JPS5911187A - 酵素を利用した反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は水相−ｒ６よび有機溶媒相の２相系で実施する
酵素を利用した反応方法に関するものである。

より詳しくは、基質が酵素の活性を劣化させる反応方法
において、該基質と混和し得るが水と混和しな（・有機
溶媒の存在下、水相中の該基質濃度を酵素の活性を劣化
させない濃度以下、いわゆる阻害濃度以下に保ちながら
反応を実施する方法に関するものである。

酵素を利用する反応方法では酵素にとって水が最巨の反
応媒体であり、通常、反応は水媒体中で実施されている
。しかしながら、基質によっては水に対する溶解性が低
いものがあり、必ずしも最良の媒体とはならない。この
ような基質では酵素を含有する水媒体中（以下、酵素含
有液と言う）での反応に必要な量の基質を確保し、反応
を円滑に進めるために（・くつかの方法がとられている
。

例えば、有機溶媒、すなわち水および基質と混和と する溶媒、または水／混和しないが基質と混和オる有機
溶媒を用い反応を実施する例も知られている。即ち、特
公昭４７−３４１５３号公報では、インドールおよびセ
リンをアクロバクテリウム属細菌を利用してＬ　−）リ
プトファンを製造する方法にお（・て、反応促進剤とし
てトルエン、ブタノール、アルコール、アセトンが用い
られること、また、特開昭４７−４３２８７号公報では
水に溶解しない基質てあろデカンなデカン酸化酵素の存
在下で酸化する際、水および基質と混和するジメチルホ
ルムアミドを用いること、さらに特公昭５６−４５５９
３号公報では、基質が酵素含有液にほとんど不溶である
酵素反応において、水と混和しないが基質とは混和し得
る有機溶媒の存在下に反応を実施する方法を開示してい
る。

これらの方法において、有機溶媒は基質を酵素含有液に
不溶化することをたすけ、反応促進剤として使用されて
いる。特に、後者の方法における有機溶媒の役割りは、
基質を貯蔵する機能、反応生成物を抽出する機能と共に
最も主要な機能として、この方法が水にほとんど溶けな
い基質の酵素反応を対象とするものであるため、基質を
有機溶媒に不溶化し、水相系へ円滑に溶解させ実質上水
中の基質濃度を飽和状態とする機能である。

すなわち、この方法は前記機能により反応を促進するも
ので、水に殆んど溶けない基質の酵素反応を実施するに
は優れた方法と言える。

しかしながら、酵素を利用する反応方法では、基質濃度
が酵素に与える影響も考慮する必要がある。

すなわち、酵素を利用する反応においては、基質の濃度
が反応を進行させる酵素の活性を著しく低下させるもの
もある。例えば、アンスラニル酸を前駆体とし、酵素の
存在下トリプトファンを製造する場合、水相中のアンス
ラニル酸の濃度が反応に甲いろ酵素の！舌性劣化に影響
なめぼオこと（釉開昭５７−５６９４）、またＤＬ−セ
リンとピロカテコールよりエルビニア拳ヘルビコラを酵
素としてＬ−ＤＯＰＡ　を製浩する際、その基質でちる
ピロカテコールが水溶媒中高濃度に存在すると酵素活性
を劣化す°ること（／１５ｇ−ｂ＝ｃ　、Ｆ３ｉ−Ｊ　
、　ＣＪ？−ａｎ　、　３７巻、４Ｑ３−４Ｑ９；７２
５〜７３５．１９７３　）　、さらにインドールとセリ
ンよりトリプトファンを製］告するさい、その基質でち
るインドールが合成酵素であるトリプトファン・シンセ
ターゼの活性を劣化さぜること等が知られている（’　
（Ｕ、　ｊｋ／Ｌａ−ｆ　、　Ｔ４ｚＦ；、ンＡ　Ｒｕ
−ｖｐ−ｅ＝ｎ　ＣｖｎＰ保ｉ　ａｎ　Ｂオσムｃ４ａ
σ１θＨ１、２／′１８６〜２／１．Ｒ９，１９７８）
。

