CH659824A5

CH659824A5 - Verfahren zur verhinderung der herabsetzung der aktivitaet eines enzyms in einer enzymreaktion in waessriger phase.

Info

Publication number: CH659824A5
Application number: CH696983A
Authority: CH
Inventors: Masaharu Ohoka; Yukihiro Yoshikawa; Nobuyuki Kawashima; Nobuhiro Kawashima; Syosuke Magao; Takao Takano
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date: 1982-07-08
Filing date: 1983-12-29
Publication date: 1987-02-27
Also published as: AU2280183A; JPS5911187A; GB2151634B; CA1207689A; FR2557590A1; NL8304495A; GB8333899D0; FR2557590B1; AU564178B2; DE3347617A1; DE3347617C2; JPH0724587B2; GB2151634A

Description

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PATENTANSPRUCH Verfahren zur Verhinderung der Herabsetzung der Aktivität eines Enzyms durch ein Substrat in einer Enzymreaktion in wässriger Phase, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Reaktionssystem ein mit Wasser nicht mischbares, jedoch mit dem Substrat mischbares organisches Lösungsmittel in solchem Mengenanteil zusetzt, dass die Konzentration des Substrats in der wässrigen Phase unterhalb der Konzentration, bei welcher die Aktivität des Enzyms praktisch aufgehoben würde, gehalten wird.

Die vorliegende Erfindung ist auf eine Verbesserung einer Enzymreaktion in wässriger Phase gerichtet.

Bei Reaktionen unter Verwendung eines Enzyms ist Wasser das beste Reaktionsmedium für das Enzym und demzufolge werden derartige Reaktionen üblicherweise in wässriger Phase ausgeführt. Einige Substrate zeigen jedoch in Wasser geringe Löslichkeit. Bei Verwendung derartiger Substrate werden verschiedene Massnahmen ergriffen, um sicher zu stellen, dass ein für die Reaktion in wässriger, ein Enzym enthaltender Phase (oft als Enzym enthaltende Flüssigkeit bezeichnet) das benötigte Substrat in genügendem Mengenanteil vorhanden sei, um die Reaktion glatt ausführen zu können. Es ist beispielsweise bekannt, die Reaktion unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels auszuführen. In der JP-AS 34 153/1972 ist offenbart, dass Toluol, Butanol, Ethanol oder Aceton in Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan aus Indol und Serin unter Verwendung eines Bakteriums vom genus Aerobacterium als Reaktionsförderer eingesetzt wird. In der GB-AS 13 134 wird offenbart, dass bei der Oxidation von Decan ein wasserunlösliches Substrat in Gegenwart eines Decan oxidierenden Enzyms, mit Wasser mischbares Dimethylformamid und das Substrat eingesetzt werden.

In diesen Methoden werden die organischen Lösungsmittel verwendet, um das Lösen der Substrate in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit zu unterstützen und die Reaktionen zu fördern.

In Reaktionen unter Verwendung von Enzymen sollte der Einfluss der Konzentration eines Substrats auf ein Enzym in Betracht gezogen werden. Wenn in einer Enzymreaktion die Konzentration eines Substrats in der Reaktionsphase hoch ist, kann die Aktivität des Enzyms deutlich herabgesetzt werden und die Reaktion verzögern. Es ist bekannt, dass beispielsweise bei der Herstellung von Tryptophan in Gegenwart eines Enzyms unter Verwendung von Anthranil-säure als Vorläufer, die Konzentration von Anthranilsäure in der wässrigen Phase zur Herabsetzung der Aktivität des in der Reaktion verwendeten Enzyms führt, wie in der US-PS 4 363 875 beschrieben; bei der Herstellung von L-DOPA aus L-Serin und Pyrocatechin unter Verwendung von Erwinia herbicola, vermindert die Anwesenheit von Pyrocatechin als ein Substrat in einer hohen Konzentration in der wässrigen Phase die Wirksamkeit des Enzyms, wie in «Agric. Biol. Chem.», Bd. 37, S. 493-499 und 725-735,1973, beschrieben; und in der Herstellung von Tryptophan aus Indol und Serin vermindert Indol als ein Substrat die Aktivität von Trypto-phan-Synthetase, wie von U. Behrendt in «The First European Congress on Biotechnology», 2/186-2/189,1978, beschrieben.

Daraus ergibt sich, dass wenn anzunehmen ist, dass in einer Reaktion unter Verwendung eines Enzyms ein Substrat die Wirksamkeit des Enzyms vermindere, die Reaktion solcherart auszuführen wäre, dass die Konzentration des Substrats in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit unterhalb der Konzentration gehalten wird, bei welcher die Aktivität des

Enzyms herabgesetzt wird (die Inhibierungskonzentration) um glatten Verlauf der Reaktion selbst dann zu ermöglichen, wenn das Substrat in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit vollständig löslich ist. Um Reaktionen dieser Art zu indu-5 strialisieren, muss ein kontinuierlicher Analysator für die kontinuierliche Analyse der Substratkonzentration während der Reaktion entwickelt werden, um die Konzentration des Substrats in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit unterhalb der Inhibitionskonzentration zu halten. Ausserdem wird zur io kontinuierlichen Einleitung des Substrats ein Zuführungssystem benötigt, das mit dem kontinuierlichen Analysator in direkter Verbindung steht. Dadurch werden die Einrichtung und die Reaktionsausführung unvermeidlich komplex. Falls in Reaktionen dieser Art ein grosser Überschuss eines En-15 zyms eingesetzt und die Verbrauchsgeschwindigkeit des Substrats in der Reaktion höher gemacht wird als die Mischgeschwindigkeit des Substrats mit Wasser, kann die Reaktion natürlich bei einer wesentlich niedrigeren Substratkonzentration als der Inhibierungskonzentration ausgeführt wer-20 den. Da jedoch der Mengenanteil des in der Reaktion verbrauchten Enzyms in der Praxis sehr hoch liegt, ist ein derartiges Vorgehen industriell bedeutungslos.

Aus Indol durch eine Enzym- bzw. Fermentationsreaktion hergestelltes Tryptophan sollte zweckmässig von unre-25 agiertem Indol frei sein, wenn es in Arzneimitteln oder Futtermittelzusätzen zum Einsatz gelangt, da das unreagierte Indol einen unangenehmen Eigengeruch freisetzt.

Bisher was als Methode zur Entfernung des unreagierten Indols aus der Reaktionslösung bei der Herstellung von L-30 Tryptophan aus Indol durch eine Enzymreaktion Dampfdestillation bekannt, wie in der JP-AS 800/1982 bekannt. Da jedoch der Dampfdruck von Indol niedriger ist als derjenige von Wasser, wird zur Entfernung von Indol durch Destillation eine grosse Dampfmenge benötigt. Dies erhöht die 35 Energiekosten und eine derartige Methode ist kommerziell nicht zu verantworten. Es besteht daher ein starker Wunsch zur Lösung dieses Problems.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zu schaffen, um die Herabsetzung der Aktivi-40 tät eines Enzyms durch ein Substrat in einer Enzymreaktion in wässriger Phase zu verhindern.

Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemässe, im Patentanspruch definierte Verfahren gelöst.

