KR870001150B1 - 효소 반응의 개량방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

효소 반응의 개량방법

본 발명은 수상(水相)에서의 효소 반응의 개량 방법에 관한 것이다. 더욱 특별하게는 본 발명은 기질과 혼화할 수 있으나 물과 혼화할수 없는 유기용매를 반응계에 가하여, 수상에서의 기질의 농도를 효소의 활성이 억제되는 농도(억제 농도) 이하에서 유지시키면서 반응을 수행함을 특징으로 하는, 효소가 사용되는 반응에서 기질에 의한 효소 활성의 저하를 방지하는 방법에 관한 것이다.

효소를 사용하는 반응에서, 물은 효소를 위한 가장 좋은 방응 매질이므로 이런 방응은 보통 수상에서 수행된다. 그러나, 어떤 기질은 물에 대한 용해도가 낮다. 이런 기질을 사용하는 경우, 효소를 함유한 수상(때때로 효소-함유 액체로 칭함)에서 반응에 필요한 기질의 양을 확인하고 반응을 부드럽게 수행하기 위해 기준이 있다. 예를 들면 유기 용매를 사용하여 반응을 수행하는 것은 공지이다. 일본국 특허 공고34153/1972에는 아에로박테리움(Aerobacterium)속의 박테리아를 사용하여 인돌 및 세린으로부터 L-트립토판을 제조하는 방법에 있어서 반응 촉진제로서 톨루엔, 부탄올, 에탄올 또는 아세톤이 사용된다고 기재되어 있다. 영국 특허 GB-13134에는 데칸의 산화에 있어서 데칸 산화효소 존재하에 수불용성 기질, 물과 혼화할 수 있는 디메티로름아미드 및 기질이 사용된다고 기재되어 있다.

이 방법에서, 유기용매는 효소-함유 액체에서 기질의 용해를 돕고 반응을 촉진시키기 위해 사용된다.

효소를 사용하는 반응에서, 효소에 대한 기질 농도의 영향을 고려해야 한다. 효소반응에서, 반응상에서의 기질의 농도가 높다면, 효소의 활성이 현저하게 감소하여 반응을 저지한다. 예를 들면, 효소 존재하에 전구체로서 안트라닐산을 사용하여 트립토판을 제조하는데 있어서, 수상에서의 안트라닐산의 농도는 반응에 사용된 효소의 활성을 저하시키며(미합중국 특허 4,363,875) ; 에르위니아 헤르비콜라(Erw inia herbicola)를 사용하여 L-세린 및 피로카테콜로부터 L-DOPA를 제조하는데 있어서, 수상에서 기질로서 고농도의 피로카테콜의 존재는 효소의 활성을 감소시키며 (Agric. Bool, Chem., Vol. 37, 493-499 : 725-735, 1973) : 인돌 및 세린으로부터 트립토판을 제조하는데 있어서, 기질로서의 인돌은 트립토판 합성 효소의 활성을 감소시킨다(U. Behrendt,The First European Congress on Biotechnology, 2/186-2/189,1978).

따라서, 효소를 사용하는 반응에서 기질이 효소의 활성을 감소시킨다면, 기질이 효소-함유 액체에 충분히 용해될 수 있을 때에도 반응을 부드럽게 하기 위해 효소-함유 액체에서의 기질의 농도를 효소의 활성이 저하되는 농도(억제 농도)이하로 유지시키면서 반응을 수행해야 한다. 이런 형태의 반응을 공업화하기 위해, 반응 동안 기질의 농도를 연속적으로 분석하기 위해 연속 분석기를 장치하고, 효소-함유 액체 내에서 기질의 농도를 억제농도 이하로 유지시켜야 한다. 더우기, 기질을 연속적으로 공급하기 위해, 연속 분석기에 직접 연결된 물질공급 시스템이 필요하다. 그러므로, 장치 및 반응 공정이 복잡해진다. 이런 형태의 반응에서, 대량의 효소가 사용되고, 반응에서 기질의 소비 속도가 기질과 물의 혼합 속도보다 더 크면, 반응은 실제적으로 억제 농도보다 낮은 기질 농도에서 수행될 수 있다. 그러나, 반응에 사용된 효소의 량이 실제로 매우 크기 때문에 공업적으로 이용 가치가 적다.

효소 반응 또는 발효 반응에 의해 인돌로부터 수득된 트립토판은 미반응 인돌이 고유의 불쾌한 냄새를 방출하기 때문에 의약품 또는 식품 첨가물에 사용할 때 미반응 인돌로부터 유리되어야 한다.

종래에는, 효소 반응에 의해 인돌로부터 L-트립토판을 제조하는데 있어 반응 용액으로부터 미반응 인돌을 제거하는 방법으로 증기증류를 이용하였다(일본국 특허공고 800/1982). 그러나 인돌의 증기압이 물의 증기압보다 낮기 때문에, 증류에 의해 인돌을 제거하기 위해 대량의 증기가 필요하다. 따라서, 경비가 비싸므로 이 방법은 상업적으로 비 경제적이다. 그러므로 이런 문제를 해결하는 것이 강하게 요청되고 있다.

본 발명의 목적은 효소 반응에서 기질에 의해 효소의 활성이 저하되는 것을 방지하는 개량 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따라, 반응계에 물과는 혼화되지 않으나 기질과는 혼화되는 유기용매를 가하고 수상에서의 기질의 농도를 효소의 활성이 실제로 방해되는 농도 이하로 감소시킴을 특징으로 하는, 수상에서의 효소 반응시 효소의 활성이 기질에 의해 저하되는 것을 방지하는 방법에 의해 상기의 목적이 수행된다.

