrat verwendet, und die inhibitorische Konzentration des Substrats in einer Enzym enthaltenden Flüssigkeit
unter den Reaktionsbedingungen wird gemessen. Anschließend wird das Verteilungsverhältnis des
Substrats zwischen der Enzym enthaltenden Flüssigkeit und dem organischen Lösungsmittel bestimmt und die
Konzentration des Subtrats in dem organischen Lösungsmittel, die niedriger als die vorstehend gemessene
inhibitorische Konzentration, wird vorgeschrieben. Wenn die Konzentration des Substrats in dem bei der
Reaktion zu verwendenden organischen Lösungsmittel wie vorstehend bestimmt ist, kann die Menge der Enzym
enthaltenden Flüssigkeit und die Menge des verwendeten organischen Lösungsmittels aus der verwendeten
Substratmenge je nach der Konzentration des gewünschten, in dem Reaktionsgemisch akkumulierten
Reaktionsprcdukts bestimmt werden.
Daher kann, solange die Konzentration des Substrats in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit niedriger gehalten
werden kann, als die inhibierende Konzentration, das organische Lösungsmittel frei gewählt werden, und
seine Menge kann frei bestimmt werden.
Die erfindungsgemäße Verfahrensweise dient zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von
Indol und L- oder DL-Serin als Substrate. Da bei der Herstellung von L-Tryptophan aus Indol und L-Serin
unter Verwendung von Tryptophansynthetase Indol die Aktivität von Tryptophansynthetase verringert, muß die
Reaktion durchgeführt werden unter Niedrighalten der Indolkonzentration in Wasser. Aus diesem Zwecke wurden
nichtionische oberflächenaktive Mittel oder Adsorbensharze verwendet (Behrendt, The First European
Congress in Biotechnology, 2/186—189, 1978). Die Reaktion in Anwesenheit eines nichtionischen oberflächenaktiven
Mittels unterscheidet sich jedoch im Mechanismus von der Reaktion entsprechend der erfindungsgemäßen
Verfahrensweise, die im wesentlichen zwischen zwei Phasen durchgeführt wird, da Indol in der
Form einer Micelle in der wäßrigen Phase durch den Einfluß des oberflächenaktiven Mittels vorliegt. Darüber
hinaus ist diese Verfahrensweise gewerblich nicht durchführbar, da es schwierig ist, das oberflächenaktive
Mittel von dem Reaktionsprodukt nach der Reaktion abzutrennen. Die Verfahrensweise unter Einbeziehung
der Anwendung eines Adsorbensharzes ist industriell nachteilhaft, da bei einigen Adsorbensharzen daran adsorbiertes
IndoJ nicht vollständig abzutrennen ist oder das Reaktionsprodukt an diesen Hirzen adsorbiert werden
kann.
Wenn im Gegensatz dazu eine Lösung von Indol in
einem organischen Lösungsmittel zu einer wäßrigen Lösung gefügt wird, die Serin und das Enzym enthält,
und die Reaktion in zwei Phasen durchgeführt wird, so kann die Konzentration des in der wäßrigen Phase gelösten
Indols niedrig gehalten werden und Indol wird automatisch aus der organischen Lösungsmittelphase im
Verlauf des Verbrauchs während der Reaktion zugeführt Daher verläuft die Reaktion glatt
durch das Verteilungsverhältnis νυη Indol zwischen einer
Enzym enthaltenden flüssigen Phase und einer organischen Phase unter den Reaktionsbedingungen und der
verwendeten Indolmenge. Gewöhnlich wird sie derart bestimmt, daß die Indolkonzentration in der Enzym enthaltenden
Flüssigkeit niedriger als 800 ppm, industriell bevorzugt niedriger als 750 ppm, beträgt
L-Tryptophan, bei dem es sich um das Reaktionsprodukt handelt, fällt in Form von Kristallen in der Enzym
enthaltenden Flüssigkeit aus. Unter den angewendeten Reaktionsbedingungen beeinflussen diese Kristalle
überhaupt nicht das Fortschreiten der Reaktion.
Bei dem vorstehenden Verfahren kann DL-Serin als
Substrat verwendet werden. In diesem Falle kann durch
In einei Flüssigkeit die einen Mutantenstamm von 15 Verwendung kultivierten Zellen von Pseudomonas puti-Escherichia
coli enthält ist die inhibitorische Konzen- da IFO 12 996 oder Pseudomonas punctata FERM
tration des Indols etwa 800 ppm. Beispiele für organi- ' ~
sehe Lösungsmittel, Indol in niedrigerer Konzentration
als die inhibitorische Konzentration in die wäßrige Phase freisetzen, sind Toluol, Chlorbenzol, Ethylcitrat Methylisobutylketon
und Anisol. Wird beispielsweise eine 20 Gew.-% ToluollöEung von Indol verwendet, so löst
sich Indol in einer Konzentration von weniger als 720 ppm in einer einen Mutantenstamm von Escherichia
coli enthaltenden Flüssigkeit, und die Reaktion kann durchgeführt werden, während die Konzentration an
Indol niedriger gehalten wird als die vorstehende inhibitorische Konzentration. Die Konzentration an Indol in
einer Enzym enthaltenden Flüssigkeit unter den Reaktionsbedingungen kann niedriger als 800 ppm gehalten
BP-21 als Serinracemase, L-Tryptophan in hohen Ausbeuten erhalten werden, ohne die Aktivität des Enzyms
durch das organische Lösungsmittel zu verhindern.
Es ist von großer gewerblicher Bedeutung, daß L-Tryptophan ohne jegliches Problem aus chemisch hergestellten
DL-Scrin und Indol in Anwesenheit von zwei Enzymtypen hergestellt werden kann, unter Verwendung
von leicht verfügbaren organischen Lösungsmitteln.
