JPH06510182A - アリールアルカン酸の分割 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アワールアルカンｒの　Ｎ１ 及二Ω立野 本発明は、アリールアルカン酸の分割に関する。

及咀公亙旦 化学合成によって製造された薬剤活性をもつ多（の化合物は、立体異性体の混合 物として得られ、かつ販売されている。しかし、このような立体異性体の一つだ けが薬剤的に活性である場合がしばしばある。不純にするエナンチオマーは、活 性を有するとしても非常に乏しく、場合によっては、望ましくない生理的副作用 を有し、毒性を示す。

多数の研究者による研究は、２−アリールプロピオン酸である、ナプロキセンお よびイブプロフェンの抗炎症性が（Ｓ）エナンチオマーについて見られることを 示した。現在、ラセミ化合物として製造、販売されているケトプロフェンについ ても同じことが当てはまる。

アリールアルカン酸は、以下の反応式 （式中、Ｒ′はアルキル基であり、Ａｒは芳香族残基であり、例えばＲは、１〜 ４個の炭素原子をもつ脂肪族残基である）で示される生物的変換によって分割す ることができる。

本発明の他ならぬ目的は、光学的に純粋な（旦）−ケトプロフェンを製造する経 済的な方法を提供することである。

及ユΩ里１ 本発明は、とりわけ、ラセミ混合物から（旦）−ケトプロフェンを分割する方法 を提供する。この方法は、ラセミケトプロフェンのエステルを生物的触媒加水分 解により、一方のエナンチオマーを実質的に多く含むケトプロフェン酸と、他方 のエナンチオマーを実質的に多く含むケトプロフェンエステルとを含む生物的変 換ブイヨンを得ること含む。生物的変換の酸生成物が所望のエナンチオマーを十 分に多（含むならば、標準的な化学的手法を使用して、高い光学純度をもつキラ ルなアミンとの塩を形成し、次いで溶液から結晶させることにより、光学純度の さらなる改善を容易かつ低廉に達成することができる。生物的変換から残留した ケトプロフェンエステルは容易に精製し、化学的にラセミ化することができ、こ れを、さらなる生物的変換での使用にＩａλてリサイクルさせて、原材料費を最 小限にすることができる。

１肌公塁朋 本発明の好ましい側面は、上述した生物的変換における使用に適した生物的触媒 の発見に基づ（ものである。必要とされる分割を実施するのにきわめて有用な、 ある微生物（ＥＮＺＡ−１３）が確認されている。この生物体は、元来、汚水処 理施設から得た試料を選別することによって単離し、唯一の炭素源としてのエタ ノール上で増殖させたものである。続いてエチルケトプロフェンを含むプレート 上でこの生物体を選別すると、増殖ののち、非水溶性のエチルケトプロフェンの 広範囲な隙間がＥＮＺＡ−Ｉ３コロニーの周囲に存在する（潜在的なエステル加 水分解を示唆する）ことがわかった。

液状媒体中でさらに選別すると、液体選別の間に、ＥＮＺＡ−Ｉ　３がエチルケ トプロフェンの加水分解において他の単離体よりも相当に活性であることが示さ れた。

この細胞株は、ラセミケトプロフェンエステルからの（旦）−ケトプロフェンの 分割にとって有利である、次のような多数の特徴を有することが証明された。

（ａ）短鎖ケトプロフェンエステルを非常に速やかに加水分解する。

（ｂ）非常に高いエナンチオ選択性をもってラセミエチルケトプロフェンから（ 旦）−ケトプロフェン酸を製造する。例えば、低い転換率では、９５％を超える 純度の（旦）−ケトプロフェンを得ることができるほどである。５０％に近い転 換率（４０〜５０％）では、純度は９０％に下がる。この選択性は、不純にする 活性を精製して除去したり（費用がかかりつる）、クローニングによって対象の 活性を過度に発現させたりすることなしに得られる。