상기 방법의 구체예로서, 본 발명은

(A)물과는 혼합되지 않으나 인돌과는 혼화하는 유기용매 존재하에 수상에서 기질로써 인돌을 사용하여 효소 반응을 수행하고, 반응 혼합물로부터 유기 용매를 회수하고 효소를 제거한 후, 생성된 L-트립토판의 수용액으로부터의 미반응 인돌을 회수된 유기 용매로 추출하고, 이 추출물을 반응에 재사용함을 특징으로 하는 방법, 및

(B) 물과는 혼화하지 않으나 인돌과는 혼화하는 유기용매 존재하에 수상에서 기질로써 인돌을 사용하여 효소 반응을 수행하고, 유기용매 층의 미반응 인돌을 반응 혼합물로부터 분리함을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 기본적 원리는 기질의 용해된 유기 용매상과 수상 사이의 분포비에 따라 수상에서의 기질의 농도를 어떤 고정된 농도 이하로 유지시키는 것이다.

일반적으로 효소의 활성이 기질에 의해 감소되는 반응에서, 수상에서의 기질의 농도를 항상 낮게 유지시켜야 하며, 이 목적을 위해 어떤 기준에 의해 기질을효소 함유 반응계에 연속적 또는 간헐적으로 조금씩 가하는 방법이 사용된다. 그러나 이 방법은 기질을 반응계에 가할 때 효소 함유 액체에서의 농도를 낮게 유지하도록 반응을 조절하기 위해 복잡한 공정 및 장치가 필요하다.

반대로, 본 발명의 방법에 따르면, 기질과는 혼화하나 물과는 혼화하지 않는 유기 용매를 효소 함유 액체에 가하여 기질을 유기 용매상에 거의 완전히 용해시킨다. 결과적으로, 수상에서의 기질의 농도는 유기 용매상과 수상 사이의 기질의 분포비에 따라 억제농도 이하로 유지될 수 있다. 이때, 반응 생성물이 유기 용매상 또는 효소 함유상에 용해되거나 침전되는 것은 문제가 되지 않는다.

본 발명의 방법에 따라, 효소 함유 액체상 내의 기질은 반응의 진행 및 기질의 소모에 따른 두 상 사이의 기질의 분포비에 따라 유기 용매상으로부터 연속적으로 공급된다. 기질을 용해시키는 유기 용매는 일시에 가해질 수 있으며, 또는 수상에서 기질의 농도가 억제농도 이하로 유지될 수 있다면 간헐적 또는 연속적으로 가해질 수 있다. 필요하다면, 기질의 운동 속도는 교반과 같은 작업을 통해 유기상과 수상 사이의 접촉 면적을 변화시킴으로써 변화될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 효소는 단독으로 또는 둘 이상의 혼합물로 사용될 수 있다. 그러나 공지의 방법에 따라 수행되는 효소 반응에 사용될 때 효소의 활성이 기질에 의해 감소되는 경우 둘 이상의 효소가 사용 되어야만 한다.

본 발명에 사용된 효소는 순수한 것이 아니어도 되며 조한 상태의 것일 수 있다. 예를들면, 효소는 효소 생성 미생물의 배양 브로스로부터 원심분리 등에 의해 수집된 살아 있는 세포, 이 세포를 동결 건조시키고 이를 마쇄, 자가수소 및 울트라소니케이션과 같은 처리를 함으로써 수득된 세포, 이들 세포의 추출물 및 추출물로서 수득된 효소일 수 있다.

본 발명의 방법에 사용된 유기용매는 기질과는 혼화할 수 있으나 물과는 혼화되지 않는 것이다. 실제로 사용된 효소에 따라 반응 조건하 효소의 활성을 감소시키지 않는 유기 용매를 선택할 필요가 있다.

주어진 기질에 적당한 유기용매를 선택하며, 그 양은 하기에 나타낸 바와 같이 결정한다. 특별하게는, 반응될 효소와 기질을 사용하고, 반응 조건하 효소 함유 액체에서의 기질의 억제농도를 측정한다. 그리고 효소 함유 액체와 유기용매 사이의 기질의 분포비를 결정하고, 유기용매에서 상기에 측정된 억제 농도보다 낮은 기질의 농도를 결정한다. 반응에 사용된 유기용매에서의 기질의 농도를 상기와 같이 결정했을 때 사용된 효소 함유 액체의 양과 유기용매의 양은 반응 혼합물에 축적된 필요한 반응 생성물의 농도에 따라 상용된 기질의 양으로부터 결정될 수 있다.

그러므로, 효소 함유 액체에서의 기질의 농도를 억제농도 이하로 유지시킬 수 있는 한, 유기매를 자유롭게 선택할 수 있으며, 그 양도 자유롭게 결정할 수 있다.

본 발명의 방법은 기질로써 인돌 및 L-또는 DL-세린을 사용한 L-트립토판의 제조에 대해 하기에 설명된다. 트립토판 합성 효소를 사용하여 인돌 및 L-세린으로부터 L-트립토판을 제조하는데 있어서, 인돌은 트립토판 합성 효소의 활성을 감소시키기 때문에 이 반응은 물에서의 인돌의 농도를 낮게 유지하면서 수행되어야 한다. 이 목적을 위해, 비이온성 표면활성제 또는 흡착수지가 사용된다(Behrendt, The First Euro-pean Congress in Biotechnology, 2/186-189, 1978). 그러나 비이온성 표면 활성제 존재하의 반응은 인돌이 표면 활성제의 영향에 의해 수상에서 미셀을 형성하기 때문에 두상 사이에서 수행되는 본 발명의 방법에 따른 반응과는 메카니즘이 다르다. 더우기, 이 방법은 반응 후 반응 생성물로부터 표면활성제를 분리하는 것이 어렵기 때문에 비경제적이다. 흡착수지를 사용한 방법은 인돌에 흡착된 흡착수지가 완전히 분리되지 않거나, 반응 생성물이 이들 수지에 흡착되기 때문에 공업적으로 단점이 있다.

