JPS5848160B2 - シンキカゴウブツノセイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は好ましくはその本質的に純粋な形で式により表
わされる■−３−（２−デオキシーβ−Ｄ一エリスロー
ベントフラノシル）−３，６，７．８−テトラヒドロイ
ミダゾ［４，５−ｄ）ＣＩ，３〕ジアゼピン−８−オー
ルおよび上記の化合物の製造法に関する。

さらに詳しくはその方法は、微生物であるストレプトマ
イセス・アンチピオチクスのうちの選ばれた（ＦＯ−３
−（２−デオキシーβ−Ｄ一エリスローベントフラノシ
ル）−３，６，７，８−テトラヒドロイミダゾＣ４，５
−ｄ，ＩＣｌ，３）ジアゼビン−８−オール産生菌株を
培養することにより本発明の化合物を製造するための発
酵法に関する。

加うるに本発明は９−（β一Ｄ−アラビノフラノシル）
アデニンとの組合せにおいて本発明の化合物を含有する
薬学的組成物および庖疹感染症の治療における上記の薬
学的組成物の使用法に関する。

本発明によれば、本発明の化合物（１）は、生物体であ
るストレプトマイセス・アンチビオチクスのうちの選ば
れた（Ｒ）一３−（２−デオキシーβ一Ｄ一エリスロー
ベントフラノシル）−３．６，７，８−テトラヒドロイ
ミダゾ（４，５−ｄ）（１，３〕ジアゼピン−８−オー
ル産生菌株を適当な栄養培地中で人工的条件下に、実質
的な量の＠−３（２−デオキシーβ一Ｄ一エリスローベ
ントフラノシル）−３．６，７，８−テトラヒドロイミ
ダゾＣ４，５−ｄ）ＣＬ３）ジアゼピン−８一オールが
生成されるまで培養し、９−（β一Ｄ 一アラビノフラ
ノシル）アデニンを除去し且つ本発明の化合物を分離す
ることにより製造される。

定期間の培養ののちに（６）−３−（２−デオキシーβ
一Ｄ一エリスローベントフラノシル）−３，６，７，８
−テトラヒドロイミダゾ［４．５−ｄ］〔１，３〕ジア
ゼピン−８−オールを下記に記載した方法によりその培
地から得ることができる。

本明細書中で使用されている「微生物であるストレプト
マイセス・アンチビオチクスのうちの（刊３−（２−ｙ
”オキシーβ−Ｄ一エリスローベントフラノシル）−３
．６，７．８−テトラヒドロイミダゾ［４，５−ｄ）
〔１ ，３）ジアゼピン−８オール産生菌株」なる表現
は、ストレプトマイセス・アンチビオチクスのうちの一
菌株を意味し、？れは本明細書中に記載された人工的条
件下に繁殖させた場合にビールを生成せしめ、それから
述べられた方法により（刊−３−（２−デオキシーβ−
Ｄ一エリスローペントノラノシル）−３．６，７，８−
テトラヒドロイダゾ〔４，５−ｄ〕〔１，３〕ジアゼピ
ンー８−オールを得ることができる。

本発明の目的に対して適当なストレプトマイセス・アン
チビオチクスの一菌株は、イタリー国カンパニア、ネイ
ブルスプロビンズ、バスコトリケースの近くで収集され
た土壌の試料から単離された。

この微生物の培養は米国イリノイ州ペオリアにあるアメ
リカ合衆国農務省北部利用研究開発部に寄託され、ＮＲ
ＲＬ３２３８としてそれらの永久的培養コレクション中
に保管されている。

その微生物は放線菌目のうちの好気性で且つ空気中で胞
子を形成する種類であり、Ｂａｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａ
ｌ ｏｆ ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ第７版（１９５７）に記載されているよ
うにストレプトマイセス属に属する。

この属の微生物を同定するために有用な多数の培地にお
けるその肉眼的な培養上の特徴は表１に示される。

？記の微生物をある種の寒天培地で培養する場合、空気
中の菌糸体は普通淡褐色ないし灰黄褐色である。

これらの寒天培地における培養により黄褐色ないし中程
度の褐色の溶解性色素を生成し、それは培地を水酸化ナ
トリウムで処理した場合に赤味を帯びてくる。

複合窒素源を含有する培地中では暗褐色または黒色の溶
解性色素を生成する。

その胞子鎖は直線状ないし屈曲性で、しばしば環状また
はゆるいら旋形になっている。

時間の経過とともにそれらの鎖は非常に屈曲し且つ不規
則になる。

胞子は平滑で楕円形ないし球求であり、０．７〜１．２
クロン×０．９〜１．７ミクロンの範囲で大きさが変り
うる。

炭素利用試験において、つぎの単一の炭素源、すなわち
グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、ｉ−
イノシトール、Ｄ−マンニトールＤ−フルクトースおよ
びラムノースを用いた場合、良好ないし中程度の成長が
得られた。

ラフイノースを用いると不十分な成長ないし中程度の成
長が得られ、スクロースおよびセルロースを用いた場合
には不十分な成長かまたは成長しないという結果が得ら
れた。