Das durch die vorstehende Verfahrensweise erhaltene Reaktionsgemisch enthält das resultierende L-Tryptophan,
das nicht umgesetzte Ausgangsmaterial, das organische Lösungsmittel, das Enzym, usw. Vorzugsweise
wird dieses Reatkionsgemisch mittels der Methode ent-
20
25
werden, wenn die Konzentration von Indol in anderen sprechend den nachstehend beschriebenen Ausfüh-
Lösungsmitteln 40 Gew.-% für Ethylcitrat, 50 Gew.-% rungsformen A) oder B) behandelt,
für Methylisobutylketon, 30 Gew.-°/o für Anisol und Gemäß der Ausführungsform A) wird folgendes Ge-
20 Gew.-°/o für Monochlorbenzol, ist. winnungsverfahren durchgeführt. Zuerst wird das orga-
Gemäß einer typischen Ausführungsform der erfin- 35 nische Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch ge-
dungsgemäßen Verfahrensweise kann L-Tryptophan wonnen und das Enzym wird entfernt. Wenn das Reak-
hergestelit werden durch Kultur eines Mutantenstam- tionsgemisch kräftig gerührt wird, während das Enzym
mes von Escherichia coli durch Unterwerfen eines KuI- und das organische Lösungsmittel miteinander darin
turmediums, das einen Tryptophanase-Mangel-Mutan- vorhanden sind, so wird die Grenzfläche zwischen der
tenstamm von L-Tryptophan erfordernden Escherichia 40 wäßrigen Phase und der organischen Lösungsmittelpha-
coli, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und se undeutlich, und es wird manchmal schwierig, das or-
anorganische Salze enthält, anaeroben Bedingungen bei ganische Lösungsmittel abzutrennen, in dem das extra-
einer Temperatur von 28 bis 400C und einem pH Wert hierte nicht umgesetzte Indol gelöst ist. Um dieses Phä-
von 6 bis 8, Suspendieren der Mikrobenzellen entweder nomen zu vermeiden, ist es üblich, das organische Lö-
wie in der Kulturbrühe oder nach dem Abtrennen aus 45 sungsmittel aus dem Reaktionsgemisch an erster Stelle
dem Kulturmedium, in einer Pyridoxylphospaht, L-Serin zu gewinnen. Dies kann beispielsweise durch übliches
und anorganisches Material enthaltenden Lösung, anschließenden Zusatz einer Lösung von Indol in einem
mit Indol mischbaren, jedoch mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels auf einmal oder kontinuierlich,
bei einem pH-Wert von 7,5 bis 9,5, vorzugsweise 8 bis 9, und Durchführen der Reatkion bei einer
Temperatur von 20 bis 400C.
Beispiele für das organische Lösungsmittel, das zu Destillieren erzielt werden. Anschließend wird das in dem Reaktionsgemisch, aus dem das organische Lösungsmittel gewonnen wurde, enthaltene Enzym entfernt.
Beispiele für das organische Lösungsmittel, das zu Destillieren erzielt werden. Anschließend wird das in dem Reaktionsgemisch, aus dem das organische Lösungsmittel gewonnen wurde, enthaltene Enzym entfernt.
Es besteht keine spezielle Begrenzung hinsichtlich der Verfahrensweise zur Entfernung des bei der Reaktion
verwendeten Enzyms aus dem Reaktionsgemisch. Eine industriell wirksame Verfahrensweise besteht dar-
diesem Zeitpunkt verwendet werden kann, umfassen 55 in, eine Mineralsäure zu dem Reaktionsgemisch zu füaromatische
Kohlenwasserstoffe und ihre Derivate, wie gen, aus dem das organische Lösungsmittel entfernt
Benzol, Toluol, Chlorbenzol, Nitrobenzol und Aceto
phenon; aliphatische Ester mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen, wie n-Butylacetat, Isoamylacetat, Ethylbutyrat
und Isobutylacetat; aliphatische Ketone mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen, wie Methylisobutylketon,
Diisobutylketon, Diisopropylketon, Methyl-n-amylketon
und Di-n-propylketon; Zitronensäureester, wie Acetyltriethylcitrat,
Acetyltributylcitrat, Triethylcitrat und Tributylcitrat; Weinsäureester; Apfelsäureester; und
Ether, wie Anisol.
Die Menge des verwendeten organischen Lösungsmittels variiert je nach seiner Art, da sie bestimmt wird
wurde, dadurch den pH-Wert des Reaktionsgemischs auf 2 bis 5 einzustellen, es je nach Erfordernis zur Förderung
der Ausflockung des Enzyms zu erhitzen und das ausgeflockte Enzym durch Maßnahmen, wie Filtrieren,
zu entfernen. Wenn erforderlich, kann das Reaktionsgemisch, aus dem das Enzym entfernt wurde, konzentriert
werden. Um das nicht-umgesetzte Indol wirksam aus dem Reaktionsgemisch zu extrahieren und abzutrennen,
ist es bevorzugt, L-Tryptophan im gelösten Zustand ohne seine Ausfällung als Kristalle zu halten. Wenn L-Tryptophan
aus wäßriger Lösung kristallisiert wird, so bezieht es nicht-umgesetztes Indol ein, das eine ähnliche
Molekülstruktur aufweist, und bewirkt seine gleichzeitige
Kristallisation. Aus diesem Grunde sollte je nach der Behandlungstemperatur die Konzentration des durch
das organische Lösungsmittel zu extrahierenden Reaktionsgemisches derart eingestellt werden, daß sich L-Tryptophan
im gelösten Zustand befindet.
Das nicht-umgesetzte Indol wird durch ein organisches
Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch extrahiert, aus dem das Enzym entfernt wurde. Das organische
Lösungsmittel kann in geeigneter Weise aus solchen gewählt werden, die in der Reaktion verwendet
werden. Gewöhnlich wird das gleiche organische Lösungsmittel verwendet, das bei der Reaktion eingesetzt
wird. Daher kann das wiedergewonnene organische Lösungsmittel für diesen Zweck verwendet werden, jedoch
muß das Lösungsmittel nicht das gleiche sein, wie das bei der Reaktion verwendete, und Lösungsmittel,
die für die Tryptophan erzeugende Reaktion und für die Extraktion des nicht-umgesetzten Indols geeignet sind,
können gewählt werden.
Die vorstehende Wiedergewinnungsverfahrensweise ist besonders geeignet bei der Herstellung von L-Tryptophan
durch eine Enzymreaktion unter Verwendung von Indol als ein Substrat, da das wiedergewonnene
Indol erneut verwendet werden kann. Im allgemeinen wird bei der Herstellung von L-Tryptophan durch eine
Enzymreaktion das Enzym usw., das bei der Reaktion verwendet wird, aus dem Reaktionsgemisch durch eine
allgemeine Verfahrensweise entfernt, und anschließend wird L-Tryptophan isoliert. Die Verwendung der wiedergewonnenen
Lösung, die das nicht-umgesetzte Material als solches enthält, inhibiert häufig die Aktivität
des Enzyms, und dies führt bei der industriellen Praxis zu einem ernstlichen Problem.