Das erfindungsgemässe Verfahren bietet die folgenden 45 Ausführungsformen:

(A) Ein Verfahren, das die Ausführung einer Enzymreaktion unter Verwendung von Indol als ein Substrat in einer wässrigen Phase in Gegenwart eines organischen, mit Wasser nicht jedoch mit Indol mischbaren Lösungsmittels umfasst,

so wobei das organische Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch zurückgewonnen und das Enzym entfernt wird, das unreagierte Indol aus der erhaltenen wässrigen Lösung von L-Tryptophan mit dem zurückgewonnenen organischen Lösungsmittel extrahiert und der Extrakt in der Reaktion wie-55 derverwendet wird; und

(B) eine Methode, die eine Enzymreaktion unter Verwendung von Indol als ein Substrat in einer wässrigen Lösung in Gegenwart eines organischen, mit Wasser nicht jedoch mit Indol mischbaren Lösungsmittels umfasst, wobei das unre-

6o agierte Indol als organische Lösungsmittelschicht aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt wird.

Das Grundprinzip dieser Erfindung besteht darin, dass die Konzentration eines Substrats in einer wässrigen Phase unterhalb einer bestimmten, festgelegten Konzentration in «s Übereinstimmung mit dem Verteilungsverhältnis des Substrats zwischen einer organischen Lösungsmittelphase, in welcher das Substrat gelöst ist, und der wässrigen Phase gehalten wird.

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Im allgemeinen muss in einer Reaktion, in welcher die Aktivität eines Enzyms durch ein Substrat vermindert wird, die Konzentration des Substrats in einer wässrigen Phase stets niedrig gehalten werden, wobei für diesen Zweck eine Methode zum Einsatz gelangt, in welcher das Substrat auf irgendeine Art dem das Enzym enthaltenden Reaktionssystem entweder kontinuierlich oder ansatzweise in kleinen Anteilen zugesetzt wird. Diese Methode verlangt jedoch für die Kontrolle der Reaktion einen komplexen Betrieb und eine komplizierte Apparatur, sodass bei Zugabe des Substrats zum Reaktionssystem dessen Konzentration in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit niedrig gehalten wird.

Im Gegensatz dazu wird im erfindungsgemässen Verfahren einer Enzym enthaltenden Flüssigkeit ein organisches, mit Wasser nicht jedoch mit einem Substrat mischbares Lösungsmittel zugesetzt, um das Substrat in der organischen Lösungsmittelphase fast vollständig zu lösen. Als Resultat kann die Konzentration des Substrats in der wässrigen Phase in Übereinstimmung mit dem VerteilungsVerhältnis des Substrats zwischen der organischen Lösungsmittelphase und der wässrigen Phase wesentlich unterhalb der Inhibitionskonzentration gehalten werden. Zu diesem Zeitpunkt spielt es keine Rolle, ob das Reaktionsprodukt in der organischen Lösungsmittelphase oder der Enzym enthaltenden Phase gelöst oder ausgefällt wird.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird das Substrat in der Enzym enthaltenden Flüssigkeitsphase in Übereinstimmung mit dem Verteilungsverhältnis des Substrats zwischen den beiden Phasen bei fortschreitender Reaktion und Verbrauch des Substrats kontinuierlich aus der organischen Lösungsmittelphase zugeführt. Das organische Lösungsmittel für das Lösen des Substrats kann in einem Guss oder in Unterbrüchen oder kontinuierlich zugesetzt werden, vorausgesetzt, dass die Konzentration des Substrats in der wässrigen Phase unterhalb der Inhibitionskonzentration gehalten werden kann. Nötigenfalls kann die Bewegungsgeschwindigkeit des Substrats durch Veränderung der Kontaktfläche zwischen oder organischen und der wässrigen Phase verändert werden, beispielsweise durch Rühren.

Im erfindungsgemässen Verfahren können Enzyme einzeln oder in Form eines Gemischs von zwei oder mehreren eingesetzt werden, wovon jedoch mindestens eines von der Art sein sollte, dessen Aktivität durch ein Substrat vermindert wird, wenn es in einer nach konventioneller Methode ausgeführten Enzymreaktion verwendet wird.

Die im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Enzyme müssen nicht stets rein und können roh sein. Beispielsweise können die Enzyme durch Zentrifugation aus einer Kulturbrühe eines Enzym produzierenden Mikroorganismus gewonnene Enzyme in Form von lebenden Zellen oder dgl., und durch Einfrieren oder Trocknen der lebenden Zellen erhalten sein; oder weiterverarbeitete Produkte davon, beispielsweise durch Mahlen, Eigenverdauung, Ultraschallbehandlung, Extraktion der Zellen und aus den Extrakten gewonnene Enzyme.

Das im erfindungsgemässen Verfahren verwendete organische Lösungsmittel ist mit Substraten, mit Wasser jedoch nicht mischbar. In der Praxis ist es notwendig, in Abhängigkeit von den jeweils verwendeten Enzymen diejenigen organischen Lösungsmittel auszuwählen, welche die Aktivität des jeweiligen Enzyms unter den Reaktionsbedingungen nicht vermindern.

Ein für ein bestimmtes Substrat und Enzym brauchbares organisches Lösungsmittel wird ausgewählt und dessen Mengenanteil bestimmt, wie nachstehend beschrieben. Spezifisch werden ein Enzym und ein zu reagierendes Substrat gewählt und die Inhibitionskonzentration des Substrats in einer Enzym enthaltenden Flüssigkeit unter den Reaktionsbedingungen wird gemessen. Dann wird das Verteilungsverhältnis des Substrats zwischen der Enzym enthaltenden Flüssigkeit und dem organischen Lösungsmittel bestimmt und die Konzentration des Substrats im organischen Lösungsmittel vorgeschrieben, die niedriger ist als die vorstehend gemessene Inhibitionskonzentration.

Sobald einmal die Konzentration des Substrats in dem in der Reaktion zu verwendenden organischen Lösungsmittel wie vorstehend beschrieben bestimmt ist, können die Mengenanteile der Enzym enthaltenden Flüssigkeit und des verwendeten organischen Lösungsmittels aus dem Mengenanteil des verwendeten Substrats in Abhängigkeit von der Konzentration des erwünschten, im Reaktionsgemisch angesammelten Reaktionsproduktes bestimmt werden.

Solange also die Konzentration des Substrats in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit niedriger gehalten werden kann als die Inhibitionskonzentration, kann das organische Lösungsmittel frei gewählt und dessen Mengenanteil frei bestimmt werden.

Im nachstehenden wird das erfindungsgemässe Verfahren unter Bezugnahme auf die Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von Indol und L- oder DL-Serin als Substrate beispielsweise erläutert. Da bei der Herstellung von L-Tryptophan aus Indol und L-Serin unter Einsatz von Tryp-tophan-Synthetase, Indol die Aktivität von Tryptophan-Synthetase vermindert, muss die Reaktion unter Einhaltung einer niedrigen Konzentration von Indol in Wasser ausgeführt werden. Für diesen Zweck wurden nicht-ionische oberflächenaktive Mittel oder Adsorptionsharze verwendet, wie von Behrendt in «The First European Congress in Biotech-nology», 2/186-189, 1978, beschrieben. Die Reaktion in Gegenwart eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels unterscheidet sich jedoch im Mechanismus von der Reaktion nach dem erfindungsgemässen Verfahren, die zur Hauptsache zwischen zwei Phasen erfolgt, da Indol unter dem Ein-fluss des oberflächenaktiven Mittels in der wässrigen Phase in Form einer Micelle vorliegt. Ausserdem ist diese Methode kommerziell nicht ausführbar, da es schwierig ist, das oberflächenaktive Mittel nach der Reaktion vom Reaktionsprodukt abzutrennen. Die Methode unter Verwendung eines Adsorptionsharzes ist industriell nachteilig, da bei gewissen Adsorptionsharzen von diesen adsorbiertes Indol nicht vollständig abgetrennt werden kann oder das Reaktionsprodukt zur Adsorption auf diesem Harz neigt.

