DK169947B1

DK169947B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af L-tryptophan samt til fremstilling af vandige indolopløsninger til brug herved

Info

Publication number: DK169947B1
Application number: DK248789A
Authority: DK
Inventors: Shinji Ogawa; Seiya Iguchi; Hiroshi Kimura; Hideharu Kuwamoto
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date: 1987-09-25
Filing date: 1989-05-23
Publication date: 1995-04-10
Also published as: US5085991A; DK248789D0; EP0333877A1; DK248789A; EP0333877B1; EP0333877A4; KR890701754A; KR920008598B1

Description

DK 169947 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af L-tryptophan samt til fremstilling af vandige indolopløsningertil brug herved.

Der kendes forskellige fremgangsmåder til syntese af forbindelser ved en enzymreaktion, hvor 5 man gør brug af indol som substrat for enzymet. Et typisk eksempel på en sådan fremgangsmåde er en fremgangsmåde til syntese af L-tryptophan ud fra indol og L-serin under anvendelse af tryptophansynthetase, og denne fremgangsmåde udføres nu industrielt.

Normalt fremstilles indol ved en kemisk syntese eller ved fraktioneret destillation af kultjære, 10 og indol fremstillet ved en sådan fremgangsmåde indeholder normalt substituerede indoler såsom ethylindol og andre aromatiske forbindelser som urenheder. Nogle af disse urenheder inhiberer eller desaktiverer endog enzymet fuldstændigt, hvis de forekommer i reaktionsblandingen. Til uforstyrret gennemførelse af enzymreaktionen må disse urenheder derfor ikke forekomme i reaktionsblandingen, ligesom de ikke må ophobes i reaktionsblandingen.

15

For de fleste enzymer, som benyttes i enzymreaktioner, er vand det bedste opløsningsmiddel. Derfor udføres de fleste enzymreaktioner i vandig opløsning. Da endvidere de fleste enzymer udviser høj aktivitet ved en temperatur på 15-50°C, udføres enzymreaktioner normalt i dette temperaturområde.

20

Imidlertid er indol uopløseligt i vand, idet dets opløselighed i vand ved stuetemperatur kun er 3-4 gram pr. liter. 1 enzymreaktioner, hvor man benytter indol som udgangsmateriale, er det derfor ikke let at fremstille og tilvejebringe en vandig indoiopløsning, navnlig ikke kvantitativt.

25 Konventionelle fremgangsmåder til fremstilling af vandige opløsninger omfatter en fremgangsmåde, hvor fast indolpulver opløses i vand eller i vandig opløsning, som allerede indeholder indol, ved kraftig omrøring til fremstilling af en vandig indoiopløsning, og det uopløste indol fjernes ved fraskillelse af fast stof fra væsken; en fremgangsmåde består i, at man fremstiller en indoiopløsning ved opløsning af indol i et opløsningsmiddel, som er blandbart med 30 vand, fx en lavmolekylær aliphatisk alkohol såsom methanol, hvorpå indolopløsningen blandes med vandig indoiopløsning.

Ved disse fremgangsmåder sikres den kvantitative karakter af indolkoncentrationen i den vandige opløsning. Når imidlertid industrielt fremstillet råt indol benyttes, opløses de deri inde-35 holdte urenheder også i den vandige opløsning, så at de tilføres enzymreaktionen. Når således råt indol benyttes ved ovennævnte konventionelle fremgangsmåder, foretages der ikke rensning af indolet, så at denne fremgangsmåde er mindre ønskværdig til brug ved enzymreaktio-nen. I de tilfælde, hvor man benytter et opløsningsmiddel, som er blandbart med vand, vil op- DK 169947 B1 2 løsningsmidlet i sig selv endvidere denaturere, inhibere eller desaktivere enzymet, så at brugen af et sådant opløsningsmiddel bør undgås.

