NL8304495A - Werkwijze voor het verbeteren van een enzymreactie. - Google Patents

Description

N.0. 32226

Werkwijze voor het verbeteren van een enzymreactie.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het verbeteren van een enzymreactie in een water' bevattende fase. De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op een werkwijze voor het voorkomen van het verminderen van de activiteit van een enzym door een substraat 5 bij een reactie, waarbij het enzym wordt toegepast, waarbij door toevoegen aan het reactiesysteem van een organisch oplosmiddel, dat mengbaar is met het substraat maar niet-mengbaar is met water, de omzetting wordt uitgevoerd terwijl de concentratie van het substraat in de water bevattende fase wordt gehandhaafd beneden die concentratie, waarbij de 10 activiteit van het enzym wordt geïnhibeerd (de zogenaamde inhibitie— concentratie).

Bij een omzetting, waarbij een enzym wordt gebruikt, is water het beste reactiemilieu voor het enzym en derhalve wordt een dergelijke reactie gewoönlijk uitgevoerd in een water bevattende fase. Een aantal 15 substraten bezit echter een geringe oplosbaarheid in water. Wanneer een dergelijk substraat wordt toegepast, worden diverse maatregelen genomen teneinde te verzekeren, dat een hoeveelheid van het substraat, die vereist is voor de reactie in een water bevattende fase, die een enzym bevat (die soms wordt aangeduid als een enzym bevattende vloeistof) aan-20 wezig is en de omzetting vlot uit te voeren. Het is bijvoorbeeld bekend, de omzetting met toepassing van een organisch oplosmiddel uit te voeren. In de Japanse octrooipublikatie 34153/1972 wordt beschreven, » dat tolueen, butanol, ethanol of aceton wordt gebruikt als een reactie-promotor bij een werkwijze voor het bereiden van L-tryptofaan uit in-25 dool en serine onder toepassing van een bacterie van de genus

Aerobacterium. In de Britse octrooipublikatie GB-13134 wordt beschreven, dat bij de oxydatie van decaan, een in water onoplosbaar substraat, bij aanwezigheid van een decaan oxyderend enzym met water en het substraat mengbaar dimethylformamide wordt gebruikt.

30 Volgens deze werkwijzen worden de organische oplosmiddelen ge bruikt als hulpmiddelen voor het oplossen van de substraten in de enzym bevattende vloeistof en voor het bevorderen van de omzettingen.

Bij omzettingen, waarbij enzymen worden gebruikt, dient rekening te worden gehouden met het effect van de concentratie van een substraat 35 op een enzym. Indien bij een enzymreactie de concentratie van een substraat in de reactiefase te groot is, kan de activiteit van het enzym aanzienlijk worden verminderd, hetgeen de reactie vertraagt. Het is bijvoorbeeld bekend, dat bij de bereiding van tryptofaan bij aanwezig- 8304495 ___ H _____ I t f· * V * 2 heid van een enzym onder toepassing van antranilzuur als een precursor, de concentratie van antranilzuur in de water bevattende fase de daling van de activiteit van het bij de omzetting gebruikte enzym nadelig beïnvloedt (Amerikaans octrooischrift 4.363.875); bij de bereiding van 5 L-DOPA uit L-serine en pyrocatechol onder toepassing van Erwinia herbicola wordt door de aanwezigheid van pyrocatechol als een substraat in een hoge concentratie in de water bevattende fase de activiteit van het enzym verminderd (Agric. Biol. Chem., deel 37, 493-499; 725-735, 1973); en bij de bereiding van tryptofaan uit indool en serine vermin-10 dert indool als een substraat de activiteit van tryptofaan-synthetase (IJ. Behrendt, The First European Congress on Biotechnology, 2/186-2/189, 1978).

Wanneer bij een reactie, waarbij een enzym wordt gebruikt, een substraat waarschijnlijk de activiteit van het enzym vermindert, moet 15 de reactie derhalve worden uitgevoerd terwijl de concentratie van het substraat in de enzym bevattende vloeistof wordt gehandhaafd beneden die concentratie, waarbij de activiteit van het enzym wordt verminderd (de inhibitie-concentratie) teneinde de reactie vlotter te laten verlopen, zelfs wanneer het substraat volledig oplosbaar is in de enzym be-20 vattende vloeistof. Teneinde reacties van dit type voor industriële toepassing geschikt te maken, moet een inrichting voor het continu analyseren van de substraatconcentratie tijdens de reactie worden ontwikkeld teneinde de concentratie van het substraat in de enzym bevattende vloeistof beneden de inhibitie-concentratie te handhaven. Verder is 25 voor de continue toevoer van het substraat een toevoersysteem voor materiaal, dat direct met de inrichting voor de continue analyse is verbonden, vereist. Derhalve worden de inrichting en de uitvoering van de reactie onvermijdelijk ingewikkeld. Indien bij reacties van dit type een grote overmaat van een enzym wordt gebruikt en de snelheid van het 30 substraatverbruik bij de reactie groter is dan de mengsnelheid van het substraat met water, kan de omzetting natuurlijk bij een aanzienlijk lagere substraatconcentratie worden uitgevoerd dan de inhibitie-concentratie. Aangezien echter de hoeveelheid van het bij de omzetting gebruikte enzym in de praktijk zeer groot is, heeft een dergelijke wijze 35 van werken geen industriële betekenis.

Tryptofaan, dat door een enzymreactie of een fermentatiereactie uit indool is verkregen, dient bij voorkeur vrij te zijn van het niet-omgezette indool, wanneer het wordt gebruikt in geneesmiddelen of toevoegsels voor voeding omdat het niet-omgezette indool een onaangename 40 geur bezit.

8 3 0 4 4 9 5 # 4 3

Tot dusver is het bekend stoomdestillatie toe te passen als werkwijze voor het verwijderen van het niet-omgezette indool uit de reac-tie-oplossing bij de bereiding van L-tryptofaan uit indool door een enzym react ie (Japanse octrooipublikatie 800/1982). Haar omdat de dampdruk 5 van indool lager is dan die van water, is een grote hoeveelheid stoom vereist voor het verwijderen van indool door destillatie. Dit draagt bij aan de energiekosten en een dergelijke werkwijze is technisch niet geschikt. Derhalve is het zeer gewenst, dit probleem op te lossen.

De uitvinding heeft ten doel een verbeterde werkwijze te verschaf- 10 fen voor het voorkomen van het verminderen van de activiteit van een enzym door een substraat bij een enzymreactie.

Volgens de uitvinding wordt dit doel bereikt door een werkwijze voor het voorkomen van het verminderen van de activiteit van een enzym door een substraat bij een enzymreactie in een water bevattende fase.

15 Deze werkwijze wordt gekenmerkt, doordat men ervoor zorgt, dat een met water niet-mengbaar maar met het substraat mengbaar organisch oplosmiddel in bet reactiesysteem aanwezig is, waarbij de concentratie van het substraat in de water bevattende fase wordt verlaagd tot beneden die concentratie, waarbij de activiteit van het enzym in aanzienlijke mate ft 20 wordt geïnhibeerd.