Wird jedoch das nicht-umgesetzte Indol aus dem Reaktionsgemisch mit dem organischen Lösungsmittel
entsprechend der vorstehenden Wiedergewinnungsmethode extrahiert, so kann der Gehalt an Indol in L-Tryptophankristallen
verringert werden, und das Indol, das mit dem organischen Lösungsmittel in Form der Lösungsmittellösung
extrahiert wird, kann erneut bei der nächsten Reaktion verwendet werden, ohne das extrahierende
Indol aus der Lösung zu isolieren (wenn es verwendet wird, erfolgt die Reaktion ohne inhibieren
des Enzymaktivität).
Die Menge des bei der Extraktion des nicht-umgesetzten Indols verwendeten organischen Lösungsmittels
variiert in Abhängigkeit von dem Verteilungsverhältnis von Indoi zwischen der organischen Lösungsmittelphase
und der wäßrigen Phase, sowie auch von der Reaktionsumwandlung des Indols. Da jedoch Enzyme mit
feststehenden spezifischen Aktivitäten handelsüblich sind und die Reaktionsumwandlung konstant ist, kann
die Menge des bei der Extraktion verwendeten organischen Lösungsmittels leicht bestimmt werdea
Es besteht keine spezielle Einschränkung bei der Durchführung der Extraktion des nicht-umgesetzten Indols
und sie kann nach üblicher Verfahrensweise durchgeführt werden. Im allgemeinen wird eine geeignete
Menge eines organischen Lösungsmittels zu dem Reaktionsgemisch, aus dem das Enzym entfernt wurde, gefügt,
und das Gemisch wird gerührt, um die wäßrige Phase voll mit der organischen Phase in Kontakt zu
bringen. Wie vorstehend erwähnt, ist es bevorzugt, das
Reaktionsgemisch in einem derartigen Zustand zu halten, daß keine L-Tryptophankristalle ausgefällt werden.
Industriell ist es wirksam, die Estraktion unter Erwärmungsbedingungen
durchzuführen, um die Löslichkeit des L-Tryptophans in Wasser zu vergrößern. Nach einem
gleichmäßigen Kontakt der beiden Phasen, wie vorstehend beschrieben, wird das Gemisch stehengelassen,
um es in eine wäßrige Phase und ein organische Lösungsmittelphase zu trennen. Der Extraktionsvorgang
kann ansatzweise durchgeführt werden, jedoch wird er industriell kontinuierlich nach einer Gegenstrom-
Extraktionsmethode durchgeführt.
Das das extrahierte nicht-umgesetzte Indol enthaltende organische Lösungsmittel wird in der nächsten Reaktion wiederverwendet, nachdem erforderlichenfalls frisches Lösungsmittel zugesetzt wurde oder mit einem anderen Lösungsmittel vermischt wurde oder frisches Indol zugesetzt wurde.
Das das extrahierte nicht-umgesetzte Indol enthaltende organische Lösungsmittel wird in der nächsten Reaktion wiederverwendet, nachdem erforderlichenfalls frisches Lösungsmittel zugesetzt wurde oder mit einem anderen Lösungsmittel vermischt wurde oder frisches Indol zugesetzt wurde.
Diese Verfahrensweise ist von großer industrieller Bedeutung, da das nichtumgesetzte Indol wirksam wiedergewonnen
werden kann, selbst wenn die Umwandlung von Indol durch Schwankungen der spezifischen
Aktivität des Enzyms die häufig bei Enzymreaktionen auftreten, variiert wird. Selbst wenn darüber hinaus das
Indol extrahiert wird und als solches wiedergewonnen wird, kann die Reaktion ohne Inhibierung der Enzymaktivität
durchgeführt werden.
Wenn die vorstehende Wiedergewinnungsmethode angewendet wird, kann das nicht-umgesetzte Indol wirksam extrahiert und auch aus einer L-Tryptophan enthaltenden Reaktionsmischung, die nach üblicher Verfahrensweise erhalten wurde, wiedergewonnen werden.
Wenn die vorstehende Wiedergewinnungsmethode angewendet wird, kann das nicht-umgesetzte Indol wirksam extrahiert und auch aus einer L-Tryptophan enthaltenden Reaktionsmischung, die nach üblicher Verfahrensweise erhalten wurde, wiedergewonnen werden.
Nach der Ausführungsform B) wird das Reaktionsgemisch, das das resultierende L-Tryptophan, das nichtumgesetzte
Material, das organische Lösungsmittel und das Enzym enthält, in eine organische Lösungsmittelphase
und eine wäßrige Phase getrennt. Die organische Lösungsmittelphase, die das nicht-umgesetzte Material
enthält, wird gewonnen. Anschließend wird das Enzym aus der wäßrigen Phase entfernt, d. h. dem Reaktionsgemisch,
das das L-Tryptophan enthält, um das L-Tryptophan zu gewinnen. Wenn das Enzym und das organische
Lösungsmittel zusammen in dem Reaktionsgemisch enthalten sind, so wird die Grenzfläche der wäßrigen Phase
und der organischen Lösungsmittelphase manchmal undeutlich und ihre Trennung kann schwierig werden. In
einem derartigen Faiie kann die Trennung nach einer üblichen Verfahrensweise durchgeführt werden, beispielsweise
durch Behandeln des Reaktionsgemische in einem Zentrifugenabscheider. Falls die Extraktion und
das Abtrennen unter Verwendung des verwendeten organischen Lösungsmittels wiederholt werden, wird die
Wirkung der Entfernung des Indols verstärkt
Bei dem Trennvorgang kann L-Tryptophan in der wäßrigen Lösung in Form von Kristallen ausfallen, jedoch
ist die Wirkung der Extraktion des nicht-umgesetzten Indols besser, wenn es in dem gelösten Zustand
vorhanden ist
Es ist günstig, wenn die Temperatur zum Trennungszeitpunkt unter dem Siedepunkt des organischen Lösungsmittels
liegt und wenn Wasser und organisches Lösungsmittel ein Azeotrop unter seinem Siedepunkt
bilden. Die abgetrennte und wiedergewonnene Indollösung kann direkt bei der nächsten Reaktion ohne Probleme
verwendet werden.