반대로, 유기용매 중의 인돌 용액을 세린 및 효소를 함유한 수용액에 가하고 반응을 두 상에서 수행할때, 수상에 용해된 인돌의 농도를 낮게 유지할 수 있으며, 인돌은 반응에 의해 소비되면 유기 용매상으로부터 자동적으로 공급된다. 그러므로 반응이 자연스럽게 진행된다.

에스케리키아 클리(Escherichia coli)의 변이주를 함유한 액체에서, 인돌의 억제농도는 약 800ppm이다. 수상에서의 억제농도보다 낮은 농도에서 인돌이 분포하는 유기용매의 예로는 톨루엔, 콜로로벤젠, 에틸시트레이트, 메틸이소부틸케론 및 아니솔이 있다. 예를들면, 인돌의 20중량% 톨루엔 용액이 사용된다면, 인돌은 에스케리키아 콜리의 변이주를 함유한 액체의 720ppm 이하의 농도에 용해되며, 이 반응은 상술한 억제 농도 이하의 인돌 농도를 유지하면서 수행될 수 있다. 다른 용매에서의 인돌의 농도가 에틸시트레이트에 대해 40중량%, 메틸이소부틸케톤에 대해 50중량%, 아니솔에 대해 30중량% 및 모노클로로벤젠에 대해 20중량%이라면 반응 조건하 효소 함유 액체에서 인돌의 농도는 800ppm이하로 유지될 수 있다.

본 발명의 한 구체적인 방법에 따라, L-트립토판-필요 에스케리키아 콜리의 트리토판아제 결피 변이주, 탄소원, 질소원 및 무기염을 함유한 배양 배지를 28~40℃의 온도 및 pH 6~8에서 호기성 조건하에 에스케리키아 콜리의 변이주를 배양하고, 배양 브로스 자체 또는 배양 배지로부터 분리된 후의 미생물 세포를 피리독살포스페이트, L-세린 및 무기물질을 함유한 용액에 현탁시킨 후, 인돌과는 혼화하나 물과는 혼화할 수 없는 유기용매에 녹인 인돌 용액을 pH7.5~9.5, 바람직하게는 pH8~9에서 일시에 또는 연속적으로 가하고, 20~40℃의 온도에서 반응을 수행함으로써 L-트립토판이 제조될 수 있다.

이때 사용될 수 있는 유기용매의 예를 들면 벤젠, 톨루엔, 클로로벤젠, 니트로벤젠 및 아세토페논과 같은 방향족 탄화수소 및 그의 유도체 ; n-부틸 아세테이트, 이소아밀 아세테이트, 에틸부틸레이트 및 이소부틸 아세테이트와 같은 6이상의 탄소 원자를 갖는 지방족 에스테르; 메틸 이소부틸케톤, 디이소부틸케톤, 디이소프로필케톤, 메틸 n-아밀 케톤 및 디-n-프로필케튼과 같은 6 이상의 탄소원자를 갖는 지방족 케톤 ; 아세틸 트리에틸시트레이트, 아세틸 트리부틸시트레이트, 트리에틸시트레이트 및 트리부틸시트레이트와 같은 시트르산 에스테르 ; 타르타르산 에스테르 ; 말산 에스테르 및 아니솔과 같은 에테르가 있다.

사용된 유기용매의 양은 반응조건하 효소 함유 액체상과 유기상 사이의 인돌 분포비 및 사용된 인돌의 양에 따라 결정되므로 유기 용매의 종류에 따라 변화된다. 보통 효소함유 액체에서의 인돌의 농도는 800ppm 이하, 공업적으로 바람직하게는 750ppm 이하로 결정된다.

반응 생성물인 L-트립토판은 효소-함유 액체에 결정으로서 침전된다. 사용된 반응 조건하에서, 이들 결정은 반응의 진행에 어떤 영향도 미치지 않는다.

상기의 방법에서, DL-세린은 기질로서 사용될 수 있다. 이 경우, 세린 라세마제로써 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)(MT-10182) 또는 슈도모나스 풍크타타(Pseudomonas punctata)(MT-10243)의 배양 세포를 사용함으로써 유기 용매에 의한 효소 활성의 저하 없이 고수율로 L-트립토판이 수득될수 있다.

L-트립토판이 쉽게 이용할 수 있는 유기 용매를 사용하여 두 형태의 효소 존재하에 화학적으로 합성된 DL-세린 및 인돌로부터 어떤 문제 없이 제조될 수 있다는 것은 상업적으로 매우 중요하다.

상기 방법에 의해 수득된 반응 혼합물은 생성된 L-트립토판, 미반응 원료, 유기 용매, 효소 등을 함유한다. 바람직하게는 이 반응 혼합물을 상술한 구체에(A) 또는 (B)에 따른 방법에 의해 처리한다.

구체에(A)에 따라, 하기의 회수 방법이 사용된다. 먼저 유기 용매를 반응 혼합물로부터 회수하고 효소를 제거한다. 효소 및 유기 용매가 공존하는 반응 혼합물을 거세게 교반하면 수상과 유기 용매상 사이의 중간 표면이 불명료해지며, 이것은 때때로 추출된 미반응 인돌이 용해된 유기 용매를 분리하는 것을 어렵게 한다. 이런 현상을 피하기 위해, 반응 혼합물로부터 유기 용매를 제일 먼저 회수하는 것이 실제적이며 보통은 증류에 의해 회수한다. 그리고 나서, 유기 용매가 회수된 반응 혼합물에 함유된 효소를 제거한다.