Wenn im Gegensatz dazu eine Lösung von Indol in einem organischen Lösungsmittel einer Serin- und das Enzym enthaltenden wässrigen Lösung zugesetzt und die Reaktion in zwei Phasen ausgeführt wird, kann die Konzentration des in der wässrigen Phase gelösten Indols niedrig gehalten werden und Indol wird in Abhängigkeit von dessen Verbrauch durch die Reaktion automatisch aus der organischen Lösungsmittelphase zugeführt. Die Reaktion verläuft somit glatt.

In einer einen Stamm einer Mutante von Escherichia coli enthaltenden Flüssigkeit beträgt die Inhibitionskonzentration von Indol etwa 800 ppm. Organische Lösungsmittel, welche Indol in der wässrigen Phase in niedrigerer als der Inhibitionskonzentration verteilen, sind beispielsweise Toluol, Chlorbenzol, Ethylcitrat, Methylisobutylketon und Anisol. Wenn beispielsweise eine 20 gew.-%ige Lösung von Indol in Toluol verwendet wird, löst sich Indol in einer einen Stamm einer Mutante von Escherichia coli enthaltenden Flüssigkeit in einer Konzentration von weniger als 720 ppm und die Reaktion kann unter Einhaltung einer niedrigeren als der vorstehend genannten Inhibitionskonzentration von Indol ausgeführt werden. Die Konzentration von Indol in einer Enzym enthaltenden Flüssigkeit unter Reaktionsbedingungen kann niedriger als 800 ppm gehalten werden, wenn die Kon-

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zentration von Indol in anderen Lösungsmitteln bei Ethylci- die Grenzfläche zwischen der wässrigen und der organischen trat 40 Gew.-%, bei Methylisobutylketon 50 Gew.-%, bei Lösungsmittelphase undeutlich und es ist oft schwierig, das Anisol 30 Gew.-% bzw. bei Monochlorbenzol 20 Gew.-% organische Lösungsmittel, in welchem das unreagierte extrabeträgt. hierte Indol gelöst ist, abzutrennen. Um diese Erscheinung Nach einer typischen Ausführungsform des erfindungsge- 5 zu vermeiden, ist es üblich, an erster Stelle das organische mässen Verfahrens kann L-Tryptophan hergestellt werden Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch zurückzugewin-durch Kultivierung eines Stamms einer Mutante von Esche- nen. Dies kann beispielsweise durch übliche Destillation aus-richia coli, indem ein für Tryptophanase unzulänglicher geführt werden. Danach kann das im Reaktionsgemisch, aus Stamm einer Mutante von L-Tryptophan benötigenden welchem das organische Lösungsmittel entfernt wurde, entEscherichia coli, eine Kohlenstoff-, eine Stickstoffquelle und 10 haltene Enzym entfernt werden.

anorganische Salze enthaltendes Kulturmedium bei 28-40 °C Es gibt keine besondere Einschränkung der Art der Ent-und einem pH-Wert von 6-8 aeroben Bedingungen unterzo- fernung des in der Reaktion verwendeten Enzyms aus dem gen wird, die mikrobiellen Zellen entweder wie in der Kul- Reaktionsgemisch. Eine industriell wirksame Methode um-turbrühe oder nach Abtrennung aus dem Kulturmedium in fasst Zugabe eines Mineralöls zum Reaktionsgemisch, aus einer Pyridoxalphosphat, L-Serin und anorganisches Mate- 15 welchem das organische Lösungsmittel entfernt wurde, wo-rial enthaltenden Lösung suspendiert werden, dann eine Lö- bei der pH-Wert des Reaktionsgemischs auf 2-5 gestellt sung von Indol in einem mit Indol jedoch nicht mit Wasser wird, soweit benötigt Erwärmung des Reaktionsgemischs mischbaren Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 7,5-9,5, zur Förderung der Ausflockung des Enzyms und Entfernung vorzugsweise 8-9, in einem Guss oder kontinuierlich zugege- des ausgeflockten Enzyms, beispielsweise durch Filtration, ben und die Reaktion bei 20-40 °C ausgeführt wird. 20 Nötigenfalls kann das Reaktionsgemisch nach Entfer-

Zu diesem Zeitpunkt verwendbare organische Lösungs- nung des Enzyms konzentriert werden. Zur wirksamen Exmittel sind beispielsweise aromatische Kohlenwasserstoffe traktion und Abtrennung des unreagierten Indols aus dem und deren Derivate, wie Benzol, Toluol, Chlorbenzol, Nitro- Reaktionsgemisch wird es bevorzugt, L-Tryptophan ohne benzol, Acetophenon; aliphatische Ester mit mindestens 6 dessen Ausfallung in Form von Kristallen in gelöstem Zu-C-Atomen, wie n-Butylacetat, Isoamylacetat, Ethylbutyrat, 25 stand zu erhalten. Wenn L-Tryptophan aus wässriger Lö-Isobutylacetat; aliphatische Ketone mit mindestens 6 C-Ato- sung kristallisiert wird, schliesst dies das unreagierte Indol men, wie Methylisobutylketon, Diisobutylketon, Diisopro- mit einer ähnlichen Molekülstruktur und auf Grund dessen pylketon, Methyl-n-amylketon, Di-n-propylketon; Zitronen- gleichzeitiger Kristallisation ein. Aus diesem Grund sollte in säureester, wie Acetyltriethylcitrat, Acetyltributylcitrat, Abhängigkeit von der Behandlungstemperatur die Konzen-

Triethylcitrat, Tributylcitrat; Weinsäureester; Apfelsäure- 30 tration des durch das organische Lösungsmittel zu extrahie-ester; Ether, wie Anisol. renden Reaktionsgemischs so eingestellt werden, dass das L-

Der eingesetzte Mengenanteil an organischem Lösungs- Tryptophan in gelöstem Zustand verbleibt.

mittel variiert in Abhängigkeit von dessen Art, da er be- Das unreagierte Indol wird aus dem Reaktionsgemisch,

stimmt wird durch das Verteilungsverhältnis von Indol zwi- aus welchem das Enzym entfernt wurde, mittels eines organischen einer Enzym enthaltenden Flüssigkeitsphase und einer 35 sehen Lösungsmittels extrahiert. Das organische Lösungsorganischen Phase unter den Reaktionsbedingungen und der mittel kann zweckmässig aus denjenigen ausgewählt werden, eingesetzten Menge Indol. Üblicherweise wird er solcherart die in der Reaktion verwendet werden. Üblicherweise wird bestimmt, dass die Konzentration von Indol in der Enzym das gleiche organische Lösungsmittel verwendet, wie in der enthaltenden Flüssigkeit weniger als 800 ppm beträgt, indu- Reaktion, sodass das aus der Reaktion zurückgewonnene or-striell bevorzugt weniger als 750 ppm. 40 ganische Lösungsmittel für diesen Zweck eingesetzt werden

Das Reaktionsprodukt L-Tryptophan fallt in der Enzym kann. Das Lösungsmittel braucht jedoch nicht das gleiche zu enthaltenden Flüssigkeit in Form von Kristallen aus. Unter sein wie dasjenige, das in der Reaktion verwendet wurde und den eingesetzten Reaktionsbedingungen beeinträchtigen die- es kann ein beliebiges der für die Tryptophan produzierende se Kristalle den Verlauf der Reaktion in keiner Weise. In der Reaktion bzw. die Extraktion wirksamen Lösungsmittel ausvorstehend beschriebenen Methode kann als Substrat DL- 45 gewählt werden.