Es besteht keine spezielle Beschränkung hinsichtlich der Verfahrensweise zur Entfernung des Enzyms aus
dem Reaktionsgemisch nach dem Abtrennen der das nicht-umgesetzte Indol enthaltenden organischen Lösungsmittelphase.
Eine industriell wirksame Entfernungsverfahrensweise besteht im Zusatz einer Mineral-
ίο
säure bzw. anorganischen Säure zu dem Reaktionsgemisch, das nach der Entfernung der organischen Lösungsmittelphase
verbleibt, um den pH-Wert des Gemischs auf 2 bis 5 einzustellen, Erwärmen je nach Erfordernis,
um das Enzym auszuflocken, und Entfernen der ausgeflockten Masse durch Maßnahmen, wie Filtrieren.
L-Tryptophan kann durch Konzentrieren des Reaktionsgernischs, aus dem das Enzym so entfernt wurde,
erhalten werden.
zentration an Indol in der den Mikroorganismus enthaltenden
Flüssigkeit niedrigzuhalten. Speziell wenn die Reaktion in Wasser ohne Zusatz eines organischen Lösungsmittels
durchgeführt wurde, so wurde die Konzentration an Indol in der wäßrigen Phase zu 3000 ppm, und
die Ausbeute an L-Tryptophan betrug, basierend auf Indol, 47 MoI-0Zb. Wurde im Gegensatz Butylcitrat als
organisches Lösungsmittel zugesetzt, und die Konzentration an Indol bei 790 ppm in der wäßrigen Phase
Nach der vorstehenden Verfahrensweise bewegt sich io gehalten, so stieg dei Ausbeute an L-Tryptophan be-
das nicht-umgesetzte Indol in dem Reaktionsgemisch wirksam zu dem organischen Lösungsmittel. Das organische
Lösungsmittel, das das nicht-umgesetzte Indol enthält, kann in der nächsten Reaktionsstufe verwendet
werden, nachdem, je nach Erfordernis, frisches Lösungsmittel zugeführt oder frisches Indol zugesetzt wurde.
Diese Wiedergewinnungsverfahrensweise ist auch besonders brauchbar bei der Herstellung von L-Tryptophan
durch eine Enzymreaktion unter Verwendung von Indol als ein Substrat, aus dem gleichen Grunde wie bei
der Ausführungsform A).
Die erfindungsgemäße Verfahrensweise ist von großer industrieller Bedeutung, da L-Tryptophan mit hoher
Reinheit, das frei von Indol ist, erhalten werden kann, und das Ausgangsindol wiedergewonnen und erneut
verwendet werden kann.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.
trächtlich auf 95 Mol-%, basierend auf Indol, an. Wenn
die Konzentration an Indol in der wäßrigen Phase bei 1070 ppm (höher als 800 ppm) gehalten wurde, so sank
die Ausbeute an L-Tryptophan um etwa 10%, bezogen auf die ab, die erhalten wurde, wenn die Indolkonzentration
800 ppm betrug.
Menge des | Konzentration | Konzentration | Ausbeute an |
verwendeten | an Indol in | an Indol | L-Tryptophan |
organischen | der Lösung des | in der Enzym | (Mol-% |
Lösungs | organischen | enthaltenden | basierend |
mittels *) 1 | Lösungs | Flüssigkeit | auf Indol) |
(g) | mittels *) 1 | (ppm)*) 2 | |
(Gew.-o/o) |
30
34,45
27,56 22,97
19,69
10
20
25
30
35
45
-3000
20
25
30
35
45
-3000
160
400
520
660
790
400
520
660
790
1070
96,5 96,3 95,8 96,2 95,0 86,3
*) 1: Acetyltributylcitrat.
Ein 300-ml-Kolben, ausgerüstet mit einem Rührer,
wurde mit 9,27 g L-Serin, 3 g Ammoniumsulfat, 10 mg Pyridoxalphosphat und 82,5 g Wasser beschickt, und es
wurde gut gerührt. Der pH-Wert des Gemischs wurde 35 *)2: In einem frühen Stadium der Reaktion,
mit konzentriertem wäßrigem Ammoniak auf 8,5 einge- *) 3: Es wurde kein organisches Lösungsmittel zugesetzt,
stellt, und die Temperatur wurde auf 35° C angehoben. 3 g eines nassen cremigen Kuchens kultivierter Zellen
von Escherichia coli FERM BP-20 mit einem Gehalt an Tryptophansynthetase wurden zugesetzt. Anschließend 40
wurden 68,9 g einer Acetyltributylcitratlösung von 6,89 g Indol zugefügt Die Reaktion wurde 48 h durchgeführt,
und das Reaktionsgemisch wurde auf einem Gesamtvolumen von 300 ml mit 5% wäßriger Natriumhydroxidlösung
verdünnt, um das resultierende L-Tryp- 45 volumen der Suspension wurde auf 20 ml eingestellt,
tophan vollständig aufzulösen. Die Lösung wurde durch Eine wäßrige Lösung, die aus 11,3 g DL-Serin, 6,0 g
einen Scheidetrichter in eine wäßrige Phase und eine Lösungsmittelphase getrennt Ein Teil der wäßrigen
Phase wurde mittels eiens Zentrifugenabscheiders zur Sedimentation der Mikrobenzellen zentrifugiert Die
klare überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt, und die Konzentration des L-Tryptophans wurde durch
Flüssigkeitschromatographie analysiert, und seine Aus-
6,8 g (Feststoffgehalt 1,7 g) eines nassen cremigen Kuchens von Escherichia coli FERM BP-20, enthaltend
Tryptophasynthetase und 3,4 g (Feststoffgehalt 0,85 g) Pseudomonas putida IFO 12 996, enthaltend Serinracemase,
wurden in Wasser suspendiert, und das Gesamt-
50
beutemenge wurde bestimmt Die Ausbeute des Pro-Ammoniumsulfat, 10 mg Pyridoxalphosphat und 66 g
Wasser bestand, wurde in einen 300-ml-Kolben beschickt, und der pH-Wert der wäßrigen Lösung wurde
mit konzentriertem wäßrigem Ammoniak auf 8,5 eingestellt und die vorstehend hergestellte Mikrobenzellsuspension
wurde in den Kolben beschickt
Das Innere des Kolbens wurde bei 35° C gehalten und 57,2 g einer Toluollösung von 11,5 g Indol wurden zuge-
dukts, basierend auf Indol, betrug 96,5 Mol-%. 55 setzt und die Reaktion wurde bei dieser Temperatur
Die vorstehende Verfahrensweise wurde wiederholt 48 h durchgeführt. Zu Beginn der Reaktion betrug die
wobei jedoch die Menge des verwendeten organischen
Lösungsmittels geändert wurde, und das Verteilungsverhältnis in der wäßrigen Phase verändert wurde. Die
Ergebnisse sind in der Tabelle I aufgeführt Wurde die vorstehende Reaktion ohne Zusatz des
organischen Lösungsmittels durchgeführt so betrug die
Konzentration des Indols in der den Mikroorganismus enthaltenden Flüssigkeit 3000 ppm, und die Ausbeute an
65
L-Tryptophan betrug 47 Mol-%. Aus diesem Versuchstatsachen ist ersichtlich, daß es für die Herstellung von
L-Tryptophan wichtig ist ein mit Wasser nicht mischbares, organisches Lösungsmittel zuzusetzen und die Kon-Konzentration
an Indol in der wäßrigen Phase 720 ppm.