반응에 사용된 효소를 반응 혼합물로부터 제거하는 방법에는 특별한 제한이 없다. 공업적으로 효과적인 한가지 방법은 유기 용매가 제거된 반응 혼합물에 무기산을 가하여 반응 혼합물의 pH를 2~5로 맞추고, 효소의 응고를 촉진시키는데 필요한 만큼 가열한 후, 여과와 같은 방법에 의해 응고된 효소를 제거한다.

필요한 경우, 효소가 제거된 반응 혼합물을 농축할 수 있다. 미반응 인돌은 반응 혼합물로부터 효과적으로 추출 및 분리하기 위해, 용해된 상태의 L-트립토판이 결정으로 침전되지 않도록 유지시키는 것이 바람직하다. L-트립토판이 수용액으로부터 결정화될 때, 유사한 분자구조를 갖는 미반응 인돌이 포함되어 동시 결정화될 수 있다. 이런 이유 때문에, 처리 온도에 따라 유기 용매에 의해 추출된 반응 혼합물의 농도를 L-트립토판이 용해된 상태에 있도록 맞추어야 한다.

미반응 인돌은 유기 용매에 의해 효소가 제거된 반응 혼합물부터 추출된다. 유기 용매는 반응에 사용된것으로부터 선택하는 것이 적당하다. 보통은 반응에 사용된 것과 같은 유기용매가 사용된다. 그러므로 회수된 유기 용매가 이런 목적에 사용될 수 있다. 그러나 용매가 반응에 사용된 것과 같을 필요는 없으며, 트립토판 생성 반응 및 미반응 인돌의 추출에 효과적인 용매가 각각 선택될 수 있다.

상기의 회수 방법은 회수된 인돌이 재사용될 수 있기 때문에, 기질로서 인돌을 사용한 효소 반응에 의해 L-트립토판의 제조에 특히 유용하다. 일반적으로 효소 반응에 의한 L-트립토판의 제조에 있어서, 반응에 사용된 효소 등을 일반적 방법에 의해 반응 혼합물로부터 제거하고, L-트립토판을 분리한다. 미반응 물질을 함유하는 회수된 용액의 이용은 효소의 활성을 저해하며, 이것은 공업적인 사용시 심각한 문제를 일으킨다. 그러나, 상술한 회수방법에 따라 미반응 인돌이 반응 혼합물로부터 유기 용매에 의해 추출될 때, L-트립토판 결정 내의 인돌의 함량이 감소될 수 있으며, 용매용액 형태로 유기 용매에 의해 추출된 인돌은 용액으로부터 추출된 인돌을 분리하지 않고 다음 반응에 재사용될 수 있다(재사용될 때 반응은 효소의 활성을 저해하지 않고 진행된다).

미반응 인돌을 추출하는데 사용된 유기 용매의 양은 유기 용매상과 수상 사이의 인돌의 분포비 및 인돌의 반응 전환에 따라 변화된다. 그러나 지정된 특정 활성을 갖는 효소가 상업적으로 이용되고 반응 전환이 일정하기 때문에 추출에 사용된 유기 용매의 양은 쉽게 결정될 수 있다.

미반응 인돌을 추출하는 공정에는 특별한 제한이 없으며, 공지의 방법에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 적당량의 유기 용매를 효소가 제거된 반응 혼합물에 가하고, 그 혼합물을 교반하여 수상과 유기상을 충분히 접촉시킨다. 상술한 바와 같이, 반응 혼합물을 L-트립토판 결정이 침전되지 않도록 유지하는 것이 바람직하다. 공업적으로는 물에서의 L-트립토판의 용해도를 증가시키기 위해 가열된 상태에서 추출을 수행하는 것이 효과적이다. 상술한 바와 같이 두 상을 균일하게 접촉한 후 혼합물을 방치하여 혼합물을 수상과 유기 용매상으로 분리시킨다. 추출 공정은 배치식으로 수행될 수 있으나, 공업적으로는 역류추출 방법에 의해 연속적으로 수행된다.

추출된 미반응 인돌을 함유한 유기 용매는 다음 반응에 재사용되며, 필요한 경우 새로운 용매를 가하거나 다른 용매와 혼합하거나 새로운 인돌을 공급한다.

이 방법은 인돌의 전환이 효소 반응에서 종종 일어나는 효소의 특정 활성의 변동에 의해 변화할 때 조차도 미반응 인돌이 효과적으로 회수될 수 있기 때문에 공업적으로 대단히 중요하다. 더우기, 추출 및 회수된 인돌이 재사용될 때 조차도 이 반응은 효소의 활성을 저해하지 않고 수행될 수 있다.

상술한 회수 방법이 이용된다면, 미반응 인돌은 공지의 방법에 의해 수득된 L-트립토판 함유 반응 혼합물로부터 효과적으로 추출 및 회수될 수 있다.

구체에(B)에 따라, 생성된 L-트립토판, 미반응 물질, 유기 용매 및 효소를 함유한 반응 혼합물을 먼저 유기용매상 및 수상으로 분리한다. 미반응 물질을 함유한 유기 용매상을 회수한다. 효소를 수상, 즉 L-트립토판을 함유한 반응 혼합물로부터 제거하여 L-트립토판을 수득한다. 효소와 유기 용매가 반응 혼합물에 함께 존재할 때, 수상과 유기 용매상 사이의 중간면이 때때로 불명료해져서 그의 불리가 어렵게 된다. 이런 경우, 분리는 공지의 방법, 예를 들면 반응 혼합물을 원심 분리함으로써 수행될 수 있다. 추출 및 분리가 사용된 유기 용매를 사용하여 반복된다면, 인돌의 제거 효과가 감소한다.

분리 방법에 있어서, 수용액 중의 L-트립토판은 결정으로 침전될 수 있으나. 미반응 인돌을 추출하는 효과는 용해된 상태에서 더 좋다.