Man har foreslået en enzymreaktion, hvor indol er substrat, og hvor der benyttes et organisk 5 opløsningsmiddel i reaktionen. Således anviser USA patent nr. 3,926,726 en gennemførelse af en enzymreaktion, hvor substratet for enzymet er praktisk taget uopløseligt i den enzymholdige *· opløsning, i nærværelse af et organisk opløsningsmiddel, som er ublandbart med vand, men blandbart med substratet. Ved denne fremgangsmåde er funktionen af det organiske opløsningsmiddel imidlertid at sikre substratet i praktisk taget samme koncentration som dets mæt-10 ningskoncentration i den vandige fase, hvori reaktionen ved hjælp af enzymet udføres.

GB 2,151,634 A anviser, at man i en enzymreaktion, hvor i det mindste et substrat inhiberer enzymreaktionen, tilsætter et organisk opløsningsmiddel, som er ublandbart med vand, men blandbart med substratet, så at man nedsætter substratkoncentrationen i den vandige fase til et 15 niveau, hvor enzymaktiviteten Ikke inhlberes. I denne beskrivelse anvises en fremgangsmåde til enzymatisk syntese af L-tryptophan under anvendelse af indol som substrat.

Endvidere har Bang et al anvist en fremgangsmåde til syntese af L-tryptophan ud fra indol og L- eller DL-serin under anvendelse af celler af E. coli, hvor indol opløses i et organisk opløs-20 ningsmiddel, som er ublandbart med vand, og indolopløsningen bruges som kilde for indol i enzymreaktionen (Biotechnology og Bioengineering vol. XXV 999-1011,1983).

Disse fremgangsmåder, hvor man benytter et organisk opløsningsmiddel, som er ublandbart med vand, er effektive fremgangsmåder i det tilfælde, hvor et stof såsom indol, som er praktisk 25 taget uopløseligt i vand, er substrat for et enzym. Disse fremgangsmåder omtaler imidlertid slet ikke de urenheder, som ofte belaster indol. Ved disse fremgangsmåder er det organiske opløsningsmiddels rolle derfor at genetablere indolet og at levere det til den vandige fase i en bestemt koncentration ved udførelsen af enzymreaktionen.

30 Ved brug af råt indol med organiske urenheder bør man imidlertid passe på ved udvælgelsen af det organiske opløsningsmiddel. Det har vist sig, at o-ethylanilin eller 3-methylindol, som kan findes i råt indol, inhiberer enzymet tryptophansynthetase, som syntetiserer tryptophan ud fra indol og L-serin, i et niveau på ca. 200 ppm, og 2-ethylindol inhiberer enzymet i en så lav koncentration som ca. 20 ppm. Der findes nogle andre urenheder, som inhiberer enzymet, hvis 35 de forekommer i en høj koncentration på 1000 ppm eller mere.

Selv om det organiske opløsningsmiddel, som er ublandbart med vand, således genetablerer indolet og sikrer tilførslen af indol til den vandige fase i en konstant koncentration, forholder det DK 169947 B1 3 sig pi den måde, at hvis de organiske urenheder fordeles i den vandige fase i samme udstrækning som indol, så vil urenhederne også optræde i enzymreaktionssystemet og inhibere enzymet. Endvidere forholder det sig på den måde, at selv om et organisk opløsningsmiddel har et lavere fordelingsforhold for urenhederne end for indol, så vil der ske det, at da substrat-5 indolet forbruges ved enzymreaktionen, medens urenhederne normalt ikke forbruges ved reaktionen, vil urenhederne ophobes i reaktionssystemet. Hvis man således benytter et organisk opløsningsmiddel, hvis fordeligsforhold for urenhederne i forhold til den vandige fase ikke er tilstrækkelig lille, så er det ikke let at forebygge en inhibering af enzymreaktionen eller en forurening af produktet fra enzym reaktionen, så at det er vanskeligt at styre enzymreaktionen 10 på en glat og tilfredsstillende måde.