Als uitvoeringsvormen van de bovenvermelde werkwijze worden volgens de onderhavige uitvinding verschaft: (A) een werkwijze, die de uitvoering van een enzymreactie omvat, waarbij indool als een substraat wordt toegepast in een water bevatten- 25 de fase bij aanwezigheid van een met water niet-mengbaar maar met indool mengbaar organisch oplosmiddel, het organische oplosmiddel uit het reactiemengsel wordt teruggewonnen en bet enzym wordt verwijderd, het niet-gereageerde indool uit de verkregen water bevattende oplossing van L-tryptofaan met het teruggewonnen organische oplosmiddel wordt geëx- 30 traheerd en het extract opnieuw bij de reactie wordt gebruikt; (B) een werkwijze, die de uitvoering van een enzymreactie omvat, waarbij indool als een substraat wordt gebruikt in een water bevattende oplossing bij aanwezigheid van een met water niet-mengbaar maar met indool mengbaar organisch oplosmiddel en het niet-gereageerde indool als 35 een organisch oplosmiddel bevattende laag van het reactiemengsel wordt afgescheiden.

Het basisprincipe van de onderhavige uitvinding is, dat de concentratie van een substraat in een water bevattende fase wordt gehandhaafd beneden een zekere vastgestelde concentratie in overeenstemming met de 40 verdelingsverhouding van het substraat tussen een organische oplosmid- 8 3 0 4 4 3 5 * * 4 delfase met daarin opgelost het substraat.en de water bevattende fase.

In het algemeen moet bij een omzetting, waarbij de activiteit·van een enzym wordt verminderd door een substraat, de concentratie van het substraat in een water bevattende fase altijd laag worden gehouden en 5 voor dit doel wordt een methode toegepast, waarbij volgens een bepaalde maatregel het substraat in porties continu of met tussenpozen aan het reactiesysteem, dat het enzym bevat, wordt toegevoegd. Deze methode vereist echter een ingewikkelde uitvoering en inrichting voor het controleren van de reactie, zodat bij het toevoegen van substraat aan het 10 reactiesysteem, de concentratie daarvan in de enzym bevattende vloeistof laag wordt gehouden*

Volgens de werkwijze van de uitvinding wordt daarentegen een met het substraat mengbaar maar met water niet-mengbaar organisch oplosmiddel toegevoegd aan een enzym bevattende vloeistof teneinde het sub-15 straat bijna volledig in de organische oplosmiddelfase op te lossen. Dientengevolge kan de concentratie van het substraat in de water bevattende fase in aanzienlijke mate worden gehandhaafd beneden de inhibi-tie-concentratie in overeenstemming met de verdelingsverhouding van het substraat tussen de organische oplosmiddelfase en de waterfase. Op dit 20 tijdstip is het niet van belang of het reactieprodukt is opgelost of neergeslagen in de organische oplosmiddelfase of de enzym bevattende fase.

Volgens de werkwijze van de uitvinding wordt het substraat in de enzym bevattende vloeibare fase continu toegevoerd vanuit de organische 25 oplosmiddelfase in overeenstemming met de verdelingsverhouding van het substraat tussen de twee fasen naarmate de reactie voortschrijdt en het substraat wordt verbruikt. Het organische oplosmiddel voor het oplossen van het substraat kan in een keer, met tussenpozen of continu worden toegevoegd mits de concentratie van het substraat in de waterfase lager 30 kan worden gehouden dan de inhibitie-concentratie. Indien gewenst kan de bewegingssnelheid van het substraat worden veranderd door het aanra-kingsgebied tussen de organische fase en de waterfase te veranderen, bijvoorbeeld door roeren.

Volgens de werkwijze van de uitvinding kunnen enzymen afzonderlijk , 35 of als mengsels van twee of meer enzymen worden gebruikt. Tenminste een enzym moet echter zijn van het type, waarvan de activiteit wordt verminderd door een substraat, wanneer het wordt gebruikt bij een enzym-reactie, die volgens een gebruikelijke methode wordt uitgevoerd.

De volgens de uitvinding te gebruiken enzymen behoeven niet altijd 40 zuiver te zijn en kunnen ook ruwe enzymen zijn. De enzymen kunnen bij- 8 3 0 4 A 9 3

V

5 » ♦ voorbeeld levende cellen zijn, die door centrifugeren en dergélijke zijn verzameld uit een kweekvloeistof van een enzym producerend micro-organisme, cellen, die zijn verkregen door bevriezen of drogen van levende cellen, behandelde produkten van deze cellen, die worden verkre-5 gen door behandelingen, zoals malen, zelf-ontsluiting en behandeling met ultrasone trillingen, extracten van deze cellen en uit de extracten verkregen enzymen.

Het bij de werkwijze volgens de uitvinding gebruikte organische oplosmiddel is mengbaar met substraten maar niet mengbaar met water. In 10 de praktijk is het afhankelijk van de gebruikte enzymen noodzakelijk die organische oplosmiddelen te kiezen, die de activiteiten van de enzymen onder de reactie-orastandigheden niet verminderen.

Er wordt een organisch oplosmiddel gekozen, dat geschikt is voor een bepaald substraat en enzym, en de hoeveelheid ervan wordt op de in 15 het onderstaande aangegeven wijze bepaald. In het bijzonder worden een enzym en een om te zetten substraat gebruikt en wordt de inhibitie-con-centratie van het substraat in een enzym bevattende vloeistof onder de reactie-omstandigheden gemeten. Vervolgens wordt de verdelingsverhou-ding van het substraat tussen de enzym bevattende vloeistof en het or-20 ganische oplosmiddel bepaald en wordt de concentratie van het substraat in het organische oplosmiddel, die lager is dan de boven aangegeven, gemeten inhibitie-concentratie, voorgeschreven. Wanneer de concentratie van het substraat in het te gebruiken organische oplosmiddel bij de reactie op de boven beschreven wijze wordt bepaald, kunnen de hoeveel-25 heid van de enzym bevattende vloeistof en de hoeveelheid van het gebruikte organische oplosmiddel worden bepaald uit de hoeveelheid van het gebruikte substraat in overeenstemming met de concentratie van het gewenste reactieprodukt, dat in het reactiemengsel is geaccumuleerd.

Zolang de concentratie van het substraat in de enzym bevattende 30 vloeistof lager kan worden gehouden dan de inhibitie-concentratie, kan het organische oplosmiddel dus vrij worden gekozen ai kan de hoeveelheid ervan vrij worden bepaald. r

De werkwijze volgens de uitvinding wordt in het onderstaande beschreven met betrekking tot de bereiding van L-tryptofaan onder toepas-35 sing van indool en L- of DL-serine als substraten. Aangezien bij de bereiding van L-tryptofaan uit indool en L-serine onder toepassing van tryptofaan-synthetase indool de activiteit van tryptof aan-synthetase vermindert, moet de omzetting worden uitgevoerd terwijl de concentratie van indool in water laag wordt gehouden. Voor dit doel zijn niet-iono-40 gene oppervlak-actieve middelen of adsorberende harsen gebruikt 8334405 _____1 f i * 6 m , (Behrandt, The First European Congress in-Biotechnology, 2/186-189, 1978). De omzetting bij aanwezigheid van een niet-ionogeen oppervlak-actief middel is wat betreft het mechanisme echter verschillend van de omzetting volgens de werkwijze van de uitvinding, die in hoofdzaak 5 wordt uitgevoerd tussen twee fasen, omdat indool zich in de vorm van een micel in de waterfase bevindt door het effect van het oppervlak-ac-tieve middel. Bovendien is deze methode technisch niet geschikt, omdat het moeilijk is het oppervlak-actieve middel na de omzetting van het reactieprodukt af te scheiden. De werkwijze, waarbij adsorberende har-10 sen worden toegepast, is in industrieel opzicht nadelig omdat met een aantal adsorberende harsen het daardoor geadsorbeerde indool 'niet volledig wordt afgescheiden of het waarschijnlijk is dat het reactiepro-dukt aan deze harsen wordt geadsorbeerd.

