DE3025098C2 - Vorbehandeln von aus Lignozellulosematerialien gewonnenen Hydrolysaten - Google Patents

Description

1) die Hydrolysate zur Entfernung dampfflüchtiger Substanzen mit Dampf abgestreift werden, dann

2) Calciumoxid zum Einregeln eines pH-Wertes zwischen 10 und 10,5 zu dem dampf-abgestreiften Hydrolysat gegeben, die Mischung 1 bis 3 Stunden auf diesem pH-Wert gehalten und das Hydrolysat von dem so gebildeten Niederschlag abgetrennt wird,

3) Mineralsäure zum Einregeln des pH-Wertes des Hydrolysat« auf 5 bis 7 hinzugegeben wird und

4) die Konzentration des Hydrolysats an Glucose auf weniger als 150 g/I zur Herstellung einer zu Äthylalkohol fermentierbaren Lösung eingestellt wird, was unter der Bedingung gilt, daß dann, wenn die Konzentration über 50 g/l Hegt, als Mineralsäure beim Verfahrensschritt (3) Phosphorsäure verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das dem Verfahrensschritt (1) zugeführte Hydrolysat einen pH-Wert von 0,5 bis 1,5 hat und von Sägemehl oder Zeitungspapier stammt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrolysat vor der Dampfbehandlung teilweise auf einen pH-Wert von 4 durch Zugabe von Calciumcarbonat oder Ammoniumhydroxid eingestellt und daraus der anfallende Niederschlag abgetrennt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Verfahrensschritt (3) als Mineralsäure Phosphorsäure verwendet wird.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrolysat in dem Verfahrensschritt (4) auf eine Glucosekonzentration von mindestens 100 g/l, jedoch weniger als 150 g/l konzentriert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrolysat durch Erhitzen auf 35° unter einem Vakuum von 71,12 bis 76,20 cm Quecksilbersäule konzentriert wird.

7. Verwendung des nach einem der Ansprüche 1—6 erhaltenen Produkts zur Herstellung von Äthylalkohol.

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Die Patentansprüche 2 bis 6 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens. Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung des nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhaltenen Produkts zur Herstellung von Äthylalkohol.

Traditionell werden Holz, Papier und landwirtschaftliche Nebenprodukte, wie Sägemehl, Holzabfall, Maiskolben, Stroh bzw. Gelbstroh, Zuckerrohrbagasse, Zeitungspapier und dergleichen im wesentlichen nls Abfallmaterialien angesehen und mittels Veraschung oder ähnlicher Maßnahmen, die gleichermaßen unproduktiv sind, vernichteL Es ist sehr wohl bekannt, daß die Lignozellulosebestandteile derartiger Materialien hydrolysiert werden können, um wertvollere Produkte zu liefern, die wiederum in zusätzliche und unterschiedlich wertvollere Produkte überführt werden können. Jedoch sind derartige Maßnahmen in begrenzter Anwendung, was größtenteils auf die relativ niedrigen Investitionserträge zurückgeht, die erreicht werden können. Die für Planung und Konstruktion der zur Durchführung derartiger Wiedergewinnungsmaßnahmen erforderlichen Kapitalaufwendungen können beträchtlich sein, weshalb es daher verlangt wird, daß relativ hohe Umsetzungen erreichbar sind, um die vorgenommenen Ausgaben zu rechtfertigen.

Die US-Patentanmeldung Nr. 2 885 (vom 12. Januar 1979 und von John A. Church et al.) t.iit dem Titel »Continous Process for Cellulose Saccharification« beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verzuckerung von cellulosehaltigen bzw. celluloseartigen Produkten, bei denen die Cellulosebestandteile typischer Abfallprodukte zu Glucose, Furfural und Xylose umgesetzt werden können. Ein derartiges Verfahren liefert bequem, schnell und wirtschaftlich durch saure Cellulosehydrolyse ein Hydrolysat, das als Rohmaterial zur Herstellung wertvollerer Produkte herangezogen werden kann. Zum Beispiel wird es in dieser US-Patentanmeldung erwähnt, daß derartige Hydrolysate als fermentierbare Rohsubstanzen bei einem Verfahren zur Umsetzung von Zucker in Äthylalkohol verwendet werden können.

Wenngleich es lange bekannt gewesen ist, daß Cellulosehydrolysatlösungen zwecks Herstellung von Alkoholen fermentierbar gemacht werden können, sind die früheren Verfahren jedoch lediglich im kleinen Labormaßstab durchführbar gewesen und sind über dieses Stadium hinaus nicht bedeutsam entwickelt worden. Hauptsächlich sind diesem Stand der Technik übermäßig langsame Reaktionsgeschwindigkeiten mit extrem niedriger Ausbeute und das Fehlen von Voraussagen über solche Bedingungen, die eine Fermentation eines beliebigen gegebenen Hydrolysats erlauben würden, zugeschrieben worden. Zusätzlich sind wirtschaftliche Erwägungen, die bei der chemischen Umsetzung von Zucker zu Alkohol auftreten, ein begrenzender Faktor. So ist es z. B. lediglich theoretisch möglich, eine Einheit Alkohol von jeweils zwei Einheiten von Zuckei, der im Rohmaterial vorliegt, zu erhalten. Verluste an Zuckergehalt des Rohmaterials unter den Herstellungsbedingungen, bei der mechanischen Behandlung und dergleichen führen selbst des weiteren zu einer Abnahme der niedrigen Ausbeute, die möglicherweise erhalten worden ist.