Som en foranstaltning til løsning af problemet med forureningerne har man overvejet at rense det rå indol. Skønt indol kan renses ved rektifikation eller omkrystallisation, er imidlertid de fleste urenheder substituerede derivater af indol med fysiologiske egenskaber i lighed med 15 indolets egenskaber, så at den renhed af indolet, som kan opnås ved rensningsoperationen såsom en rektifikation, er begrænset. Blandt rensningsoperationerne er omkrystallisation en egnet fremgangsmåde til opnåelse af indol med høj renhed. Imidlertid er udbyttet af indol lavt, og operationen medfører det problem, at urenhederne ophobes i filtratet. Endvidere er omkostningerne ved omkrystallisationen høje. Således er der behov for en industriel rensnings-20 proces uden omkrystallisation.

Formålet med opfindelsen er at anvise en forbedret fremgangsmåde til fremstilling af L-trypto-phan samt til fremstilling af vandige indolopløsninger til brug herved, og disse formål opnås ved det, der er angivet i den kendetegnende del af henholdsvis krav 1 og 3.

25

Et vigtigt karakteristisk træk er, at kontakten mellem den organiske fase og den vandige fase udføres i fravær af tryptophansynthetase.

Ifølge det tidligere nævnte GB 2,151,634 A udføres en enzymreaktion på en sådan måde, at 30 koncentrationen af en substans i en vandig opløsning, som inhiberer enzymaktiviteten, formindskes ved kontakt mellem et organisk opløsningsmiddel, som opløser substansen mere end vand, og den vandige opløsning. Især anvises en metode til fremstilling af L-tryptophan fra L-serin og indol ved hjælp af tryptophansynthetase.

35 Men ved denne kendte metode bringes det organiske opløsningsmiddel og den vandige opløsning i kontakt i nærværelse af tryptophansynthetase, dvs. enzymreaktionen udføres i nærværelse af et organisk opløsningsmiddel. Som et resultat heraf nedsættes enzymaktiviteten af det organiske opløsningsmiddel. L-serin (eller DL-serin), indol, enzymkilde og et organisk opløs- DK 169947 B1 4 ningsmiddel sættes chargevis til en reaktor. Efter reaktionen fås L-tryptophan i form af en blanding med ikke-omsat L-serin, ikke-omsat indol, enzymkilden og det organiske opløsningsmiddel, og L-tryptophan renses derpå. Da altså enzymkilden og det organiske opløsningsmiddel koeksisterer, er aktiviteten af enzymet alvorligt inhiberet. Og når L-tryptophan akkumuleres t 5 mere end opløseligheden i vand (ca. 2 g/l ved 30°C, pH 7.0), bliver reaktionsblandingen et slam, så at det organiske opløsningsmiddel kun kan fjernes ved destillation. Således er det ^ vanskeligt at få rent L-tryptophan.

Da rensningen af indol ifølge opfindelsen derimod udføres i fravær af tryptophansynthetase, 10 nedsættes aktiviteten af tryptophansynthetase ikke af det organiske opløsningsmiddel. Når endvidere L-tryptophan fremstilles under anvendelse af den rensede indolopløsning fremstillet efter fremgangsmåden ifølge opfindelsen, vil - da vandig renset indolopløsning alene sættes til reaktionssystemet - rensningen af det fremstillede L-tryptophan være let at udføre.

15 Ved en enzymreaktion, hvor indol er substrat for enzymet, vil man konventionelt til opnåelse af en renset vandig indolopløsning til tilføring til reaktionssystemet finde det nødvendigt først at fremstille renset indol ved rektifikation eller omkrystallisation og derpå fremstille en renset vandig indolopløsning. Det forholder sig anderledes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Ikke blot kan der fremstilles en renset vandig indolopløsning ud fra industrielt tilgængeligt råt in-20 dol med lav renhedsgrad under anvendelse af råt indol som udgangsmateriale, men der kan yderligere fremstilles en vandig indolopløsning med en ønsket indolkoncentration med stor lethed og på kvantitativ måde.