Serin verwendet werden. In diesem Fall kann unter Verwen- Die vorstehend beschriebene Rückgewinnungsmethode dung von kultivierten Zellen von Pseudomonas putida ist besonders nützlich bei der Herstellung von L-Tryptophan

(MT-10 182) oder Pseudomonas punctata (MT-10 243) als durch eine Enzymreaktion unter Verwendung von Indol als Serin-Racemase, L-Tryptophan in hoher Ausbeute ohne ein Substrat, da das zurückgewonnene Indol wiederverwen-Verminderung der Aktivität des Enzyms durch das organi- so det werden kann. Im allgemeinen wird das Enzym etc., das sehe Lösungsmittel erhalten werden. in der Reaktion zur Herstellung von L-Tryptophan durch ei-

Es ist von hoher kommerzieller Bedeutung, dass L-Tryp- ne Enzymreaktion verwendet wird, aus dem Reaktionsge-tophan ohne jegliches Problem aus chemisch synthetisiertem misch durch eine allgemeine Methode entfernt und dann das DL-Serin und Indol in Gegenwart von zwei Arten von Enzy- L-Tryptophan isoliert. Bei der Verwendung der zurückge-men unter Verwendung leicht erhältlicher organischer Lö- 55 wonnenen, das unreagierte Material enthaltenden Lösung als sungsmittel hergestellt werden kann. solche, wird oft die Aktivität des Enzyms inhibiert, was in

Das nach dem vorstehend beschriebenen Vorgehen er- der industriellen Herstellung zu ernsthaften Problemen führt, haltene Reaktionsgemisch enthält das resultierende L-Tryp- Wenn jedoch das unreagierte Indol nach der vorstehend be-tophan, das unreagierte Rohmaterial, das organische Lö- schriebenen Rückgewinnungsmethode mit dem organischen sungsmittel, das Enzym, etc.. Vorzugsweise wird dieses Re- «o Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch extrahiert wird, aktionsgemisch nach einer der vorstehend unter (A) bzw. (B) kann der Gehalt an Indol in den L-Tryptophankristallen beschriebenen Ausführungsformen behandelt. vermindert werden und das mit dem organischen Lösungs-

Nach der Ausführungsform (A) wird die nachstehende mittel extrahierte Indol in Form der erhaltenen Lösungsmit-Gewinnungsmethode angewendet: Zuerst wird das organi- tellösung in der nächsten Reaktion ohne Isolation des extra-sche Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch zurückge- 65 hierten Indols aus der Lösung wiederverwendet werden, wo-wonnen und das Enzym entfernt. Wenn das Reaktionsge- bei die Reaktion ohne Verminderung der Aktivität des En-misch, in welchem das Enzym und das organische Lösungs- zyms verläuft.

mittel zusammen enthalten sind, heftig gerührt wird, wird Der eingesetzte Mengenanteil an organischem Lösungs-

mittel zur Extraktion des unreagierten Indols variiert in Abhängigkeit vom Yerteilungsverhältnis von Indol zwischen der organischen Lösungsmittelphase und der wässrigen Phase und auch der reaktiven Umsetzung von Indol. Da jedoch Enzyme festgesetzter spezifischer Aktivitäten im Handel erhältlich sind und die Umsetzung der Reaktion konstant ist, kann der für die Extraktion einzusetzende Mengenanteil organischen Lösungsmittels leicht bestimmt werden.

Es gibt keine besonderen Einschränkungen hinsichtlich des Betriebs der Extraktion des unreagierten Indols und diese kann nach einer konventionellen Methode erfolgen. Im allgemeinen wird dem Reaktionsgemisch nach der Entfernung des Enzyms ein zweckentsprechender Mengenanteil des organischen Lösungsmittels zugesetzt und das Gemisch zur vollständigen Kontaktierung der wässrigen mit der organischen Phase gerührt. Wie bereits erwähnt, wird es bevorzugt, das Reaktionsgemisch in solchem Zustand zu erhalten, dass keine L-Tryptophankristalle ausfallen. Industriell ist es wirksam, die Extraktion in erwärmtem Zustand auszuführen, um die Löslichkeit von L-Tryptophan in Wasser zu erhöhen. Nach gleichmässiger Kontaktierung der beiden Phasen wie vorstehend beschrieben, wird das Gemisch zur Trennung in eine wässrige und eine organische Lösungsmittelphase stehengelassen. Die Extraktion kann ansatzweise ausgeführt werden, wird jedoch industriell kontinuierlich nach einer Ge-genstrom-Extraktionsmethode ausgeführt.

Das das extrahierte, unreagierte Indol enthaltende organische Lösungsmittel wird in der folgenden Reaktion wieder verwendet, nachdem nötigenfalls frisches Lösungsmittel oder frisches Indol zugesetzt oder anderes Lösungsmittel beigemischt wurde.

Diese Methode ist von grosser industrieller Bedeutung, da das unreagierte Indol wirksam zurückgewonnen werden kann, selbst wenn die Umsetzung von Indol durch Fluktuierung der Dichte des Enzyms, die bei Enzymreaktionen oft vorkommt, variiert. Ausserdam kann, selbst wenn das extrahierte und rückgewonnene Indol als solches wiederverwendet wird, die Reaktion ohne Verminderung der Aktivität des Enzyms ausgeführt werden.

Bei Anwendung der vorstehend beschriebenen Rückgewinnungsmethode kann das unreagierte Indol wirksam extrahiert und rückgewonnen werden, auch aus einem nach konventioneller Methode erhaltenen, L-Tryptophan enthaltenden Reaktionsgemisch.

Nach der Ausführungsform (B) wird das das resultierende L-Tryptophan, unreagiertes Material, organisches Lösungsmittel und Enzym enthaltende Reaktionsgemisch zuerst in eine organische Lösungsmittelphase und eine wässrige Phase aufgetrennt. Die unreagiertes Material enthaltende organische Lösungsmittelphase wird rückgewonnen. Dann wird aus der wässrigen Phase, d.h. dem L-Tryptophan enthaltenden Reaktionsgemisch, zur Gewinnung von L-Tryptophan das Enzym entfernt. Wenn Enzym und organisches Lösungsmittel zusammen im Reaktionsgemisch vorliegen, wird die Grenzfläche zwischen der wässrigen und der organischen Lösungsmittelphase oft undeutlich und deren Trennung kann schwierig werden. In einem solchen Fall kann die Trennung nach einer bekannten Methode erfolgen, beispielsweise durch Behandlung des Reaktionsgemischs in einem Zentrifugalseparator. Wiederholung der Extraktion und Trennung unter Einsatz des verwendeten organischen Lösungsmittels erhöht die Wirkung der Entfernung von Indol.

Beim Trennvorgang kann das L-Tryptophan in der wässrigen Lösung in kristalliner Form ausfallen, wobei jedoch die Wirkung der Extraktion des unreagierten Indols in gelöstem Zustand besser ist.

Zweckmässig liegt die Temperatur zum Zeitpunkt der Trennung unterhalb des Siedepunktes des organischen Lö659 824

sungsmittels und falls Wasser und organisches Lösungsmittel ein Azeotrop bilden, unterhalb dessen Siedepunkt. Die abgetrennte und rückgewonnene Indollösung kann ohne jegliche Probleme direkt in der nächstfolgenden Reaktion wiederverwendet werden.