Celluloseextrakte und ihre Zersetzungsprodukte als fermentierbare Rohmaterialien sind insbesondere wegen der großen Anzahl von Faktoren zu beurteilen, in vielen Fällen den Fermentationsvorgang verhindern. Ein Faktor. de^r lange als bedeutsam bei der Verzögerung der Entwicklung eines ausführbaren Fermentationsverfahrens in Betracht gezogen wurde, ist die Gegenwart von Materialien in dem Hydrolysat gewesen, die als Toxine oder Fermentationsinhibitoren wirken. Jedoch können die Toxine in jedem gegebenen Hydrolysat beträchtlich in Abhängigkeit von dem Behandlungsablauf, den Ausgangsmaterialien u. dgl. schwanken. Des weiteren ist dieses Problem mit der Tatsache verbunden, daß selbst nach Identifizierung

besonderer Toxine in einem vorliegenden Hydrolysat ihre Wirkungsweise unter einer beliebigen vorgegebenen Anzahl von Bedingungen größtenteils nicht vorhersehbar ist und die Fermentation selbst unter besonderen Bedingungen schwierig abläuft. Verschiedene Forscher haben vermutet, daß diese Schwierigkeiten von irgendeiner Zahl von Faktoren, einschließlich den Behandlungstemperaturen, dem pH-Wert der Medien, der Gegenwart oder Abwesenheit von Sauerstoff, der Konzentration und der Art der toxischen Substanzen, dem Verhältnis der Hefezellen zu den toxischen Substanzen, dem physiologischen Zustand der Hefezellen, der weiten Variation der Toxizität verschiedener Substanzen auf den Stoffwechsel der besonderen Hefe, das Oxidations-/Reduktions-Potential, das während der Reaktion entwickelt wird, und vielen anderen Faktoren abhängt. Diskussion über die verschiedenen Schwierigkeiten der Fermentation und allgemeine Faktoren, die den Fermentationsprozeß beeinflussen, finden sich in einer Vielzahl von Literaturstellen. .

Zusammenfassende Diskussionen liefern Harris et al. in «Fermentation of Douglas Fir Hydroiyzates by S. cerevisiae« und Leonard et al. in »Fermentation of Wood Sugars to Ethyl Alcohol«, Industrial and Engineering Chemistry, Band 38, S. 896 bis 904, 1946, und Band 37, S. 390 bis 397, 1946. Des weiteren haben sich zu den aufgezeigten Fragestellungen Eklund et al. in »Acid Hydrolyses of Sunflower Seed Husks for Production of Single Cell Protein«, European Journal of Applied Microbiology, Band 2, S. 143—152, 1976, geäußert. In dieser Literaturstelle wird ein Verfahren zur Hydrolyse von HC'sen bzw. Schalen von Sonnenblumensamen und der Abbau der erhaltenen Hydrolysate zur Herstellung von Protein beschrieben. .

Die DE-PS 676 967 beschreibt fcin Verfahren zum Reinigen von Xylosewürzen für Nahrung„mittelzwecke oder zur Hefeherstellung, die durch saure Hydrolyse von Cellulose enthaltenden Substanzen hergestellt worden sind durch Ausfällen von Calciumphosphat und Calciumsulfat nach Erhitzen auf 65 bis 100⁰C zusammen mit Zentrifugieren und Leiten der Würze über oxydierte Metallfeilspäne oder über Materialien mit großer Oberfläche, während die Würze einen pH-Wert von 4 bis 7,5 hat, durch Zugabe von Malzsprößlingen zu der derart gereinigten Würze und durch Rühren während mehrerer Stunden.

Die US-PS 22 03 360 beschreibt ein Verfahren zur Verbesserung der Fermentationseigenschaften von unter sauren Bedingungen erhaltenen Holzhydrolysaten durch Behandlung der Hydrolysate mit Kalk, um den pH-Wert auf 9 bis 10 einzustellen, durch Altern während 1 bis 2 Tagen, Herabsetzen des pH-Wertes mit Schwefelsäure auf 5, Reinigen der Lösung mit aktivierter Holzkohle, Verdünnen der Lösung zur Herstellung eines 40 bis 70 vol.-prozentualen Hydrolysats, Beimpfen der Lösung mit einer Hefekultur und Fermentieren im Verlaufe von zwei Tagen.

Die oben diskutierten bekannten Verfahren illustrieren das Fehlen eines industriell ausführbaren Verfahrens zur Fermentierung von Säurehydrolysaten zu Alkohol, was auf die übermäßig langen Reaktionszeiten und niedrigen Ausbeuten zurückgeht, im Hinblick auf das andauernde Interesse an Alkohol als potentielle Energiequelle, die auf ständig verfügbare Rohmaterialien zurückgeht, ist eine rechtzeitige Entwicklung eines Verfahrens zur leichten und wirksamen Herstellung von Alkohol durch Fermentation von Zuckern, die in Holz und Holzncbcnprodukton vorliegen, bedeutsam.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Vorbehandeln von unter sauren Bedingungen aus Lignozelluloseniaterialien gewonnenen Hydrolysaten, wobei die Hydrolysate Glucose und zur Hemmung der Fermentation neigende Substanzen enthalten, zur Verfugung zu stellen, das die technisch einwandfreie Verhefung dieser Hydrolysate zu Äthylalkohol gestattet.

Diese Aufgabe wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelöst.

Das Hydrolysat wird also in bestimmter Weise vorbehandelt, um den Effekt der hemmenden Substanzen aufzuheben und/oder zu vermindern oder sonstwie auszuschalten, und zwar bis zu einem Ausmaß, daß das Hydrolysat ohne weiteres im wesentlichen in theoretischer Ausbeute zu Äthylalkohol fermentiert werden kann. Das kann durch eine 1- bis 2stündige Fermentation geschehen.

Die Erfindung kann mit jedem beliebigen Hydrolysat in die Praxis umgesetzt werden, das durch saure Hydrolyse von Lignozellulosematerialien erhalten worden ist Ein solches Lignozellulosematerial kann aus einer großen Anzahl von Materialien, einschließlich Holz und Papier und insbesondere benutztem Papier und Holznebenprodukten, wie Sägespäne, Holzabfall, Stroh, Zuckerrohrbagasse, Reisihülsen, Zeitungspapier u.dgl., ausgesucht werden. Derartige Materialien können in Gegenwart erres sauren Katalysators nach bekannten Verfahren hydrolysiert werden, um ein geeignetes Hydrolysatrohmaterial für die Zwecke des Verfahrens zu schaffen.