Derfor har fremgangsmåden ifølge opfindelsen stor industriel værdi som en fremgangsmåde, 25 hvor en enzymreaktion kan udføres under anvendelse af råt indol som udgangsmateriale, der fremstilles ved kemisk syntese eller på anden måde.

Det rå indol, der benyttes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er fx produkter, som er dannet syntetisk ved omsætning af aniliner og ethylenglykoler i nærværelse af forskellige kata-30 lysatorer, ved katalytisk reaktion af anilinoethanol og o-nitrotoluen eller lignende og ved dehy-dratisering af indolin, samt indol fremstillet ved fraktioneret destillation af kultjære. De organi- ► ske urenheder, som indeholdes i det rå indol, som fås ved disse fremgangsmåder, omfatter fx substituerede indoler såsom 2-methylindol, 3-methylindol, N-methylindol, 2-ethylindol, 3-ethyl-indol og N-ethylindol, cykliske forbindelser såsom 3-methylquinolin og N-phenylpyrrol, substitu- 5 35 erede aniliner og derivater såsom anilin, o-ethylanilin, N-ethylanilin og acetoaldehydanil og o-toluidin og anilinoethanol.

DK 169947 B1 5

Det organiske opløsningsmiddel til opløsning af det rå indol indeholdende sådanne organiske urenheder er et sådant, som er ublandbart med vand, som danner et tofasesystem ved blanding med vand, og som kan opløse indol. For at det organiske opløsningsmiddel ikke skal inhibere enzymreaktionen, er opløsningsmidler, hvis opløselighed i vand er meget lille, de fore-5 trukne opløsningsmidler uden hensyn til, om opløsningsmidlet er aliphatisk eller aromatisk. Foretrukne eksempler på organiske opløsningsmidler omfatter mættede aliphatiske carbonhy-drider såsom pentan, n-hexan, heptan, isooktan og nonan, cycloaliphatiske carbonhydrider såsom cyclohexan og methylcyclohexan, aromatiske carbonhydrider såsom benzen, toluen og xylen, estere såsom butylacetat, butylcitrat og ethylcitrat og ketoner såsom methylisobutylketon 10 og diisobutylketon.

Blandt disse foretrækkes aliphatiske opløsningsmidler frem for aromatiske opløsningsmidler, da denatureringen og inhiberingen af enzymet er mindre.

15 Til opnåelse af en renset vandig indolopløsning udvælges endvidere et organisk opløsningsmiddel, til hvilket urenhederne har en affinitet, som er forskellig fra affiniteten af indol. Man vælger altså et organisk opløsningsmiddel med et fordelingsforhold for urenhederne mellem den organiske fase og den vandige fase, som er større end fordelingsforholdet for indol. Som nævnt ovenfor har de organiske urenheder, som findes i industrielt fremstillet råt indol, et smel-20 tepunkt eller kogepunkt, som er forskelligt fra de tilsvarende værdier for indol. For i høj grad at differentiere fordelingsforholdet for urenhederne og for indol under anvendelse af sådanne forskelle udvælges et organisk opløsningsmiddel, som i det mindste har en høj opløselighed for urenhederne. Således foretrækkes de opløsningsmidler, som har en opløselighedsparameter på 7-9,5 ved den temperatur, hvor reaktionen udføres. I afhængighed af de organiske urenhe-25 der i det rå indol kan der endvidere udvælges et mere egnet organisk opløsningsmiddel. Dette vil sige, at i sådanne tilfælde, hvor det rå indol indeholder sådanne urenheder som 2-methylin-dol og 3-methylindol, som begge har et smeltepunkt og et kogepunkt, som ligger højere end for indol, foretrækkes opløsningsmidler med en opløselighedsparameter (solubility parameter SP) på ca. 8 såsom methylcyclohexan og cyclohexan, medens man i de tilfælde, hvor det rå indol 30 indeholder sådanne urenheder som 2-ethylindol og 3-ethylindol, som har et lavere smeltepunkt end indol, kan opnå tilfredsstillende renseeffekt med sådanne opløsningsmidler med en opløselighedsparameter SP på ca. 7 såsom n-hexan og isooctan. Man kan udvælge et passende opløsningsmiddel til den konkrete industrielle proces under hensyntagen til indflydelsen af opløsningsmidlet på enzymreaktionen, let håndterbarhed og lignende.