したがって、酵素を利用する反応において、基質が酵素
の活性を劣化させるような場合は、前記のような基質を
水に不溶化しようとする試みに対し、反応を円滑させる
ためには基質が酵素含有液に十分に溶解する場合であっ
ても、水中での基質濃摩を活性の劣イ１が生じる濃度（
川下、阻害濃度と言う）範囲以下に低く抑えて反応を実
施する必要がある。このため、この種の１プ応のｒ業化
にあたっては、水中での基質濃度をＩＳＳ実害濃度以下
４−７ｇつよう、反応中基質濃度を連続的１７分析する
必゛卑があるので、連続分析計の１市発が必−ｊ）−な
り、また線質を連続的に装入するため、速読分析計と直
結した原料装入装置が必要となるなど、装置ならびに反
応操作が煩雑、になることが避けられながった。　勿論
、この種の反応では校名に使用する酵素の使用量を大過
剰にし、基質が水に混和する速ε 度より反応で消費される速ＩＷの方〆大きくすれば実質
トは基質の阻害ａ咋以下で反１．チでとることは言うま
でも／ｒＸいが、男１誦的にこの様な反応方法は反応に
使用する酵素の使用量が極めて大計となり工業的には意
味がない。

本発明者らは基質が酵素の活性を劣化させる、酵素を利
用する゛反Ｃ５において、ヒ記の問題点を解消するよう
な反応方法について鋭意横側した。その結果基・ｋと混
和するが水と混和しない有機溶媒・を用い水溶液との２
相系とし、酵素含有溶液での基質／ａ麻を実質的に阻害
濃度以下に低く抑えながら基質の酵素的転化を高収率で
実施する本発明の方法な一出した。

寸なわち、本発明は、基質が酵素の活性を低下させる、
酵素を利用する反応において、基質と混和するが水と混
和しない有機溶媒を用いて水相中の基質４度を実質的に
阻害濃度以下に抑えながら反応させることを特徴とする
酵素を利用した反応方法である。

本発明の方法によれば、基質を溶解した有機溶応では、
水相系での基質濃度を常に低くおさえる必要があり、そ
のため酵素を含有する反応系に基質を継続的にまたは”
′形１売的に何らかの方法で少量づつ添加する方法がと
られる。このような方法では基質を反応系へ添加する場
合、酵素含有液中の装置が必Ｑｐとされ問題である。

しかし、本発明の方法で１・士、基質と混和し／水と混
和しない有機溶媒を酵素含有液に添加することにより、
酵素の活性を低下させる基質を有機溶媒相にほとんど溶
解させ、有機溶媒相と水相間の基質の分配比より水相中
の基質濃度を実質的に阻害濃度以下に抑える。この際、
反応生成物が有機溶媒相、あるいは１酵素含有相のいづ
れの相に溶解または析出しても問題ない。

また、本発明の方法によれば、反応の進行と共に消費さ
れていく酵素含有液相中の基質は２相間の分配比にした
がい速読的にかつ所望のある一定濃度以下で供給される
。なお、基質を溶解した有機溶媒１・ま、水相中の基質
濃度が阻害濃度以下に抑えることができれば、一括して
添加しても、間欠的に添加しても、また速読的に添加し
てもよい。

攪拌等の操作により有痛相と水相との接触面積を変化さ
せて、基質の移動速度を変化させることができる。

本発明の方法に適用される酵素は一種または二種以上併
用していても良い。これらの酵素は少くとも一種が基質
により活性の劣化を示すものである。

また、本発明に用いられる酵素類は、必ずしも純粋であ
る必要はなく、通常、それぞれの酵素の生産菌の培養液
から遠心分離などの方法により採取した生菌体、その凍
結菌体、または乾燥菌体でもよく、これらの菌体を磨砕
、自己消化、音波処理などの処理により得られた菌体処
理物、さらにはこれらの菌体からの抽出物ならびに該抽
出物より得られる酵素等の粗製物が用いられる。