Das gelieferte Hydrotysatrohrnaterial wird bezüglich des Zuckergehalts und anderer Komponenten Schwankungen unterliegen, was von den Bedingungen, unter denen es hergestellt worden ist, abhängt. Dieses läßt sich am besten verstehen, wenn man die chemischen Abläufe, auf denen die saure Hydrolyse basiert, in Betracht zieht und diese zur Erläuterung in vereinfachter Form darstellt. Wenn ein Zellulosematerial bzw. zellulosehaltiges Material mit verdünc-er wäßriger Säure erhitzt wird, werden die glycosidischen Bindungen, die die einzelnen Anhydroglucoseeinheiten miteinander in dem Zellulosemolekül verbinden, durch saure Katalyse aufgespalten. Ein Molekül Wasser lagert sich an jede Anhydroglucoseeinheit an, um ein Molekül Glucose zu bilden, wie es durch die folgende idealisierte Gleichung erläutert wird:

(C₆H₁₀O₅)„ + η H₂O -~

C₆H₁₂O₆

Glucose ist von Natur aus in heißen sauren Lösungen instabil und kann drei Moleküle Wasser freisetzen, um 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) entsprechend der folgenden Gleichung zu liefern:

C₆H_nO₆

H +

C₆H₆O₃ + 3H₂O

HMF wiederum ist instabil und kann Zwei Moleküle Wasser anlagern, um Levulinsätire und Ameisensäure entsprechend der folgenden Gleichung entstehen zu lassen:

C₆H₆O₃ + 2H₂O

C₅H₈O₃ + HCOOH

Andere sehr komplexe Reaktionen treten ebenfalls auf, von denen angenommen wird, daß HMF zu dunklen unlöslichen Röckständen, als Humine bekannt, kondensiert Ligninabbauprodukte, wie Vanillin oder 3i>Ji'.r* aromatische Verbindungen, können ebenfalls vorliegen. Des weiteren werden die Bindungen des HemizeHui^s;: tnoleküls aufgespalten, um freie Moleküle von Xyiose aus Xylar, zu bildea Gewisse Reaktionsbedingungen begünstigen die Bildung von Glucose oder Xylose und die begleitenden Zersetzungsprodukte.

Ein besonders günstiges Verfahren sowie eine vorrichtung zur Herstellung geeigneter Säurehydrolysatrohmaterialien für die Zwecke der Erfindung wird in der vorstehend genannten US-Patentanmeldung 2 885 mit dem Titel »Continuous Process for Cellulose Saccharification« (vom 12. Januar 19/9) beschrieben. Wie in dieser Patentanmeldung beschrieben, läuft die Umsetzung von Zellulose zu Glucose am besten unter schärferen Bedingungen ab, während die Xylanumsetzung zu Xylose bei relativ niedrigen Temperaturen stattfindet. Es ist nicht möglich gewesen, maximale Mengen sowohl an Xylose als auch an Glucose nach einem Einphasenverfahren herzustellen, was auf die Tatsache zurückgeht, daß Xylose unter den Bedingungen zu Furfural dehydriert, die am wirksamster, die Umsetzung von Zellulose zu Glucose bewirken. Das Verfahren nach der genannten US-Patentanmeldung definiert die Bedingungen, die die Herstellung von Glucose/Furfural begünstigen und die den Abbau von Glucose zu HMF und Levulinsäure auf ein Minimum herabsetzen. Da, was nachfolgend noch diskutiert und erläutert wird. Furfural, HMF und Levulinsaure jeweils Toxine für Fermentationsorganismen darstellen, wird im Falle der Erfindung am besten ein Hydrolysatrohmaterial verwendet, das unter solchen Bedingungen hergestellt worden ist, die die Gegenwart von solchen toxischen Substanzen, soweit wie möglich, auf ein Minimum herabsetzen.

Derartige Bedingungen sind im allgemeinen bei der sauren Hydrolyse, in Gegenwart von Dampf, von Zelluloseausgangsmaterial eines Feststoffgehalts von 20 bis 45 Gew.-% Temperaturen innerhalb des Bereiches von 190 bis 225°C und Drücke von 14,1 bis 28,2 kp/cm² bei Verweilzeiten in der Reaktionszone von 1 bis 10 min. In der Reaktionsmasse ist die optimale Menge an Wasser nach der Dampfinjektion 75 bis 80 Gew.-%. Praktisch kann jede beliebige starke Mineralsäure verwendet werden, um die Hydrolysereaktion zu katalysieren. Schwefelsäure ist die normalerweise in Mengen von 1 bis 3%, bezogen auf das Gesamtgewicht so der Reaktionsmasse, eingesetzte Säure. In diesem Verfahren zur Herstellung von Hydrolysatrohmaterial wird die Reaktionsmasse einer abrupten Druckverminderung unterzogen, wodurch eine Fraktion des Hydrolysats verdampft und wiedergewonnen werden kann. Diese Fraktion enthält normalerweise Furfural und Essigsäure.

Die obigen Ausführungen sollen lediglich ein günstiges Vorgehen zur Herstellung eines Säurehydrolysats erläutern, das für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders brauchbar ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann Säurehydrolysate von beliebiger Herkunft ausnutzen, da es ein Kennzeichen der Erfindung ist, daß das Vorbehandlungsverfahren dazu führt, daß gewisse Toxinmalerialien bis zu einem tolerierbaren A'ismaß vermindert oder entfernt werden und/oder sonst wie der Effekt derartiger Materialien ohne wesentlichen nachteiligen Effekt auf die Glucose, die in dem Hydrolysat vorliegt, beheben wird. Derjrtipe Hydrolysatrohmaiei-iülicii cn:halien jedoch im allgemeinen Gliicuse, Pi'. ,urs". Hv >OAj.ineihylfurfural, Essigsäure, Ameisensäure und Levulinsäure unu haben einen pH-Wert von weniger als 1,5, zweckmäßig 0,5.