35

Den rensede vandige indolopløsning kan fremstilles ved opløsning af det rå indol i ovennævnte organiske opløsningsmiddel, hvorefter man bringer den organiske indolopløsning i kontakt med det vandige reaktionsmedium indeholdende L-serin i praktisk taget fravær af tryptophansynthe- DK 169947 B1 6 tase. På basis af forskellen mellem fordelingskoefficienten for indol og de organiske urenheder mellem den organiske og den vandige fase tilbageholdes næsten alle urenheder i det organiske lag og overføres ikke til den vandige fase, så at den vandige fase bliver en praktisk taget ren vandig indolopløsning, som ikke i væsentlig grad indeholder urenheder, men som 5 indeholder L-serin.

Der er ingen begrænsninger for fremgangsmåden til at bringe den organiske opløsningsmiddelfase og den vandige fase i kontakt med hinanden og sammenblanding. Der kan benyttes apparater såsom en tank med omrører eller en statisk blandeindretning, som normalt benyttes til 10 væske-væske-ekstraktion. Til fremme af overføringshastigheden mellem den organiske og vandige fase foretrækkes apparater, hvor grænsefladearealet mellem de to væsker er stort.

Om fornødent kan adskillelsen mellem faserne ved aflejring også ske i et konventionelt apparat til væske-væske-ekstraktion.

15 Det er endvidere et karakteristisk træk ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, at der kvantitativt kan fremstilles en vandig indolopløsning med en ønsket indolkoncentration ved passende udvælgelse af koncentrationen af det rå indol, som opløses i det organiske opløsningsmiddel, rumfangsforholdet for den organiske og den vandige fase, temperaturen og varigheden af kontakten, når den organiske opløsning bringes i kontakt med og blandes med det vandige medi-20 um.

Der kan naturligvis sættes yderligere råt indol til den organiske opløsningsmiddelfase efter adskillelse ved henstand til indstilling af indolkoncentrationen efterfulgt af genbrug af det organiske opløsningsmiddel, som bringes i kontakt med og blandes med det vandige medium. Hvis 25 det organiske opløsningsmiddel genbruges flere gange, kan de organiske urenheder ophobe sig i det organiske opløsningsmiddel, og indolet i det organiske opløsningsmiddel kan da udvindes ved destillation eller omkrystallisation, og det udvundne indol kan genbruges ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af en renset vandig indolopløsning.

30 Nedenstående eksempler illustrerer opfindelsen.

Eksempel 1 I 500 ml n-hexan (med en opløselighedsparameter SP på 7,3) opløses 16 g råt indol med en renhed på 97,5 vægtprocent og indeholdende 2-methylindol, 3-methylindol, N-ethylindol og 7 35 anilin som urenheder, og den fremkomne opløsning blandes med 500 ml af en vandig opløsning indeholdende 7,5 g L-serin. Den fremkomne blanding skilles ved henstand. Indolkoncentrationen i den fremkomne vandige fase er 1,9 g/liter, og forholdet mellem indol og urenheder hidrørende fra indol er 99,8 vægtprocent til 0,2 vægtprocent. Koncentrationen af L-serin i den DK 169947 B1 7 vandige fase ændres ikke før og efter operationen. Endvidere er koncentrationen af n-hexan i den vandige fase 10 ppm.