Wanneer daarentegen een oplossing van indool in een organisch op-15 losmiddel wordt toegevoegd aan een water bevattende oplossing, die serine en het enzym bevat, en de omzetting wordt uitgevoerd in twee fasen, kan de concentratie van in de waterfase opgelost indool laag worden gehouden en wordt indool automatisch vanuit de organische oplosmid-delfase toegevoerd in de mate, waarin het bij de omzetting wordt ver-20 bruikt. Derhalve verloopt de reactie vlot.

In een vloeistof, die een mutant-stam van Escherichia coli bevat, is de inhibitie-concentratie van indool ongeveer 800 dpm. Voorbeelden van organische oplosmiddelen, die indool in een lagere concentratie dan de inhibitie-concentratie in de waterfase verdelen, zijn tolueen, 25 chloorbenzeen, ethylcitraat, methylisobutylketon en anisool. Wanneer bijvoorbeeld een 20 gew.procents tolueenoplossing van indool wordt gebruikt, lost indool op in een concentratie van minder dan 720 dpm in een vloeistof, die een mutant-stam van Escherichia coli bevat, en de omzetting kan worden uitgevoerd terwijl de concentratie van indool la-30 ger wordt gehouden dan de boven vermelde inhibitie-concentratie. De concentratie van indool in een enzym bevattende vloeistof onder de reactie-omstandigheden kan lager dan 800 dpm worden gehouden indien de concentratie van indool in andere oplosmiddelen 40 gew.% voor ethylcitraat, 50 gew.% voor methylisobutylketon, 30 gew.% voor anisool en 20 35 gew.% voor monochloorbenzeen bedraagt.

Volgens een specifieke uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding kan L-tryptofaan worden geproduceerd door kweken van een mutant-stam van Escherichia coli door een kweekmedium, dat een wat betreft tryptofanase-deficiënte mutant-stam van L-tryptofaan vereisend 40 Escherichia coli, een koolstofbron, een stikstofbron en anorganische 8304495 * * 7 zouten bevat» onder aerobe omstandigheden.onderwerpt aan een temperatuur van 28-40°C en een pH van 6-8, de microbiële cellen zoals ze in de kweekvloeistof aanwezig zijn of na afscheiden van het kweekmedlum suspendeert in een oplossing, die pyridoxal-fosfaat, L-serine en anorga-5 nisch materiaal bevat, vervolgens een oplossing van indool in een met indool mengbaar met met water niet-mengbaar oplosmiddel in een keer of continu bij een pH van 7,5-9,5, bij voorkeur 8-9, toevoegt en de omzetting bij een temperatuur van 20-40°C uitvoert.

Voorbeelden van de organische oplosmiddelen, die hierbij kunnen 10 worden gebruikt, zijn aromatische koolwaterstoffen en derivaten ervan, zoals benzeen, tolueen, chloorbenzeen, nitrobenzeen en acetofenon; ali-fatische esters met tenminste 6 koolstofatomen, zoals n-butylacetaat, isoamylacetaat, ethylbutyraat en isobutylacetaat; alifatische ketonen met tenminste 6 koolstofatomen, zoals methyl!sobutylketon, diisobutyl-15 keton, diisopropylketon, methyl-n-amylketon en di-n-propylketon; ci-troenzuuresters, zoals acetyltriethylcitraat, acetyltributylcitraat, triethylcitraat en tributylcitraat; esters van wijnsteenzuur, esters van appelzuur en ethers zoals anisool.

De hoeveelheid van het gebruikte organische oplosmiddel varieert 20 en is afhankelijk van het type ervan aangezien deze wordt bepaald door de verdelingsverhouding van indool tussen éen enzym bevattende vloeibare fase en een organische fase onder de reactie-omstandigheden en de gebruikte hoeveelheid indool. Gewoonlijk wordt deze zodanig bepaald, dat de concentratie van indool in de enzym bevattende vloeistof lager 25 is dan 800 dpm, op industriële schaal Mj voorkeur lager dan 750 dpm.

L-tryptofaan, dat het reactieprodukt is, precipiteert als kristallen in de enzym bevattende vloeistof. Onder de toegepaste reactie-omstandigheden hebben deze kristallen in het geheel geen nadelige invloed op het verloop van de reactie.

30 Bij de boven beschreven werkwijze kan DL-serine als het substraat worden gebruikt. In dit geval kan door toepassing van gekweekte cellen van Pseudomonas putida (MT-10182) of Pseudomonas punctata (MT-10243) als een serine-racemase L-tryptofaan in hoge opbrengsten worden verkregen zonder dat de activiteit van het enzym door het organische oplos-35 middel wordt verminderd.

Het is van grote commerciële betekenis, dat L-tryptofaan zonder enig probleem kan worden geproduceerd uit chemisch gesynthetiseerd DL-serine en indool bij aanwezigheid van twee typen enzymen onder toepassing van gemakkelijk verkrijgbare organische oplosmiddelen.

40 Het volgens de boven beschreven werkwijze verkregen reactiemengsel 83 0 4 i::r.

I * * 8 bevat het gevormde L-tryptofaan, het nietrgereageerde uitgangsmateriaal, het. organische oplosmiddel, het enzym enz* Bij voorkeur wordt dit reactiemengsel behandeld volgens de boven beschreven uitvoeringsvorm (A) of (B).

5 Volgens uitvoeringsvorm (A) wordt de volgende werkwijze voor het terugwinnen toegepast. Eerst wordt het organische oplosmiddel uit het reactiemengsel teruggewonnen en wordt het enzym verwijderd. Indien het reactiemengsel krachtig wordt geroerd, terwijl het enzym en het organische oplosmiddel daarin samen aanwezig zijn, wordt het scheidingsvlak 10 tussen de waterfase en de organische oplosmiddelfase onduidelijk en wordt het soms moeilijk het organische oplosmiddel met daarin het niet-gereageerde, geëxtraheerde en opgeloste indool, af te scheiden. Om dit verschijnsel te vermijden is het gebruikelijk het organische oplosmiddel op de eerste plaats uit het reactiemengsel terug te winnen. Dit kan 15 bijvoorbeeld tot stand worden gebracht door een gebruikelijke destillar-tie. Vervolgens wordt het enzym, dat het aanwezig is in het reactiemengsel, waaruit het organische oplosmiddel is teruggewonnen, verwijderd.

Er is geen bijzondere beperking met betrekking tot de werkwijze 20 voor het verwijderen van het bij de reactie gebruikte enzym uit het reactiemengsel· Een op industriële schaal doelmatige methode omvat het toevoegen van een anorganisch zuur aan het reactiemengsel, waaruit het organische oplosmiddel is verwijderd, waarbij de pH van het reactiemengsel wordt ingesteld op 2-5, verhitten daarvan, zoals vereist is om 25 uitvlokken van het enzym te bevorderen, en verwijderen van het uitgevlokte enzym door filtratie of andere methoden.

Indien vereist kan het reactiemengsel, waaruit het enzym is verwijderd, worden geconcentreerd. Voor het op doelmatige wijze extraheren en afscheiden van het niet-omgezette indool uit het reactiemengsel ver-30 dient het de voorkeur L-tryptofaan in opgeloste toestand te houden zonder het als kristallen te precipiteren. Wanneer L-tryptofaan uit water bevattende oplossing wordt gekristalliseerd, bevat het het niet-om-gezette indool, dat een overeenkomstige molecuulstructuur bezit, en veroorzaakt het de gelijktijdige kristallisatie daarvan. Om deze reden 35 dient afhankelijk van de behandelingstemperatuur de concentratie van het reactiemengsel, dat met het organische oplosmiddel moet worden geëxtraheerd, zodanig te worden ingesteld, dat L-tryptofaan zich in opgeloste toestand bevindt.