Vorbehandlung des Hydrolysate

Das Hydrolysatrohmaterial stellt, wie es erhalten wird, ein Konglomerat chemischer Substanzen dar. Viele derartiger Substanzen wirken als Inhibitoren oder Tuxine auf die Hefe. Es ist auch möglich, daß einige dieser Substanzen sich synergistisch kombinieren, um entweder den besonderen Hefeorganismus oder andere Mechanismen, die bei der Fermentation ablaufen, zu hemmen. Weil daher notwendigerweise eine gewisse Unsicherheit darüber existiert, wie die Ziele der Erfindung exakt realisiert werden, wird angenommen, daß das Vorbehandlungsverfahren das Hydrolysat entweder durch die Entfernung von Toxinsubstanzen oder durch die Umsetzung vor ,nindestens eines Teils solcher Substanzen in die Nichiicxir-forrn fermentierbar macht.

Es wurde gefunden, daß mehrere Materialien, die als Toxine bekannt sind, in Säurehydrolysaten von. hier eingesetzten Lignozellulosematerialien vorliegen. Ihr Effekt ist quantitativ erfaßt worden, um ihn zu eliminieren oder zumindest auf ein Minimum herabzusetzen. Der Effekt solcher Substanzen kann aus den Ergebnissen der folgenden Versuche ersehen werden, bei denen eine anaerobe Kultur von S. uvarum in einer Konzentration von etwa 0,7 (Trocken) Gew.-°/o an Zellen mit Säurehydrolysaten unter den angegebenen Bedingungen eingesetzt wird und wobei identisch eine Impfkultur und ein Fermentationsmedium zur Anwendung kommen. Glucosezuckerbestimmungen wurden unter Verwendung des Beckmann-Glucose-Analysators vorgenommen. Wo eine Fermentation erreicht oder versucht wurde, wurde das dcmpf-'bgestreifte, CaO-vorbehandelte Hydrolysat mit HCI als Neutralisationsmittel neutralisiert.

Die Zellenkonzentration, auf die hier Bezug genommen wird, wird durch die Messungen der optischen Dichte oder des Trockengewichts bestimmt.

1. Essigsäure und Ameisensäure

Beide Säuren sind Toxine der Alkohol bildenden Hefe. Essigsäure ist in dem Hydrolysat in Mengen von 3 bis 4 g/l vorhanden, während die Ameisensäure in Mengen von 8 bis 9 g/l vorliegt. Der toxische Effekt dieser Säuren kann nicht dadurch aufgehoben werden. daß die Fermentation bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 7, zweckmäßig bei etwa 5,5 bis 6,5 durchgeführt wird. Oa5 Fermentieren unterhalb etv a 5 bis 6 führt nicht zu einem Ausschalten des Effekts der Toxine, während ein Fermentieren oberhalb des pH-Werte? von 7 für die Äthanolherstellung ungünstig ist. Diese Parameter werden am besten durch die Ergebnisse der nachfolgend beschriebenen Versuche erläutert, bei denen Zeitungspapierhydrolysat erfindungsgemäß vorbehandelt und eine Analyse im Hinblick auf Ameisensäure und Essigsäure vorgenommen wurde. Eine Kortroll-Lösung reiner Glucose wurde ebenfalls herangezogen. Zu jeder Lösung wurden identische Nährstoffe in identischen Men^e" gegeben. |edc der Lösungen wurdf* mit 0,7% Hefezellen beimpft und innerhalb von 1& Stunden fermentieren gelassen. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 1 wiedergegeben.

	Tabelle I	t von 4.0 und	30 25	in	098	8	In 2	Wachstum	Verdopplungszeit	Wachstum
7		g/l		40.0 l0				geschwindigkeit		geschwindigkeit
	pH 4.0		9.0		Verdoppiungszcil		{h-1	(hi	Ih-")
			4.0	HMF			0,059
	40,0	Ameisen-	0		(h)	0,051	46	0,150
	9,0	7.0	18.5 „ 46.3 %	(g/l)	11.7		7,0	0,099
Fermentierung von Glucose in Gegenwart von	4.0			5	13,6	sch windigkeit Veruopplungs7.eit	20,4	0.034
und Essigsäure bei einem pH-Weri	41.0	pH 7.0		7		18,7	0,37
	0 0		Wachstunisge		22	0,32
		39.8 ι λ 20		3. Levulinsäure
A. Kontrollversuch		3,0
ursprüngliche Glucose		3,0
zugegebene Ameisensäure	36.4	0
zugegebene Essigsäure	3,0	18.9	Levulinsäure inhibiert das Hefewachstum in Konzentra
endgültige Glucose	3,0	47.5%	tionen von 10 g/l oder größer bei einem pH-Wert von 6 bis 7.
endgültiges Äthanol prozentuale Ausbeute	36.4
(bezogen auf Glucose)	0	Levulinsäure
	0
B. Zeitungspapierhydrolysat		(g/i)
anfängliche Glucose
Gehalt an Ameisensäure	0
Gehalt an Essigsäure	10
endgültige Glucose	20
endgültiges Äthanol	30
prozentuale Ausbeute	40

2. 5-Hydroxymethylfurfural (HMF)

HMF ist ein starker Inhibitor für das Hefewachstum. Jedoch kann dieses Material durch CaO-Behandlung bei Raumtemperatur innerhalb eines pH-Bereiches von 10 bis 10,5 ohne nachteiligen Einfluß auf die Glucose zerstört oder abgebaut werden. Der pH-Bereich scheint hier entscheidend zu sein, da bei einem pH-Wert von unter 10 die Wirkung des HMF nicht aufgehoben wird, während bei einem pH-Wert oberhalb 10,5 das Zuckerprodukt instabil ist. Es ist festgestellt worden, daß die CaO-Behandlung der Hydrolysate bei einem pH-Wert von 10 bis 10.5 zu einem raschen Zerfallen des HMF während der ersten zwei Stunden führt, der danach abflacht. So wurde z. B. festgestellt, daß etwa 63% des HMF in einer Stunde bei einem pH-Wert von 10,5 entfernt werden.