（Ｃ）基質をエチルケトプロフェンからメチルケトプロフェンに換えることによ り、生物的触媒の選択性を変化させて、例えば（旦）エナンチオマーではなく（ 旦）−ケトプロフェンを優先的に蓄積させることもできる。このように、生物的 変換を５０％超に上げることにより、（旦）−ケトプロフェンをメチルエステル として製造することができる。

（ｄ）１．５〜２時間の倍加時間をもって周囲温度で急速に増殖して、生物的触 媒を容易かつ低廉に調製することを可能にする。

単離された株は、オランダのＣｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ　ＶｏｏｒＳｃｈｉｍ ｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ　（ＣＢ　Ｓ　）により、Ｅｎｄｏｍ　ｃｅｓ　１ａｉ ｂａｃｃｈｉｉとしテモ分類すレる肛旦加三ｏｒｏｎ国止鯨肋見　（Ｗｉｎｄｉ ｓｃｈ）と確認された。この種のいくつかの代替の株をＣＢＳから公に入手する ことができる。このような株、例えばＣＢＳ　５７９１．５７９０．５３８１お よび２４９５を入手し、単離体ＥＮＺＡ−Ｉ　３とともに試験した。これらの試 験は、生物的変換を実施することにおいてこれらの株のいくつかが単離体ＥＮＺ Ａ−Ｉ３とほぼ同じくらい良好なものであることを示す。ＣＢＳの１９９０年カ タログ（第３２版）においては、これらの株はＴｒｉｃｈｏｓ　ｏｒｏｎ　ｂｅ ｉ　ｅｌｉｉと分類されているが、のちに、ＣＢＳによってＥｎｄｏｍ　ｃｅｓ 　１ａｉｂａｃｃｈｉｉと改名されている。試験したＴ、　ｂｅｉ工吐島の株は 、ＥＮＺＡ−Ｉ　３と同様な選択性を有するが、ＥＮＺＡ−Ｉ　３はど活性では ないことがわかった。

ＥＮＺＡ−Ｉ　３は、ブタベスト条約の規定のもと、１９９１年８月２０日にＩ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（ 英国Ｋｅｗ）に寄託され、寄託番号３４８９１７を付された。

寄託された微生物ＥＮＺＡ−Ｉ　３のさらなる特徴を以下に示す。

発酵増殖ニゲルコース　−ｖｅ 好気好気的増殖：グーグルコース　＋ｖｅＤ−ガラクトース　＋ｖｅ Ｌ−ソルボース　＋ｖｅ Ｄ−グルコサミン　＋ｖｅ シタ 子嚢−なし 冬胞子／担子基−なし 以下の実施例により、本発明を例示する。以下の培地を実施例１〜５（（Ｓ）− ケトプロフェンを製造した）使用した。

”　Ｉｖａｎｈｏｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社、米国イリノイ州オートクレーブ処理 に付す前に、水酸化ナトリウムによってすべての培地をｐＨ６，５に調節した。

接種の前に、すべての培地を１２１”Ｃで２０〜４０分間加熱滅菌した。グルコ ースは、培地の他の部分とは別に５０％溶液として滅菌した。

生物的変換混合物は次のとおりである。

リン酸ナトリウム　１００ｍＭ、　ｐＨ６，５酵母抽出物　Ｌｏｇ／Ｉ Ｔｗｅｅｎ　８０　５ｇ／ｌ 消泡剤（ＸＦＯ３７１）　１　ｍｌ／１ケトプロフエンエチルエステルを、接種 物を加えたのちのその最終濃度が５０ｇ／ｌになるように、生物的変換混合物に 加えた。この生物的変換の培地を１２１℃で２０〜４０分間加熱滅菌し、ケトプ ロフェンエチルエステルをそれとは別に加熱滅菌した。

使用した微量元素の溶液は次のとおりであった。

ＣａＣ１＊−２Ｈ，０３，５７ｇ／ｌ ＺｎＯ２，０ｇ／ｌ ＣｕＣ１，・２Ｈ，ＯＯ，８５ｇ／Ｉ Ｎａａ　ＭＯＯ４・２８ｚ　Ｏ４，８ｇ／ＩＭｎＣ１２・４　Ｈ２Ｏ２，０ｇ／ ｌ ＦｅＣｌ２　”６Ｈ＊　０　５．４　ｇ／ＩＨ，ＢＯ３０，３ｇ／Ｉ ＣｏＣ１ｇ　・６Ｈ２０２，４ｇ／ｌ ＨＣｌ　２５０　Ｉｌｌ／ｌ ！施±ユ 細胞（ＥＮＺＡ−１３）をＹＭ　（Ｄｉｆｃｏ　）寒天プレートに接種し、２３ ℃で２日間製置した。次に、単コロニーを、５００ｍ１振とうフラスコ中の接種 培地７５ｍ１の中に移した。そして、これを２３℃で２４時間、好気的に増殖さ せた。次に、この培養体を、増殖培地１．５１２を２３℃で含む２．８ｇ発酵槽 の中に移した。好気状態を維持するために十分に通気し、攪拌しながら、増殖を １０時間続けた。次に、この培養体１５０ｍ１を、２．８４容器中の生物的変換 培地ｌ、３５βの中に移した。生物的変換の間。

１．２００ｒｐｍの攪拌速度および０．５ｖｖｍの通気量を維持した。

温度は２３℃に制御した。開始してから２０時間後に採取した試料は、７ｇ／ｌ のケトプロフェン濃度を９８％の（旦）−ケトプロフェン純度とともに示した。

生物的変換を開始してから７３時間後に採取した試料は、２３．３ｇ／ｌのケト プロフェン濃度を９４％の（旦）−ケトプロフェン純度とともに示した。

夾皿遡ｌ 実施例１に記載したものと同様な方法を、その規模を拡大して使用した。細胞を ＹＭ　（Ｄｉｆｃｏ　）寒天プレートに接種し、２日間製置した。次に、単コロ ニーを、接種培地２５０ｍ１を含む４個の１２三角フラスコのそれぞれに移した 。１日増殖させたのち、すべてのフラスコの内容物を、増殖培地９Ｉ２を含む１ ５℃発酵槽の中に移した。１０時間の好気的増殖ののち、細胞ブイヨン５ｉを、 生物的変換培地４５ρを含む７５β容器の中に移して、生物的変換を開始させた 。好気状態を維持し、良好な混合を保証するために、０．２ｖｖｍの空気流量お よび５００　ｒｐｍの攪拌速度を使用した。生物的変換を開始してから７１時間 後に採取した試料を分析すると、（旦）エナンチオマーを９３％の純度で含むケ トプロフェン１７ｇ／ｌが蓄積されていることがわかった。

夫五伍ユ ＣＢＳから入手した、以下の表に示す種々の株の培養体を、新鮮なＹＭ寒天プレ ートから、増殖培地２５ｍ１をグルコースなしで含む２５０ｍ１フラスコの中に 移した。２４時間の増殖ののち、各培養体５．０ｍｌを、生物的変換培地２０ｍ １を含む２５０ｍ１バッフル付きフラスコの中に移した。２３℃で７２時間振と うしたのち、試料を採取した。結果を以下の表にまとめる。

０１度が低いため、正確な定量が困難であったが、各株について（旦）エナンチ オマーに対する選択性（程度の差がある）が見られた。

！嵐皿Ａ　温度の効果 研究は、生物的変換の間の生物的触媒の２３℃および２６℃の性能が同程度であ ることを示す。２０℃では、生物的変換の速度は２３℃でのそれと同程度である が、生物的触媒のエナンチオ選択性は、標準的な生物的変換（実施例１）におい て７０時間後に酸生成物の純度が９３〜９４％ではな（８８％（旦）−ケトプロ フェンにしかならないほどにまで低下する。３０℃で、触媒作用の速度は約４０ 〜５０％低下し、エナンチオ選択性も良くない。

犬二土互　ｐｔ＋の効果 ｐＨ４，５とｐＨ７，５（試験をしてはいないが、これより高くてもよいことは ほぼ確かである）との間で活性が見られる。ｐＨ４，５未満では生物的触媒の選 択性が有意に低下する。最適なｐＨは６．５〜７．５であると考えられる。