微細形態、空気中の菌糸体の色およびメラニン生成にお
いて、上記の微生物はストレプトマイセス・アンチビオ
チクスに類似しており、それゆえにこの種のうちの１つ
とみなされる。

実験室での比較研究においてこの微生物はエス・アンチ
ビオチクスの菌株ＩＭＲＵ３４３５の標準培養物（タイ
プカルチュア）に類似している。

しかしながら表２に示されるようにある点においてわれ
われの微生物はＩＭＲＵ３４３ ５菌株とは明らかに異
なり、したがってエス・アンチビオチクスの新規で別個
の菌株と考えられ、その新規な菌株は培養番号ＮＲＲＬ
３ ２ ３ ８により表わされる。

またこの菌株は受託番号微工研菌寄第３０３０号を以て
微生物工業研究所に寄託されてる。

？発明により（Ｒ）−３−（２−デオキシーβ一ｐエリ
スローベントフラノシル）−３，６，７．８−テトラヒ
ドロイミダゾ〔４．５−ｄ）（１．３〕ジアゼビン−８
−オールは、ストレプトマイセス・アンチビオチクスの
うちの（ｌ−３−（２デオキシーβ一Ｄ一エリスローベ
ントフラノシル）−３．６，７．８−テトラヒドロイダ
ゾ〔４，５−ｄ）（１．３）ジアゼピン−８−オール産
生菌株を水性の栄養培地に接種し、無菌的な好気性条件
下に約２０°および４５℃の間の温度で、その発酵混合
物中に実質的な量の＠−３−（２−デオキシーβ一Ｄ一
エリスローベントフラノシル）−３．６，７．８−テト
ラヒドロイミダゾ〔４，５−ｄ）Ｉ：１，３）ジアゼピ
ン−８−オールが生成するまで発酵を行ない、且つ目的
の生成物を得るためにその発酵混合物を後処理に付すこ
とにより製造される。

接種に対してはストレプトマイセス・アンチピオチクス
のうちの選ばれた培養物の胞子または分生胞子を使用す
ることができる。

少量の石けんまたは他の湿潤剤を含有する胞子または分
生胞子の水性懸濁物を便利に使用することができる。

大規模な発酵に対しては短期培養の活発な通気および攪
拌した微生物のブロス培養物を使用するのが好ましい。

適当な水性の栄養培地は同化できる炭素および窒素源を
含有し、そして好ましくは約６および８の間のｐＨを有
する培地である。

同化でき且つ満足に使用される炭素源には、商業上入手
可能な炭水化物混合物はもちろん、その生物体により利
用されうる純粋な炭水化物も含まれる。

この目的に対して適当な物質のいくつかの例は種々の糖
、たとえばグルコース、マルトース、ラクトースおよび
マンノース、澱粉および変性された澱粉、とうもろこし
シロップ、発酵酒、廃糖蜜（ブラックストラツプモラセ
ス）、グリセロールおよびひきわりとうもろこしである
。

栄養培地中に存在する炭水化物の量は特に臨界的ではな
く、重量でその培地の約０．５％から５％までで変わり
うる。

多少この範囲を越えた量を使用することもできる。

栄養培地中の窒素源は有機、無機または有機無機混合の
性質を有するものであってもよい。

その栄養培地中で使用することができる多数の窒素性物
質のうちのいくつかの例は、アミノ酸、ペブトン、加水
分解されたおよび加水分解されていない蛋白質、魚粉、
大豆粉、落花生粉、綿実粉、小麦グルテン、コーンステ
ィープリカー、脱水されたコーンステイーブリカー、肉
エキス、無機硝酸塩、尿素およびアンモニウム塩である
。

大部分の容易に入手できる窒素源の未加工の性質のため
に、その培地に加えられる量は純度によって異なり、培
地に加えられるべき窒素源物質の一定の量を明記するこ
とは容易にはできない。

しかしながら実際的な目的のために窒素性物質は総発酵
培地の６重量パーセントを越える必要はなく、かなり少
量存在すればよいということができる。

ある量の無機塩および未知の組成を有する痕跡量の成長
因子の存在は、（ｌ｛）−：３−（２−デオキシーβ−
Ｄ一エリスローベントフラノシル）−３，６，７，８−
テトラヒドロイミダゾ（４．５−ｄ）（ １ ． ３）
ジアゼピン−８−オールの最高収量を得るために望まし
い。

多数の容易に入手しうる粗製物質、たとえばコーンステ
イープリカー、酵母製剤、大豆油粕、糖蜜発酵残留物お
よび同様の性質を有する他の生成物は、そのような無機
塩および成長因子を含有しており、１種または数種のこ
れらの物質を発酵培地中に含有するのが望ましい。

培地中に適量の鉱物成分の存在を確実ならしめるために
、多くの場合痕跡量の鉱物、たとえば銅、コバルト、マ
ンガン、亜鉛、および鉄はもちろん、ある量の無機塩た
とえば塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、燐酸カリ
ウム、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよび硫酸マグ
ネシウムを加えることもまた有利である。