Das Reaktionsprodukt wurde nach der gleichen Verfahrensweise wie im Beispiel 1 analysiert. Es zeigt sich,
daß das L-Tryptophan in einer Ausbeute von 89,3 Mol-%, basierend auf Indol, erhalten wurde.
Um die Wirkung der Konzentration des Indols in der wäßrigen Phase zu bestimmen, wurde die vorstehende
Verfahrensweise wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Menge des verwendeten Toluols variiert wurde. Die
Ausbeuten an L-Tryptophan in diesen Ansätzen sind in der Tabelle II gezeigt
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die inhibitori-
'■A
Pi ί7!
Pi ί7!
sehe Konzentration von Indol in der wäßrigen Phase
etwa 800 ppm beträgt. Wie gezeigt, war, wenn die Reaktion bei einer Indolkonzentration von nicht mehr als
720 ppm gestartet wurde, die Ausbeute an L-Tryptophan etwa 90 Mol-%, sie verringerte sich jedoch auf
82 Mol-%, wenn die Reaktion bei einer Indolkonzentration von 920 ppm durchgeführt wurde.
Menge der | Konzentration | Konzentration | Ausbeute an |
Toluol- | an Indol in | an Indol in | L-Tryptophan |
lösung | der | der wäßrigen | (Mol-%, |
(g) | Toluollösung | Phase in einer | basierend |
(Gew.-o/o) | frühen Stufe | auf Indol) | |
der Reaktion | |||
(ppm) |
115
57,5
38,3
57,5
38,3
10
20
30
20
30
450
720
920
720
920
91,2
89,3
82,4
89,3
82,4
Nach der gleichen Verfahrensweise wie im Beispiel 2 wurden DL-Serin und Indol in Anwesenheit von Kulturzellen
von Escherichia coli FERM BP-19 und kultivierten
Zellen von Pseudomonas punctata FERM BP-21 umgesetzt.
Hier wurde Methylisobutylketon als organische Lösungsmittel
verwendet, und die Reaktion wurde so durchgeführt, daß die Konzentration an Indol in der
wäßrigen Phase zu Beginn der Reaktion auf 760 ppm eingestellt wurde.
Nach Durchführen der Reaktion bei 35°C während 48 h betrug die Ausbeute an L-Tryptophan 98,6 Mol-%,
basierend auf Indol.
Zur Bestimmung der Wirkung der Indolkonzentration in der wäßrigen Phase wurde die Menge an Methylisobutylketon
variiert, und die Änderungen der Ausbeute an L-Tryptophan wurden bewertet. Die Ergebnisse
sind in der Tabelle III aufgeführt.
Es ist ersichtlich, daß durch Halten der Konzentration in der wäßrigen Phase unter 800 ppm unter Verwendung
von Methylisobutylketon L-Tryptophan in einer Ausbeute von mehr als 99 Mol-% erhalten werden
kann.
Menge der | Konzentration | Konzentration | Ausbeute an |
Ketonlösung | an Indol | an Indol in | L-Tryptophan |
(g) | in der | der wäßrigen | (Mol-%, |
Ketonlf'öung | Phase in | basierend | |
(Gew.-) | einer frühen | auf Indol) | |
Stufe der | |||
Reaktion | |||
(ppm) | |||
115 | 10 | 80 | 99,8 |
57,5 | 20 | 190 | 99,9 |
38,3 | 30 | 340 | 99,8 |
28,75 | 40 | 510 | 99,6 |
23,0 | 50 | 720 | 98,6 |
Nach der gleichen Verfahrensweise wie im Beispiel 2 wurden DL-Serin und Indol in der Anwesenheit von
Escherichia coli FERM BP-20 und Pseudomonas putida IFO 12 996 umgesetzt. Durch Verwenden von Anisol als
Lösungsmittel wurde die Konzentration an Indol in der wäßrigen Phase unter 300 ppm gehalten.
Nach 40stündiger Reaktion bei 35°C betrug die Ausbeute an L-Tryptophan, basierend auf Indol, 95 Mol-%.
Escherichia coli wurde bei einer Temperatur von
ίο 300C und einem pH-Wert von 7 in Anwesenheit von
Monokaliumphosphat, Dikaliumphosphat, Ammoniumsulfat, Calciumchlorid, Eisensulfat, Hefeextrakt und
Polypepton unter Einblasen von Luft in das Kulturmedium und Zusatz von Glucose und Indol kultiviert. Außerdem
wurden Mikrobenzellen, die Pseudomonas putida enthielten, in einem gleichen Kulturmedium bei einer
Temperatur von 300C und einem pH-Wert von 7 kultiviert,
wobei Luft eingeblasen und Glucose zugesetzt wurde. In 40 h waren diese Mikrobenzellen in einer
Konzentration von 30 bis 35 g/l ausgebildet. Nach Super-Hochgeschwindigkeiiszentrifugenabscheidung
erhielt man sie als cremige Kuchen mit einem Wassergehalt von 85 bis 85%.