Bei einem pH-Wert von 10.25 sind etwa zwei Stunden erforderlich, um die gleiche Menge an HMF zu entfernen, während bei einem pH-Wert von 10,75 etwas Glucose gleichzeitig zerstört wird. Daher stellt es eine günstige Ausgestaltung der Erfindung dar, wenn das Hydrolysat mit einer ausreichenden Menge CaO bei Raumtemperatur und unter Rühren behandelt wird, um den pH-Wert bei 10.5 '. bis 1.5 Stunden zu halten.

Die Wirkung des HMF auf die Hefe kann aus den nachfolgend beschriebenen Versuchen ersehen werden. bei denen das Hefewachstum als eine Funktion der HMF-Konzentration in dem Hydrolysat bei einem pH-Wert innerhalb des Ferrnentierungsbereiches von 6 bis 7 bestimmt wurde. Bei der »Verdopplungszeit« handelt es sich um eine Zeit, die zur Regenerierung der Zellen verstreicht Sie wurde durch Messungen der optischen Dichte bestimm·.

Es wird ■ *n keine! Folge in dem Vorbehandlungsschritt angenommen, daß sie den Effekt dieses Toxinmaterials unwirksam macht. Fermentationen werden vermutlich wegen der Entfernung oder des Unwirksammachens dieses Effekts anderer vorliegender Toxine erhalten, die einen kumulativen oder synergistischen Effekt zusammen mit der Levulinsäure haben können. Zusätzlich, wie es iml-i-n noch diskutiert wird, liefert gegen Levulinsäure unempfindliche Hefe ein alternatives Mittel zum weiteren Ausschalten des Effekts dieses Toxins.

4. Furfural

Furfural ist in Konzentrationen von mehr als 5,0 g/l toxisch. Bei Konzentrationen zwischen 3 und 5 g/l wurde festgestellt, daß es das Hefewachstum beträchtlicn hemmt.

Furfural	Verdopplungszeit	Wachstum
		geschwindigkeit
(g/1)	(h)	(h-T
0	4,6	0,150
2.0	U	0,165
4,0	7,4	0,094
55 5,0	-	0

Verdopplungszeit
(h)

Wachstumgeschwindigkeit GV)

4,6

9.7

0,15
0.071

Furfural wird ohne weiteres aus dem Hydrolysat entweder durch Dampf-Abstreifen und/oder Calciumoxidbehandlung entfernt.

Der Effekt des Dampf-Abstreifens und der CaO-Vorbehandlung kann durch den folgenden Versuch erläutert werden, bei dem das Hydrolysat bei einem pH-Wert von 6.8 mit einer anaeroben Kultur von Candida utilis-Hefe in einer Zellenkonzentration von etwa 0,7% Trockengewicht in einer Schüttelflasche gemischt und die Fermentation der Glucose nach 16 Stunden beobachtet wird. Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle II erfaßt

9 10

Tabelle II

Λ. Effekt des Dampf-Abstreifens bzw. der Behandlung mit CaO auf das Hydrolysat

Behandlung	Glucose	Furfural	MMF	Glucose	Furfural	HMF	Glucose nach
							einem Wachstum
							von 16 h
	(g/l).	(g/l ι	(g/l)	(g/l)	(g/l)	(g/l)	(g/l)
Λ. keine	44	10,0	4,6	44
B. CaO	44	5,0	1,6	44
C. Dampf-Abstreifen	44	1,2	2,2	0
von B
D. Zugabe von Furfural	44	4.2	2,2	0
;oiC
B. Effekt der CaO-Behandlung auf dampf-abgestreiftes Hydrolysat
Rphiinillunp	Glucose nach
	einem Wachstum
	von 16 h
	(g/l)

A.	keine	44
B.	Dampfabstreifen	42
C.	CaO-Behandlung	41
	von B

4,6
4,4
0.1

Aus den obigen Angaben ist ersichtlich, daß weder die CdO-Behandlung allein noch das Abstreifen mit Dampf allein wirksam ist. um das Hydrolysat fermentierbar zu machen, obwohl beide Behandlungen den Gehalt an Furfural herabsetzen. Es wurde gefunden, daß die Zugabe von Furfural zu einem CaO-behandelten und dampfabgestreiften Hydrolysat bis auf eine Konzentration, die der nach der CaO-Behandlung gleich ist, jedoch vor dem Dampfabstreifen das Wachstum nicht hemmt. Dieses zeigt an, daß das Dampfabstreifen einiges zusätzliches unbekanntes inhibierendes Material entfernen kann.

Es ist aus den obigen Ausführungen ersichtlich, daß die Schritte (1) des Dampfabstreifens, (2) des Behandeins mit CaO bei einem pH-Wert von 10 bis 10,5 und (3) das Fermentieren bei einem pH-Wert von 5 bis 7 für eine erfolgreiche Durchführung des Vorbehandlungsstadiums des Verfahrens entscheidend sind.

Verschiedene zusätzliche Schritte können zwischen die wesentlichen Schritte des Vorbehandlungsverfahrens, wenn gewünscht, eingeschoben werden. So wird bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Hydrolysat eines pH-Wertes von etwa 03 teilweise mit Kalkstein oder Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von etwa 4 vor dem Dampfabstreifen neutralisiert Während das Hydrolysat entweder bei einem niedrigen pH-Wert, wie erhalten, oder einem pH-Wert von 4 nach der teilweisen Neutralisation dampfabgestreiift werden kann, ist eine teilweise Neutralisation vor dem Dampfabstreifen zweckmäßig, um die Geräte korrosion herabzusetzen. Dieser Schritt erfordert einen zusätzlichen Filtrationsschritt, um niedergeschlagenes Material zu entfernen, und kann auch schließlich bei einer solchen eingesetzten Einrichtung ausgelassen werden, die nicht ohne weiteres korrodiert oder bei der die Korrosion nicht ins Gewicht fällt Wenn das Hydrolysat auf einen pH-Wert von 4 unter Einsatz von Calciumcarbonat u.dgl. neutralisiert wird, kann der erhaltene Niederschlag nach der Gewinnung aus dem Hydrolysat verascht werden, um Brennstoff für die Gewinnung von Dampf für das Verfahren zu liefern. Normalerweise wird der Filterkuchen vor dem Veraschen mit Waschflüssigkeiten, die zu dem Hydrolysatfiltrat gegeben worden sind, gewaschen, um Zucker zu entfernen und wiederzugewinnen.