与えられた無機塩の好ましい濃度は栄養培地の０．１な
いし１重量％である。

ストレプトマイセス・アンチビオチクスのうちの選ばれ
た菌株の水性栄養培地は、多数の異なった方法で行なう
ことができる。

たとえば培地の表面で好気性条件下にその微生物を培養
するかまたは培地の表面より下で、すなわち深部条件下
にそれを培養することができるが、ただし十分な酸素の
供給が行なわれるものとする。

（旬−３−（２−デオキシーβ−Ｄ一エリスローベント
フラノシル） −３ ． ６ ， ７ ． ８−テトラ
ヒド口イミダゾ［４．５−ｄ］（１ ．３）ジアゼピン
−８−オールを大規模に製造するための好ましい方法は
、深部培養におけるストレプトマイセス・アンチビオチ
クスのうちの（ａ−３−（２−デオキシーβ一Ｄ一エリ
スローベントフラノシル）−３．６，７．８−テトラヒ
ド口イミダゾ［４，５−ｄ，１［１３）ジアゼピン−８
−オール産生菌株の発酵による方法である。

本発明のこの態様により、滅菌された水性の栄養培地に
選ばれた培養物を接種し、且つ無菌的条件下約２０およ
び４５℃の間の温度で、好ましくは３３〜４０℃の付近
の温度で攪拌し且つ通気しながら、実質的な量の（Ｒ）
−３−（２−−ｊ’オキシーβ−Ｄ一エリスローベント
フラノシル）−３．６，７，８−テトラヒドロイミダゾ
（４．５−ｄ）［１，３，１ジアゼピン−８−オールが
培養液中に見出されるまで培養する。

最高得量に対して必要とされる時間の長さは、使用され
る装置の大きさおよび型、攪拌および通気速度、特定の
微生物の培養およびその他の因子により異なる。

タンク型の発酵容器中で行なわれる大規模な商業上の発
酵においては、普通約３ないし７日間で最犬の生産量に
達する。

短い発酵期間を使用することもできるが普通低収率を生
じる。

発酵が振盪されたフラスコ中で行なわれる場合、最犬の
生産量に対して必要な時間は大規模な発酵タンクが使用
される場合よりも幾分長いかもしれない。

表面培養法において比較的連続した菌膜が培地の表面に
存在するのとは対照的に、深部培養条件下ではその微生
物は栄養培地全体に分散した比較的ばらばらな粒子とし
て発育する。

この培地全体にわたる微生物の分布により、発酵工業に
おいて習慣的に使用されるタンクおよびバット（犬型の
桶）中でその微生物を培養する場合に、大量の接種され
た栄養培地を使用することができる。

他のデザインの発酵装置も使用することができるが、攪
拌および通気装置を備え固定されたバット型の発酵容器
は大規模な製造に対して特に適当である。

生成物を少量製造するためかまたは大規模な発酵のため
に接種物として使用される微生物の培養物を製造するた
めには、深部培養法は小型のフラスコまたはジャー中で
行なうことができ、それらは適当な機械的手段により振
盪されるかまたは攪拌される。

深部培養法において培養混合物の攪拌および通気は多く
の方法で行なうことができる。

攪拌はタービン、パドル（かい）、インペラ（羽根車）
または他の機械的攪拌装置によるか、発酵槽それ自体を
回転させるかまたは振盪することによるか、種々のポン
プ装置によるかまたは空気または酸素を培地中に通じる
ことにより行なうことができる。

通気は開管、孔管または多孔性の拡散部分を有する管を
通して空気または酸素を発酵混合物に導入することによ
り行なわれるか、または酸素を含有する大気中にまたは
その大気を通して培地を噴霧するか飛散させるかまたは
放出することにより行なうことができる。

好ましい深部培養法に代わる別の方法は、（Ｒｌ３−（
２−−ｙ’オキシーβ−Ｄ一エリスローベントフラノシ
ル）−３．６，７．８−テトラヒドロイミダゾ［４，５
−ｄ）［：．１．３）ジアゼピン−８−オールを製造す
るための表面培養法であり、それにより滅菌された水性
の栄養培地の薄層（普通２ｃｍ以下）にストレプトマイ
セス・アンチピオチクスのうちの（Ｒ）−３−（２−デ
オキシーβ一Ｄーエリスローベントフラノシル）−３．
６，７．８一テトラヒドロイミダゾ［４，５−ｄ）（１
．３）ジアゼピン−８−オール産生菌株を接種し、且つ
その接種した混合物を約２０および４５℃の間の温度で
好気性条件下に培養する。

つぎに深部培養法に対して記載したのと同様の方法でそ
の生成物が得られる。

本法における発酵段階の終了時において目的の生成物は
つぎの方法で得ることができる。

沖過または遠心分離のような手段により菌糸体を分離す
る。

Ｆ塊を水で十分に洗浄し、洗液を沢過されたビールと合
し、塩基たとえば水酸化ナトリウム、トリエチルアミン
または水酸化アンモニウムの水性溶液を使用してそのｐ
Ｈを約９．２に調節し、且つその合した液体を最初の容
量の約１０分の１に減圧濃縮する。

この濃縮した溶液を約５℃で長期間（容量により数時間
ないし数日間）冷却し、沈殿した固体〔それはアメリカ
合衆国特許第３６１６２０８号明細書に開示されている
ように９−（β一Ｄ−アラビノフラノシル）アデニンで
ある〕を珪藻土を用いて沖去する。