77,3 g DL-Serin, 10,5 g Ammoniumsulfat und 486 g Wasser wurden in einen Kolben eingesetzt, und der pH-Wert des Gemischs wurde mit 29% wäßrigem Ammoniak auf 8,5 eingestellt. Außerdem wurden 51,2 g des cremigen Kuchens von Escherichia coli und :?3,2 g des cremigen Kuchens von Pseudomonas putida zugesetzt, und das gesamte Gemisch wurde gut gerührt. Darüber hinaus wurden 392 g einer Toluollösung von 78,4 g Indol zugesetzt, und die Reaktion wurde 40 h bei 35° C durchgeführt. Der Gehalt an L-Tryptophan in der Reaktionsmasse erwies sich als 129,8 g durch Flüssigkeitschroma- tographie. Die Ausbeute betrug 95,0%, basierend auf Indol.
77,3 g DL-Serin, 10,5 g Ammoniumsulfat und 486 g Wasser wurden in einen Kolben eingesetzt, und der pH-Wert des Gemischs wurde mit 29% wäßrigem Ammoniak auf 8,5 eingestellt. Außerdem wurden 51,2 g des cremigen Kuchens von Escherichia coli und :?3,2 g des cremigen Kuchens von Pseudomonas putida zugesetzt, und das gesamte Gemisch wurde gut gerührt. Darüber hinaus wurden 392 g einer Toluollösung von 78,4 g Indol zugesetzt, und die Reaktion wurde 40 h bei 35° C durchgeführt. Der Gehalt an L-Tryptophan in der Reaktionsmasse erwies sich als 129,8 g durch Flüssigkeitschroma- tographie. Die Ausbeute betrug 95,0%, basierend auf Indol.
Toluol wurde durch Destillation entfernt, und das Reaktionsgemisch
wurde mit Wasser verdünnt, um die Konzentration von L-Tryptophan auf 4,2 Gew.-% einzustellen.
Der pH-Wert des Gemisches wurde mit 98% Schwefelsäure auf 4,0 eingestellt, und wurden 27 g Aktivkohle
zugesetzt. Die Temperatur wurde auf 95° C angehoben, und das Gemisch wurde 1 h bei 95 bis 980C
gehalten und heiß bei dieser Temperatur filtriert, um die Zellen zusammen mit der Aktivkohle zu entfernen. Bei
80° C wurde das wiedergewonnene Toluol zu dem FiI-trat
gefügt, und es wurde gut gerührt. Anschließend wurde das Rühren beendet, und das Gemisch wurde
stehengelassen. Es trennte sich zu einer oberen Toluolschicht und einer unteren wäßrigen Schicht. Die Toluolschicht
wurde entfernt, und die gleiche Toluolmenge, wie vorstehend, wurde zu der wäßrigen Schicht gefügt,
und es wurde erneut extrahiert.
Die Konzentration an Indol in der wäßrigen Schicht betrug 55 ppm nach der ersten Extraktion und 4 ppm
nach der zweiten Extraktion.
Die wäßrige Schicht wurde auf L-Tryptophankonzentration von 10Gew.-% konzentriert und auf 200C gekühlt
Die ausgefällten L-Tryptophankristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und
getrocknet. Die isolierte L-Tryptophanmenge betrug 100 g. Die Reinheit betrug 99,5% bei einem Indolgehalt
von 0 ppm. Wenn die wiedergewonnene Toluollösung des Indols in der nächsten Reaktion nach Zufuhr von
zusätzlichem Toluol verwendet wurde, so ergab sich keine Auswirkung auf die Ausbeute von L-Tryptophan,
und die Reaktion verlief in jutem Zustand. Die Ergebnisse sind in der Tabelle IV aufgeführt.
Anzahl der Recyclisate
der extrahierten
Toluolschicht
der extrahierten
Toluolschicht
Ausbeute an L-Tryptophan
(MoI-%, basierend auf Indol)
(MoI-%, basierend auf Indol)
95,0
983
98,6
97,0
95,4
98,7
983
98,6
97,0
95,4
98,7
316 g jedes der Reaktionsgemische, die 500 ppm und 2000 ppm nicht-umgesetztes Indol enthielten, wurden
mit 27,6 g Toluol bei 80° C extrahiert, und die Beziehung zwischen der Anzahl der Extraktionen und der Konzentration
des in der wäßrigen Phase verbleibenden Indols wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V
aufgeführt.
Konzentration | Anzahl der | Konzentration |
an Indol in der | Extraktionen | an Indol im |
wäßrigen Phase | Wasser anch der | |
in einer frühen | Extraktion | |
Stufe der Reaktion | (ppm) | |
(ppm) | ||
2000 | 1 | 299 |
299 | 2 | 54 |
54 | 3 | 9,8 |
500 | 1 | 45 |
45 | 2 | 18 |
18 | 3 | 3 |
Beispiel 6 |
L-Tryptophan wurde hergestellt durch Reaktion von L-Serin und InJol in Wasser und Diisobutylketon bei
einer Temperatur von 35° C und bei einem pH-Wert von 8,5 in Anwesenheit von Escherichia coli-Zellen, die nach
der gleichen Verfahrensweise wie im Beispiel 6 kultiviert wurden. Die Ausbeute an L-Tryptophan betrug
983%, basierend auf Indol.
Das Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung von Diisobutylketon destilliert, und anschließend auf einem
Zentrifugenabscheider behandelt, unter Erzielung eines weißen cremigen Kuchens, der L-Tryptophan und die
Mikrobenzellen enthielt.
Der cremige Kuchen wurde in Wasser gefügt und mit Wasser auf eine L-Tryptophankonzentration von
0,8 Gew.-% verdünnt. Die L-Tryptophankristalle wurden in Wasser gelöst und die Lösung wurde durch eine
Ultrafiltrationsmembran bei Raumtemperatur zur Entfernung der Mikrobenzellen geleitet. Zu diesem Zeitpunkt
betrug die Konzentration an Indol in der wäßrigen Phase 90 ppm. Diisobutylketon in einer Menge von
einem Fünftel der Menge der wäßrigen Phase wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde gerührt. Das Gemisch
wurde stehengelassen, um es in zwei Schichten zu trennen. Die Diisobutylketonschicht wurde entfernt.
Anschließend wurde der gleiche Extraktionsvorgang wiederholt, unter Verwendung der gleichen Menge an
Diisobutylketon wie bei dem vorhergehenden Arbeitsgang.
Die Konzentration an Indol in der wäßrigen Schicht betrug 32 ppm nach der ersten Extraktion und 2 ppir
nach der zweiten Extraktion.