Es gibt keine besondere Einschränkung hinsichtlich der Methode der Entfernung des Enzyms aus dem Reaktionsgemisch nach der Abtrennung der das unreagierte Indol enthaltenden organischen Lösungsmittelphase. Eine industriell wirksame Entfernungsmethode umfasst Zugabe einer Mineralsäure zum nach der Entfernung der organischen Lösungsmittelphase verbliebenen Reaktionsgemisch, um den pH-Wert des Gemischs auf 2-5 zu stellen, Erwärmung soweit als nötig zur Anregung der Ausflockung des Enzyms und Entfernung der ausgeflockten Masse, beispielsweise durch Filtration. Durch Konzentration des solchermassen vom Enzym befreiten Reaktionsgemischs kann L-Tryptophan erhalten werden.

In der vorstehend beschriebenen Methode wandert das unreagierte Indol im Reaktionsgemisch wirksam in das organische Lösungsmittel. Das das unreagierte Indol enthaltende organische Lösungsmittel kann in der nächstfolgenden Reaktion eingesetzt werden, nachdem nötigenfalls frisches Lösungsmittel oder ein Gemisch davon mit frischem Indol zugesetzt wurde.

Diese Rückgewinnungsmethode ist aus dem gleichen Grund wie in der Ausführungsform (A) besonders nützlich bei der Herstellung von L-Tryptophan durch eine Enzymreaktion unter Verwendung von Indol als ein Substrat. Das erfindungsgemässe Verfahren ist von grosser industrieller Bedeutung, da L-Tryptophan hoher Reinheit und frei von Indol erhalten und das Ausgangsmaterial Indol zurückgewonnen und wiederverwendet werden kann.

In den nachstehenden Beispielen wird die Erfindung spezifisch erläutert.

Beispiel 1

In einem 300 ml Kolben mit Rührer wurden 9,27 g L-Se-rin, 3 g Ammoniumsulfat, 10 mg Pyridoxalphosphat und 82,5 g Wasser gefüllt und gut gerührt. Der pH-Wert des Gemisches wurde mit wässriger Ammoniaklösung konz. auf 8,5 gestellt und die Temperatur auf 35 °C erhöht. Dann wurden 3 g eines feuchten Cremekuchens von kultivierten Zellen von Escherichia coli (MT-10 242) enthaltend Tryptophan-Syn-thetase und danach 68,9 g einer Lösung von 6,89 g Indol in 68,9 g Acetyltributyleitrat zugegeben. Die Reaktion wurde während 48 h ausgeführt und das Reaktionsgemisch mit einer 5 gew.-%igen wässrigen Lösung von Natriumhydroxid auf ein Gesamtvolumen von 300 ml gestellt, um das resultierende L-Tryptophan vollständig zu lösen. Die Lösung wurde mittels eines Trenntrichters in eine wässrige und eine organische Lösungsmittelphase getrennt. Ein Teil der wässrigen Phase wurde in einem Zentrifugalseparator behandelt, um die mikrobiellen Zellen zu sedimentieren. Die überstehende klare Flüssigkeit wurde gesammelt und die Konzentration von L-Tryptophan durch Flüssigchromatographie bestimmt und die Ausbeute ermittelt. Bezogen auf Indol betrug die Ausbeute 96,5 mol%.

Das vorstehend beschriebene Vorgehen wurde mit den Ausnahmen wiederholt, dass der jeweilige Mengenanteil des organischen Lösungsmittels und das Verteilungsverhältnis in der wässrigen Phase variiert wurden, wie in Tabelle 1 angegeben, welche auch die jeweils erhaltenen Resultate enthält.

Bei vergleichsweiser Wiederholung der vorstehenden Reaktion, jedoch ohne Zugabe des organischen Lösungsmittels, betrug die Konzentration von Indol in der den Mikroorganismus enthaltenden Flüssigkeit 3000 ppm und die Ausbeute an L-Tryptophan 47 mol%. Aus diesem Versuch geht her-

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vor, dass es für die Herstellung von L-Tryptophan wichtig ist, ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel zuzusetzen und die Konzentration von Indol in der den Mikroorganismus enthaltenden Flüssigkeit niedrig zu halten. Spezifisch wurde bei Ausführung der Reaktion in Wasser ohne Zusatz eines organischen Lösungsmittels die Konzentration von Indol in der wässrigen Phase 3000 ppm und die Ausbeute an L-Tryptophan, bezogen auf Indol, betrug 47 mol%. Im Gegensatz dazu stieg die Ausbeute an L-Tryptophan, wenn als organisches Lösungsmittel Butylcitrat zugegeben und die Konzentration an Indol in der wässrigen Phase bei 790 ppm gehalten wurde, deutlich auf 95 mol%, bezogen auf Indol. Bei Einhaltung einer Konzentration von Indol in der wässrigen Phase von 1070 ppm (höher als 800 ppm), sank die Ausbeute an L-Tryptophan gegenüber derjenigen bei einer Konzentration des Indols von 800 ppm um etwa 10% ab.

trägt. Wie dargestellt betrug, wenn die Reaktion bei einer In-dolkonzentration von nicht mehr als 720 ppm begonnen wurde, die Ausbeute an L-Tryptophan etwa 90 mol%, sank jedoch auf 82 mol% ab, wenn die Reaktion bei einer Indol-5 konzentration von 920 ppm begonnen wurde.

Tabelle 2 Mengenanteil io Toluol, g

15 115 57,5 38,3

Konzentration Indol in der Toluol-lösung Gew.-%

10 20 30

Konzentration Indol in der wässrigen Phase zu Beginn der Reaktion, ppm

450 720 920

Ausbeute L-Tryptophan, bezogen auf Indol, mol%

91.2

89.3

82.4

Tabelle 1

Mengen

Konzentra

Ausbeute L-

anteil tion Indol im tion Indol in

Tryptophan,

organisches organischen der Enzym ent bezogen auf

Lösungs

Lösungs haltenden Flüs

Indol, mol%

mittel mittel (*1)

sigkeit (*2),

-

(*D,g

Gew.-%

ppm

68,9

10

160

96,5

34,45

20

400

96,3

27,56

25

520

95,8

22,97

30

660

96,2

19,69

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790

95,0

15,31

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1070

86,3

-(*3)

-

3000

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(*1): Acetyltributylcitrat

(*2): Im frühen Stadium der Reaktion

(*3): Ohne organisches Lösungsmittel

Beispiel 2

6,8 g (Festkörpergehalt 1,7 g) eines feuchten Cremekuchens von Escherichia coli (MT-10 242), enthaltend Trypto-phan-Synthetase, und 3,4 g (Festkörpergehalt 0,85 g) Pseudomona putida (MT-10 182), enthaltend Serin-Racemase, wurden in Wasser suspendiert und das Gesamtvolumen der Suspension auf 20 ml gestellt.

In einen 300 ml Kolben wurde eine wässrige Lösung von 11,3 g DL-Serin, 6,0 g Ammoniumsulfat, 10 mg Pyrodoxal-phosphat und 66 g Wasser eingefüllt und der pH-Wert der wässrigen Lösung wurde mit wässriger Ammoniaklösung konz. auf 8,5 gestellt, wonach die vorstehend beschriebene Suspension von mikrobiellen Zellen in den Kolben gegeben wurde.