得られるＦ液をつぎにおよそ濃縮するまえのそめもとの
容量まで水で希釈する。

水性の酸（たとえば塩酸または硫酸）を使用してそのｐ
Ｈを約８．３に調節し且つ活性炭または他の吸着剤好ま
しくはダルコＧ−６０、で処理する。

吸着はバッチ法によるかまたは流水を連続的に吸着カラ
ムを通過させることにより行なうことができる。

好ましいバッチ法において０．５からｉｏ．ｏ％まで、
好ましくは約３％（重量／容量）の好ましい炭末吸着剤
をその涙過したビールに加え、生成した混合物を１〜３
時間攪拌する。

この混合物を沖過し、固体分を水で洗浄しついで水性ア
セトン（約同等部の水およびアセトン）で溶出させるこ
とにより洗浄する。

この溶出液を最初のビールの量の約３００分の１容量に
なる程度に濃縮する。

８０％水性メタノール溶液が得られるようにその濃縮物
にメタノールを加える。

その結果生成した沈殿を済去する。

Ｐ液を濃縮してメタノールを除去し、つぎに水性アセト
ン溶液（水中約５％のアセトン）の添加によりそのもと
の容量の約２ｙ２倍に濃縮を希釈し、炭末カラムを通過
させる。

この場合そのカラムの長さおよび幅は使用される容量に
より異なる。

その炭末カラムを約９５％の水および５％のアセトンを
含有するアセトン溶液で、ついで約９０％の水および１
０％のアセトンを含有する溶液で洗浄する。

つぎにそのカラムを約７５％の水および２５％のアセト
ンを含有するアセトン溶液で溶出する。

溶出液を真空下に濃縮し且つ凍結乾燥する。この乾燥し
た固体の最小量の水に溶解しつぎに水中で調製したセフ
ァデツクスＧ−１０の充填カラムを通して炉過する。

このカラムを水で洗浄し、目的の生成物を含有するそれ
らの部分を乾燥し且つ水性メタノールから結晶化する。

本質的に純粋な＠−３−（２−デオキシーβ−Ｄ−工Ｉ
Ｊスローベントフラノシル） ３ｔ６ｔ７ｔ８−テト
ラヒド口イミダゾ［４，５−ｄ）［１，３〕ジアゼピン
−８−オールはつぎの特性を有する。

１）融点２２０〜２２５℃（未補正） ２）紫外線吸収スペクトルλ２ ｓ ２ Ｅ％ ２
９ ｓｐＨ２ λ２７３ Ｅ｝２８２ｐ
Ｈ２に６．５時間保ったのち λ２６７ ＥＮ１７ ？Ｈ １ １ λ２８３ Ｅ１２９７３）
〔α）ｊ’＋７６．４°（１％水溶液）４）薄層クロマ
トグラフィー（プリンクマンシリカゲルＦ２５４） ａ）５０％メタノール−５０％クロロホルムＲ４０．４
２ ｂ）８０％メタノール−２０％クロロホルムＲ４０．５
４ ５） ｐＫ’ａ ５．２ （水中）、推定分子量３０
０６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠） ３ ４ ０ ０ 〜２ ５ ０ ０ｃｒｎ−’領域にお
ける幅広い強い吸収帯で３４００，３３３０，３１２０
，２ ９ ４ ０ ， ２ ８ ９ ０ｃｍ−’に吸収
極太を有する。

そのスペクトルの残りの部分は鋭い吸収極大を示し、よ
り顕著な吸収は１６４９，１５７８，１５４４，１５０
５，１４７０，１４６０，１４１４ １３９６，１３
７０，１３５６，１３２５，１３０１，１２８１，１２
４５，１２１４ １１７８，１１６２，１１３５，１
１１５ １０９５，１０６０，１０３５，１０２０
，９９０，９５２，８６８，８４２，８２２，７６５，
７４５．７０２，６６８，５８０，５４０，５１０，４
７５ＣｒｒＬ−’に存在する０ ７）テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を外部基準として使
用しＤ２０中における核磁気共鳴 ２．６５，２．８１，２．８７，２．９８，３．１０ｐ
ｐｍにおける多重線、３．７ ９ ， ３．８ ２ ，
３．８ ９，４．１ ３ ， ４．１ ９ ｐｐｍに
おける鋭い吸収帯、４．４ ３ ， ４．４ ９ ，
４．５ ６ ， ４．６ ２ｐｐｍにおける四重線、４
．８７ ， ４．９３ ， ４．９６ ， ４．９８
，５．０ ２ ， ５．０ ９ｐｐｍにおける多重線、
５．１６ｐｐｍにおけるＨＤ０， ５．５ １ ， ５
．５ ４ ， ５．５ ７，５．６０ｐｐｍにおける四
重線、６．５ ５ ， ６．６ ７および６．７９ｐｐ
ｍにおける三重線、７．６２および８．１１ｐｐｍにお
ける一重線（ｐｐｍは１００万分の部を表わす）。