Die Indol enthaltende Diisobutylketonschicht wurde in der nächsten Reaktion wiederverwendet nach Zufuhi
einer erforderlichen Indolmenge. Bei der nächsten Reaktion traten keine Probleme auf.
ίο L-Tryptophan wurde hergestellt durch Reaktion von
DL-Serin und Indol bei einem pH-Wert von 8,5 und seiner Temperatur von 35° C während 48 h in Wasser
und Benzol in Anwesenheit von Escherichia coli und
Pseudomonas punctata, die kultiviert und gesammelt wurden nach der Verfahrensweise des Beispiels 6. Die
Ausbeute an L-Tryptophan betrug, basierend auf Indol 93,7%. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch zur
Entfernung von Benzol destilliert und dann mit Wasser auf eine L-Tryptophankonzentration von 4,2Gew.-%
verdünnt Das verdünnte Gemisch wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 3,5 eingestellt, und es
wurden 15 Gew.-% Aktivkohle, basierend auf dem resultierenden Tryptophan, zugesetzt. Das Gemisch wurde
bei 95 bis 98° C 1 h erwärmt Es wurde unter Druck bei der gleichen Temperatur während 1 h filtriert. Zu
dem Filtrat wurde Benzol bei 80° C gefügt Das Gemisch wurde gut gerührt und dann zur Trennung in Schichten
stehengelassen. Das verwendete Benzol war das bei der vorstehenden Destillation gewonnene. Die gleiche Exfraktion
wurde dreimal unter Verwendung der gleichen Menge an frischem Benzol wiederholt. Die Konzentration
an Indol in der wäßrigen Phase betrug vor der Extraktion 1850 ppm, 265 ppm nach der ersten Extraktion,
43 ppm nach der zweiten Extraktion und 4,6 ppm nach der dritten Extraktion. Wenn das Reaktionsgemisch
konzentriert und kristallisiert wurde, erhielt man L-Tryptophan mit einer Reinheit von 99,7% und in einer
Ausbeute von 69,8%, basierend auf Indol. Sein Indolgehalt betrug 2,1 ppm.
Die gewonnene benzolische Indollösung wurde in der nächsten Reaktion nach Zufuhr der erforderlichen Menge
an frischem Indol verwendet. In der nächsten Reaktion trat kein Problem auf.
Eine wäßrige Lösung aus 11,3 g DL-Serin, 6,0 g Ammoniumsulfat,
10 mg Pyridoxalphosphat und 66 g destilliertem Wasser wurde gut bei 35° C in einem 300 miso
Kolben gerührt, und 29% wäßriges Ammoniak wurde zur Einstellung des pH-Werts der Lösung auf 8,5 zugesetzt.
Anschließend wurden 4,0 g eines Zellcremekuchens, der Escherichia coli, kultiviert nach der Arbeitsweise
des Beispiels 6, und 2,5 g eines Zellcremekuchens, enthaltend Pseudomnonas putida, kultivert nach der Arbeitsweise
des Beispiels 6, zugesetzt, und es wurde bei 35° C gut gerührt, um zu dispergieren.
Außerdem wurde eine Lösung von 11,5g Indol in
26,8 g Diisobutylketon zugesetzt, und das Gemisch wurde 40 h bei 35° C und 90 UpM gerührt.
Nach der Reaktion wurde mit dem Rühren aufgehört. Das Reaktionsgemisch wurde stehengelassen, um es in
zwei Schichten zu trennen. Die obere Diisobutylketonschicht wurde entfernt. Diisobutylketon wurde in der
gleichen Menge wie vorstehend zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 min bei 90 UpM gerührt. Das Gemisch
wurde anschließend stehengelassen, und die Diisobutyl-
ketonschicht wurde in gleicher Weise wie vorstehend gewonnen.
Es zeigte sich, daß das nicht-umgesetzte Indol, das in
dem Reaktionsgemisch am Ende der Reaktion verblieb, bis zu einem Ausmaß von 8£-/o durch die erste Extraktion
mit Diisobutylketon gewonnen wurde und bis zu einem Ausmaß von. 99% durch die zweite Extraktion.
Die Indolmenge wurde gaschromatographisch analysiert.
Wenn das wiedergewonnene Diisobutylketon in der nächsten Reaktion nach Zufuhr der gewünschten Indolmenge
verwendet wurde, ergaben sich keine Probleme.
Es wurde die gleiche Reaktion wie im Beispiel 9 bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit · von 640 UpM
durchgeführt unter Verwendung von 45,7 g Toluol. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch im
Zentrifugenabscheider behandelt, um die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten auszuprägen, da es sich
um eine gleichmäßige Emulsion handelte.
Die obere Toluolschicht wurde entfernt Anschließend wurde Toluol in der gleichen Menge zugesetzt,
und die Extraktion des nicht-umgestzten Indols wurde wiederholt.
Es zeigte sich, daß das nicht-umgesetzte Indol, das am Ende der Reaktion in dem Reaktionsgemisch enthalten
war, bis zu einem Ausmaß von 87% durch die erste Extraktion und bis zu einem Ausmaß von 99,9% durch
die zweite Extraktion wiedergewonnen wurde.
Das wiedergewonnene Toluol, das Indol enthielt, wurde in der nächsten Reaktion nach Zufuhr der erforderlichen
Indolmenge wiederverwendet Es ergaben sich keine Probleme bei der nächsten Reaktion.
Beispiel 10
gewaschen und getrocknet
Die Ausbeute an isolierten L-Tryptophan betrug 74,5 Mol-%, basierend auf Indol. Es wies eine Reinheit
von 99,4% und einen Indolgehalt von 1,2 ppm auf.
Das wiedergewonnene Ethylcitrat, das Indol enthielt wurde in der nächsten Reaktion nach Zufuhr der erforderlichen
Indolmenge verwendet. In der nächsten Reaktion ergab sich keine Auswirkung auf die Ausbeute an
L-Tryptophan, und die Raktion verlief in gutem Zustand.