Das Kolbeninnere wurde bei 35 °C gehalten und mit 57,2 g einer Lösung von 11,5 g Indol in Toluol versetzt. Die Reaktion wurde während 48 h bei 35 °C ausgeführt. Zu Beginn der Reaktion betrug die Konzentration an Indol in der wässrigen Phase 720 ppm.

Das Reaktionsprodukt wurde analysiert, wie in Beispiel 1 beschrieben und die Analyse ergab eine Ausbeute an L-Tryptophan von 89,3 mol%, bezogen auf Indol.

Zur Bestimmung der Auswirkung der Konzentration von Indol in der wässrigen Phase wurde das vorstehend beschriebene Vorgehen mehrmals mit der Ausnahme wiederholt,

dass der jeweilige Mengenanteil Toluol variiert wurde, wie in Tabelle 2 angegeben, in welcher auch die jeweils erhaltene Ausbeute an L-Tryptophan angeführt ist.

Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass die Inhibitionskonzentration von Indol in der wässrigen Phase etwa 800 ppm be-

2o Beispiel 3

Nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Vorgehen wurden DL-Serin und Indol in Gegenwart kultivierter Zellen von Escherichia coli (MT-10 232) und Pseudomonas punctata (MT-10 243) ausgeführt.

25 Als organisches Lösungsmittel wurde Methylisobutylketon eingesetzt und die Reaktion solcherart ausgeführt, dass die Konzentration an Indol in der wässrigen Phase zu Beginn der Reaktion 760 ppm betrug.

Nach Ausführung der Reaktion während 48 h bei 35 °C 30 betrug die Ausbeute an L-Tryptophan 98,6 mol%, bezogen auf Indol.

Zur Bestimmung der Auswirkung der Indolkonzentra-tion in der wässrigen Phase wurde der Mengenanteil Methylisobutylketon variiert und die jeweilige Veränderung der 35 Ausbeute an L-Tryptophan variiert, wie in Tabelle 3 angegeben, die auch die jeweiligen Werte der Ausbeute enthält.

Es ist ersichtlich, dass durch Einhaltung einer Konzentration von Indol in der wässrigen Phase von weniger als 800 ppm bei Verwendung von Methylisobutylketon, L-Trypto-40 phan in einer Ausbeute von mehr als 99 mol% erhalten werden kann.

45 Tabelle 3

Mengen

Konzentra

Ausbeute anteil tion Indol in tion Indol in

L-Tryptophan.

Keton, g der Keton-

der wässrigen bezogen auf

lösung

Phase zu Be

Indol, mol%

50

Gew.-%

ginn der Re

aktion, ppm

115

10

80

99,8

57,5

20

190

99,9

ss 38,3

30

340

99,8

28,75

40

510

99,6

23,0

50

720

98,6

60 Beispiel 4

Nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Vorgehen wurden DL-Serin und Indol in Gegenwart von Escherichia coli (MT-10 242) und Pseudomonas putida (MT-10 182) unter Verwendung von Anisol als organisches Lösungsmittel und 65 Einhaltung einer Konzentration von Indol in der wässrigen Phase von weniger als 300 ppm zur Reaktion gebracht.

Nach Reaktion während 48 h bei 35 °C betrug die Ausbeute an L-Tryptophan 95 mol%, bezogen auf Indol.

7

659 824

Beispiel 5

In einen 200 ml Reaktionsbehälter wurden 20 g DL-Serin, 1,0 g Ammoniumacetat, 0,2 g Natriumbisulfat, 0,1 g EDTA und eine Kulturbrühe von Erwinia herbicola (ATCC 21 434) eingefüllt.

Die Kulturbrühe wurde hergestellt durch Kultivierung von Erwinia herbicola unter Belüftung bei 28 C während 28 h in einem Kulturmedium aus 0,2% L-Tyrosin, 0,2% K2HP04, 0,1% MgS04 • 7H20, 2 ppm FeS04 • 7H2, 0,01% Pyridoxin-hydrochlorid, 0,6% Glycerin, 0,5% Succinsäure, 0,1% DL-Methionin, 0,2% DL-Alankin, 0,05% Glycin, 0,1% L-Phenylalanin und 12 ml Sojabohnenprotein-hydro-lysat.

Dann wurde eine Lösung von 0,7 g Pyrocatechin in Toluol in den Reaktionsbehälter gefüllt und die Konzentration is von Pyrocatechin in Wasser auf unterhalb 3000 ppm gestellt. Unter diesen Bedingungen wurde die Reaktion bei 37 °C und dem pH-Wert 8 während 48 h ausgeführt. Der Mengenanteil an akkumuliertem L-DOPA betrug 30 g/1.

20

Beispiel 6

Escherichia coli enthaltende mikrobielle Zellen wurden bei 30 C und dem pH-Wert 7 in Gegenwart von Monokali-umphosphat, Dikaliumphosphat, Ammoniumsulfat, Calci-umchlorid, Eisensulfat, Hefeextrakt und Polypepton unter 25 Einblasen von Luft in das Kulturmedium und Zugabe von Glukose und Indol kultiviert. Daneben wurden Pseudomonas putida enthaltende mikrobielle Zellen in einem ähnlichen Kulturmedium bei 30 C und dem pH-Wert 7 unter Einblasen von Luft und Zugabe von Glukose kultiviert. Innert 40 h 30 erreichten diese mikrobiellen Zellen eine Konzentration von 30-35 g/1. Mittels eines Hochgeschwindigkeits-Zentrifugalse-parators wurden sie in Form eines Cremekuchens mit einem Wassergehalt von 80-85% erhalten.

In einen Kolben wurden 77,3 g DL-Serin, 10,5 g Ammo- 35 niumsulfat und 486 g Wasser gefüllt und der pH-Wert des Gemischs wurde mit 29%iger wässriger Ammoniaklösung auf 8,5 gestellt. Dann wurden 51,2 g des Cremekuchens von Escherichia coli und 23,2 g des Cremekuchens von Pseudomonas putida zugegeben und das gesamte Gemisch wurde gut gerührt. Weiterhin wurden 392 g einer Lösung von 78,4 g Indol in Toluol zugesetzt und die Reaktion wurde bei 35 C während 40 h ausgeführt. Durch Flüssigchromatographie wurde im Reaktionsgemisch ein Gehalt von 129,8 g L-Tryptophan ermittelt, was einer Ausbeute von 95,0 mol%, bezogen auf Indol, entspricht.

Toluol wurde abdestilliert und das Reaktionsgemisch durch Wasserzugabe auf eine Konzentration an L-Tryptophan von 4,2 Gew.-% gestellt. Der pH-Wert des Gemischs wurde mit 98%iger Schwefelsäure auf 4,0 gestellt und dann mit 27 g Aktivkohle versetzt. Dann wurde die Temperatur auf 95 °C erhöht und das Gemisch während 1 h bei 95-98 °C gehalten und dann zur Entfernung der Zellen, zusammen mit der Aktivkohle, heiss filtriert. Bei 80 °C wurde dem Filtrat das zurückgewonnene Toluol zugesetzt und gut gerührt.

Dann wurde das Rühren eingestellt und das Gemisch stehengelassen, wobei es sich in eine obere Toluolschicht und eine untere wässrige Schicht aufteilte. Die Toluolschicht wurde entfernt und der wässrigen Schicht ein gleich grosser Mengenanteil Toluol wie vorstehend angegeben zugegeben und die Extraktion wiederholt.

Nach der ersten Extraktion betrug die Konzentration von Indol in der wässrigen Schicht 55 ppm und nach der zweiten Extraktion 4 ppm.