Das -Neutralisieren des Hydrolysats mit Ammoniumhydroxid hat den zusätzlichen Vorteil der Zufuhr eines Nährstoffs, den die Fermentierungsmikroorganismen für ihr Wachstum verwenden können, während zur gleichen Zeit der pH-Wert des Hydrolysats angehoben wird, um die Korrosion zu verhindern.

Das Dampfabstreifen wird am besten dadurch vorgenommen, daß Dampf in das Hydrolysat in einer ausreichenden Menge injiziert wird, um das Hydrolysat auf einer Temperatur von 95 bis 105° C zu halten.

Zweckmäßigerweise kann das Hydrolysat durch einen Gegenstromextraktor geleitet werden, um die dampfflüchtigen Materialien zu entfernen. Bei dieser Technik wird Dampf im unteren Teil der Säule eingeführt. Das Hydrolysat wird oben zugeführt und in einem Behälter am unteren Teil der Säule gesammelt Dampf-flüchtige Toxine werden in dem Dampf entfernt, der in einem gesonderten Behälter kondensiert und gesammelt wird.

Nach dem Dampfabstreifen wird das Hydrolysat mit einer ausreichenden Menge CaO behandelt, um den pH-Wert zwischen 10 und 10,5 während einer Zeitdauer von 1 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur zu halten, wonach der Niederschlag durch zweckmäßige Mittel, einschließlich Filtration, Zentrifugiert: sw, entfernt wird.

Das Hydrolysat ist nach der Neutralisation mit Mineralsäure und nach dem Entfernen anfallenden Niederschlags in diesem Verfahrensstadium fermentierbar. Dabei wurde gefunden, daß die Schnelligkeit der Reaktion von der Konzentration der Zuckerlösung, dem

besonderen eingesetzten Hefestamm, der Hefezellenkonzentration und der zur Neutralisation des vorbc'.nndelten Hydrolysats verwendeten Mineralsäure abhängt.

Effekt der Mineralsäure

Das Hydrolysat wird auf einen pH-Wert von etwa 5 bis 7, am besten 5,5 ois 6,5. nach der CaO-Behandlung neutralisiert, indem eine Mineralsäure, z. B. Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergl.. eingesetzt wird. Phosphorsäure wird besonders aus verschiedenen Gründen bevorzugt. Das Neutralisieren mit Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure führt zu einer trüben Lösung, was bei einer Chargenfermentation keine Folgen hat. Wenn jedoch eine kontinuierliche Kulturfermentation durchgeführt wird, müssen die Hefezellen von dem ausfließenden Strom zurück in den Fermenter geführt und vor einem derartigen Zurückführen wieder angereichert werden. Noch bedeutsamer ist es, wie nachfolgend noch diskutiert, daß es festgestellt worden ist, daß die Verwendung von Phosphorsäure zu einer rascheren Fermentation führt. Wenn sie in Kombination mit einer hohen Konzentration an Hefezellen eingesetzt wird, so führt das zu extrem großen Fermentationsgeschwindigkeiten mit konzentrierten Hydrolysaten, was es möglich macht, theoretische Ausbeuten nach der Fermentation in einer Zeitdauer von I bis 3 Stunden zu erhalten

Effekt der Konzentration des Hydrolysats

Es wurde gefunden, daß die Vorbehandlung des Hydrolysats durch CaO-Vorbehandlung, Dampfabstreifen und Zugabe von Mineralsäure, z. B. HCI-Neutralisation auf einen pH-Wert von 6 bis 7 zu fermentierbaren Lösungen führt, die fortschreitend schwieriger zu fermentieren sind, wenn die Glucosekonzentration über 50 g/l angehoben wird. Es scheint, daß die Konzentration der Lösung ebenfalls das Niveau bzw. die Menge anderer inhibierender Substanzen in dem Hydrolysat über die tolerierbare Grenze anhebt. Um dieser Inhibierung konzentrierter Lösungen entgegenzuwirken, wurden, wie nachfolgend noch diskutiert, verschiedene Hefen und Hefekonzentrationen beurteilt. Um jedoch den Effekt des Konzentrierungsschritts zu erläutern, können typische Ergebnisse aus den nachfolgend beschriebenen Versuchen hergeleitet werden, wobei diese Ergebnisse mit anaerob vermehrter Candida utilis in einer Zellenkonzentration von 0,7% mit Sägemehlhydrolysat erhalten wurden, wobei eine Neutralisation mit HCI und ein Fermentieren während etwa 16 Stunden erfolgte.

Behandlung	Glucose	Glucose nach
		Wachsen
	(g/1)	(g/l)
A. keine	44,0	44,0
B. CaO und Abstreifen	44,0	η
C. Konzentrieren von B	100,0	ϊΰϋ.0
D. Verdünnen von C auf	70,0	49,5
E. Verdünnen von C auf	60,0	0
F. Verdünnen von C auf	50,0	0

Versuche, Hydrolysatlösungen, die auf 150 g/l oder mehr konzentriert wurden, zu fermentieren, haben sich als nicht erfolgreich erwiesen, was selbst unter Einsatz der nachfolgend diskutierten Mittel gilt

Effekt dt-Λ Hefestamms, der Zcllenkonzentration
liiij der neutralisierenden Säure

Die obigen Ergebnisse wurden in Schüttelflaschen Ί unter Verwendung von Candida utilis als Hefekultur und von HCI als Neutralisationsmiui.-I erhalten. .

Andere llefestämme wurden erprobt und bezüglich des Effekts auf die Fermentierbarkeit des vorbehandelten Hydrolysats, wenn es -mit HICI neutralisiert worden war, beurteilt.