８）溶媒への溶解性 水に易溶（３０■／ｍｌ以上）、メタノールに可溶、エ
タノールにわずかに可溶、クロロホルム、エーテルおよ
びヘキサンには不溶。

９）呈色反応 特になし。

１０）外観および性状 本品は白色結晶状固体であり、微かに弱塩基性を示す。

本発明の化合物は強力な脱アミノ酵素阻害剤である（実
施例１．Ａ）ｏ加うるに本発明の化合物は、ＤＮＡビー
ルスにより引き起こされた感染症、特に噛乳動物におけ
る庖疹および種痘ビールス感染症の治療において有用な
抗ビールス剤（米特許第３６１６２０８号明細書参照）
である９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニンの
活性を増強する。

さらに明確にいえば、本発明の化合物は９（β一Ｄ−ア
ラビノフラノシル）アデ二ン１部に対し本発明の化合物
約０．００５〜０．２部の割合で９−（β一Ｄ−アラビ
ノフラノシル）アデニンと組合せて投与した場合、９−
（β−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニンのみを含有す
る組成物よりもＤＮＡビールスに対する抗ビールス剤と
して一層活性な薬学的組成物を生じる。

好ましい範囲は９−（β−Ｄ−アシビノフラノシル）ア
デニン１部に対して本発明の化合物０．０１〜０．０５
部までである。

さらに特定的にはその組成物を非経口的好ましくは静脈
内に投与する場合、１日あたり体重ｋｇ当たり０，１■
から５■までの９−（β−Ｄーアラビノフラノシル）ア
デニンおよび体重ｋｇあたり０．０００５■ないし１即
の本発明の化合物を宿主（患者）に提供するために注射
可能な溶液が与えられる。

１日を基準として投与される好ましい量は、体重ｋｇあ
たり約０．００５ないし０．００２■の本発明の化合物
に対して、体重−あたり約０．５■から２■までの９−
（β一Ｄ−アラビノフラノシル）アデニンである。

薬学的組成物は９−（β一Ｄ−アラビノフラノシル）ア
デニン約１部に対して本発明の化合物０．００５ないし
０．２部を含有するバルク形態であってもよく、それは
注射用として適当な溶媒の添加により使用時溶液にされ
る。

別法としては薬学的組成物は、９−（β−Ｄ−アラビノ
フラノシル）アデニン約１部に対し０．００５から０．
２部までの割合の本発明の化合物および他の物質（たと
えば防腐剤、緩衝剤、溶液の等張性を調節するための薬
剤など）を含有する水性溶液であってもよい。

水の容量は臨界的ではな＜１ｍ７以下から約５００縦ま
で変わりうる○ さらに上記の組合せは庖疹性角膜炎の治療において眼科
用組成物、たとえば軟膏および溶液として使用すること
ができる。

したがって約０．００１％ないし０．０５％、好ましく
は０．００１％ないし０．００５％の本発明の化合物お
よび０．１％ないし０．５％の９−（β一Ｄ−アラビノ
フラノシル）アデニンを適当な薬学的担体中に含有する
軟膏または溶液を使用することができる。

さらに防腐剤、溶液の等張性を調節するための薬剤、緩
衝剤などを薬学的担体中に含有させることができる。

最後に上記の組合せはまた局所的軟膏およびクリームに
使用することもできる。

その軟膏またはクリームは約０．００１ないし０．０５
％、好ましくは０．００１％ないし０．００５％の本発
明の化合物および０．１％ないし０．５％の９−（β−
Ｄ−アラビノフラノシル）アデニンを適当な薬学的担体
中に含有すべきであり、その担体は任意に防腐剤、着色
料などを含有することができる。

本発明をさらによく説明するために以下に実施例をあげ
て説明する。

実施例 ｌ 発酵のための接種物は培養物ＮＲＲＬ３２３８の凍結乾
燥貯蔵物を滅菌蒸留水に懸濁し、この培養懸濁物を適当
な寒天培地の斜面に塗る。

得られた斜面を約２５°から３２°までの湛度（最高５
０°）で培養する。

約３ないし１０日間でその微生物は成長し空気中に胞子
を生じる。

これらの胞子を形成した培養物は接種物としてただちに
使用されるか、または使用するまえに数ケ月間３ないし
１０℃で貯蔵される。

発酵による（均一３−（２−デオキシーβ一Ｄ−エリス
ローベントフラノシ／ｌ／）−３．６，７．８テトラヒ
ドロイミダゾ［４，５−ｄ，ｌ（１．３）ジアゼピン−
８−オールの製造は２０００ガロンの発酵槽中で行なう
ことができる。