Eksempel 2 5 Man blander 15 g indol med parfumerenhed og bestående af 99,95 vægtprocent indol og 0,05 vægtprocent 3-methylindol med bestemte mængder af 3-methylindol med 99,9 vægtprocent renhed til fremstilling af indol med forskellige renheder. Det således fremstillede indol opløses i 90 ml n-hexan, og opløsningen bringes i kontakt med og blandes med 210 ml vandig opløsning indeholdende 2,8 g L-serin, 1,0 g glycin, 0,1 g calciumchloriddihydrat og 2 mg pyridoxal-5'-10 phosphat, hvis pH-værdi er indstillet på 8,5 med ammoniakvand. Den organiske fase og den vandige fase skilles fra hinanden ved aflejring, og koncentrationerne af indol og 3-methylindol analyseres ved HPLC. Vægtforholdet mellem indol og 3-methylindol opløst i n-hexan før kontakten med det vandige medium og værdien i den vandige fase efter kontakten fremgår af tabel 1.

15

Tabel 1

Organisk fase før kontakt _Vandig fase efter kontakt_ _Indol__3-methylindol__Indol__3-methylindol 98,5 vægtprocent 1,5 vægtprocent 99,7 vægtprocent 0,3 vægtprocent 94.0 vægtprocent 6,0 vægtprocent 98,5 vægtprocent 1,5 vægtprocent 90.0 vægtprocent 10,0 vægtprocent 97,6 vægtprocent 2,4 vægtprocent 80.0 vægtprocent 20,0 vægtprocent 94,5 vægtprocent__5,5 vægtprocent 20 Referenceeksempel 1

Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19), som er en tryptophansynthetaseproducerende bakterie, podes i 100 ml af et kulturmedium med den i tabel 2 viste sammensætning i en 500 ml kolbe og inkuberes ved 35°C i 24 timer. 200 ml (i to kolber) af kulturmediet podes i 15 liter af et kulturmedium med den i tabel 3 viste sammensætning i en fermenteringsbeholder på 30 liter 25 og inkuberes ved 35°C, pH 6,8 (indstillet med 28% ammoniakvand) i 30 timer.

Efter dyrkningen centrifugerer man kulturmediet til udskillelse af 600 g bakterieceller (våd vægt). Cellerne anbringes i en forseglet beholder og anbringes derefter i et køleskab ved 4°C og benyttes til fremstilling af den immobiliserede enzymkilde.

30 DK 169947 Bl 8

Tabel 2

Erlich's kødekstrakt............................................................................................................10 g

Polypepton.........................................................................................................................10 g r 5 NaCI.....................................................................................................................................5 g opløst i 1 liter destilleret vand (pH 6,8) i*

Tabel 3

Sammensætning af dyrkningsmedium 10

Glucose..............................................................................................................................10 g (NH4)2S04.......................................................................................................................1,5 g K2HP04...............................................................................................................................1 g

MgSO, 7H20.......................................................................................................................1 g 15 Polypepton........................................................................................................................0,5 g Gærekstrakt......................................................................................................................0,5 g L-tryptophan....................................................................................................................0,15 g

Overfladeaktivt stof..............................................................................................................5 g (Adecanol® LG-805, fremstillet af Asahi Denka Co., Ltd) opløst i 20 1 liter destilleret vand (pH 6,8)

En del af de ovenfor beskrevne våde bakterieceller og en del isotonisk natriumchloridopløsning blandes under omrøring. På den anden side blandes 7,76 dele destilleret vand og 0,24 dele natriumalginat (NSPLL fremstillet af Kibun Food Chemifa, Co., Ltd.) under omrøring, og pH-25 værdien indstilles på 8,5 med natriumhydroxid.

To dele af cellesuspensionen og 8 dele af natriumalginatopløsningen blandes under omrøring, og den fremkomne blanding indføres i en sprøjte og dryppes i en geleringsopløsning fra spidsen af en nål med en indvendig diameter på 0,5-0,8 mm.

30

Geleringsopløsningen er 0,5 M vandig calciumchloriddihydratopløsning, hvis pH-værdi er indstillet på 8,5 med 6N natriumhydroxidopløsning og opbevaret ved 10°C og benyttet i en mængde på 10 dele.

{r 35 De partikler, som dannes ved neddrypning af blandingen i geleringsopløsningen, modnes under omrøring i geleringsopløsningen til opnåelse af en immobiliseret enzymkilde.