Het niet-omgezette indool wordt met een organisch oplosmiddel ge-40 extraheerd uit het reactiemengsel, waaruit het enzym is verwijderd. Het 83 0 4 4 0 5 V %

V

9 organische oplosmiddel kan op geschikte wijze «orden gekozen uit. oplosmiddelen, die bij de omzetting worden gebruikt. Gewoonlijk wordt hetzelfde organische oplosmiddel als bij de omzetting gebruikt. Derhalve kan het teruggewonnen organische oplosmiddel voor dit doel worden ge-5 bruikt. Het oplosmiddel behoeft echter niet hetzelfde te zijn als het bij de omzetting gebruikte oplosmiddel en oplosmiddelen, die doelmatig zijn voor de tryptofaan producerende reactie en de extractie van het niet-omgezette indool kunnen afzonderlijk worden gekozen.

De boven beschreven werkwijze voor het terugwinnen is in het bij-10 zonder toepasbaar bij de bereiding van L-tryptofaan volgens een enzym-reactie onder toepassing van indool als een substraat omdat het teruggewonnen indool opnieuw kan worden gebruikt. In het algemeen wordt bij de produktie van L-tryptofaan door een enzymreactie het bij de reactie gebruikte enzym en dergelijke volgens een algemene werkwijze uit het 15 reactiemengsel verwijderd en vervolgens wordt L-tryptofaan geïsoleerd.

De toepassing van de teruggewonnen, het niet-omgezette materiaal bevattende oplossing als zodanig inhibeert vaak de activiteit van het enzym en dit geeft aanleiding tot een ernstig probleem bij een uitvoering op industriële schaal. Wanneer echter het niet-omgezette indool volgens de 20 boven vermelde werkwijze voor het terugwinnen met het organische oplosmiddel uit het reactiemengsel wordt geëxtraheerd, kan het gehalte aan indool in L-tryptofaankristallen worden verminderd en kan het indool, zoals het met het organische oplosmiddel in de vorm van een oplossing in het oplosmiddel is geëxtraheerd, bij de volgende omzetting opnieuw 25 worden gebruikt zonder het geëxtraheerde indool uit de oplossing te

Isoleren (wanneer het opnieuw wordt gebruikt verloopt de omzetting zonder dat inhibitie van de activiteit van het enzym optreedt).

De hoeveelheid van het organische oplosmiddel, die bij het extraheren van bet niet-omgezette indool wordt gebruikt, varieert en is af-30 hankelijk van de verdelingsverhouding van indool tussen de organische oplosmiddelfase en de waterfase en ook van de mate van omzetting van -- indool. Aangezien enzymen met vastgestelde specifieke activiteiten echter in de handel verkrijgbaar zijn ai de mate van omzetting constant is, kan de hoeveelheid van het bij de extractie gebruikte organische 35 oplosmiddel gemakkelijk worden bepaald.

Er is geen bijzondere beperking ten aanzien van de werkwijze voor het extraheren van het niet-omgezette indool en deze kan op gebruikelijke wijze worden uitgevoerd. In het algemeen wordt een geschikte hoeveelheid van het organische oplosmiddel aan het reactiemengsel, waaruit 40 het enzym is verwijderd, toegevoegd en het enzym wordt geroerd om de 0 3 0 4 ; Γ ' __' V Ψ 10 waterfase volledig met de organische fase .in.-aanraking te brengen. Zoals boven reeds is vermeld, verdient het de voorkeur het reactiemengsel in een zodanige toestand te houden, dat L-tryptofaankristallen niet precipiteren. Op industriële schaal is het doelmatig de extractie uit 5 te voeren, terwijl wordt verhit teneinde de oplosbaarheid van L-trypto-faan in water te verhogen. Na het gelijkmatig in aanraking brengen van de twee fasen op de boven beschreven wijze, laat men het mengsel staan teneinde de scheiding in een waterfase en een organische oplosmiddelfa-se plaats te laten vinden. De werkwijze voor het extraheren kan la-10 dingsgewijs worden uitgevoerd maar op industriële schaal wordt deze " continu uitgevoerd volgens een in tegenstroom uitgevoerde extractiemethode.

Het organische oplosmiddel, dat het geëxtraheerde, niet-omgezette indool bevat, wordt opnieuw gebruikt bij de volgende omzetting nadat, 15 indien vereist, een verse hoeveelheid van het oplosmiddel is toegevoegd of is gemengd met een ander oplosmiddel of vers indool is toegevoegd.

Deze werkwijze is van grote industriële betekenis aangezien het niet-omgezette indool op doelmatige wijze kan worden teruggewonnen, zelfs wanneer de omzetting van indool variabel is door fluctuaties van 20 de specifieke activiteit van het enzym, hetgeen vaak optreedt bij enr-zymreacties. Bovendien kan de omzetting worden uLtgevoerd zonder dat inhibitie van van de activiteit van het enzym optreedt, zelfs wanneer het indool, zoals het wordt geëxtraheerd en teruggewonnen, als zodanig wordt gebruikt.

25 Indien de boven beschreven werkwijze voor het terugwinnen wordt toegepast, kan het niet-omgezette indool ook uit een L-tryptofaan bevattend reactiemengsel, dat volgens een gebruikelijke werkwijze is verkregen, op effectieve wijze worden geëxtraheerd en teruggewonnen.

Volgens de uitvoeringsvorm (B) wordt het reactiemengsel, dat het 30 gevormde L-tryptofaan, het niet-omgezette materiaal, het organische oplosmiddel en het enzym bevat, eerst gescheiden in een organische oplos-middelfase en een waterfase. De organische oplosmiddelfase, die het niet-omgezette materiaal bevat, wordt teruggewonnen. Vervolgens wordt het enzym uit de waterfase, dat wil zeggen het L-tryptofaan bevattende^ 35 reactiemengsel, verwijderd teneinde L-tryptofaan te verkrijgen. Wanneer het enzym en het organische oplosmiddel samen in het reactiemengsel aanwezig zijn, wordt het grensvlak tussen d§ waterfase en de organische oplosmiddelfase soms onduidelijk en kan de scheiding van de fasen moeilijk worden. In een dergelijk geval kan de scheiding volgens een beken-40 de methode worden uitgevoerd, bijvoorbeeld door het reactiemengsel te 83 0 4·?

V

11 onderwerpen aan een scheiding met behulp van: een centrifuge. Indien de extractie en de scheiding worden herhaald onder toepassing vap. het ger-bruikte organische oplosmiddel, neemt het effect van de verwijdering van indool toe.

5 Bij de werkwijze voor het scheiden kan L-tryptofaan in de water bevattende oplossing als kristallen precipiteren, maar het effect van het extraheren van het niet-omgezette indool is beter indien het zich in de opgeloste toestand bevindt.

Het is gewenst dat de temperatuur op het moment van de scheiding 10 beneden de kooktemperatuur van het organische oplosmiddel, en indien water en het organische oplosmiddel een azeotroop vormen, beneden het kookpunt ervan ligt. De afgescheiden en teruggewonnen indooloplossing kan zonder enig probleem direct bij de volgende omzetting worden gebruikt.