その方法は好気性放線菌の標準深部発酵法である。

胞子を形成した斜面培養物（段階１）は種子用培地に接
種するために使用され、それはこの方法において製造用
培地と同一である。

その微生物を１０ガロンの通気され攪拌されない培地中
で４０時間発芽成長せしめる（段階■）。

つぎにこの成長した種子は容量３００ガロンの攪拌通気
された中間の種子用発酵槽に接種するために使用される
（段階■）。

この中間の種子（段階■）を約２４時間或長させ、つぎ
に１２０Ωガロンの培地を含む２０００ガロンの製造用
タンク（段階■）に接種するために使用する。

一定の通気および攪拌下に約５日間発酵を進行させる。

成長、ｐＨおよび生化学的変化を測定するためにその発
酵物から定期的に試料を抽出する。

収獲したビール（２５１５ガロン）を１００ポンドの珪
藻土たとえばセライト５４５で処理し、且つ３６インチ
板を通して炉過し且つフレームで圧搾する。

ｐＨを６．７ないし９．２に調節しそのビールを真空下
で２５０ガロンに濃縮し、且つその濃縮物を４〜５℃に
３日間冷却する。

セライト５４５（４０ポンド）をその冷却した混合物に
加え、１８インチ板およびフレーム枦搾器を通してその
スラリーを涙過する。

ｐ液を水で再び２５００ガロンに希釈しｐＨ８．３に調
節したその希釈溶液を、３％（重量／容量）（約６００
ポンド）の活性炭たとえば亜炭および炭末から製造され
た活性炭であるダルコＧ−６０（アトラス・ケミカル・
インダストリーズ製品）、および２００ポンドのセライ
ト５４５で処理する。

このスラリーを室温で約１時間混合しついで３０インチ
板およびフレーム炉搾器を通して炉過する。

沖塊を７５０ガロンの水で洗浄しつぎに２５％水性アセ
トン５００ガロンずつで４回溶出する。

最初の３回の各５００ガロン溶出液を合し（ ｐＨ７．
４ ）真空下に３２リットルまで濃縮する（ｐＨ８）。

後者の濃縮物を３２ガロンのメタノールで希釈して８０
％水性メタノール溶液を得る。

放置（２時間）することにより生成した沈殿を炉過し且
つ捨てる。

つぎにｐ液を真空下で２４リットルに濃縮する。

溶液中固体分の総量は約１３．９ｋｇである。

？．実験室的精製 上記２４リットルのうちの７００ｍｌをとり水９ ６
０ＴＬｌおよびアセトン８７．５ｍで希釈し５％水性ア
セトン溶液を得る。

この溶液は６インチ×４フィートの炭素カラムへの供給
液として使用され、そのカラムはつぎのように製造され
る。

活性炭（たとえばダルコＧ−６０）３５００．！ｉ’お
よび珪藻士（たとえばセライト５４５）３５００．！ｉ
＋を５％水性アセトン溶液中でスラリーにする。

このスラリーを希水酸化ナトリウムでｐＨ８．５に調節
し且つ６インチ×６フィートのガラス力ラムに充填する
。

この充填カラムは約４８インチの高さである。添加物（
１９４５ｍのをカラムを通して炉過し、１９リットルの
５％水性アセトンおよび１９リットルの１０％水性アセ
トンを連続的カラム洗浄液として使用する。

目的の脱アノ酵素阻害剤は４０リットルの２５％水性ア
セトンで溶出される。

２５％アセトンを最初９リットル溶出させたのち、１５
００〜１８００ＴＬｌずつの分画を集める。

これらの分画の脱アミン酵素阻害剤の含有量を検定しそ
して大部分の目的の生成物を含有する分画を合する（６
２００ｍｌ）（４分画）ｏｐＨを８．２〜８．５に保ち
ながら後者のプールを真空下に濃縮し、つぎに凍結乾燥
すると１４．’ＮＺの固体が得られる〇残留物を１００
１ｒＬｌの水に溶解し、その溶液のｐＨを７，９ないし
８．５に調節し、細孔を有する重合デキストラン（たと
えば水中で製造されたセファデツクスＧ−１０）のカラ
ム〔５． Ｉ ＣｒｒＬｘ １ １ ５ｃｆＩＬ，（外
部容積）８００ＴＬｌ、（内部容積）１２００ｍｌ〕に
その物質を入れる。

その供給物を一度３２０ｍｌ／時間の速度でカラムを通
して沢過しそして力米？ラムを水で展開する。

（内部容積）分画を各１００Ｍ分画で集める。

脱アミノ酵素の検定により（内部容積）の末尾およびそ
れ以降の分画から目的物質が得られるので、これらを凍
結乾燥する。

１．４０ｇの固体を含む１個の凍結乾燥された分画を５
．５縦の冷メタノールに溶解し、その溶液を５℃で１夜
冷却する。

その結果生成した結晶を沖別し冷メタノールで洗浄し且
つ１０１ｒＬｌのメタノールおよび０． ６ ｒｎｌの
水から再結晶する。

結晶の収量２１５■，ｍ．ｐ．２２０〜２２５℃（未補
正）。

脱アミノ酵素（デアナーゼ）阻害の程度を計算すること
による（ｌ｛）−３−（２−デオキシーβ一Ｄ一エリス
ローベントフラノシル）−３，６，７．８−テトラヒド
ロイダゾ［４．５−ｄ］Ｉ：１．３〕ジアゼピン−８−
オールの酵素的定量は次のようにしてなされた。

３００マイクログラム／ｍｌの水性９−（β一Ｄ一アラ
ビノフラノシル）アデニン溶液１ｍを０．０５Ｍ燐酸緩
衝液（ ｐＨ７．５） ８ｒ／′Ｌｌで希釈し、この溶
液に種々の量の（Ｒ）−３−（２−デオキシーβＤ一エ
リスローベントフラノシル）−３，６，７，８−テトラ
ヒドロイミダゾＣ４，５−ｄ）〔１，３〕ジアゼピン−
８−オールを含有する試験溶液１７７１７ｌ！を加える
。