Beispiel 11
Die gleiche Reaktion wie im Beispiel 9 wurde unter Verwendung von 14,3 g Ethylcitrat durchgeführt. Nach
der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch in der Form einer gleichmäßigen Emulsion im kontinuierlichen Zentrifugenabscheider
behandelt um es in eine wäßrige Schicht und eine Ethylcitratschicht zu trennen. Zu der
wäßrigen Schicht wurde die gleiche Menge an Ethylcitrat, wie sie in der Reaktion verwendet wurde, gefügt,
und das Gemisch wurde erneut in eine wäßrige Schicht und eine organische Schicht durch kontinuierliche Zentrifugenabscheidung
getrennt Aus einem Teil der wäßrigen Schicht wurden Proben entnommen, und das resultierende
Tryptophan wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie analysiert. Seine Ausbeute
ergab sich als 99,7% basierend auf Indol.
Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser auf eine L-Tryptophankonzentration von 4,2 Gew.-% verdünnt
und mit Schwefelsäure auf den pH-Wert 3,5 eingestellt. Pulverisierte Aktivkohle wurde in einem Anteil von
15 Gew.-%, basierend auf L-Tryptophan, zugesetzt, und das Gemisch wurde 1 h bei 90° C erwärmt Nach dem
vollständigen Auflösen der L-Tryptophankristalle wurde die Lösung durch Absaugen bei der gleichen Temperatur
filtriert um Mikrobenzellen zusammen mit Aktivkohle zu entfernen.
Das heiße Filtrat wurde auf eine L-Tryptophankonzentration von 10Gew.-% konzentriert und auf 10°C
gekühlt Der pH-Wert der Lösung wurde dann auf 5,9 eingestellt und die ausgefällten ablagerungsartigen Kristalle
wurden durch Filtrieren abgetrennt, mit Wasser Escherichia coli und Pesudomonas putida wurden jeweils
in gleicher Weise wie in Beispiel 9 kultiviert und in einem Superzentrifugenabscheider behandelt, unter Bildung
von Zellcremekuchen der beiden Mikroorganismen, jeweils mit einem Wassergehalt von 75%.
Eine wäßrige Lösung aus 77,3 g DL-Serin, 10,5 g Am-
Eine wäßrige Lösung aus 77,3 g DL-Serin, 10,5 g Am-
moniumsulfat und 486 g Wasser wurde mit 29% wäßrigem
Ammoniak auf den pH-Wert 8,5 eingestellt, und 51,2 g des Zellcremekuchens von Escherichia coli und
23,2 g des Zellcremekuchens von Pseudomonas putida, die wie vorstehend erhalten wurden, zugesetzt. Es wurde
durch sorgfältiges Rühren dispergiert und 392 g Toluollösung von 78,4 g Indol wurden zugesetzt Die Reaktion
wurde 48 h bei 35° C durchgeführt.
Nach der Reaktion wurde ein Teil des Reaktionsgemischs
genommen und in eine Toluolschicht und eine wäßrige Schicht durch einen Zentrifugenabscheider getrennt.
L-Tryptophan wurde gelöst durch Zusatz eines Alkali zu der wäßrigen Schicht, in der Kristalle von
L-Tryptophan ausgefüllt wurden. Anschließend wurde die wäßrige Schicht durch ein Membranfilter geleitet,
um die Mikrobenzellen zu entfernen. Das Filtrat -vurde einer Hochleistungsfähigkeits-Flüssigkeitschromatographie
unterzogen, um das L-Tryptophan zu analysieren. Die Ausbeute an L-Tryptophan in dem Reaktionsgemisch erwies sich als 99,3 Mol-%, basierend auf Indol.
Ein weiterer Teil des Reaktionsgemischs wurde entnommen und in eine wäßrige Schicht und eine Toluolschicht
durch einen Zentrifugenabschieder getrennt. Die Konzentration des nicht-umgesetzten Indols, das in
den Toluol enthalten war, wurde gaschromatographisch als 2,3 ppm gemessen.
Wenn die Toluollösung, die Indol enthielt, in der nächsten Reaktion nach dem Zusatz der erforderlichen Menge
an frischem Indol verwendet wurde, so ergab sich keine Auswirkung auf die Ausbeute von L-Tryptophan,
und die Reaktion verlief gut.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle VI aufgeführt.
Tabelle VI | Ausbeute an L-Tryptophan |
55 Anzahl der Recyclisate | (Mol-%, basierend auf Indol |
der wiedergewonnen | |
Toluolschicht | 99,3 |
0 | 98,5 |
60 1 | 98,9 |
2 | 99,2 |
3 | 98,2 |
4 | 99,4 |
5 | |
Die wäßrige Schicht, die durch Zentrifugenabtrennung gewonnen wurde, wurde mit Wasser auf eine L-Tryptophankonzentration
von 4,2 Gew.-% verdünnt
17
\i
stellt 27,0g pulverisierte Aktivkohle wurden zugesetzt
|j und die Temperatur des Gemischs wurde auf 98" C an-
y, gehoben. Anschließend wurde das Gemisch 1 h bei 93
'p,
bis 100° C zur Auflösung der ausgefällten L-Trypto-
jjjj phankristalle gehalten.
Die Mikrobenzellen wurden zusammen mit der Aktivkohle durch Heißfiltration entfernt Das Filtrat wurde
auf eine L-Tryptophankonzentration von 15Gew.-%
zur Ausfällung von ablagerungsartigen Kristallen von L-Tryptophan konzentriert. Die Kristalle wurden durch
Filtrieren bei 10° C abgetrennt mit Wasser gewaschen
und getrocknet unter Bildung von blaßgelben ablagerungsartigen Kristallen von L-Tryptophan mit einer
Reinheit von 99,2% in einer Ausbeute von 813 Mol-%, basierend auf IndoL Die resultierenden L-Tryptophan-H kristalle wiesen eine spezifische Drehung von —31,8°,
ι §j einen Schwermetallgehalt von weniger als 20 pm und
?! einen Verbrennungsrückstand von 0,02 Gew.-% sowie
ίί einen Ammoniakgehalt von 0,01 Gew.-% auf.
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Verhinderung der Verminderung der Aktivität eines Enzyms durch ein Substrat in einer Enzyinreaktion in wäßriger Phase zur Herstellung von Trypthophan aus Indol und L-Serin unter Verwendung einer Tryptophaeynthetase oder aus Indol und DL-Serin unter Verwendung einer Serinacemase und Tryptophansynthetase, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Reaktionssystem ein organisches Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar, jedoch mit dem Substrat mischbar ist, zusetzt, um die Konzentration des Substrats in der wäßrigen Phase unter die Konzentration zu verringern, bei der die Aktivität des Enzyms wesentlich inhibiert wird.
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