Die wässrige Schicht wurde auf eine Konzentration von L-Tryptophan von 10 Gew.-% eingedickt und dann auf 20 C gekühlt. Die ausgefällten Kristalle von L-Tryptophan wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 100 g L-Tryptophan einer Reinheit von 99.5% mit einem Indolgehalt von 0 ppm isoliert. Bei Wiederverwendung der rückgewonnen Toluollösung von Indol in einer nachfolgenden Reaktion nach Zusatz von frischem Toluol ergab sich keine Auswirkung auf die Ausbeute an L-Trypto-phan und die Reaktion verlief glatt. Die Versuchsanordnung und die dabei erhaltenen Resultate sind in Tabelle 4 zusam-mengefasst.

1 Tabelle 4

Recyclierungszahl der extrahierten Toluolschicht

Ausbeute L-Tryptophan, bezogen auf Indol, mol%

95,0

98.3

98.6 97,0

95.4

98.7

Je 316 g jedes der Reaktionsgemische enthaltend 500 ppm bzw. 2000 ppm unreagiertes Indol, wurden bei 80 C mit je 27,6 g Toluol extrahiert und das jeweilige Verhältnis zwischen der Anzahl Extraktionen und der Konzentration von in der wässrigen Phase zurückgebliebenem Indol festgestellt. Die Versuchsanordnung und die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

40

Tabelle S Konzentration Indol in der wässrigen Phase zu Beginn der Reaktion, ppm

2000 299 54 500 45 18

Anzahl Extraktionen

Konzentration Indol im Wasser nach Extraktion, ppm

299 54 9,8 45 18 3

45

50

55

60

65

Beispiel 7

Durch Reaktion von L-Serin und Indol in Wasser und Diisobutylketon bei 35 °C und pH-Wert 8,5 in Gegenwart von nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Vorgehen kultivierten Zellen von Escherichia coli mit einer Ausbeute von 98,3 mol%, bezogen auf Indol, L-Tryptophan hergestellt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung von Diisobutylketon destilliert und dann in einem Zentrifugalseparator behandelt, wobei ein L-Tryptophan und die mikrobiellen Zellen enthaltender feuchter Cremekuchen erhalten wurde.

Der erhaltene Cremekuchen wurde in Wasser gegeben und mit Wasser auf eine Konzentration an L-Tryptophan von 0,8 Gew.-% verdünnt. Das kristalline L-Tryptophan wurde in Wasser gelöst und die Lösung bei Zimmertemperatur durch eine Ultrafiltrationsmembran filtriert, um die mikrobiellen Zellen zu entfernen, wonach die Konzentration an Indol in der wässrigen Phase 90 ppm betrug. Dann wurde ein Fünftel des Volumens der wässrigen Phase Diisobutylketon zugesetzt, das Gemisch gerührt und dann zur Auftrennung in zwei Schichten stehengelassen. Die Diisobutylketon-Schicht wurde entfernt und die gleiche Extraktionsbehandlung unter Verwendung des gleichen Mengenanteils Diisobutylketon wie in der vorgängigen Behandlung wiederholt.

659 824

8

Nach der ersten Extraktion betrug die Konzentration an Indol in der wässrigen Schicht 32 ppm und nach der zweiten Extraktion 2 ppm.

Die Indol enthaltende Diisobutylketon-Schicht wurde nach Zusatz des benötigten Mengenanteils Indol in einer nachfolgenden Reaktion verwendet, wobei keinerlei Probleme auftraten.

Beispiel 8

Durch Reaktion von DL-Serin und Indol bei 35 °C und pH-Wert 8,5 während 48 h in Wasser und Benzol in Gegenwart von nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Vorgehen kultivierten Escherichia coli und Pseudomonas punctata wurde mit einer Ausbeute von 93,7 mol%, bezogen auf Indol, L-Tryptophan hergestellt.

Dann wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung von Benzol destilliert und danach mit Wasser auf eine Konzentration an L-Tryptophan von 4,2 Gew.-% verdünnt. Das verdünnte Gemisch wurde mittels Salzsäure auf den pH-Wert 3,5 gestellt und dann mit 15 Gew.-%, bezogen auf den Gehalt an L-Tryptophan, Aktivkohle versetzt, dann während 1 h auf 95-98 °C erwärmt und danach bei der gleichen Temperatur während 1 h durch eine Filterpresse filtriert. Dem Filtrat wurde bei 80 °C Benzol zugesetzt, das Gemisch gerührt und dann zur Auftrennung in zwei Schichten stehengelassen. Zugesetzt wurde das in der vorstehend genannten Destillation zurückgewonnene Benzol. Die gleiche Extraktionsbehandlung wurde unter jeweiligem Zusatz eines gleichen Mengenanteils von frischem Benzol noch zweimal wiederholt. Die Konzentration an Indol in der wässrigen Phase betrug vor der Extraktion 1850 ppm, nach der ersten Extraktion 265 ppm, nach der zweiten Extraktion 43 ppm und nach der dritten Extraktion 4,6 ppm. Nach Konzentration und Kristallisation des Reaktionsgemischs wurde in einer Ausbeute von 69,8 mol%, bezogen auf Indol, L-Tryptophan einer Reinheit von 99,7% mit einem Gehalt an Indol von 2,1 ppm erhalten.

Die zurückgewonnene Lösung von Indol in Benzol wurde nach Zusatz eines benötigten Mengenanteils von frischem Indol in einer nachfolgenden Reaktion verwendet, wobei keinerlei Probleme auftraten.

Beispiel 9

In einem 300 ml Kolben wurde ein Gemisch von 11,3 g DL-Serin, 6,0 g Ammoniumsulfat, 10 mg Pyridoxalphos-phat und 66 g dest. Wasser bei 35 °C gut gerührt und die erhaltene Lösung mittels 29 gew.-%iger wässriger Ammoniaklösung auf den pH-Wert 8,5 gestellt.

Dann wurden der Lösung 4,0 g eines Cremekuchens, enthaltend Escherichia coli und 2,5 g eines Cremekuchens, enthaltend Pseudomonas putida, die beide nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Vorgehen kultiviert und gewonnen worden waren, zugesetzt und das Gemisch wurde zur Dispergierung der beiden Cremekuchen bei 35 °C gut gerührt.

Dann wurde eine Lösung von 11,5 g Indol in 26,8 g Di-isobutylketon zugesetzt und das Gemisch während 40 h bei 35 °C mit 90/min. gerührt.

Nach der Reaktion wurde das Rühren abgebrochen und das Reaktionsgemisch zur Auftrennung in zwei Schichten stehengelassen. Die obere Diisobutylketon-Schicht wurde entfernt und dann wurde ein gleicher Mengenanteil wie vorstehend genannt, Diisobutylketon zugesetzt und das Gemisch während 30 min. bei 90/min. gerührt und danach zur Rückgewinnung der Diisobutylketon-Schicht wie vorstehend beschrieben stehengelassen.

Es wurde gefunden, dass das nach der Reaktion im Reaktionsgemisch verbliebene unreagierte Indol in der ersten Extraktion mit Diisobutylketon zu einem Ausmass von 85%

und in der zweiten Extraktion mit Diisobutylketon zu einem Ausmass von 99% zurückgewonnen worden war, wobei die Mengenanteile Indol mittels Gaschromatographie bestimmt wurden.

Bei Verwendung des zurückgewonnenen Diisobutylke-tons nach Zusatz eines benötigten Mengenanteils Indol in einer nachfolgenden Reaktion ergaben sich keinerlei Probleme.