上記の溶液のうちの３ｒｒｌｊ３を石英の紫外用セルに
加えそして２６５ミリミクロンにおける濃度を測定する
。

１マイクログラム／ｍｌのアデノシン脱アミノ酵素溶液
０．１ｍｌ（タイブ１、腸粘膜から、シグマ・ケミカル
・カンパニー製）をそのセルに加え、その溶液を混合し
そして５分後に２６５ミリミクロンにおける紫外濃度を
定量する。

？、紫外の２６５リミクロンにおける０．１０の低下ハ
（８）−３−（２−デオキシーβ一Ｄ一エリスローベン
トフラノシル）−３．６，７，８−テトラヒドロイミダ
ゾ［４，５−ｄ）［１，３，１ジアゼピン−８−オール
約０．０３５マイクログラムに等しい。

Ｂ．パイロットプラントにおける精製 前記に記載したバッチ式炭素吸着段階（添加Ａ）から得
られた残りの濃縮物２３．７！Ｊットルを水３１．６リ
ットルおよびアセトン２．９リットルで希釈して５％水
性アセトン溶液（５８．２リットル）を得、その最終溶
液を１８インチ（幅）×１２フィート（高さ）の活性炭
（たとえばダルコＧ−６０）で調製されたカラムに対す
る仕込みとして使用する。

そのカラムはつぎのように調製する。１８０ポンドのダ
ルコＧ−６０および１８０ポンドの珪藻土（たとえばセ
ライ｝５４５）を１５０ガロンの５％水性アセトン中で
スラリー化し、１０Ｎ水酸化ナトリウム４８０ｒＩＬｌ
でその混合物のｐＨを９に調節し、そのスラリーを上記
の１８インチのカラムに充填し、その液体レベルがカラ
ム充填物の最高部とほぼ同じ高さになるまでそのカラム
から液体を流出させる。

５ ８． ２ １Ｊットルの原料をそのカラムに添加し
、つぎに５％水性アセトンでそのカラムを展開する。

カラムを１平方インチあたり１０ポンドで加圧して流速
を４５０ｍｌｌ分に調節する。

カラムを１１５ガロンの５％水性アセトン展開液および
６０ガロンの１０％水性アセトンで洗浄する。

脱アミノ酵素阻害剤を２５％水性アセトンで溶出させ、
各１８リットルの分画を集めそして脱アノ酵素阻害活性
に対して検定する。

２５ｒｆＬｌ相当分を凍結乾燥することにより各分画に
おける固体分を定量する。

脱アミン酵素阻害剤を含有する全量約１６２リットルか
らなる９分画を合し、３５℃以下で真空下にｐＨを９．
０に保ちながら濃縮して最終的に容量２．７リットルに
する。

その濃縮物中に得られる固体分の総量は約４６７ｇであ
る。

つぎに上記の濃縮物（２．７！Ｊットル）を細孔形の重
合デキストラン、たとえばセファデツクスＧ−１０（フ
ァルマシア・カンパニー製）で分画する。

交叉結合したデキストランであるセファデツクス（６ｋ
ｇ）を２日間水で膨潤させ、４インチのガラスカラムに
充填しそしてつぎに炭水化物試験？フェノールおよび硫
酸）が陰性になるまで水で洗浄する。

充填カラムの特性はつぎのとおりである。

充填カラムの大きさは４インチ×７４インチ、（外部容
積）５．２リットル、流速２．１リットル／時間であり
、カラムに対する供給物は炭素カラム濃縮物２．７リッ
トルのうちの約６００１１Ｌｌである。

その供給物を一度セファデツクスＧ−１０を通して済過
し、そのカラムを水で展開する。

（内部容積）を各４００ｒＩＬｌＯ分画で集め大部分の
（ｌ｛）一３−（２−デオキシーβ−Ｄ一エリスローベ
ントフ才ノシル）−３．６，７．８−テトラヒド口イミ
ダゾＣ４，５−ｄ）（１ ，３）ジアゼピン−８−オー
ルを含有する分画を合して真空下に濃縮し且つ凍結乾燥
する。

上記のセファデツクスカラムは炭素カラム濃縮物の残り
を分画するためにさらに３回使用される。

４個のセファデツクスカラムのおのおのから（１−３−
（２−デオキシーβ−Ｄ一エリスローベントフラノシル
） −３ ． ６ ， ７ ． ８ −テトラヒドロイ
ダゾ［４．５−ｄ］（１．３）ジアゼピン−８−オール
を含有する分画を合してため、そして９０％水性メタノ
ールから結晶化する。

結晶を３回再結晶して８。５ｇの結晶性■−３−−（２
−デオキシーβ一Ｄ一エリスローベントフラノシル）−
３．６，７．８−テトラヒドロイミダゾＣ４，５−ｄ）
（１．３）ジアゼピン−８−オールを得る。