本発明の方法は反応系に反応媒体、基質、酵素及びその
他必要な物を混合して反応を実施し、酵素の活性を低下
させることなく、より好ましい工業的な反応装置１と反
応操作より良好な成積で目的物を取得することができる
。

本発明の方７失に使用される有機溶媒は基質と混和し、
水と混和しないものであれば良いが、実際−ヒは反応に
使用する酵素に応じ、反応条件下で、ｍ媒自身が酵素の
活性劣化を起さな（・も０）を４シクぷ必要がある。

さらに有機溶媒は基質および醐）：ζに適合したものを
・共訳し、その使用量な決定する。すなわち、反応に使
用される酵素および該酵素σつ活性を劣イヒさせる基質
から反応条件下における酵素含有液Ｌｔ］の基質の阻害
濃度を測定する。

次に酵素含有液と有機溶媒との２相間における基質の分
配比を求め、先きに測定した酵素含有液相中このように
して反応に供する有機溶媒中θ）基質濃■が決まｆｔば
、反応液中の目標反応生成物蓄牙責濃度に応じたそれぞ
れの基質使用断力・ら酵素含有液の使用量および有機溶
媒使用量を’／Ｊ’ｆ？ｈることカζて・とる。

したがって、酵素含有液中での基質濃度を１氾害濃度以
下に抑えることのできるもθ）でち；ｉｕｆ、有機溶媒
の選択、およびその使用量σ）決定（ま自由に行なうこ
とができる。

もレジ 次に本番・旧の方法をインドールとＯＬ−セリンを基質
とするＬ−）　ＩＪブトファンの製造により説明する。

従来、インドールとＩ、−セリンよりトリプトファン・
シンセターゼを用いるＬ−）リプトファンの製造法では
、インドールがトリプトファン・シンセターゼの活性を
劣化させる基質であるため、水中のインドール濃度を低
く抑えて反応を実施せねばならなし・０そのため、非イ
オン性界面活性剤を用いるか、あるいは吸着樹脂を川（
・る方法もある　　（Ｘγ７　１％／ｊａｚｙＪｆ　　
、　　’Ｉ’ｋ　　Ｆｊａ、−＋ｆ　　ＥｗｙｒｐＬθ
、ｎ　Ｃｖｎ、ｇｈｃｉｉ　　　ｖｎｐ３〕・θムＣノ
１１つ・ンｎ　１ｔｙｙ）ｙ　　、　２　／　ｌ　８６
〜２／’１８９　　、　１９７８）　。

この方法ではインドールが界面活性剤により水相中でミ
セル状態となっており、本発明の方法である実ノロ的に
？相Ｉｇ１で実施される反応とは異っている。しかも反
応に非イオン性界面活性剤を用（・ているので、反応終
了後反応生成物との分離が困帷で工業的な製造法とは言
い難い。

また、吸着樹脂な用いる方法では樹脂によっては吸着さ
れたインドールが完全に溶離してこなかかったり、ある
（・は反唱生成：吻が吸着さえしる恐れがあり工業的に
問題がある。

しかしながら、本発明の方法によりインドールを有機溶
媒に溶解しておき、セリンおよび酵素を含んだ水浴液に
加え２相の状態で反応を実施すれば、水相（Ｃ溶解する
インドールを低い濃度に保つことができ、しかも反応の
進行と共に消費されたインドールｊ・ま有１°幾Ｍ）ノ
ＦＪ和かも自〔力的に補給されｆゾ応は円滑に１侑行す
る。

この方、′左ニおいて、エシェリヒア・〆り変捏株を含
有する液において、インドールの阻害濃度はおよそ８ｏ
　ｏ　ｐｐｍである。

従って、インドールを水相中、この濃Ｊｖ♂雰配する有
機溶媒、例えば、トルエン、クロルベンゼン、クエン酸
エチル、メチルイソブチルケトン、アニソール？Ｃどを
選択して使用することができる。