Beispiel 10

Die in Beispiel 9 beschriebene Reaktion wurde mit den Ausnahmen wiederholt, dass unter Verwendung von 45,7 g Toluol bei einer Tourenzahl von 640/min. gerührt wurde. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch, da es eine einheitliche Emulsion darstellte, in einem Zentrifugalseparator behandelt, um die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten sichtbar zu machen.

Die obere Toluolschicht wurde entfernt, dann Toluol in gleichem Mengenanteil wie zu Beginn zugesetzt und die Extraktion des unreagierten Indols wiederholt.

Es wurde gefunden, dass das nach Abschluss der Reaktion im Reaktionsgemisch zurückgebliebene unreagierte Indol in der ersten Extraktion mit Toluol zu einem Ausmass von 87% und in der zweiten Extraktion mit Toluol zu einem Ausmass von 99,9% zurückgewonnen worden war.

Das zurückgewonnene, Indol enthaltende Toluol wurde nach Zusatz eines benötigten Mengenanteils Indol in einer nachfolgenden Reaktion verwendet, wobei keinerlei Probleme auftraten.

Beispiel 11

Die in Beispiel 9 beschriebene Reaktion wurde mit der Ausnahme wiederholt, dass 14,3 g Ethylcitrat verwendet wurden. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch in Form einer einheitlichen Emulsion kontinuierlich durch einen Zentrifugalseparator geschickt, um es in eine wässrige Schicht und eine Ethylcitratschicht aufzutrennen. Der wässrigen Schicht wurde ein gleicher Mengenanteil Ethylcitrat wie in der Reaktion zugesetzt und das erhaltene Gemisch wurde erneut durch kontinuierliche Behandlung in einem Zentrifugalseparator in eine wässrige und eine organische Schicht aufgetrennt.

An einem Muster der wässrigen Schicht wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie ermittelt, dass L-Tryptophan in einer Ausbeute von 99,7 mol%, bezogen auf Indol, gebildet worden war.

Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser auf eine Konzentration an L-Tryptophan von 4,2 Gew.-% verdünnt und mit Schwefelsäure auf den pH-Wert 3,5 gestellt. Dann wurden 15 Gew.-% pulverisierte Aktivkohle, bezogen auf das Gewicht von L-Tryptophan, zugegeben und das Gemisch wurde während 1 h auf 90 C erwärmt. Nach vollständiger Lösung der L-Tryptophan-Kristalle wurde die Lösung bei der gleichen Temperatur abgenutscht, um die mikrobiellen Zellen, zusammen mit der Aktivkohle, zu entfernen.

Das heisse Filtrat wurde auf eine Konzentration an L-Tryptophan von 10 Gew.-% konzentriert, auf 10 °C gekühlt und dann auf den pH-Wert 5,9 gestellt. Die ausgefällten, schuppenartigen Kristalle wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Mit einer Ausbeute von 74,5 mol%, bezogen auf Indol, wurde L-Tryptophan einer Reinheit von 99,4% mit einem Gehalt an Indol von 1,2 ppm isoliert.

Das zurückgewonnene, Indol enthaltende Ethylcitrat wurde nach Zusatz eines benötigten Mengenanteils Indol in einer nachfolgenden Reaktion verwendet, die glatt verlief und in welcher keinerlei Auswirkung auf die Ausbeute an L-Tryptophan auftrat.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Beispiel 12

Nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Vorgehen wurden Zellen, enthaltend Escherichia coli und Zellen, enthaltend Pseudomonas putida kultiviert und in einem Super-Zentrifu-galseparator behandelt, wobei Cremekuchen der beiden Mikroorganismen mit einem Wassergehalt von je 75% erhalten wurden.

Eine wässrige Lösung, enthaltend 77,3 g DL-Serin und 10,5 g Ammoniumsulfat in 486 g Wasser, wurde mit 29 gew.-%iger wässriger Ammoniaklösung auf den pH-Wert 8,5 gestellt und mit 51,2 g des Escherichia coli enthaltenden Cremekuchens und 23,2 g des Pseudomonas putida enthaltenden Cremekuchens versetzt, durch Rühren dispergiert und mit 392 g einer Lösung von 78,4 g Indol in Toluol versetzt. Die Reaktion wurde während 48 h bei 35 °C ausgeführt.

Nach der Reaktion wurde ein Teil des Reaktionsgemischs mittels Zentrifugalseparator in eine Toluolschicht und eine wässrige Schicht aufgetrennt. In der wässrigen Schicht erfolgte eine kristalline Ausfallung von L-Trypto-phan, die durch Zugabe eines Alkalis gelöst wurde, wonach die wässrige Schicht zur Entfernung der mikrobiellen Zellen durch ein Membranfilter filtriert wurde. Zur Bestimmung von L-Tryptophan wurde das Filtrat einer Hochleistungs-Flüssigchromatographie unterzogen, wobei eine Ausbeute von L-Tryptophan im Reaktionsgemisch von 99,3 mol%, bezogen auf Indol, festgestellt wurde.

Ein anderer Teil des Reaktionsgemischs wurde mittels Zentrifugalseparator in eine wässrige Schicht und eine Toluolschicht aufgetrennt. Mittels Gaschromatographie wurde in der Toluolschicht eine Konzentration an zurückgebliebenem unreagiertem Indol von 2,3 ppm festgestellt.

Bei Verwendung der Indol enthaltenden Toluollösung nach Zusatz eines benötigten Mengenanteils von frischem Indol in einer nachfolgenden Reaktion, verlief diese glatt und es trat keinerlei Auswirkung auf die Ausbeute an L-Tryptophan auf.

659 824

Die Versuchsanordnung und die dabei erhaltenen Resultate sind in Tabelle 6 zusammengefasst.

Tabelle 6 5 Anzahl Recyclierungen der zurückgewonnenen Toluolschicht io 0

1

2

3

4

15 5

Ausbeute L-Tryptophan. bezogen auf Indol. mol%

99.3 98,5 98,9 99,2 98,2

99.4

Die durch Zentrifugalseparation zurückgewonnene wässrige Schicht wurde mit Wasser auf eine Konzentration an L-Tryptophan von 4,2 Gew.-% verdünnt und mit 98 gew.-20 %iger Schwefelsäure auf den pH-Wert 4,0 gestellt, dann mit 27 g pulverisierter Aktivkohle vermischt und das Gemisch auf 98 -C erwärmt und dann zur Lösung der ausgefällten Kristalle von L-Tryptophan während 1 h bei 98-100 C gehalten.

Die mikrobiellen Zellen wurden zusammen mit der Aktivkohle durch Heissfiltration entfernt. Das Filtrat wurde auf eine Konzentration an L-Tryptophan von 15 Gew.-% konzentriert, wobei das L-Tryptophan in Form von schuppenartigen Kristallen ausgefällt wurde. Die Kristalle wurden bei 10 °C abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei in einer Ausbeute von 81,3 mol%, bezogen auf Indol, hellgelbe, schuppenartige Kristalle von L-Tryptophan einer Reinheit von 99,2% erhalten wurden. Die erhaltenen Kristalle von L-Tryptophan zeigten eine spezifische Drehung von —31,8°, einen Schwermetallgehalt von weniger als 20 ppm, einen Verbrennungsrückstand von 0,02 Gew.-% und einen Ammoniumgehalt von 0,01 Gew.-%.

25

30

35

C