15 Er is geen bijzondere beperking ten aanzien van de werkwijze voor het verwijderen van het enzym uit het reactiemengsel nadat de organische oplosmiddelfase, die het niet-omgezette indool bevat, is afgescheiden. Een werkwijze voor het verwijderen, die op industriële schaal doelmatig is, omvat het toevoegen van een anorganisch zuur aan het 20 reactiemengsel, dat wordt verkregen na verwijdering van de organische oplosmiddelfase, waarbij de pH van het mengsel wordt ingesteld op 2-5, indien vereist het verhitten om uitvlokken van het enzym te bevorderen en het verwijderen van de uitgevlokte massa door filtratie of andere methoden. L-tryptofaan kan worden verkregen door concentreren van het 25 reactiemengsel, waaruit het enzym op dergelijke wijze is verwijderd.

Volgens de boven beschreven werkwijze beweegt het niet-omgezette indool in het reactiemengsel op doelmatige wijze naar het organische oplosmiddel. Het organische oplosmiddel, dat het niet-omgezette indool bevat, kan bij de volgende omzetting worden gebruikt nadat, indien ver-30 eist, een verse hoeveelheid oplosmiddel of een verse hoeveelheid indool is toegevoegd.

Deze werkwijze voor het terugwinnen is om dezelfde reden als vermeld bij de uitvoeringsvorm (A) in het bijzonder toepasbaar bij de pro-duktie van L-tryptofaan volgens een enzymreactie onder toepassing van 35 indool als een substraat*

De werkwijze volgens de uitvinding is van grote industriële betekenis omdat L-tryptofaan met een grote zuiverheid vrij van indool kan worden verkregen en het als uitgangsmateriaal gebruikte indool teruggewonnen en opnieuw gebruikt kan worden.

40 In de volgende voorbeelden wordt de uitvinding nader toegelicht.

83 0 4'·:'.

_ '

V

f 12

Voorbeeld I

In een kolf van 300 ml, die was voorzien van een roerder, werden 9,27 g L-serine, 3 g ammoniumsulfaat, 10 mg pyridoxalfosfaat en 82,5 g water gebracht en deze materialen werden goed geroerd. De pH van het 5 mengsel werd met geconcentreerde ammonia ingesteld op 8,5 en de temperatuur werd verhoogd tot 35 eC. 3 g van een natte crèmesachtige koek van gekweekte cellen van Escherichia coli (MT-10242), die tryptofaan-syn-thetase bevatte, werden toegevoegd. Vervolgens werden 68,9 g van een acetyltributylcitraatoplossing van 6,89 g indool toegevoegd. De omzet-10 ting werd gedurende 48 uren uitgevoerd en het reactiemengsel werd tot een totaal volume van 300 ml verdund met een 5 gew.procents natriumhydroxide^ oplossing in water, waarbij het gevormde L-tryptofaan volledig oploste. De oplossing werd met een scheitrechter in een waterfase en een organische oplosmiddelfase gescheiden. Een deel van de waterfase 15 werd met een centrifugale afscheider gecentrifugeerd, waarbij de micro-bi'éle cellen werden afgezet. De heldere bovenstaande vloeistof werd verzameld en de concentratie van L-tryptofaan werd geanalyseerd door vloeistof-chromatografie en de verkregen hoeveelheid ervan werd bepaald. De opbrengst van het produkt, betrokken op indool, was 96,5 20 mol.%.

De boven beschreven werkwijze werd herhaald, behalve dat de gebruikte hoeveelheid van het organische oplosmiddel werd gevarieerd en de verdelingsverhouding in de waterfase werd gevarieerd. De resultaten worden aangegeven in tabel A.

25 Wanneer de boven beschreven omzetting werd uitgevoerd zonder toe voeging van het organische oplosmiddel, was de concentratie van indool in de micro-organisme bevattende vloeistof 3000 dpm en de opbrengst aan L-tryptofaan 47 mol.%. Uit dit experimentele feit blijkt, dat het voor de produktie van L-tryptofaan belangrijk is een met water niet-mengbaar 30 organisch oplosmiddel toe te voegen en de concentratie van indool in de micro-organisme bevattende vloeistof laag te houden. In het bijzonder, wanneer de omzetting werd uitgevoerd in water zonder toevoeging van een organisch oplosmiddel, werd de concentratie van indool in de waterfase 3000 dpm en was de opbrengst aan L-tryptofaan 47 mol.%, betrokken op 35 indool. Wanneer daarentegen butylcitraat als het organische oplosmiddel werd toegevoegd en de concentratie van indool in de waterfase werd gehandhaafd bij 790 dpm, werd de opbrengst aan L-tryptofaan op aanzienlijke wijze verhoogd tot 95 mol.%, betrokken op indool. Wanneer de concentratie van indool in de waterfase werd gehandhaafd bij 1070 dpm (ho-40 ger dan 800 dpm), nam de opbrengst aan L-tryptofaan met ongeveer 10% af 8 3 0 : ·· - ·' 13 in vergelijking met de opbrengst, die werd verkregen bij een indpolcon-centratie van 800 dpm.

Voorbeeld_II

6,8 g (vaste stofgehalte 1,7 g) van een natte, crème-achtige koek 5 van Escherichia coli (MT-10242), die tryptof aan-synthetase bevat, en '3,4 g (vaste stofgehalte 0,85 g) serine-racemase bevattend Pseudomonas putida (MT-10182) werden gesuspendeerd in water en het totale volume van de suspensie werd ingesteld op 20 ml.

Een water bevattende oplossing, bestaande uit 11,3 g DL-serine, 10 6,0 g ammoniumsulfaat, 10 mg pyridoxalfosfaat en 66 g water werden in een kolf van 300 ml gebracht en de pH van de water bevattende oplossing werd met geconcentreerde ammonia ingesteld op 8,5 en de eerder bereide microbi’éle celsuspensie werd in de kolf gebracht.

De inhoud van de kolf werd bij 35eC gehouden en 57,2 g van een to-15 lueenoplossing van 11,5 g indool werden toegevoegd en de omzetting werd gedurende 48 uren bij deze temperatuur uitgevoerd. Bij het begin van de omzetting was de concentratie van indool in de waterfase 720 dpm.

Het reactieprodukt werd volgens dezelfde werkwijze als in voorbeeld I geanalyseerd. Er werd gevonden, dat L-tryptofaan was verkregen 20 in een opbrengst van 89,3 mol.%, betrokken op indool. -

Teneinde het effect van de concentratie van indool in de waterfase te bepalen, werd de boven beschreven werkwijze herhaald, behalve dat de gebruikte hoeveelheid tolueen werd gevarieerd. De opbrengst aan L-tryp-tofaan bij deze proeven wordt aangegeven in tabel B.

25 Uit de resultaten blijkt, dat de inhibitie-concentratie van indool in de waterfase ongeveer 800 dpm is. Het blijkt, dat wanneer de omzetting werd begonnen bij een indoolconcentratie van niet meer dan 720 dpm, de opbrengst aan L-tryptofaan ongeveer 90 mol.% was, maar deze afnam tot 82 mol.%, wanneer de omzetting werd begonnen bij een indoolcon-30 centratie van 920 dpm.

Voorbeeld III

Volgens dezelfde werkwijze als in voorbeeld II werden DL-serine en indool omgezet bij aanwezigheid van gekweekte cellen van Escherichia coli (MT-10232) en gekweekte cellen van Pseudomonas punctata 35 (MT-10243).

Hierbij werd methylisobutylketon als het organische oplosmiddel gebruikt en de omzetting werd zodanig uitgevoerd, dat de concentratie van indool in de waterfase bij het begin van de omzetting werd ingesteld op 760 dpm.