DK 169947 B1 9

Til hver af de vandige opløsninger med et rumfang på 100 ml indeholdende anilin, N-ethyl-anilin, o-ethylanilin, o-toluidin, 3-methylindol eller 2-ethylindol i den i tabel 4 viste mængde sættes 0,15 g calciumchloriddihydrat og 1 mg pyridoxal-5-phosphat, og pH-værdien deraf indstilles på 8,5 med mmoniakvand.

5

Til disse vandige opløsninger sættes 5 g af den ovenfor beskrevne immobiliserede enzymkilde indeholdende den tryptophansynthetaseproducerende bakterie, og blandingen henstår ved 30°C. Som referenceopløsning underkastes endvidere 100 ml destilleret vand uden indhold af organisk stof samme procedure som beskrevet ovenfor, og der tilsættes immobiliseret enzym-10 kilde som beskrevet ovenfor, hvorefter man lader henstå ved 30°C.

Efter 24 timers forløb og efter 96 timers forløb udtages 1 g immobiliseret enzymkilde fra hver af opløsningerne, og enzymaktiviteten bestemmes. Forholdet mellem aktiviteten af enzymet i opløsningen af organisk stof og aktiviteten af enzymet i referenceopløsningen bestemmes som 15 vist i tabel 4.

Enzymaktiviteten bestemmes som følger: 10 ml reaktionsmedium indeholdende indol, L-serin, pyridoxal-5'-phosphat (PLP) og 0,3 g af den immobiliserede enzymkilde fremstilles, og reaktionen udføres ved 35°C i en rysteinkubator i 1 time under omrøring. Det fremkomne L-trypto-20 phan analyseres ved HPLC.

DK 169947 B1 10

Tabel 4

Organisk urenhed Koncentration Aktivitetsforhold ppm 24 timer senere_96 timer senere

Anilin 200 0,98 1,01 1000 1,00 0,82 N-ethylanilin 200 1,04 0,97 1000 1,00 0,89 o-ethylanilin 200 0,90 0,77 1000 0,71 0,50 o-toluidin 200 0,97 1,06 1000 0,88 0,80 3-methylindoi 200 0,94 0,89 500 0,94 0,84 2-ethylindol 20 0,93 0,71 50 0,73 0,54 __200_ 0J68_0j48_

Eksempel 3 5 I en kontinuerligt omrørt tankreaktor indeholdende en immobiliseret enzymkilde udføres der en enzymreaktion under anvendelse af rå indolopløsning og renset indolopløsning, og halveringstiden for enzymaktiviteten sammenlignes. En vandig opløsning indeholdende 10,0 g pr. liter af L-serin, 1,5 g pr. liter af calciumchloriddihydrat og 10 g pr. liter af pyridoxal-5'-phosphat, hvis pH-værdi er indstillet på 8,5 med ammoniakvand (i det følgende betegnet opløsning A), under-10 kastes reaktionen. I hver af tre glasreaktorer på 500 ml med omrører anbringes 100 ml af den ovenfor beskrevne opløsning A og 30 g immobiliseret enzymkilde indeholdende de tryptophan-synthetaseproducerende celler, og reaktorerne anbringes i varmt vand til opretholdelse af en temperatur på 35°C.

15 Til den første reaktor sættes opløsning A med en hastighed på 49 ml pr. time. På den anden side opløses råt indol indeholdende 94,0 vægtprocent indol og 6,0 vægtprocent 3-methylindol i * 70 rumfangsprocent vandig methanolopløsning til fremstilling af en vandig opløsning med en indolkoncentration på 75 g pr. liter og en 3-methylindolkoncentration på 4,79 g pr. liter. Denne > opløsning føres kontinuerligt til reaktoren med en hastighed på 1 ml pr. time. Endvidere fjer-20 nes reaktionsblandingen fra reaktoren med en hastighed på 50 ml pr. time til udførelse af en kontinuerlig syntesereaktion for L-tryptophan. Man udtager portioner af reaktionsblandingen på fastsatte tidspunkter, og koncentrationen af 3-methylindol og L-tryptophan bestemmes ved DK 169947 B1 11 HPLC. 24 timer efter starten af tilførslen af indolopløsning er koncentrationen af 3-methylindol 96 mg pr. liter. Udbyttet af L-tryptophan i forhold til tilført indol pr. tidsenhed bestemmes. Det tidspunkt fra reaktionens begyndelse, hvor udbyttet er reduceret til 50%, altså halveringstiden for enzymaktiviteten, er 615 timer.