例えＩフイ、トルエンを・弱択した場合、２０ｗｔ％濃
度のインドール溶液を使用すれば、インドールはエシェ
リヒア・コリ変異株を含ｔｊするＵ中に７２０Ｄｐｌｎ
以下で溶解し、：油記の阻害濃度以下で反応な゛実施す
ることがで宅る。

回春１４、イ１１ｊ、の１容媒でｒ、つぎのようなイン
ドール一度にずれＩ−ｆ反応冬即下酵素含有・夜中のイ
ンドール濃度を８０００ｐｍ以下にすることができろ。

すなわち、クエン９エチルでは４．　Ｑ　ｗ　ｔ％、メ
チルイソブチルケトンでｆ４５０ｗｔ％、アニソールで
は３Ｑｗｔ％およびモノクロベンゼンでは２０ｗｔ％で
もる。

本発明の古弓二でＬ　−トＩＪブトファン要求性エシェ
リヒア＠〆りのｌ−ＩＪプトフ了ナーゼ欠損変異株ｆＸ
−炭素および窒素源ｆ、ｃらびに無効塩を含有ずろ培地
を甲いて＋、　−トＩＪブトファンの酵素的な製造を実
施するには、まず好気性の条件下２８〜４０°Ｃ１ｐ［
１６〜８の采（牛でエシェリヒア・コリ変尾株を培養し
、菌体をその培秤液のまままたは培地から分離してピリ
ドキザールリン酸塩（６よびＬ−セリン、無・憑嘲を６
喀した溶液に懸濁させる。ｐＨ７，５〜９．５好ましく
はｐＨｏＸ〜９の条件下水と混相しないがインドールと
混和する有・段溶媒に溶・仔したインドール溶液を−１
７１、あるいは連１読的Ｋ　ｉｎｎえ２０〜４０　’Ｃ
の範囲で反応を行いＬ　−トＩＪブトファンを生成ぜし
める。

このｊ（ｑ用いられる有機溶媒としては、ベンゼン、ト
ルエン、クロルベンゼン、ニトロベンゼン、アセトフェ
ノン等の芳香族炭化水素およびその誘導体、炭素数６以
−ヒの脂肪族エステル類、例えば、ｎ−ブチルアセテー
ト、イソアミルアセテート、エチルブチレート、イソブ
チルアセテート等、炭素数６　ｔ′：Ｊ、ｌ−０）１折
肋族ケトン類、例えばメチルイソブチルケトン、ジイソ
ブチルケトン、ジイソプロピルケトン、メチル−ｎ−−
アミルケトン、ジーｎ　−プロピルケトン等クエン酸エ
ステル類、例えばアセ千ルトリエチルシトレート、了セ
チルトリブチルシトレー１−、トＩＪ工千ルシトレー）
、１−ＩＪブチルシトレート等そのほか酒石酒エステル
類、リンゴ酸エステル類が使用される。エーテル類とし
てアニソール等も使用される。

この際、有し″８省媒の使用量は反「１−６件下での酵
素含有液相と有（携溶媒相との間のインド−／し分配比
と、インドール使用量により決まるため、各種有機溶媒
１Ｃよりその使用量は異なるが、・［０常は酵素含有液
相中のインドール濃度が８００ｐｐｍ以下、工程的に好
ましくは７５０ｐｐｍ以下になるように決めれば白い。

この際、反応牛Ｈｖ物であるＬ　−トリプトファンは酵
素含有液中に結晶として析出してくるが、この反応条件
下では、反応の進行に何ら影響を与えない。

この製造法において、基質にＤ　Ｌ−セリンを用℃・て
も何ら差しつかえない。すなわち、二の際はセリンラセ
マーセとしてシュードモナス・ブテイーダ（１ν（Ｔ−
１，０１８２）、またはンコーードモナス・ブンクタ〜
り（Ｉｖ＋Ｔ−１０２４３）を用いることにより有機溶
媒による活性劣化を受けることなく　Ｌ　−）　ＩＪブ
トファンを高収率で得ろことができる。この化学的に合
成されたＤＬ−セリンとインドールを２ｆｉｒｆの酵素
の存在下、さらに工業的に生産されている有１浅溶媒と
の２相系で何ら問題もなく　Ｌ　−）　ＩＪブトファン
を製造しうろことは工業的に極めて重要なことである。