40 Na het uitvoeren van de omzetting bij 35°C gedurende 48 uren was 83 0 h !·. '·· ··' * % * 14 de opbrengst aan L-tryptofaan 98,6 mol.%,.betrokken op indool

Voor het bepalen van het effect van de Jndoolconcentratie in de waterfase werd de hoeveelheid methylisobutylketon gevarieerd en werden de veranderingen van de opbrengst van L-tryptofaan onderzocht. De re-5 sultaten worden aangegeven in tabel C.

Uit de resultaten blijkt, dat door het handhaven van de concentratie van indool in de waterfase beneden 800 dpm onder toepassing van methylisobutylketon, L-tryptofaan kan worden verkregen in een opbrengst van meer dan 99 mol.%.

10 Voorbeeld IV

Volgens dezelfde werkwijze als in voorbeeld II werden DL-serine en indool omgezet bij aanwezigheid van Escherichia coli (MT-10242) en Pseudomonas putida (MT-10182). Onder toepassing van anisool als oplosmiddel werd de concentratie aan indool in de waterfase beneden 300 dpm 15 gehouden.

Na een omzetting bij 35°C gedurende 48 uren was de opbrengst aan L-tryptofaan, betrokken op indool, 95 mol.%.

Voorbeeld V

20 g DL-serine, 1,0 g ammoniumacetaat, 0,2 g natriumwaterstofsul-20 faat, 0,1 g DETA en een kweekvloeistof met Erwinia herbicola (ATCC 21434) werden in een reactievat van 200 ml gebracht.

De kweekvloeistof was verkregen door kweken van Erwinia herbicola gedurende 28 uren bij 28eC, terwijl werd ge'éereerd, in een kweekmedium, bestaande uit 0,2 gew.% L-tyrosine, 0,2 gew.% K2HPO4, 0,1 gew.% 25 MgSO^.y^O, 2 dpm FeSO^71^0, 0,01 gew.% pyridoxine-hydrochlo- ride, 0,6 gew.% glycerol, 0,5 gew.% barnsteenzuur, 0,1 gew.% DL-methio-nine, 0,2 gew.% DL-alanine, 0,05 gew.% glycine, 0,1 gew.% L-fenylalani-ne en 12 ml van een hydrolysaat van sojaboonproteïne.

Een 0,7 g pyrocatechol bevattende oplossing in tolueen werd toege-30 voegd en de concentratie van pyrocatechol in water werd ingesteld tot minder dan 3000 dpm. Onder deze omstandigheden werd de omzetting gedurende 48 uren bij een temperatuur van 37°C en een pH van 8 uitgevoerd.

De geaccumuleerde hoeveelheid L-D0PA was 30 g/liter.

Voorbeeld VI

35 Escherichia coli bevattende microbi'éle cellen werden bij een tem peratuur van 30°C en een pH van 7 gekweekt bij aanwezigheid van monoka-liumfosfaat, dikaliumfosfaat, ammoniumsulfaat, calciumchloride, ijzer-sulfaat, gistextract en polypepton, terwijl in het kweekmedium lucht werd geblazen en glucose en indool werden toegevoegd. Verder werden 40 Pseudomonas putida bevattende microbi’éle cellen in een soortgelijk

8 3 0 4 4 S S

v *

3 V

15 kweekmedium bij een temperatuur van 30 °C en .een pH van 7 gekweekt, terwijl in het kweekmilieu lucht werd geblazen en glucose werd toegevoegd.

In verloop van 40 uren waren deze microbi'éle cellen in een concentratie van 30-35 g/liter gevormd. Met een bij zeer hoge snelheid werkende cen-5 trifugale afscheider werden ze verkregen als crème-achtige koeken met een. watergehalte van 85-85%.

DL-serine (77,3 g), 10,5 g ammoniumsulfaat en 486 g water werden in een kolf gebracht en de pH van het mengsel werd met 29 gew.procents ammonia ingesteld op 8,5. Verder werden 51,2 g van de crème-achtige 10 koek van Escherichia coli en 23,2 g van de crème-achtige koek van

Pseudomonas putida toegevoegd en het gehele mengsel werd goed geroerd.

Verder werden 392 g van een oplossing van 78,4 g indool in tolueen toegevoegd en de omzetting werd gedurende 40 uren bij 35°C uitgevoerd. Het gehalte aan L-tryptofaan in de reactiemassa bleek volgens vloeistof-15 chromatografie 129,8 g te zijn. De opbrengst ervan was 95,0%, betrokken op indool.

Tolueen werd door destillatie verwijderd en het reactiemengsel werd met water verdund, waarbij de concentratie van L-tryptofaan werd ingesteld op 4,2 gew.%. De pH van het mengsel werd met 98 gew.procents 20 zwavelzuur ingesteld op 4,0 en 27 g geactiveerde kool werden toegevoegd. De temperatuur werd verhoogd tot 95°C en het mengsel werd gedurende 1 uur op een temperatuur van 95-98ÖC gehouden en bij deze temperatuur gefiltreerd teneinde de cellen tezamen met de geactiveerde kool te verwijderen. Bij 80eC werd het teruggewonnen tolueen aan het fil-25 traat toegevoegd en het mengsel werd goed geroerd. Vervolgens stopte men het roeren en liet men het mengsel staan. Het mengsel werd gescheiden in een bovenste tolueenlaag en een onderste waterlaag. De tolueen-laag werd verwijderd en dezelfde hoeveelheid tolueen als in het vorenr-staande werd weer aan de waterlaag toegevoegd en de extractie werd her-30 haald.

De concentratie van indool in de waterlaag was na de eerste extractie 55 dpm en na de tweede extractie 4 dpm.

De waterlaag werd geconcentreerd tot de L-tryptofaanconcentratie 10 gew.% was en vervolgens werd af gekoeld tot 20 °C. De geprecipiteerde 35 L-tryptofaankristallen werden verzameld door filtratie, gewassen met water en gedroogd. De geïsoleerde hoeveelheid L-tryptofaan was 100 g.

Het bezat een zuiverheid van 99,5% en een indoolgehalte van 0 dpm. Wanneer de teruggewonnen tolueenoplossing van indool na aanvullen van extra tolueen bij de volgende omzetting werd gebruikt, trad geen effect 40 met betrekking tot de opbrengst aan L-tryptofaan op en de omzetting 8304495 j * 16 * verliep vlot. -

De resultaten worden aangegeven in tabel D.

316 g van elk van de reactiemengsels met 500 dpm en 2000 dpm niet-omgezet indool werden bij 80°C geëxtraheerd met 27,6 g indool en de re-5 latie tussen het aantal extracties en de concentratie van in de waterfase achtergebleven indool werd onderzocht. De resultaten worden aangegeven in tabel E.

Voorbeeld VII

L-tryptofaan werd geproduceerd door omzetting van L-serine en in-10 dool in water en diisobutylketon bij een temperatuur van 35eC en een pH van 8,5 bij aanwezigheid van Escherichia coli cellen, die volgens de werkwijze van voorbeeld VI waren gekweekt. De opbrengst aan L-tryptofaan was 98,3%, betrokken op indool.

Het reactiemengsel werd gedestilleerd om diisobutylketon te ver-15 wijderen en vervolgens met een centrifugale afscheider behandeld, waarbij een vochtige crème-achtige koek werd verkregen, die L-tryptofaan en de microbiële cellen bevatte.