Es wurde festgestellt, daß S. uvarum in einer Zellenkonzentration von 0,7% Trockengewicht 100 g/l Hydrolysate in etwa 98 Stunden und 50 g/l Hydrolysatlösungen in etwa 19 Stunden fermentiert, während S.

cerevisiae (Backhefe) 100 g/l Hydrolysat in etwa 42 Stunden zu Äthanol in einer Konzentration von 50,8 g/l fermentiert. Ein gegen Levulinsäure unempfindlicher Stamm von S. uvarum wurde hergestellt und durch Behandlung der Zellen mit Levulinsäure in chemostatischer Kultur isoliert, hs wurde gefunden, daß dieser Stamm in einer Konzentration von 0,7% 100 g/l Hydrolysat in etwa 50 Stunden fermentiert, was zu 49,3 g/l Äthanol führt.

Es wurde dann gefunden, daß die Verwendung von Phosphorsäure als Neutralisationsmittel einen deutlich positiven Effekt auf die Geschwindigkeit der Fermentation der konzentrierten Hydrolysate ausübt. Mit Phosphorsäure behandelte Hydrolysate lieferten bei einer Konzentration von 100 g/l, wenn sie entweder mit dem Ausgangsstamm S. uvarum oder mit dem gegen Levulinsäure unempfindlichen Stamm S. uvarum. beide in einer Zellenkonzentration von 0,7%, Ausbeuten von 47,7 g/l Äthanol in 15.5 Stunden, während Backhefe in der gleichen Konzentration 46,5 g/l in 11.5 Stunden entstehen ließ.

Eine sogar schnellere Fermentation in theoretischer Ausbeute ist möglich, wenn höhere Hefezellenkonzentrationen verwendet werden, was durch erhaltene Ergebnisse, die in der Tabelle III aufgelistet sind, deutlich gemacht wird.

Tabelle III

Effekt der Zellenkonzentration bei einem mit Phosphorsäure neutralisierten Sägemehlhydrolysat von 100 g/l Backhefe

Das !neinano<=T~rei?>n und die Wechselwirkung ^e-verschiedenen Schritte der Vorbehandiungsnviiinahme des Verfahrens wie auch der Effekt der besonderen Neutralisationssäure und der besonderen Hefezellenkonzentration können ohne weiteres unter Heranziehen der oben wiedergegebenen Ergebnisse von Versuchen beurteilt werden.

Die Funktion der CaO-Behandlung zur wirksamen Entfernung oder zum wirksamen Abbau von HMh in

Zellenkonzentration	erforderliche	Äthanol
in % (Trockengewicht)	Zeit in h	ausbeute in %
0,7	20	50
1,5	12	48,1
2,0	8	50,6
2,5	5,6	50,2
3,0	3,0	46,8
5.0	1,5	47.8
7.0	1,25	48,4

/.(■uen von weniger als I bis 3 Stunden, der Effekt des Neutralisicrens auf einen pH-Wert von 5 bis 7. der Effekt der Konzentration des Hydrolysats und der Hefe/.eMnn und die Erzielung extrem schneller "cak tionsgeschwindigkeiten konzentrierter Hydrolysate, wenn sie mit Phosphorsäure neutralisier! werden, stelien jeweils bedeutsame Faktoren dar. die nicht zu erwarten waren und eine wesentliche Aufgabe im Zusammenhang des Gesamtverfahrens zu erfüllen scheinen.

Bereitstellung des Fermentationsmediunis

Nach dem Vorbehandlungsverfahren ist das Hydrolysat zur Fermenticrung fertig, wobei entweder ein diskontinuierliches oder ein kontinuierliches KuUurfermentationsverfahrcn unter Bedingungen durchgeführt wird, unter denen sich die Zellen aerob oder anaerob vermehren.

Die Beimpfung verschiedener Hefestämme kann nach beliebigen bekannten Verfahren vorgenommen werden, jede Hefe kann verwendet werden, die imstand. ist, in dem Fermentationsmedium zu wachsen. Wie es oben bereits diskutiert wurde, sind zufriedenstellende Ergebnisse mit verschiedenen Mitgliedern der Gattung Saccharomyces, wie S. uvarum, S. uvarum. modifiziert zur gegen Levulinsäure unempfindlichen Art, S. cerevisiac (Backhefe) und dergl. erhalten worden, wobei Backhefe besonders gerne verwendet wird. Zufriedenstellende Ergebnisse sind auch mit C. utilis bei Glucosekonzentrationen bis zu 60 g/l erzielt worden. Es wurde gefunden, daß diese besondere Hefe bei höheren Glucosekonzentrationen wirksam ist.

Für das mikrobielle Wachstum geeignete Nährstoffe können zu dem Hydrolysat und zu dem Beimpfungsentwicklungsmedium, wenn gewünscht, gegeben werden, einschließlich Phosphor und Stickstoff in Form von Phosphaten, Ammonium, Harnstoff usw. Wenn Phosphorsäure als Neutralisationsmittel verwendet wird, wird ein Phosphornährstoff während des Neutralisationsschritts hinzugegeben. Zusätzlich kann die Fermentierung, wenn Phosphorsäure als neutralisierende Säure eingesetzt wird, durch Zugabe von Harnstoff als einziger zusätzlicher Nährstofflieferant durchgeführt werden. Das teilweise Neutralisieren mit Ammoniumhydroxid vor dem Dampfabstreifen führt ebenfalls Stickstoff als Nährstofflieferant zu. Andere Mineralsalze, Spurenelemente, Vitamine usw, einschließlich Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Calciumchlorid, Kaliumphosphat, Biotin, Folsäure, Inositol, Niacin, p-Aminobenzoesäure, Riboflavin, Thiamin. Harnstoff usw., können als Wachstumsnährstofte. wenn gewünscht, dem ι !j drolysat zugegeben werden.