바람직하게는 분리시 온도는 유기 용매의 비점 이하이며, 물과 유기 용매가 아조트로프를 형성한다면 그의 비점 이하이다. 분리 및 회수된 인돌 용액은 어떤 문제도 일으키지 않고 다음 반응에 직접 사용될수 있다.

미반응 인돌을 함유한 유기 용매상을 분리한 후, 반응 혼합물로부터 효소를 제거하는 방법에는 특별한 제한이 없다. 한가지 공업적으로 효솨적인 제거 방법은 유기 용매상을 제거한 후 남은 반응 혼합물에 무기산을 가하여 혼합물의 pH 를 2~5로 맞추고, 효소의 응고를 촉진하기에 필요한 만큼 가열한 후, 응고된 덩어리를 여과에 의해 제거하는 방법이다. L-트립토판은 효소가 제거된 반응 혼합물을 농축함으로써 수득될 수 있다.

상기 방법에 의해, 반응 혼합물 중의 미반응 인돌은 효과적으로 유기 용매로 이동한다. 미반응 인돌을 함유한 유기 용매는 필요시 새 용매를 가하거나 새로운 인돌을 공급한 후 다음 반응에 사용될 수 있다.

이 회수 방법은 구체에(A)와 같은 이유로 기질로써 인돌을 사용한 효소 반응에 의한 L-트립토판의 제조에 특히 유용하다.

본 발명의 방법은 인돌로부터 유리된 고순도의 L-트립토판이 수득될 수 있고, 출발 인돌이 회수된어 재사용될 수 있기 때문에 공업적으로 매우 중요하다.

하기의 실시예는 본 발명의 방법을 더욱 상세히 설명한다.

[실시예1]

교반기가 장치된 300ml 플라스크에 9.27g의 L-세린, 3g 의 황산 암모늄, 10mg의 피리독살포스페이트 및 82.5g의 물을 채우고, 잘 교반한다. 진한 암모니아수를 가하여 혼합물의 pH를 8.5로 맞추고, 온도를 35℃로 상승시킨다. 트립토판 합성 효소를 함유한 에스케리키아 콜리(MT-10242) 배양 세포의 습식 크림 케이크 3g을 가한 후, 인돌을 함유한 68.9g의 아세틸 트리부틸 시트레이트 용액을 가한다. 반응을 48시간 동안 수행하고, 5% 수산화나트륨 용액으로 반응 혼합물의 총 부피가 300ml가 되도록 희석하여 생성된 L-트립토판을 완전히 용해시킨다. 용액을 분리 깔대기에 의해 수상 및 유기 용매상으로 분리한다. 수상의 일부를 월심 분리하여 미생물 세포를 침강시킨다. 맑은 상층액을 수집하여, L-트립토판의 농도를 액체 크로마토크래피에 의해 분석하고, 수득된 양을 측정한다. 인돌을 기준으로 한 생성물의 수율은 96.5몰%이다.

사용된 유기 용매의 양과 수상에서의 분포비를 변화시켜 상기의 방법을 반복한다. 결과는 표 1에 기재한다.

상기 반응을 유기용매를 첨가하지 않고 수행할 때, 미생물 함유 액체에서의 인돌의 농도는 3,000ppm이고, L-트립토판의 수율을 47몰%이다. 이와같은 실험적 사실로부터 L-트립토판의 제조를 위해서 물과 혼합할 수 없는 유기 용매를 가하고 미생물 함유 액체에서의 인돌의 농도를 낮게 유지하는 것이 중요하다는 것을 알 수 있다. 특별하게는, 유기 용매를 가하지 않고 물에서 반응을 수행할 때 수상에서의 인돌의 농도는 3,000ppm이 되고, 인돌을 기준으로 한 L-트립토판의 수율은 47몰%이다. 반대로, 부틸 시트레이트를 유기 용매로써 가하고, 수상에서의 인돌의 농도를 790ppm에서 유지시킬 때, 인돌을 기준으로 한 L-트립토판의 수율은 95몰%로 현저하게 증가한다. 수상에서의 인돌의 농도를 1,070ppm(800ppm 이상)에서 유지시킬 때 L-트립토판의 수율은 인돌 농도가 800ppm일 때 수득된 것보다 약 10% 감소한다.

[표1]

(^*1) : 아세틸트리부틸 시트레이트

(^*2) : 반응의 초기 단계

(^*3) : 유기 용매를 가하지 않음

[실시예2]

트립토판 합성 효소를 함유한 에스케리키아 콜리(MT-10,242)의 습식 크림 케이크 6.8g(고체함량 1.7g) 및 세린 라세마제를 함유한 슈도모나스 푸티다(MT-10182) 3.4g(고체 함량 0.85g)을 물에 현탁시키고, 현탁액의 총 부피를 20ml로 맞춘다.

11.3g의 DL-세린, 6.0g의 황산 암모늄, 10mg의 피리독살 포스페이트 및 66g의 물을 함유한 수용액을 300ml의 플라스크에 채우고, 진한 암모니아수로 수용액의 pH를 8.5로 맞춘 후, 상기에 제조된 미생물 세포 현탁액을 플라스크에 넣는다.

플라스크의 내부를 35℃로 유지시키고, 11.5g의 인돌을 함유한 57.2g의 톨루엔용액을 가한 후, 이 온도에서 48시간 동안 반응을 수행한다. 반응 초기에 수상에서의 인돌의 농도는 720ppm이다.

반응 생성물을 실시예1과 같은 방법으로 분석한다. 인돌을 기준으로 한 L-트립토판의 수율은 89.3몰%이다.

수상에서의 인돌 농도의 영향을 측정하기 유해, 사용된 톨루엔의 양을 변화시켜 상기의 방법을 반복한다. 이들에 대한 L-트립토판의 수율은 표 2에 나타낸다.