De crème-achtige koek werd in water gebracht en met water verdund tot de L-tryptofaanconcentratie 0,8 gew.% was. De L-tryptofaankristal-20 len werden opgelost in water en de oplossing werd bij kamertemperatuur door een ultrafiltratiemembraan geleid teneinde de microbiële cellen te verwijderen. Op dit moment was de indoolconcentratie in de waterfase 90 dpm. Diisobutylketon werd in een hoeveelheid van eenvijfde van de hoeveelheid van de waterfase toegevoegd en het mengsel werd geroerd. Men 25 liet het mengsel staan, waarbij een scheiding in twee lagen optrad. De diisobutylketonlaag werd verwijderd. Vervolgens werd dezelfde extractie herhaald onder toepassing van dezelfde hoeveelheid diisobutylketon als bij de voorafgaande behandeling.

De indoolconcentratie in de waterlaag was na de eerste extractie 30 32 dpm en na de tweede extractie 2 dpm.

De indool bevattende diisobutylketonlaag werd na aanvullen van een vereiste hoeveelheid indool bij de volgende omzetting gebruikt. Bij de volgende omzetting traden geen problemen op.

Voorbeeld VIII

35 L-tryptofaan werd bereid door omzetting van DL-serine en indool bij een pH van 8,5 en een temperatuur van 35 °C gedurende 48 uren in water en benzeen bij aanwezigheid van Escherichia coli en Pseudomonas punctata, die volgens de werkwijze van voorbeeld VI waren gekweekt en verzameld. De opbrengst aan L-tryptofaan was 93,7%, betrokken op in-40 dool.

8304455 17

Het reactiemengsel werd vervolgens gedestilleerd cm benzeen te verwijderen en vervolgens met water verdund tot de L-tryptofaanconcen-tratie 4,2 gew.% was. Het verdunde mengsel werd met waterstofchloride ingesteld op pH 3,5 en 15 gew.% geactiveerde kool, betrokken op het ge-5 vormde tryptofaan, werden toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 1 uur op 95-98°C verwarmd. Het werd bij dezelfde temperatuur in verloop van 1 uur door een filter geperst. Aan het filtraat werd bij 80°C benzeen toegevoegd. Het mengsél werd goed geroerd en vervolgens liet men het staan, waarbij een scheiding in lagen optrad. Het gebruikte benzeen was 10 het benzeen, dat op de boven beschreven wijze door destillatie was teruggewonnen. Dezelfde extractie werd driemaal herhaald onder toepassing van dezelfde hoeveelheid vers benzeen. De indoolconcentratie in de war· terfase was voor de extractie 1850 dpm, na de eerste extractie 265 dpm, na de tweede extractie 43 dpm en na de derde extractie 4,6 dpm. Na con-15 centreren en kristalliseren van het reactiemengsel werd L-tryptofaan met een zuiverheid van 99,7% in een opbrengst van 69,8%, betrokken op indool, verkregen. Het indoolgehalte ervan was 2,1 dpm.

De teruggewonnen benzeenoplossing van indool werd na toevoegen van een vereiste hoeveelheid vers indool bij de volgende omzetting ge-20 bruikt. Bij de volgende omzetting traden geen problemen op.

Voorbeeld IX

Een water bevattende oplossing, bestaande uit 11,3 g DL-serine, 6,0 g ammoniumsulfaat, 10 mg pyridoxalfosfaat en 66 g gedestilleerd water werd bij 35°C in een kolf van 300 ml goed geroerd en 29 gew.pro-25 cents ammonia werd toegevoegd, waarbij de pH van de oplossing werd ingesteld op 8,5.

Vervolgens werden 4,0 g van een cellen bevattende cr^ie^achtige koek met Escherichia coli, die op dezelfde wijze als in voorbeeld VI was gekweekt, en 2,5 g van een cel bevattende crème-achtige koek met 30 Pseudomonas putida, die op dezelfde wijze als in voorbeeld VI was gekweekt, toegevoegd en bij 35°C goed geroerd teneinde de toegevoegde mar terialen te dispergeren.

Verder werd een oplossing van 11,5 g indool in 26,8 diisobutylke-ton toegevoegd en het mengsel werd gedurende 40 uren bij 35°G en 90 orn-35 wentelingen per minuut geroerd.

Na de omzetting werd het roeren gestopt. Men liet het reactiemengsel staan, waarbij een scheiding in twee lagen optrad. De bovenste di~ isobutylketonlaag werd verwijderd. Diisobutylketon werd in dezelfde hoeveelheid als in het vorenstaande toegevoegd en het mengsél werd ger 40 durende 30 minuten bij 90 omwentelingen per minuut geroerd. Men liet 8304455 ---------*— 18 het mengsel staan en de diisobutylketonlaag .werd op. dezelfde wijze, als In het vorenstaande teruggewonnen.

Het niet-omgezette indool, dat aan het eind van de omzetting in het reactiemengsel achterbleef, bleek in een hoeveelheid van 85% door 5 de eerste extractie met diisobutylketon en in een hoeveelheid van 99% door de tweede extractie te worden teruggewonnen. De hoeveelheid indool werd geanalyseerd door gaschromatografie.

Wanneer het teruggewonnen diisobutylketon na aanvullen van een vereiste hoeveelheid indool bij de volgende omzetting werd gebruikt, 10 traden geen problemen op.

Voorbeeld X

Dezelfde omzetting als in voorbeeld IX werd uitgevoerd bij een rotatie snel heid van 640 dpm onder toepassing van 45,7 g tolueen. Na de omzetting werd het reactiemengsel in een centrifugale afscheider behan-15 deld ter verkrijging van een grensvlak tussen twee afzonderlijke lagen aangezien het reactiemengsel een uniforme emulsie was.

De bovenste tolueenlaag werd verwijderd. Vervolgens werd tolueen in dezelfde hoeveelheid toegevoegd en werd de extractie van het niet-omgezette indool herhaald.

20 Het niet-omgezette indool, dat aan het eind van de omzetting in het reactiemengsel aanwezig was, bleek in een hoeveelheid van 87% door de eerste extractie en in een hoeveelheid van 99,9% door de tweede extractie te worden teruggewonnen.

Het indool bevattende teruggewonnen tolueen werd na aanvullen van 25 een vereiste hoeveelheid indool bij de volgende omzetting gebruikt. Bij de volgende omzetting traden geen problemen op.

Voorbeeld XI

Dezelfde omzetting als in voorbeeld IX werd uLtgevoerd onder toepassing van 14,3 g ethylcitraat. Na de omzetting werd het reactiemeng-30 sel in de vorm van een uniforme emulsie in een continu werkende centrifugale afscheider behandeld teneinde het reactiemengsel in een water-laag en een ethylcitraatlaag te scheiden. Aan de waterlaag werd dezelfde hoeveelheid ethylcitraat toegevoegd als bij de omzetting was gebruikt en het mengsel werd opnieuw gescheiden in een waterlaag en een 35 organische laag door een behandeling in een continu werkende centrifugale afscheider.

Een deel van de waterlaag werd onderzocht en het gevormde trypto-faan werd geanalyseerd met behulp van hoge-druk-vloeistof-chromatogra-fie. De opbrengst bleek 99,7% te zijn, betrokken op indool.