１′Ｊ、下、本発明の方法を実施内１により更に詳しく
説明する。

実施例１ 攪拌機を備えた３００４フラスコにＬ−セリン９．２７
ｇ、硫１浚アンモニウム３ｇ、ピリドキザールリン酸１
０ｍ９．７に８２．５９を加え向くかきまぜる。

譲アンモニア水でｐＨＲ０５に調整し、３５°Ｃに昇温
したのち、トリグトファンシンセタ〜ゼを含有するエノ
エリヒア・コリ培褥菌体（１＼４１’−１０２４２）湿
潤戸塊３ｇを７旧え、・・士いてインドール！Ｒ，８９
’７を溶解したアセチルトリブチルシトレート溶液６８
゜９シを加える。４８時間反応させたのち、反応液を５
％苛性ソーダ水溶液で全容が３００　ｍｔになるよう乞 にｈ目え生成したＬ−）リプトファン各完全に溶解する
。分液漏斗で水・田と有１ｆ誹相とを分液し水相の一部
を遠心分離機にて遠心外部し、［盤体を沈降させろ。ヒ
澄の清澄液を採取し、液代クロマトグラフィーによりＬ
−）リプトファンの濃度を分析し、／４：成骨を求めた
。反応収率は９５．５ｍＪ％対インドールであった。

また、有；溌牌供の使・ｎ、４を変え、水相中のインド
ール分配比を勿えて、その時のｌ、−トリプトファンの
生成収率を求めた。結果を表−１に示す。

′ｆｃお、有８溶媒を添加することなく、反応を実施し
たところ、微生！拗含有液相中のインドール濃度は３ｏ
ｏｏｐｐｍで、この時のＬ　−ト１）ブトファン収率は
４７ｍ６ｆ％であった。この実り倹事実からも水と混和
しない有機溶媒を添加し、微生物含有液相山のインドー
ル、′慣度をはくおさえる効果がＬ−トリプトファンの
製造を二とり極めて重要な寅であるかがわかる。すなわ
ち、水溶媒のみで反応させると、この反応条件下での水
相中のインドール濃度が３０００ｐｐｍ　　で陶り、そ
の時のＬ−）ＩＪプトフ−アンの収率が４７−σ１％対
インドールであるにもかかわらず、有機ｑ媒として、ク
エンチブチを加え水相中のインドール４５摩を７９０ｐ
ｐｍにおさえることにより、Ｌ　ｆ　）リプトファンの
収率は９５７７ＬＪ％対インドールと著しく向−ヒして
いる。なお、水相中のインドール４度を１１０７０ｐｐ
と、８００　ＤＩ）１７１以上にしたところ、Ｌ−）Ｉ
Ｊブトファンの収率は、８００　ＤＩ）ＩＴＩ以下にく
らべ約１０％と著しく低下していることか１つかる。

−４ε 実施例 トリプトファン・シンセターゼを含有するエツシエリヒ
ーヤ・コリ浸潤炉塊６．．Ｒ９（固形分１．７ｇ；　Ｍ
Ｔ−１０２４２）およびセリンラセマーゼを包有するシ
ュードモナス・プチーダ湿潤Ｐ液３．４９　（固形分ｎ
、８５　Ｑ　；　ｌへ”Ｉ”−１０Ｊ　Ｒ２）を水に懸
濁させ全体の体積を２０７ｎｌとする。

次ぎＫＤＬ−セリンｎ、３ｑ、硫酸アンモニウム’、０
９、ピリドキザールリン酸１０ｍ９および水６６りな入
れた３００７＋１７４フラスコを濃アンモニア水でｐＨ
ｌ二 ３．５＼３周整し、先きに調整した菌体懸濁液な入れる
。