이들 결과로부터 수상에서의 인돌의 억제 농도가 약 800ppm임을 알 수 있다. 반응을 720ppm 이하의 인돌 농도에서 출발하였을 때 L-트립토판의 수율은 90몰%이나. 반응을 920ppm의 인돌 농도에서 출발하였을 때 수율은 82몰%이다.

[표 2]

[실시예3]

실시예2의 방법에 의해, DL-세린 및 인돌을 에스케리키아 콜리(MT-10232)의 배양 세포 및 슈도모나스 풍크타타(MT-10243)의 배양 세포 존재하에 반응시킨다.

이때, 메틸이소부틸케톤을 유기용매로써 사용하고, 반응 사작시 수상에서의 인돌의 농도를 760ppm으로 맞추고 반응을 수행한다.

35℃에서 48시간 동안 반응을 수행한 후, 인돌을 기준으로 한 L-트립토판의 수율은 98.6몰%이다.

수상에서의 인돌 농도의 영향을 측정하기 위해, 메틸이소부틸 케톤의 양을 변화시키고 L-트립토판의 수율의 변화를 측정한다. 결과는 표3에 나타낸다.

메틸이소부틸 케톤을 사용하여 수상에서의 인돌의 농도를 800ppm 이하로 유지시킴으로써 L-트립토판이 99몰% 이상의 수율로 수득될 수 있다는 것을 알 수 있다.

[표 3]

[실시예4]

실시예2와 같은 방법으로, DL-세린 및 인돌을 에스케리키아 콜리(MT-10242) 및 슈도모나스 푸티나(MT-10182) 존재하에 반응시킨다. 용매로써 아니솔을 사용하여 수상에서의 인돌의 농도를 300ppm 이하로 유지시킨다.

35℃에서 48시간 동안 반응시킨 후, 인돌을 기준으로 한 L-트립토판의 수율은 95몰%이었다.

[실시예5]

20g의 DL-세린, 1.0g의 암모니아 아세테이트, 0.2g의 소듐 비설페이트, 0.1g의 DEAT 및 에르위니아 헤르비콜라(ATCC 21434)의 배양 브로스톨 200ml 반응용기에 채운다.

0.2%의 L-티로신, 0.2%의 K₂HPO₄, 0.1%의 MgSO₄·7H₂O, 2ppm의 FeSO₄·7H₂O, 0.01%의 피리독신 히드로클로라이드, 0.6%의 글리세롤, 0.5%의 숙신산, 0.1%의 DL-메티오닌, 0.2%의 DL-알라닌, 0.05%의 글리신, 0.1%의 L-페닐알라닌 및 20ml의 대두 단백질 가수분해물을 함유한 배양 배지에서 산소 조건하 28℃에서 28시간 동안 에르위니아 헤르비콜라를 배양함으로써 배양 브로스를 수득한다.

0.7g의 피로카테콜을 함유한 톨루엔 용액을 가하고, 물에서의 피로카테콜 농도를 3,000ppm 이하로 맞춘다. 이런 조건하, 37℃의 온도 및 pH 8에서 48시간 동안 반응을 수행한다. 축적된 L-DOPA의 양은 30g/l이다.

[실시예6]

에스케리키아 콜리를 함유한 미생물 세포를 모노포타슘 포스페이트, 디포타슘 포스트페이트, 황산암모늄, 염화칼슘, 황산철, 이스트 추출물 및 폴리펩톤 존재하에 배양 배지에 공기를 불어넣고 글루코오즈와 인돌을 가하면서 30℃및 pH 7에서 배양한다. 또한 슈도모나스 푸티나를 함유한 미샹물 세포는 유사한 배양 배지에서 공기를 불어 넣고 글루코오즈를 가하면서 30℃ 및 pH 7에서 배양한다. 40시간이 되면, 이 미생물 세포는 30~35g/l가 된다. 고속원심분리기에 의해 수분 함량이 80~85 %인 크림케이크를 수득한다.

DL-세린(77.3g), 10.5g의 황산 암모늄 및 486g의 물을 플라스크에 채우고, 29% 암모니아수를 가하여 혼합물의 pH를 8.5로 맞춘다. 에스케리키아 콜리의 크림 케이크 51.2g 및 슈도모나스 푸티다의 크림 케이크 23.2g을 가하고, 전체 혼합물을 잘 교반한다. 78.4g의 인돌이 함유된 392g의 톨루엔용액을 가하고, 35℃에서 40시간 동안 반응을 수행한다. 반응 혼합물에서의 L-트립토판의 함량을 액체 크로마토그래피로 분석하면 129.8g이다. 이 수율은 인돌을 기준으로 95.0%이다.

톨루엔을 유거하고, 반응 혼합물을 물로 희석하여 L-트립토판의 농도를 4.2중량%로 맞춘다. 98% 황산을 가하여 혼합물의 pH를 4.0으로 맞추고, 27g의 활성탄을 가한다. 온도를 95℃로 올리고, 혼합물을 95~98℃에서 1시간 방치한 후, 이 온도에서 고온 여과하여 세포와 활성탄을 제거한다. 80℃에서 회수된 톨루엔 여과액에 가하고 잘 교반한다. 교반을 중단하고 혼합물을 방치한다. 상층의 톨루엔층과 하층의 수층으로 분리되면 톨루엔층을 제거하고 상기와 같은 량의 톨루엔을 다시 수층에 가하여 추출을 반복한다.

첫번재 축출 후의 수층에서의 인돌의 농도는 55ppm이고 두번째 추출 후는 4ppm이다.