5 På den anden side opløses det rå indol med samme sammensætning i n-hexan, og det bringes i kontakt med og blandes med opløsning A som i eksempel 3. Efter adskillelse ved henstand fås renset vandig indolopløsning (opløsning B). I en anden reaktor tilføres opløsning B med en hastighed på 50 I pr. time, og reaktionsblandingen fjernes kontinuerligt med samme hastighed.

10 Koncentrationen af 3-methylindol i reaktionsblandingen er 19 mg pr. liter. Halveringstiden for enzymaktiviteten er 960 timer.

I den tredje reaktor udføres den kontinuerlige enzymreaktion endvidere på samme måde som i den første reaktor, men med den forskel, at der benyttes indol af parfumekvalitet bestående af 15 99,95 vægtprocent indol og 0,05 vægtprocent 3-methylindol. Koncentrationen af 3-methylindol i reaktionsblandingen er 0,7 mg pr. liter, og halveringstiden for enzymaktiviteten er 1070 timer.

Mængden af indol, som tilføres hver reaktor pr. time, er ensartet 75 ml.

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af L-tryptophan, kendetegnet ved, (i) at man opløser råt indol indeholdende en organisk urenhed i et organisk opløsningsmiddel, som er ublandbart med vand, idet fordelingsforholdet for urenheden i den organiske 4 5 fase/vand, når der dannes et tofasevæskesystem mellem det organiske opløsningsmiddel og et vandigt medium, er større end fordelingsforholdet for indol, i (ii) at man bringer den organiske indolopløsning i kontakt med et vandigt reaktionsmedium indeholdende L-serin i praktisk taget fravær af tryptophansynthetase til dannelse af et tofasevæskesystem, idet den første fase er en vandig fase med indolet opløst deri, 10 medens den anden fase er en organisk fase indeholdende den organiske urenhed, og (iii) at man isolerer den vandige opløsning indeholdende indol og L-serin, og (iv) at man bringer den vandige opløsning indeholdende indol og L-serin i kontakt med tryptophansynthetase.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den organiske urenhed er anilin, N-ethylanilin, o-ethylanilin, o-toluidin, 3-methylindol eller 2-ethylindol.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af en vandig indolopløsning til brug ved fremstilling af L- tryptophan, kendetegnet ved, 20 (i) at man opløser et råt indol indeholdende en organisk urenhed i et organisk opløsnings middel, som er ublandbart med vand, idet fordelingsforholdet for urenheden i den organiske fase/vand, når der dannes et tofasevæskesystem mellem det organiske opløsningsmiddel og et vandigt medium, er større end fordelingsforholdet for indol, og (ii) at man bringer den organiske indolopløsning i kontakt med et vandigt reaktionsmedium 25 indeholdende L-serin i praktisk taget fravær af tryptophansynthetase til dannelse af et tofasevæskesystem, idet den første fase er en vandig fase med indolet opløst deri, og den anden fase er en organisk fase indeholdende den organiske urenhed, og (iii) at man isolerer den første fase indeholdende indolet og L-serin.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den organiske urenhed er anilin, N-ethylanilin, o-ethylanilin, o-toluidin, 3-methylindol eller 2-ethylindol. <r

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at opløselighedsparameteren SP for det organiske opløsningsmiddel ved temperaturen for udførelse af reaktionen er 7-9,5. * 35

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det organiske opløsningsmiddel er n-hexan.