３５°に保温したのち、インドール１１．５　！／を溶
解したトルエン溶液５７．２９を加え３５’（，４８時
間反応させた。この反応開始時の水相中のインドール濃
度は７２Ｑｐｐｍでちった。

実施例１と同ｒ８な操作で反応生成物を分析したところ
、Ｌ−トリプトファンが対インドール８９．３ｍ６Ｊ’
−％で得られていた。

／、「お、水相中のインドール濃度の彩管をみるため、
トルエン使用没を変えその時のＬ−）　１）ブトファン
収率をしらべた。百応条件は前述と同じ条件で実施した
。結果を表２に示す。

この結果からも水相中でのインドールによる阻害濃度が
８００１）Ｉ）ｎｌ付近にあることがわかる。すなわち
、７２０　ｏ　ｐｍ以下のインドール濃度で反応を開始
すればり、）、１）ブトファンの収率は約９０ｍ６ｊ２
％で得られるが、９２０ｐｐｍでは８２　ｍ　６１１％
と低下していることがわかる。

実施例３ 実施例２と同憎な操作でＩ）Ｌ−セリンと、インドール
をエシエリヒヤ争コリ（１ゝ／ＩＴ−１，０２３２）　
培養菌体およびシュードモナス・ブンクタータ（ＭＴ−
１０２４３）培養菌体の存在下反応させた。

こθ）さい、有＋ａ磐媒として、メチルイノブチルケト
ンを用い、反応１ｉｉ４Ｉ始時の水相中のインドール濃
昨が７６０Ｉ）Ｉ）ｍになる様にして反応を実施した。

３５”！’４Ｒ時間降のＬ−）リプトファンの反応収率
は９８．６ｍσ１％対インドールであった。

なお、水相中のインドール一度の影響をみるため、メチ
ルイソブチルケトンの使用量を変え、その時のＬ　＝　
１−リグトファンの収率をしらべた。結果な表−３に示
す。

このように、水相中のインドール濃度をメチルイソブチ
ルケトンを用いることにより８ｏｏｐｐｍ以下；１．二
おさえればＬ−トリプトファンが９９ｍｄ−％す、トの
収率で１・すられる。

４９３− 実施例４ 実！′面例２と同様にしてＤＬ−セリンとインドールを
エツシエルヒャ・コＩ）（ＭＴ−１０２４２）　おＪ−
びシュードモナス・プテイーダ（ＭＴ−１’ｎ１Ｒ２）
の存在下反応させたインドール溶媒として、アニソール
を用い水相中のインドール濃度が３００ｐｐｍＩＪ下で
反応した。

３５　？　４８時間ｒｅのＬ　−）リプトフ了ンの収率
は対インドール９５ｍσ１％で、あった。

実施例 ２００ｍＡ！反応槽にＤＬ−セリン２（１、酢酸アンセ
ン１．０２亜傭酸ナトリウム０．２ｇ、ＤＥＴＡｏ、１
ｑｋミよびＴ；ｗ＝；、ａ　Ｌ、、、８；、　ｃ、ｄａ
　（ＡＴＣＣ２１４，３４）培養液を加える。

培養液はＥ４ｕｙＬ鴫ｏ　＆＜Ｊｉ、Ｃθム菌株をＬ−
チロシン　　　０．２　　％、　　Ｋ２１−（ＰＯ２０
，２％、　ＭｇＳＯ４、７Ｈ２００，１％　Ｆｅ５０４
７１−１２０　２１）Ｉ）ｍ　、　　ピリドキシントＩ
ｃｅ０．０１％、グリセリン０．６％、コノ・り酸０．
５％、ＤＬ−メチオニン　０．１％、ＤＩ、−アラニン
　０．２％、グリシン０．０５％、Ｌ−フェニルアラニ
ン　０．１％、大豆Ｔｉ白加水分解物１２　ｍｌ中２８
４２８時１４４１通気培養したものを用いた。