？．ｏ．２２ミクロンの膜炉過器を通過させることによ
り段階ａで製造した溶液を滅菌する。

ｃ．ａ菌した９−（β一Ｄ−アラビノフラノシル）アデ
ニン水和物および（Ｅｌ−３−（２−デオキシーβ一Ｄ
一エリスローベントフラノシル）−３．６，７．８−テ
トラヒドロイダゾＣ４，５−ｄ）［１ ，３）ジアゼピ
ンー８一オールを段階ｂの滅菌した溶液に加える。

注射用滅菌水で適当な量にその容量を調節する。

均質な懸濁物が得られるまで混合する。ｄ．適当量の段
階Ｃからの懸濁物で各びんを満たし、その結果上記に記
載された成分を正しい量で含むようにする。

ｅ．段階ｄからの充填したびんを−４０℃またはそれ以
下の湿度で最低１２時間放置することにより凍結させる
。

ｆ．上記の凍結した製剤をつぎのように凍結乾燥（リオ
フイライゼーション）する。

■，乾燥機の棚をあらかじめ−４５℃に冷却する。

２，凍結した生成物を乾燥機に入れる。

３．乾燥箱の中を１００ミクロンまたはそれ以下の真空
にひく。

４．４８時間経過時において最高＋４０℃に達するよう
に棚の加熱を行なう。

５．滅菌沢過した乾燥窒素ガスで真空を常圧にもどす。

６．乾燥したびんを適当な栓でふたをする。

ｇ．使用するまえに適当な静脈注射用液体を上記の凍結
乾燥した滅菌固体に加える。

２）眼科用製剤 ？ラビノフラノシル）アデニン水和物オヨび滅菌し微粉
末にした （ＦＯ−３−（２−テオキシーβ一Ｄ一エ
リスローベントフラノシル）−３，６，７．８−テトラ
ヒドロイダゾ［４，５−ｄ）（１ ，３）ジアゼピンー
８−オールの両方を少量の滅菌した軟膏基剤中で練るこ
とにより無菌的に混合しむらなく練れたペーストを形成
する。

２．適当な滅菌した混合機を使用することにより段階１
で形成した濃厚な滅菌ペーストを残りの滅菌した軟膏基
剤と徐々に混合する０ ３．段階２からの完全な混合物を適当な滅菌した軟膏ミ
ルを用いて無菌的に通過させ確実に均質な製剤にする。

Ｋｘ 平均粒子の大きさはほぼ２．４ミクロンである。

ｂ）点眼剤 ？．塩化ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよびフエ
メロールクロリドを少量の注射用水に溶解する。

０．２２ミクロンのりボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ）膜
を通してｐ過することによりこの溶液を滅菌する。

２，滅菌した微粉末にした ９−（β−Ｄアラビノフ
ラノシル）アデニン水和物お よび滅菌し微粉末にした （Ｒ）−３−（２−テオキ
シーβ−Ｄ一エリスローベントフラノシル）−３．６，
７．８−テトラヒドロイミダゾ〔４，５−ｄ〕〔１，３
〕ジアゼピン−８−オールを段階１からの賦形剤中に無
菌的に混合する。

３．段階２からの混合物に十分な注射用滅菌水を加え必
要な容量にする。

十分に混合し均質な懸濁物を形成する。

Ｋｘ 平均粒子の大きさは約２．４ミクロンである。

？．蒸留水およびプロピレングリコールを混合し７５℃
に加熱する。

ｂ．ステアリルアルコール、ワセリン（白色）およびポ
リオキシエチレンステアレート系表面活性剤であるルジ
ュ５２を混合し且つ ７５℃に加熱することにより溶融する。

Ｃ．急速に攪拌しながら水性相（段階ａ）を油相（段階
ｂ）に徐々に加えなければならない。

ｄ．上記の製剤が５０〜５５℃に冷却した時点で９−（
β一Ｄ−アラビノフラノシル）アデニン水和物 およ
び（６）−３−（２−デオキシーβ一Ｄ一エリスローベ
ントフラノシル）−３．６，７．８−テトラヒド口イミ
ダゾ［４，５−ａ）［，３）ジアゼピン−８一オール
を混合する。

冷却し且つ凍結するまでその混合物を攪拌し続ける。

ＸＸ 平均粒子の大きさは約２４ミクロンである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ストレプトマイセス・アンチビオチクスのうちの＠
   −３−（２−デオキシーβ−Ｄ一エリスローベントフラ
   ノシル）−３．６，７．８−テトラヒドロイミダゾ（４
   ．５−ｄ）（１ ．３）ジアゼピン−８−オール産生菌
   株を水性の栄養培地に接種し、その接種した培地を好気
   性条件下に培養し、同時に生成した９−（β一Ｄ−アラ
   ビノフラノシル）アデニン生成物を分離し且つ（６）−
   ３−（２−デオキシーβ−Ｄ一エリスローベントフラノ
   シル）−３，６，７，８−テトラヒドロイミダゾ〔４，
   ５−ｄ）（１．３）ジアゼビン−８−オールを単離する
   ことからなる、（１”Ｏ−３−（２−デオキシーβ一Ｄ
   一エリスローベント７２ノシル）−３．６，７，８−テ
   トラヒドロイミダゾ（４，５−ｄ）［１．３）ジアゼビ
   ン−８−オールの製造法。