수층을 농축하여 L-트립토판의 농도가 10중량%가 되게 한 후, 20℃로 냉각시킨다. 침전된 L-트립토판 결정을 여과에 의해 수집하여 수세 및 건조시킨다. 분리된 L-트립토판의 양은 100g이다. 순도는 99.5%이고 인돌의 함량은 0ppm이다. 회수된 인돌의 톨루엔용액에 톨루엔을 더 가하여 다음 반응에 사용하였을 때 L-트립토판의 수율에는 영향이 없으며 반응이 잘 진행된다.

[표 4]

500ppm 및 2,000ppm의 미반응 인돌을 함유한 각 반응 혼합물 316g을 80℃에서 27.6g의 톨루엔으로 추출하고, 추출 회수와 수상에 남아 있는 인돌의 농도 사이의 관계를 검사한다. 결과는 표 5에 나타낸다.

[표 5]

[실시예7]

L-세린 및 인돌을 물 및 디이소부틸케톤 중에서 35℃ 및 pH 8.5에서 실시예6의 방법에 의해 배양된 에스케리키아 콜리 존재하 반응시킴으로써 L-트립토판을 제조한다. L-트립토판의 수율은 인돌을 기준으로 98.3%이다.

반응 혼합물을 증류시켜 디이소부틸케톤을 제거하고, 원심 분리하여 L-트립토판 및 미생물 세포를 함유한 습식 크림 케이크를 수득한다.

크림 케이크를 물로 희석하여 L-트립토판의 농도가 0.8중량%가 되게 한다. L-트립토판 결정을 물에 용해시키고, 이 용액을 실온에서 울트라 여과막에 통과시켜 미생물 세포를 제거한다. 이때, 수상에서의 인돌의 농도는 90ppm이다. 수상의 1/5량의 디이소부틸케톤을 가하고, 혼합물을 교반한다. 혼합물을 방치하여 두 층으로 분리시킨다. 디이소부틸케톤층을 제거한다. 상기와 같은 량의 디이소부틸케톤을 사용하여 같은 추출 공정을 반복한다.

첫번쩨 추출 후 수상에서의 인돌의 농도는 32ppm이고, 두번째 추출 후에는 2ppm이다.

인돌을 함유한 디이소부틸케톤 층에 필요한 량의 인돌을 공급한 후 다음 반응에 사용한다. 다음 반응에서 어떤 문제도 발생하지 않았다.

[실시예8]

DL-세린 및 인돌을 pH 8.5 및 35℃에서 물 및 벤젠 중에서 실시예8과 같은 방법으로 배양 및 수집된 에스케리키아코리 및 슈도모나스 풍크타타 존재하에 반응시킴으로써 L-트립토판을 제조한다. 인돌을 기준으로 한 L-트립토판의 수율은 93.7%이다.

반응 혼합물을 증류하여 벤젠을 제거하고 물로 희석하여 L-트립토판의 농도가 4.2중량%가 되게 한다. 희석된 혼합물에 염산을 가하여 pH를 3.5로 맞추고, 생성된 트립토판을 기준으로 15중량% 의활성탄을 가한다. 혼합물을 95~98℃에서 1시간 동안 가열하고, 같은 온도에서 1시간 동안 가압 여과한다. 80℃에서 여과액에 벤젠을 가한다. 혼합물을 잘 교반하고 방치하여 층을 분리시킨다. 사용된 벤젠은 상기와 같은 증류에 의해 희수된 것이다. 같은 량의 새로운 벤젠을 사용하여 같은 추출 공정을 3번 반복한다. 추출전의 수상에서의 인돌의 농도는 1,850ppm이고, 한번 추출한 후는 265ppm, 두번 추출한 후는 43ppm, 세번 추출한 후는 4.6ppm이다. 반응 혼합물을 농축 및 결정화할 때, 순도 99.7%의 L-트립토판이 인돌을 기준으로 69.8% 수율로 수득된다. 그의 인돌 함량은 2.1ppm이다.

회수된 인돌의 벤젠 용액에 필요한 량의 새로운 인돌을 공급한 후 다음 반응에 사용한다. 다음 반응에 어떤 문제점도 나타나지 않았다.

[실시예9]

11.3g의 DL-세린, 6.0g의 황산 암모늄, 10mg의 피리독살 포스페이트 및 66g의 증류수를 함유한 수용액을 300ml 플라스크에 넣고 35℃에서 교반한 후, 29% 암모니아수를 가하여 용액의 pH를 8.5로 맞춘다.

실시예6과 같은 방법으로 배양된 에스케리키아 콜리를 함유한 4.0g의 세포 크림케이크 및 실시예 6과 같은 방법으로 배양된 슈도모나스 푸티다를 함유한 2.5g의 세포 크림을 가하고 35℃에서 잘 교반하여 이들을 분산시킨다. 또한 26.8g의 디이소부틸케톤에 녹인 11.5g의 인돌 용액을 가하고, 혼합물을 35℃ 및 90rpm에서 40시간 동안 교반한다.

반응 후, 교반을 중단한다. 반응 혼합물을 방치하여 두 층으로 분리시킨다. 상층의 디이소부틸케톤 층을 제거한다. 상기와 같은 량의 디이소부틸케톤을 가하고, 혼합물을 90rpm에서 30분간 교반한다. 혼합물을 방치하고 디이소부틸케톤층을 상기와 같은 방법으로 회수한다.

반응이 종결된 후 반응혼합물에 남아 있는 미반응 인돌을 디이소부틸케톤으로 일차 추출하여 85% 정도 회수하고, 이차 추출에 의해 99% 정도 회수한다. 인돌의 양을 기체 크로마토그래피에 의해 분석한다.

희수된 디이소부틸케톤에 필요한 량의 인돌을 가하여 다음 반응에 사용하여도 아무런 문제를 일으키지 않는다.

[실시예10]

45.7g의 톨루엔을 사용하여 640rpm의 회전 속도에서 실시예 9와 같은 반응을 수행한다.