次ぎＩＣピロカテコール０．７　ｇ、トルエン溶液を時
間反応を行った。Ｌ−ＤＯＰＡの蓄積量は、３０’７／
ｌで祝った。

特許出願人 三井申１−′Ｆ化学味式会社 手　　続　　補　　正　　書（自発） 昭和５７年９月７日 特許庁長官若杉和夫殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第　１１７８２５　　号２、発明の名
称 酵素を利用した反応方法 ３補正をする者 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ５補正の内容 １）明細書、第ろ頁、第４行目および第１０行目にそれ
ぞれ「不溶化」とあるのを［可溶化−１と訂正する。

２）同じく、第４頁、第４行目に「ＤＬ−セリ／」とあ
るのを「１、−七リン」と訂正する。

３）同じく、第４頁、下薬６祈目に「不溶化」とあるの
を「可溶化」と訂正する。

４）同じく、第８頁、第９〜４０行目に「音波処理」と
あるのを「超音波処理」と補正する。

５）同じく、第８頁、第１６行目の「成績」を「成績」
と訂正する。

６）同じく、第１２頁、第１１行目に「を炭素および」
とあるのを「を用い炭素および」と補正する。

７）同じく、第１３頁、第１２行目の「プロビルケトン
等クエン酸エステル類」を「プロピルクトン等、クエン
酸エステル類」と訂正する。

８）同じく、第１４頁、第１１〜１３行目に［ンユード
モナス・プテイーダ（Ｍ　Ｔ−１０１８２）〜、または
ンユードモナス・プンクタータ（ＭＴ−１０２４６）を
用いる」とあるのを「ンユードモナス・プテイーダ（λ
４　Ｔ　−１０１８２）の培養菌体、捷たはシュードモ
ナス・プ／クタ−タ（ｌｖｌ　Ｔ　−１０２４３）の培
養菌体を用いる」と補正する。

９）同じく、第１５頁、第９〜１０行目に「培養菌体（
ｌｖｌ　Ｔ　−１０２４２）　Ｊとあるのを「（ＭＴ−
１０２４２）培養菌体の」と訂正する。

１０）同じく、第１６頁、下薬６祈目の「クエン酸ブチ
」を「クエン酸ブチル」と訂正する。

１１）同じく、第１７頁、第１行目の「約１０％と著し
く」を「約１０係も」と訂正する。

１２）同じく、第１９頁、第２〜５行目に「エソシエリ
ヒヤ・コリ浸潤沢塊６８７（固形分１７７；Ｍ　Ｔ−１
０２４２）　ｊとあるのを１エシエリヒヤ−コリ（Ｍ　
Ｔ　−１０２４２）湿潤ｉ１１塊６８７（固形分１７７
）」と削正する。

１０）同じく、第１９頁、第５〜６行目に［ンユードモ
ナス・プチーダ湿潤１ｇ　３．４　ｇ（固形分０８５７
°Ｍ　Ｔ−１０１８２）’　Ｊとあるのを「シュードモ
ナス ス−ツー１−−タ（Ｍ　Ｔ−１０１８２）　ａ潤ｉ１”
塊ろ４７（固形分０．８５　ｆ　）　Ｊと訂ＩＦする。

１４）同じく、第１９頁、下域１竹目の「彩管」を１−
影響」と訂正する。

１５）同じく、第２４頁、第５行目の「反応させたイン
ドール溶媒として、」を「反応させた。インドール溶媒
として」と訂正する。

１６）同じく、第２４頁、第１６行目の［１φ７Ｓ０４
．７Ｈ２０」を１ＭｙＳＯ，７Ｈ２０Ｊと訂正する。

１７）同じく、第２５頁、第６行目に「ピロカテコール
０．７’？、」とあるのを「ピロカテコール０７７を含
む」と補正する。

以ヱ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｊ）少くとも１種の基質が酵素の活性を劣化させる反応
   方法において、水と混和しな見・が〆基質と混和し得る
   有機溶媒を用いて水相中の基質濃度を実質的に酵素の活
   性阻害濃度以下におさえて反応させることを特徴とする
   酵素を利用した反応方法。