したがって、４，５に制御されたｐｉ（をもって標準的方法（実施例１）を使用 すると、６６時間後の試料は８ｇ／ｌ　（純度９１％（旦）−ケトプロフェン） を有していた。ｐＨ６，５で６６時間後には、試料は２４ｇ／ｌ（純度９４％（ 旦）−ケトプロフェン）を有していた。ｐＨ７，５で６６時間後には、試料は２ ３ｇ／ｌ（純度８０％（旦）−ケトプロフェン）を有していた。

夫立透互　鎖長の効果 酵母抽出物２５ｇ／ｌ、　リン酸二水素カリウムＬｏｇ／ｌ、硫酸マグネシウム 七水和物０．５ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／ｌおよび微量元素溶液（ＣａＣ １ｚ　・２２Ｈ２Ｏ−５３／ｌ　、Ｆｅ５０．　・７Ｈ，○−２ｇ／ｌ　、Ｍｎ ＳＯ４・Ｈ，Ｏ−１００ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０−２００ｍｇ／ｌ、Ｃ ｕＳＯ４−４０ｍｇ／ｌ、ＣｏＣ１１Ｈ６Ｈｚ　０　６０ｍｇ／ｌ、ＮａＭｏＯ ４−４０ｍｇ／ｌ、Ｈ３Ｂ　Ｏｚ　３０　ｍｇ／ｌ）　１　ｍｌ／ｌを含む培地 において、水酸化ナトリウムでそのｐ）Ｉを６．５に調節して、細胞を増殖させ た。−夜増殖させたのち、培養体を２０％で、同じ培地２５ｍ１を含み、異なる ケトプロフェンエステルを１０ｇ／ｌの最終濃度にまで加えた２５０ｍ１バッフ ル付きフラスコの中に移した。そして、生物的変換の速度およびケトプロフェン 生成物のエナンチオマー純度を測定した。結果は次のとおりであった。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成６年２月１８日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．アリールアルカン酸のエステルのエナンチオマーの混合物から光学活性のア リールアルカン酸の一つのエナンチオマーを主として製造する方法であって、前 記エステルを、ラセミケトプロフェンエチルエステルから（Ｓ）−ケトプロフェ ンを９５％超の純度で製造することができる特性を有する物質と接触させること を特徴とする方法。
2. ２．アリールアルカン酸のエステルのエナンチオマーの混合物から光学活性のア リールアルカン酸の一つのエナンチオマーを主として製造する方法であって、前 記エステルを、アリールアルカン酸の第一および第二のエステルを、それらのエ ステルの逆のエナンチオマーに対する選択性をもって該酸に変換することができ る特性を有する物質と接触させることを特徴とする方法。
3. ３．前記第一のエステルがケトプロフェンエチルエステルであり、前記物質が（ Ｓ）−ケトプロフェンのエステルに対してエナンチオ選択性である請求の範囲第 ２項記載の方法。
4. ４．前記第一または第二のエステルがケトプロフェンメチルエステルであり、前 記物質が（Ｒ）−ケトプロフェンのエステルに対してエナンチオ選択性である請 求の範囲第２項または第３項記載の方法。
5. ５．前記物質がＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属またはＥｎｄｏｍｙｃｅｓ属の微生 物である先行する請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。
6. ６．前記物質がＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ＥＮＺＡ　Ｉ−３、ＩＭＩ３４８９ １７の特徴を有するものである先行する請求の範囲のいずれか１項に記載の方法 。
7. ７．前記一つのエナンチオマーが（Ｓ）−ケトプロフェンである先行する請求の 範囲のいずれか１項に記載の方法。
8. ８．ｐＨ４．５〜７．５で実施する先行する請求の範囲のいずれか１項に記載の 方法。
9. ９．２０〜３０℃で実施する先行する請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。
10. １０．前記エステルがメチルエステルまたはエチルエステルである先行する請求 の範囲のいずれか１項に記載の方法。