반응 후, 반응 혼합물을 균일한 에멀젼이기 때문에 이를 원심 분리하여 두층 사이의 뚜렷한 경계를 만든다.

상층 톨루엔층을 제거하고 같은 량의 톨루엔을 가한 후, 미반응 인돌의 추출을 반복한다.

반응 종결시 반응 혼합물에 함유된 미반응 인돌은 일차 추출에서 87%, 이차 추출에서 99.9% 회수된다.

회수된 인돌 함유 톨루엔에 필요한 량의 인돌을 공급한 후 다음 반응에 사용하여도 문제를 일으키지 않는다.

[실시예 11]

14.3g의 에틸 시트레이트를 사용하여 실시예 9와 같은 반응을 수행한다. 반응 후 균일한 에멀전 형태의 반응 혼합물을 연속적 원심 분리하여 수층과 에틸 시트레이트층을 분리한다. 반응에서 사용된 것과 같은 량의 에틸 시트레이트를 수층에 가하고, 혼합물을 다시 연속 원심 분리하여 수층과 유기층으로 분리시킨다.

수층의 일부를 채취하여, 고수율 액체 크로마토그래피에 의해 생성된 트립토판을 분석한다. 그의 수율은 인돌을 기준으로 99.7%이다.

반응 혼합물을 물로 희석하여 L-트립토판의 농도를 4.2중량%로 하고, 황산을 가하여 pH를 3.5로 맞춘다. 분말성 활성탄을 L-트립토판 기준으로 15중량% 가하고, 혼합물을 90℃에서 1시간 가열한다. L-트립토판 결정을 완전히 용해시킨 후, 이 용액을 같은 온도에서 흡인 여과시켜 활성탄과 함께 미생물 세포를 제거한다.

고온 여과액을 농축하여 L-트립토판 농도가 10중량%가 되게 한 후 10℃로 냉각시킨다. 용액의 pH를 5.9로 맞추고, 침전된 비늘형 결정을 여과에 의해 분리하여 수세 및 건조시킨다.

분리된 L-트립토판의 수율은 기준으로 74.5몰%이다. 순도는 99.4%이고 인돌 함량은 1.2ppm이다.

회수된 인돌을 함유한 에틸 시트레이트에 필요한 량인 인돌을 공급한 후 다음 반응에 사용한다. 다음 반응에서 L-트립토판의 수율에는 영향이 없으며, 반응이 잘 진행된다.

[실시예12]

에스케리키아 콜리를 함유한 세포 및 슈도모나스 푸티다를 함유한 세포를 실시예 9와 같은 방법으로 배양하고, 원심 분리하여 각각 수분 함량이 75%인 두 미생물의 세포 크림 케이크를 수득한다.

77.3g 의 DL-세린, 10.5g의 황산 암모늄 및 486g의 물을 함유한 수용액에 29% 암모니아수를 가하여 pH 8.5로 맞추고, 상기에서 수득된 에스케리키아 콜리의 세포 크림 케이크 51.2g 및 슈도모나스 푸티다의 세포 크림 케이크 23.2g을 가한다. 이들을 교반하여 분산시키고, 78.4g의 인돌이 함유된 톨루엔 392g을 가한다. 35℃에서 48시간 동안 반응을 수행한다.

반응 후, 반응 혼합물의 일부를 취하고 원심 분리하여 톨루엔층과 수층으로 분리시킨다. L-트립토판의 결정이 침전된 수층에 알칼리를 가하여 L-트립토판을 용해시킨다. 수층을 막 필터에 통과시켜 미생물 세포를 제거한다. 여과액을 고수율 액체 크로마토그래피하여 L-트립토판을 분석한다. 반응 혼합물에서 L-트립토판의 수율은 인돌을 기준으로 99.3몰%이다.

반응 혼합물의 또 다른 부분을 취하여, 원심 분리에 의해 수층과 톨루엔충으로 분리시킨다. 톨루엔에 함유된 미반응 인돌의 농도를 기체 크로마토그래피로 측정하면 2.3ppm이다.

인돌을 함유한 톨루엔 용액에 필요한 량의 새로운 인돌을 가한 후 다음 반응에 사용하였을 때, L-트립토판의 수율에는 어떤 영향도 끼치지 않으며, 반응이 잘 진행된다.

결과는 표 6에 나타낸다.

[표 6]

원심 분리에 의해 회수된 수층을 물로 희석하여 L-트립토판의 농도가 4.2중량%가 되게 하고 98% 황산을 가하여 pH 4.0으로 맞춘다. 분말상 활성탄(27g)을 가하고, 혼합물의 온도를 98℃로 상승시킨다. 혼합물을 98~100℃에서 1시간 방치하여, L-트립토판의 침전된 결정을 용해시킨다.

미생물 세포는 고온 여과에 의해 활성탄과 함께 제거시킨다. L-트립토판의 농도가 15중량%가 되도록 여과액을 농축하여 L-트립토판의 비늘형 결정을 침전시킨다. 여과에 의해 10℃에서 결정을 분리하고 수세 및 건조시켜 순도 99.2%의 L-트립토판 연황색 비늘형 결정을 인돌 기준으로 81.3몰%의 수율로 수득한다. 생성된 L-트립토판 결정은 -31.8°의 비선광도, 20ppm 이하의 중금속 함량, 0.02중량%의 강열잔분 및 0.01중량%의 암모늄 함량을 갖는다.

Claims (1)

1. 물과는 혼화할 수 없으나 기질과는 혼화하는 유기용매를 반응계에 가하여 수상에서의 기질의 농도를 효소의 활성이 실제로 억제되는 농도 이하로 감소시킴을 특징으로 하는, 수상에서의 효소 반응시 기질에 의한 효소 활성의 저하를 방지하는 방법.