40 Het reactiemengsel werd met water verdund tot de L-tryptofaancon- 8 3 0 4 4 * !5 «» Λ.

19 centratie 4,2 gew*% bedroeg en met zwavelzuur Ingesteld op pH "3,5. Gepoederde geactiveerde kool werd toegevoegd in een hoeveelheid-van 15 gew.%, betrokken op L-tryptofaan, en het mengsel werd gedurende 1 uur bij 90°C verhit. Nadat de L-tryptofaankristallen volledig waren opge-5 lost, werd de oplossing bij dezelfde temperatuur onder afzuiging gefiltreerd teneinde de microbiële cellen tezamen met de geactiveerde kool te verwijderen.

Het hete filtraat werd geconcentreerd totdat de L-tryptofaancon-centratie 10 gew.% bedroeg, en afgekoeld tot 10°C. De pH van de oplos-10 sing werd vervolgens ingesteld op 5,9 en de geprecipiteerde schilferachtige kristallen werden afgescheiden door filtratie, gewassen met water en gedroogd.

De opbrengst van het geïsoleerde L-tryptofaan was 74,5 mol.%, betrokken op indool. Het bezat een zuiverheid van 99,4% en een indoolge-15 halte van 1,2 dpm.

Het indool bevattende teruggewonnen ethylcitraat werd na aanvullen van een vereiste hoeveelheid indool bij de volgende omzetting gebruikt. Dit had geen invloed op de opbrengst aan L-tryptofaan bij de volgende omzetting en de omzetting verliep goed.

20 Voorbeeld XII

Escherichia coli bevattende cellen en Pseudomonas putida bevattende cellen werden op dezelfde wijze als in voorbeeld IX gekweekt en in een snelwerkende centrifugale afscheider behandeld, waarbij cellen bevattende crème-achtige koeken van de twee micro-organismen, elk met een 25 watergehalte van 75 gew.%, werden verkregen.

Een water bevattende oplossing, bestaande uit 77,3 g DL-serine, 10,5 g ammoniumsulfaat en 486 g water werden met 29 gew.procents ammonia ingesteld op een pH van 8,5 en 51,2 g van de cellen bevattende crè-me-achtige koek van Escherichia coli en 23,2 g van de cellen bevattende 30 crène-achtige koek van Pseudomonas putida, die op de boven beschreven wijze waren verkregen, werden toegevoegd. Ze werden gedispergeerd door krachtig roeren en 392 g van een tolueenoplossing van 78,4 g indool werden toegevoegd. De omzetting werd gedurende 48 uren bij 35°G uitgevoerd .

35 Na de omzetting werd een deel van het reactiemengsel genomen en met behulp van een centrifugale afscheider in een tolueenlaag en een waterlaag gescheiden. L-tryptofaan werd opgelost door toevoeging van een base aan de waterlaag, waarin kristallen van L-tryptofaan waren neergeslagen. Vervolgens werd de waterlaag door een membraanfliter ge-40 leid om de microbiële cellen te verwijderen. Het filtraat werd aan ho- 8304455 * 20 * « ge-druk-vloeistof-chromatografie onderworpen om L-tryptofaan te analyseren. De opbrengst aan L-tryptofaan In het reactiemengsel bleek 99,3 mol.%, betrokken op indool te zijn.

Er werd nog een deel van het reactiemengsel genomen en met behulp 5 van een centrifugale afscheider in een waterlaag en een tolueenlaag gescheiden. De concentratie van het in tolueen aanwezige niet-omgezette indool, gemeten door gaschromatografie, was 2,3 dpm.

Wanneer de indool bevattende tolueenoplossing na toevoeging van een vereiste hoeveelheid vers tolueen bij de volgende omzetting werd 10 gebruikt, werd geen invloed uitgeoefend op de opbrengst aan L-tryptofaan en de omzetting verliep vlot.

De resultaten worden weergegeven in tabel F.

De door centrifugale afscheiding teruggewonnen waterlaag werd met water verdund totdat de L-tryptofaanconcentratie 4,2 gew.% was, en met 15 98 gew.procents zwavelzuur ingesteld op een pH van 4,0. Gepoederde ge activeerde kool (27 g) werd toegevoegd en de temperatuur van het mengsel werd verhoogd tot 98 QC. Het mengsel werd vervolgens gedurende 1 uur bij 98-100°C gehouden teneinde de geprecipiteerde kristallen van L-tryptofaan op te lossen.

20 De microbi'éle cellen werden tezamen met de geactiveerde kool door filtratie in hete toestand verwijderd. Het filtraat werd geconcentreerd tot de L-tryptofaanconcentratie 15 gew.% was, waarbij schilferachtige kristallen van L-tryptofaan precipiteerden. De kristallen werden afgescheiden door filtratie bij 10eC, gewassen met water en gedroogd, wat 25 lichtgele schilferachtige kristallen van L-tryptofaan met een zuiverheid van 99,2% in een opbrengst van 81,3 mol.%, betrokken op indool, opleverde. De gevormde L-tryptofaankristallen hadden een specifieke rotatie van -31,8°, een gehalte aan zware metalen van minder dan 20 dpm, een gloeirest van 0,02 gew.% en een ammoniumgehalte van 0,01 gew.%.

8304a?3 » _ > * * 21

Tabel A

Gebruikte hoe- Indoolconcen- Indoolconcen— Opbrengst aan' veelheid (g) tratie (gew.%) tratie (dpin) L-tryptofaan van bet orga- in de oplossing in de enzym (molbe- nische oplos- la het organi- bevattende trokken op middel (*1) sche oplosmid- vloeistof indool) _del (*1)_(*2)_ 68,9 10 160 96,5 34,45 20 400 96,3 27,56 25 520 95,8 22,97 30 660 96,2 19,69 35 7 90 95,0 15,31 45 1070 86,3 - (*3) - 3000 47 (*1): ac etyltributylcitraat (*2): in het vroege stadium van de omzetting (*3): hier werd geen organisch oplosmiddel toegevoegd.

Tabel B

Hoeveelheid Indoolconcen- Indoolconcen- Opbrengst aan van de tratie in de tratie in de L-tryptofaan tolueen- tolueenoplos- waterfase in het (mol.%, be- oplossing sing (gew.Z) - vroege stadium trokken op (g) van de omzet- indool) ____ting (dpm)________ 115 10 450 91,2 57,5 20 720 89,3 38,3 30 920 82,4 33044v5 -^— ---> * r 22

Tabel G

Hoeveelheid Indoolconcen- Indoolconcen- Opbrengst aan’ van de tratie in de tratie in de L-tryptofaan keton- ketonoplos- · waterfase in het (mol.%, be- oplossing sing (gew.%) vroege stadium trokken op (g) van de omzet- indool) _ting (dpm)_ 115 10 80 99,8 57,5 20 190 99,9 38,3 30 340 99,8 28,75 40 510 99,6 23,0 50 720 98,6

Tabel D

Aantal maal hergebruik Opbrengst aan van de geëxtraheerde L-tryptofaan tolueenlaag (mol.%, betrokken _op indool)_ 0 95,0 1 98,3 2 98,6 3 97,0 4 95,4 « 5 98,7 ? 3 ) 4 4 δ 5

V

m to 23

Tabel E

Indoolconcetr* Aantal Ind oo 1 c one en— tratie in de extracties tratie in waterfase in het water na vroege stadium extractie van de omzet- (dpm) ting (dpm)_ 2000 1 299 299 2 54 54 3 9,8 500 1 45 45 2 18 18 3 3

Tabel F

Aantal maal hergebruik Opbrengst aan van de teruggewonnen L-tryptofaan tolueenlaag (mol.%, betrokken _op indool)_ 0 99,3 1 98,5 2 98,9 3 99,2 4 98,2 5 99,4 *304495 ______ _*

Claims (1)

11. Ifl l- ,i 8304493