Bei einer Ausr?staitung wird die Jmpikititur ;?.r eine absatzweise bzw. die iiskontinuierliche Fermentation di-rch Beimpfen eines Mediums mit einer Schleife von Zellen aus einer Schräg(agar)kuitur entwickelt, das 2,0% Glucose. 1.0% Pepton und 0,3% Hefeextrakt enthält (nachfolgend als YPG-Medium bezeichnet). Dieses derartig beimpfte Medium wird unter Schütteln während 24 Stunden bei 32° C bebrütet, wonach es in 900 ml zusätzliches YPG-Medium überführt, unter Schütteln während 6 bis § Stunden bebrütet und in einen Fermenter überführt wird, der 9 i ίD-Medium enthält, wobei dieses 90 g/I Glucose, 7,65 g/l Hefeextraki. 1,19 g/! Ammoniumchiorid C,0! g/l Magnesiumsulfat, 0,05 g/l Calciumchlorid und 02 m/l GE 60 AF (ein Antischaummiuei) sr.Lh?.?*. Die Zellen wurden bei einem DH-Wert von 6 bis 7, einem Rühren «on 1000 U/min und einem Luftstrom von 1 Vol./Vol./min (I vvm) während 16 bis 20 Stunden vermehrt, wonach uie Zeilen ciurch Zentrifugieren oder äquivalente Mittel gewonnen und in der f'Aüiixchten Konzentration ^rurn Beimpfe^ des > Hvd;clysats eingesetzt wurden.

Die Zellen können ".uch aus einer kontinuierlichen Kultur entwickelt werden, wodurch Zellen vom AtHnolprodukt, das aus dem Feimenler entfernt wird, gewonnen werden. Bei diesem Schritt werden die

in gewonnenen Zeilen wieder angi" _ich"rt und im··¹, solchen Bedingungen zurückgeführt, daß der Stoffwechxelzuslatid der Zelle, das Volumen in den·. Fermenter und der konstante Wert der Zellenkon/entration in dem Fermenter erhalten bleiben. Das Abtrennen d(.r Zellen von dem Äthanolprodukt kann auf verschiedene Weise erfolgen, z. B. durch Schwerkraftabsetzen. Zentrifugieren, Ultrafiltration usw. Zweckmäßig werden die Zellen wiedergewonnen und mittels Doppelauslaßströme, die den Fermenter verlassen, rückgeführt. Zum Beispiel

m werden Äthanol und Hefezellen in einem ersten Auslaßstrom dosiert in einer Geschwindigkeit abgezogen, die durch einen Meßfühler in dem Fermenter bestimmt wird, der angibt, wann die Zellenkonzentration ein gewünschtes oberes Limit überschritten hat. Ein

2Ί zweiter Auslaßstrom entfernt Äthanol und Hefezellen zu einer Zellenumiaufeinrichtung, die eine geeignete Membran, z. B. einen mikroporösen Filter, wie er in Ultrafiltrationsanlagen verwendet wird, enthält, der die Zellen zurückhält, es jedoch ermöglicht, daß Äthanol und das nicht einem Stoffwechsel unterzogene Medium durchtreten, wodurch es ermöglicht wird, im wesentlichen zellenfreies Äthanol zu gewinnen. Die Membran ermöglicht eine kontinuierliche Zellenkonzenlration, so daß Zellen dem Fermenter wieder zugeführt werden können, der des weiteren mit den benötigten frischen vorbehandelten Hydrolysatströmen zwecks Fermentation beschicht wird. Die nachfolgende Beschreibung dient. dazu, die diskontinuierliche Fermentation zu erläutern.

Erläuterung einer besonders guten Ausgestaltung

Ein Säurehydrolysat eines pH-Wertes von 0,5 wird aus Sägespänen durch saure Hydrolyse in Gegenwart von Dampf und Schwefelsäure in einer R.-ikiiop.s7t>ne hergestellt, die auf eine Temperatur von 190 bis 225⁰C unter einem Druck von etwa 14 bis 28 kp/cm^J gehallen wird. Das Hydrolysat enthielt 50,2 g/l Glucose, 8,9 g/l Furfural, 3,6 g/l Hydroxymethylfurfural. 6,5 g/l Levulinsäure, 9,7 g/l Essigsäure und 4,8 ζ/l Ameisensäure.

Das Hydrolysat wurde part;;-l! rnit einer ausreiche, den Menge A-:n:oniümhydroxid auf einen pH-Wert von 4 neutralisiert, wonach der anfallende Niederschlag entfernt und der teilweise neutralisierte Strom einem Gegenstromextraktor zugeführt wurde, wo Dampf bei einer Geschwindigkeit von 4 l/h ausgesetzt wurde. Dabei wu«ieri uampfflüchtige Materialien, einschließlich Furfural, entfernt und gesammelt 14 g/l CaO wurden dem dampf-abgestreifttn Hvdrolysatmaterial zugegeben, um den pH-Wert auf 10,5 einzustellen. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur gerühr; und ί Stunde lang bei e:nem pH-Wrr; ■. ■ '0,5 gehalten, wonach der anfallende Niederschlag entfernt wurde. Das Hydrolysat wurde auf den pH-Wert von 5,5 bis 6,5 mit 1,5 bis 3.0 m!/l Phosphorsäure neutralisiert. Der erhaltene Niederschlag wurde entfenii Dis neutraliyy
-r· vor· L■ K) g/l euren h'rhjtztn auf 35°C unter

15 16

Vakuum (712 cm Hg) unter Verwendungeines kontinu- Trockenzellenkonzentration von 3 bis 3,5 Gew.-°/o zu

ierlich arbeitenden Verdampfers konzentriert . erhalten. Die Mischung wurde anaerob während 1,5 bis

Nach dem Kühlen auf Raumtemperatur wurden 0,1% 2 Stunden fermentiert, wonach 50 g/l Äthanol gewon-

Harnstoff zu dem konzentrierten Hydrolysat gegeben, nen wurden.

welches darauf zusammen mit einer ausreichenden ä Hefezellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen

Menge an hergerichuter Impfkultur zugeführt wurde, und einem nachfolgenden Fermentationsansatz zuge-

wobei die Impfkultur aerob auf einer Schräg(agar)kultur führt. Zufriedenstellende Ergebnisse wurden bei mehre-

im YPG-Medium vermehrte Backhefe enthielt, um eine ren Überführungen erhalten.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Vorbehandeln von unter sauren Bedingungen aus Lignozellulosematerialien gewonnenen Hydrolysaten, wobei die Hydrolysate Glucose und zur Hemmung der Fermentation neigende Substanzen enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß