DE2517596A1

DE2517596A1 - (r)-3-(2-deoxy-beta-d-erythro- pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo eckige klammer auf 4,5-d eckige klammer zu eckige klammer auf 1,3 eckige klammer zu diazepin-8-ol und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: DE2517596A1
Application number: DE19752517596
Authority: DE
Inventors: Henry William Dion; John David Howells; Albert Ryder; Peter Wing Kee Woo
Original assignee: Parke Davis and Co LLC
Current assignee: Parke Davis and Co LLC
Priority date: 1974-04-22
Filing date: 1975-04-21
Publication date: 1975-10-30
Also published as: FR2311552B1; JPS5848160B2; DE2517596C2; GB1481927A; NL186868B; JPS50145590A; NL186868C; CA1042376A; NL7504710A; BE828183A; FR2311552A1; US3923785A

Description

I)H. ING. F. "WDKSTiIOFF DH.E. τ. PKOHM ANN DH. ING. D. BKHRKNS I)IPL. ING. K. GOKTZ PATENTANWÄLTE

8 M ϋ VOHKN SCHWEIGxIHSTnASSE Ti-LKFOK (0S9) TXLEI S 24 070

TELKßSAMME t HBOTKCTPATBXT

1A-46 339

Beschreibun zu der Patentanmeldung

Parke Davis & Company
Joseph Campau at the River, Detroit Michigan 48232
U.S.A.

betreffend

(R)-3-(2-Deoxy-ß-I)-erythro-pentofuranosyl)-3«6,.7,8- -tetrahydroimidazo /""4_t5-d 7/""I »5 7diazepin-8-ol und Verfahren zu dessen Herstellung

Die Erfindung betrifft (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentof ura no sy 1)-3,6,7,8-tetrahydr ο imidazo £~4,5-d__7/~1, 3j7"diazepin-

8-ol der !Formel

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vorzugsweise in reiner Form und ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung. Das Verfahren besteht in einer Fermentation zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung, indem man einen ausgewählten (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /.""4,5-d__7/~1, 3_7"diazepin-8-ol bildenden Stamm von Streptomyces antibioticus züchtet. Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, enthaltend die erfindungsgemäße Verbindung zusammen mit 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin. Dieses Mittel ist geeignet zur Behandlung von Herpes-Infektionen.

Die erfindungsgemäße Verbindung I wird hergestellt durch Züchtung eines ausgewählten (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /""4,5-dJ7Z""¹, 3__7diazepin-8-ol bildenden Stammes des Organismus Streptomyces antibioticus unter künstlichen Bedingungen in einem geeigneten Nährmedium bis eine erhebliche Menge (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7-8-tetrahydroimidazo /""4,5-d_7/~1,3__7diazepin-8-ol gebildet worden ist, Entfernung von 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin und Abtrennung der erfindungsgemäßen Verbindung. Nach der Inkubations- oder Wachstumszeit kann das (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo-/,~~4,5-d__7/.~"i ,3__7diazepin-8-ol aus dem Medium entsprechend den später beschriebenen Verfahren gewonnen werden'. Der Ausdruck "(R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /~4,5-d_7Z"~1 ,3_7diazepin-8-ol bildender Stamm des Organismus Streptomyces antibioticus" bedeutet in der vorliegenden Anmeldung einen Stamm von Streptomyces antibioticus, der wenn er sich unter den hier beschriebenen, künstlichen Bedingungen vermehrt zur Bildung einer Brühe führt, aus der (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /~4,5-ά__7/~1,3_7"diazepin-8-ol nach den angegebenen Verfahren gewonnen werden kann.

Ein Stamm von Streptomyces antibioticus, der für die erfindungsgemäßen Zwecke geeignet ist, ist isoliert worden aus einer

el jLo Bodenprobe,in der Nähe von Bosco Trecase, in der Provinz

Neapel in Italien gewonnen worden ist. Kulturen dieses Organis-

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mus wurden an dem United States Department of Agriculture, Northern Utilization Resareh and Development Division, Peoria, Illinois hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer NRRL 3238.

Der Organismus ist ein aerobes und an der luft sporenbildendes Glied der Ordnung Actinomycetales und gehört zu den Streptomyces-

Arten wie in der 7 ο Auflage von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1957) beschrieben. Seine makroskopischen Kulturcharakteristika auf verschiedenen Medien die zur Identifizierung derartiger Organismen geeignet sind, sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

-4-

509844/ 10H

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Tabelle

Makroskopische Kulturcharakteristika des 9-(ß-D-Arabino-furanosyl)adenin bildenden Stammes von Streptomyces antibioticus mit der Hummer NRRL 3238

Farbe des

Kulturmedium

Luft- Rückseite Mycels des Substrat-Mycels

Hefeextrakt-Mal ζ ext rakt-Agar

Hafermehl-Agar

grau- und gelbstichiges Braun

braunstichiges Grau hell bis mittelolivbraun

löslichen
Pigments

Mittelbraun

Andere Eigenschaften

rötlich bei Zugabe von NaOH*

grau-bis rötlich bei stark gelb-Zugabe von stichiges
Braun

Anorganisches hell-bis Salz- grau-und Stärke-Agar gelbstichiges Braun

grau-und gelbstichiges Braun hell-olivgrau bis hell bis rötlich bei gelbliches Mittel-gelbliches Zugabe von braun Mittel- NaOH*

braun

Glycerin-Aspargin-Agar

Stärke-Agar- B

Organische
Nitratbrühe

graustichiges Gelb

hell-bis hellbräunliches

grau-und gelb-Grau bis hellstichiges grau- und gelb-Braun Stiches Braun

Gelatine

Milch - -

Trypton-Hefe- - -

Extrakt-Brühe

Pepton-Hefe-Extrakt-Eisen-Agar

Tyrosin-Agar - -

Hefe-Extrakt-Malz- _ __ Extrakt-Agar ™ "*

509

* Farbe des löslichen Pigments

OH graustichi-rötlich bei ges bis Zugabe von gelbliches NaOH* Braun

keines -

Nitrat wird — - nicht zu

Nitrit reduziert

dunkelbraun starke Verflüssigung

dunkelbraun starke

Hydrolyse

dunkelbraun - -

schwarz — -

dunkelbraun - -

28⁰O gutes Viachstum 37⁰G »

-5

5O

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Wenn der Organismus auf bestimmten Agar-Medien gezüchtet wird ist das Luftmyeel im allgemeinen hell bis grau- und gelbstichig braun. Die Züchtung in diesen Agar-Medien führt zur Bildung eines gelblich-braunen bis mittelbraunen löslichen Pigments, das rötlich wird, wenn die Medien mit Natriumhydroxid behandelt werden. In Medien,die komplexe Stickstoffquellen enthalten, entsteht ein dunkelbraunes oder schwarzes lösliches Pigment.

Die Sporenketten sind gerade oder gebogen, gelegentlich schleifenförmig oder lose spiralförmig. Mit dem Alter werden die Ketten stark gebogen oder gekrümmt und unregelmäßig. Die-Sporen sind glatt und elliptisch bis kugelförmig und können in der Größe von 0,7 bis 1,2 jam χ 0,9 bis 1,7 jam variieren.

Bei Versuchen zur Bestimmung des Kohlenstoffverbrauchs wurde ein gutes Wachstum erhalten mit den folgenden einzelnen Kohlenstoff quellen: Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, i-Inositol, D-Mannit, D-Pructose und Rahmnose. Ein geringes oder mäßiges Wachstum wurde erhalten mit Raffinose und ein geringes oder kein Wachstum mit Saccharose und Cellulose.

In der Mikromorphologiß,der Farbe des Luftmycels und der Melaninbildung erinnert der Organismus an Streptomyces antibioticus und wird daher als ein Stamm dieser Gruppe angesehen. Bei Vergleichslaboruntersuchungen ähnelt der Stamm dem Streptomyces antibioticus, Stamm IMRÜ 3435» In einigen Punkten ist er jedoch von dem Stamm IMRU 3435 deutlich verschieden, wie aus Tabelle 2 hervorgeht. Es wird daher angenommen, daß es sich um einen neuen und deutlich bestimmten Stamm von Streptomyces antibioticus handelt, der die Nummer NRRL 3?-38 erhielt.

S098U/10U

Tabelle 2

1A-46

tabelle 2

Vergleich des (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo Z"~4,5-d_7/~1, diazepin-8-ol-adenin bildenden Stammes von Streptomyces antibioticus mit der Nummer MRL 3238 mit Streptomyces antibioticus IMRU 3435

Eigenschaften

Parbe des
Luft-Mycels*

Mikromorphologie des
Luft-Mycels*

Lösliches Pigment

Hefe-Extrakt-Malz-Extrakt-Agar

Hafermehl-Agar

Anorganisches SaIz-Stärke-Agar

G-lycerin-Aspargin-Agar

Wirkung von NaOH auf das
lösliche Pigment der oben
angegebenen Medien

Tyrosin-Agar

Kohlenstoffverwertung

Saccharose

Xylose

i-Inositol

L-Rhamnose

Raffinose

Reduktion von Nitrat zu
Nitrit

Gelatine-Verflüssigung
Milchhydrolyse
Wachstum auf Hefeextrakt-Mal z-Extrakt-Agar bei
45⁰C und bei 50⁰C 5 0

S.antibioticus NRRL 3238

hell- bis grau- und gelbstichig braun

gelegentlich Schleifen und Spiralen

mittelbraun

graustichig bis stark gelbstichi braun

hell- bis mittelgelbstichig braun

graustichig bis stark gelbstichig braun

Pigment wird rötlich

dunkelbraun

gering gut

zufriedenstellend zufriedenstellend gering bis zufriedenstellend

negativ

stark

positiv 9844/10U * Tabelle 1 in den ersten fünf Medien.

S.antibioticus IMRU 3435

mittelgrau bis hellbräunlich grau

keine Schleifen oder Spiralen.beobachtet

graustichig gelb

keines keines

Pigment unverändert

keines

keine zufriedenstellend gut

gut

keine

positiv schwach schwach

negativ

-7-

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(R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentof uranosyl)-3, 6,7,8-tetrahydroimidazo-/~4,5-d_JT/"~1,3_7diazepin-8-ol wird erfindungsgemäß hergestellt dureh Beimpfen eines wässrigen Nährmediums mit einem (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /~4,5-d__7/~'¹»3_7-äiazepin-8-ol bildenden Stamm von Streptomyces antibioticus, Durchführung- der Fermentation unter aseptischen aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von ungefähr 20 bis 45⁰C bis eine erhebliche Menge (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /~4,5-d__7- £~Λ , 3_7diazepin-8-ol in dem Fermentations gemisch entstanden ist,, und anschließende Behandlung des Permentationsgemisches, um das gewünschte Produkt zu erhalten.

Pur die Beimpfung können Sporen oder Kondidien der ausgewählten Streptomyces antibioticus Kultur verwendet werden. Wässrige Suspensionen der Sporen oder Konidien, enthaltend eine kleine Menge Seife oder ein anderes Netzmittel, können günstig angewandt werden· Bei großen Fermentationsansätzen ist es bevorzugt, junge heftig belüftete und gerührte Kulturbrühen des Mikroorganismus anzuwenden.

Geeignete wässrige Nährmedien sind solche die assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten und vorzugsweise einen pH-Wert von ungefähr 6 bis 8 besitzen. Kohlenstoffquellen, die assimilierbar sind und geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren, umfassen reine Kohlenhydrate, die von dem Organismus verwertet werden können, sowie handelsübliche Kohlenhydratgemische« Einige Beispiele für solche Substanzen, die für diesen Zweck geeignet sind, sind verschiedene Zucker, wie Glucose, Maltose, Lactose und Mannose; Stärke und modifizierte Stärken; Maissyrup, Malzflüssigkeiten, Restmelassen, Glycerin und Maismehl. Die Menge der in dem Nährmedium vorhandenen Kohlenhydrate ist nicht besonders kritisch und kann von ungefähr 0,5 bis 5 Gew.-^, bezogen auf das Medium, variieren. Mengen,die etwas außerhalb dieses Bereiches liegen, können ebenfalls angewandt werden,

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Die in dem Nährmedium vorhandene Stickstoffquelle kann organisch, anorganisch oder gemischt organisch-anorganisch sein. Einige Beispiele für viele stickstoffhaltige Substanzen, die in dem Nährmedium angewandt werden können, sind Aminosäuren, Peptone, hydrolysierte und nicht-hydrolysierte Proteine, Fischmehl, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Weizengluten, Maiswasser, dehydratisierte Maiswasserflüssigkeiten, 3?leischextrakte, anorganische Nitrate, Harnstoff und Ammoniumsalze. Da die leicht zugänglichen Stickstoffquellen im allgemeinen roh sind, variiert die Menge,die zu dem Medium zugesetzt werden muß, je nach der Reinheit und es ist nicht ohne weiteres möglich, eine genaue Menge des als Stickstoffquelle dienenden Materials anzugeben, die zu dem Medium zugegeben werden soll· Es kann jedoch gesagt werden, daß für praktische Zwecke stickstoffhaltige Materialien in einer Menge von nicht

G-ew _#~
mehr als 6 %, bezogen auf das gesamte PermentationsmedjLum, vorhanden sein müssen und in wesentlich geringeren Mengen vorhanden sein können.

Das Vorhandensein einer bestimmten Menge an Mineralsalzen und Spuren von Wachstumsfaktoren unbekannter Zusammensetzung ist günstig, um die besten Ausbeuten an (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythropentof uranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /~4»5—d__7/~1, 3_7~ diazepin-8-ol zu erhalten. Viele leicht zugängliche rohe Substanzen, wie Maiswasser, Hefezubereitungen, Sojabohnenöl oder -mehl, Melassefermentationsrückstände und andere Produkte ähnlicher Art enthalten solche anorganische Salze und Wachstumsfaktoren und die Verwendung von einer oder mehrerer dieser Substanzen in dem Fermentationsmedium ist günstig. Um das Vorhandensein angemessener Mengen der mineralischen Komponenten in dem Medium sicher zu stellen,ist es auch in vielen Fällen vorteilhaft, einige anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Natriumbicarbonat, Kaliumphosphat, Natriumacetat, Calciumcarbonat und Magnesiumsulfat zuzusetzen sowie Spuren von Mineralien, wie Kupfer, Kobalt, Mangan, Zink und Eisen. Die bevorzugte Konzentration für ein bestimmtes Mineralsalz liegt zwischen 0,1 und 1 Gew.-$, bezogen auf das Nährmedium.

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Die Züchtung des ausgewählten Stammes von Streptomyces antibioticus in dem wässrigen Nahrmedium kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden· Zum Beispiel kann der Organismus unter aeroben Bedingungen auf der Oberfläche des Mediums gezüchtet werden oder er kann unterhalb der Oberfläche des Mediums gezüchtet werden, das heißt submers,vorausgesetzt, daß eine entsprechende Säuerstoffmenge zur Verfügung gestellt wird.

Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von (R)-3—(2—Deoxy— ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3, 6,7,8-tetrahydroimidazo /_""4,5-d_7- £~Λ ^^diazepin—8—öl in großem Maßstab ist die Züchtung eines (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo £~4-, 5-äJ7£~1, 3__7"diazepin-8-ol bildenden Stammes von Streptomyces antibioticus in einer 3ubmersen oder tiefen Kultur, Nach dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein steriles wässriges Nährmedium mit der ausgewählten Kultur beimpft und unter Rühren und Belüftung unter aseptischen Bedingungen inkubiert bei einer Temperatur von ungefähr 20 bis 45⁰C, vorzugsweise in der Gegend von 33 bis 4O⁰O, bis sich eine wesentliche Menge von (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydro imidazo /~4»5-d__7/7"1, 3_7"diazepin-8-ol in der Kulturflüssigkeit findet· Die Zeit, die erforderlich ist um eine maximale Ausbeute zu erhalten, variiert mit der Größe und Art der angewandten Apparatur, der Rühr- und Belüftungsgeschwindigkeit, der speziellen Organismuskultur und anderen Faktoren« Bei technischen Fermentationen im großen Maßstab, die. in kesselartigen Fermentationsbehältern durchgeführt werden, wird die maximale Bildung üblicherweise in ungefähr 3 bis 7 lagen erreicht. Kürzere Fermentationszeiten können auch angewandt werden, aber führen im allgemeinen zu geringeren Ausbeuten· Wenn die Fermentation in Schüttel'kolben durchgeführt wird, kann die Zeit die zur maximalen Bildung erforderlich ist, etwas länger sein als wenn große Fermentationstanks angewandt werden.

Unter submersen Kulturbedingungen entwickelt sich der Organismus in Form von verhältnismäßig einzelnen Teileben, die in dem gesamten Näbrmedium verteilt sind, im Gegensatz zu dem verhältnismäßig kontinuierlichen zusammenhängenden Häutchen oder Be-

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-lo-

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lag, der sich auf der Oberfläche des Medium bildet bei der Oberflächenkultur. Aufgrund dieser Verteilung des Organismus in dem gesamten Medium können große Volumina des beimpften Nährmediums zur Züchtung des Organismus in den Kesseln und Bottichen,^die üblicherweise in der Fermentationsindustrie verwendet werden. Ortsfeste Fermentationsbottiche, die mit Rühr- und Belüftungsvorrichtungen versehen sind, sind besonders geeignet zur Produktion im großen Maßstab, obwohl auch andere Fermentationsvorrichtungen angewandt werden können. Zur Erzeugung kleinerer Mengen des Produktes oder zur Herstellung der Organismuskulturen, die als Inokulum für Fermentationen im großen Maßstab angewandt werden, kann die submerse Kultur in kleinen Kolben oder Gefäßen durchgeführt werden, die entweder geschüttelt oder mit Hilfe geeigneter mechanischer Vorrichtungen gerührt werden.

Bei der submersen Kultur kann das Rühren bzw. die Bewegung des Kulturmediums und die Belüftung des Kulturgemisches auf verschiedene Weise erreicht werden. Die Bewegung kann erreicht werden mit Hilfe von Turbinen, Paddeln, Propellern oder anderen mechanischen Rührvorrichtungen, durch Rotieren oder Schwenken oder Schütteln des Fermentationsgefäßes selbst^ durch verschiedene Pumpvorrichtungen oder durch Durchleiten von luft oder Sauerstoff durch das Medium. Die Belüftung kann 'erreicht werden durch Einblasen von Luft oder Sauerstoff in das Fermentationsgemisch durch offene Rohre, gelochte Rohre oder Rohre, die einen porösen Diffusionsbereich besitzen oder durch Versprühen, Verspritzen oder Umgießen des Mediums in oder durch eine säuerst off halt ige Atmosphäre.

Eine Alternative zu der bevorzugten submersen Kultur ist die Oberflächenkultur zur Bildung von (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythropentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /~~4,5-ά__7"/~1 _t"5j~ diazepin-8-ol, bei der eine flache Schicht üblicherweise von weniger als 2 cm eines sterilen wässrigen Uährmediums mit einem (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /~4> 5-d__7/~1, 3_7"diazepin-8-ol bildenden Stamm von Streptomyces antibioticus beimpft wird und das beimpfte Gemisch unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von ungefähr

509844/1QU ~¹¹""

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20 bis 45⁰C inkubiert wird. Das Produkt wird dann auf ähnliche Weise erhalten wie für die submerse Kultur beschrieben.

Nach Abschluß der Fermentetionsphase des Verfahrens kann das gewünschte Produkt auf folgende Weise erhalten werden. Das Mycel wird durch Verfahren wie Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Der Filterkuchen wird gut mit Wasser gewaschen, die Waschflüssigkeiten mit der abfiltrierten Fermentationsbrühe zusammen gegeben, der pH-Wert mit Hilfe einer wässrigen Lösung einer Base wie Natriumhydroxid, Triäthylamin oder Ammoniumhydroxid auf ungefähr 9,2 eingestellt und die vereinigten Flüssigkeiten unter vermindertem Druck auf ungefähr 1/1O^- des ursprünglichen Volumens eingeengt. Die konzentrierte lösung wird eine längere Zeit (von einigen Stunden bis zu einigen Tagen, je nach dem Volumen) auf ungefähr 5⁰C abgekühlt und der sich abscheidende Feststoff der 9-(ß-Arabinofuranosyl)adenin ist, wie in der US-PS 3 616 208 angegeben, mit Hilfe von Diatomeenerde abfiltriert.

Dann wird das entstehende Filtrat mit Wasser auf ungefähr das ursprüngliche Volumen vor dem Einengen verdünnt. Der pH-Wert wird mit Hilfe einer wässrigen Säure, wie Salzsäure oder Schwefelsäure auf ungefähr 8,3 eingestellt und mit Aktivkohle oder einem anderen Adsorptionsmittel, vorzugsweise Darco G-60, behandelt» Die Adsorption kann entweder ansatzweise oder durch kontinuierlichen Fluß durch eine Adsorptionssäule durchgeführt werden. Bei dem bevorzugten ansatzweisen Arbeiten werden 0,5 bis 10 %, vorzugsweise ungefähr 3 % (Gewicht/Volumen)· des bevorzugten Aktivkohle-Adsorptionsmittels zu der filtrierten Fermentationsbrühe zugegeben und das entstehende Gemisch 1 bis 3 h gerührt. Das Gemisch wird filtriert, der feste Bestandteil mit Wasser gewaschen und anschließend mit wässrigem Aceton (ungefähr gleiche Teile Wasser und Aceton) eluiert. Das Eluat wird auf ungefähr 1/300 des Volumens der ursprünglichen Brühe eingeengt. Zu dem Konzentrat wird Methanol zugegeben, um eine 80$ige wässrige Methanollösung zu erhalten. Der entstehende

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Niederschlag wird abfiltriert. i)as Filtrat wird eingeengt, um das Methanol zu entfernen und dann auf das ungefähr 2 1/2-fache seines ursprünglichen Volumens verdünnt durch Zugabe einer wässrigen Acetonlösung (ungefähr 5 $ Aceton in Wasser) und durch eine Säule mit Aktivkohle geleitet, deren Länge und Weite mit den angewandten Volumina variiert. Die Aktivkohle-Säule wird mit Acetonlösung, enthaltend ungefähr 95 % Wasser und 5 $ Aceton, gewaschen und anschließend mit einer Lösung, enthaltend ungefähr 90 i» Wasser und 10 % Aceton. Die Säule wird anschließend mit einer Acetonlösung, enthaltend ungefähr 75 $ V/asser und 25 i° Aceton, eluiert. Das Eluat wird im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet. Der getrocknete Feststoff wird in einer möglichst geringen Menge Wasser gelöst und dann durch eine Säule perkoliert, die mit im Wasser zubereitetem Sephadex G-10 gefüllt ist. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, getrocknet und aus wässrigem Methanol umkristallisiert.

Das im wesentlichen reine (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-ery'thro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /.~4f5-dJ7Z~¹,3_7<liazepin-8-ol besitzt die folgenden Eigenschaften:

1. Schmelzpunkt 220-225⁰C (nicht korrigiert)

2ο Ultraviolett-Absorption	λ	282	1	298
pH 2	λ.	273	El 1	282
pH 2 nach 6,5 h	X	267	■i	117
pH 11	λ-	283	El 1	297

3. L^J ²⁵ + 76,4° 1 Ji in Wasser

4. Dünnschicht-Chromatographie Brinkmann-Silicagel

a) 50 $> Methanol - 50 % Chloroform R_f 0,42

b) 80 $> Methanol - 20 56. Chloroform R_f 0,54

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5. pK^fa 5,2 in Wasser; geschätztes Molekulargewicht 300.

6. Infrarotspektrum (KBr Tabletten ).

Breite intensive Bande im Bereich von 3400 bis 2500 cm"¹ mit Maxima bei 3400, 3330, 3120, 2940, und 2890 cm"¹; der Rest des Spektrums zeigt scharfe Maxima, wobei die hervorstechendsten bei 1649, 1578, 1544, 1505, 1470, 1460,1414, 1396, 1370, 1356, 1325, 1301, 1281, 1245, 1214, 1178, 1162, 1135, 1115, 1095, 1060, 1035, 1020, 990, 952, 868, 842, 822, 765, 745, 702, 668, 580, 540, 510, 475 cm"¹ liegen.

7· Kernmagnetisches Resonanzspektrum in DpO mit Tetramethylsilan (TMS) als äußerem Standard.

Multiplett bei 2,65, 2,81, 2,87, 2,98, 3,10 ppm^scharfe Banden bei 3,79, 3,82, 3,89, 4,13, 4,19 ppm. Quadruplett bei 4,43, 4,49, 4,56, 4,62 ppm. • Multiplett bei 4,87, 4,93, 4,96, 4,98, 5,02, 5,09 ppm.

HDO bei 5,16 ppm; Quadruplett bei 5,51, 5,54, 5,57,* 5,60 ppm; Triplett bei 6,55, 6,67 und 6,79 ppm; Singuletts bei 7,62 und 8,11 ppm. :' \

Die erfindungsgemäße Verbindung ist ein wirksamer Deaminaseinhibitor (Beispiel 1, Teil A). Außerdem verstärkt sie die Wirksamkeit von 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin, einem Antivirenmittel (US-PS 3 616 208), das geeignet ist, zur· Behandlung von Infektionen, die durch DNS-Viren verursacht sind, besonders Herpes und Impfvirus-Infektionen bei Säugetieren. Besonders ergibt die erfindungsgemäße Verbindung, wenn sie zusammen mit 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin in einem Verhältnis von ungefähr 0,005 bis 0,2 Teilen der erfindungsgemäßen Verbindung auf ein Teil 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin verabreicht wird, pharmazeutische Mittel, die wirksamer sind als Mittel, enthaltend nur 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin als Antivirenmittel gegen DNS Viren, Die bevorzugte Menge beträgt 0,01 bis 0,05 Teile der erfindungsgemäßen Verbindung auf einen Teil 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin. Besonders werden, wenn das Mittel parenteral, vorzugsweise intravenös verabreicht wird, injizierbare Lösungen angewandt, um dem Körper 0,1 bis 5 mg 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin/kg Körpergewicht und 0,0005 mg bis 1 mg der erfindungs-

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gemäßen Verbindung pro kg Körpergewicht und Tag zu verabreichen· Die bevorzugte Menge, die täglich verabreicht wird, beträgt 0,5 mg bis 2 mg 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin pro kg Körpergewicht und ungefähr 0,005 bis 0,002 mg der erfindungsgemäßen Verbindung pro kg Körpergewicht.

.{ Das Mittel kann als nicht geformte Masse, enthaltend 0,005 bis 0,2 Teile der erfindungsgemäßen Verbindung auf ungefähr ein Teil 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin vorliegen, die bei der Anwendung durch Zugabe eines Lösungsmittels, das für injizierbare Zubereitungen geeignet ist, in Lösung gebracht wird. Wahlweise kann das pharmazeutische Mittel eine wässrige Lösung sein, enthaltend ungefähr 0,005 bis 0,2 Teile der erfindungsgemäßen Verbindung auf ungefähr ein Teil 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin und andere Substanzen wie Konservierungsmittel _f Puffermittel, Mittel zur Einstellung der Isotonie der Lösung usw. Das Wasservolumen ist nicht kritisch und kann von weniger als 1 ml bis zu ungefähr 500 ml variieren.

Außerdem kann die oben angegebene Kombination für οphthalmische^{0 /} Mittel, wie Salben und Lösungen zur Behandlung von Herpes keratitir angewandt werden. Es können Salben oder Lösungen angewandt werden, enthaltend ungefähr 0,001 bis 0,05 ■ $, vorzugsweise 0,001 bis 0,005 $ der erfindungsgemäßen Verbindung und 0,1 bis 0,5 % 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin in einem geeigneten pharmazeutischen Träger. Ferner können Konservierungsmittel, Mittel zur Einstellung der Isotonie der Lösung, Puffer usw. zu dem pharmazeutischen Träger zugesetzt werden.

Ferner kann die oben erwähnte Kombination auch' angewandt werden für topisch anwendbare Salben und Cremes. Die Salbe oder Creme sollte ungefähr 0,001 bis 0,05 ^, vorzugsweise 0,001 bis 0,005 % der erfindungsgemäßen Verbindung und 0,1 bis 0,5 $ 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin in einem geeigneten pharmazeutischen Träger enthalten, der gegebenenfalls Konservierungsmittel, Farbstoffe usw. enthalten kann.

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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Es wurde ein Inokulum für die Fermentation hergestellt durch Suspendieren einer lyophilisierten Ausgängsmasse der Kultur NRRL 3238 in sterilem destilliertem V/asser und Ausstreichen dieser Kultur auf der Oberfläche von Schrägen eines geeigneten Agar-Mediums. Die entstehenden Schrägen wurden bei einer Temperatur von ungefähr 25 bis 32⁰C (maximal 50⁰C) inkubiert. Der Organismus wuchs und bildete Luftsporen in ungefähr 3 bis 10 Tagen. Die Kulturen, die Sporen gebildet hatten, wurden unmittelbar als Inokulum angewandt oder einige Monate vor der Verwendung bei 3 bis 1O⁰C gelagert.

Die Bildung von (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3_r6,7,8-tetrahydroimidazo /~4,5-d__7/~1,3_7-diazepin-8-ol äurch Fermentation wurde in einem Fermentationsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 7570 1 (2000 gallons) durchgeführt. Das Verfahren entsprach einer Standard-submersen Fermentation eines aeroben Actinomycetus.

Die Schrägen-Kulturen, die Sporen gebildet hatten (Stufe I), wurden angewandt, um das Impfmedium (seed medium), das bei diesem Verfahren mit dem Produktionsmedium identisch ist, zu beimpfen. Der Organismus wurde in 37,85 1 (10 gallons) eines belüfteten nicht gerührten Mediums 40 h wachsen gelassen (Stufe II). Diese wachsende Impfbrühe wurde dann angewandt, um ein gerührtes und belüftetes Impffermentationsgefäß mit einem Volumen von 1135,5 1 (300 gallons) (Stufe III) zu beimpfen. Das Zwischenimpf medium (Stufe III) wurde ungefähr 24 h gezüchtet und dann angewandt, um den 7570 1 Produktionsbottich (Stufe IV), enthaltend 4542 1 (1200 gallons) Medium zu beimpfen.

Man ließ die Fermentation ungefähr 5 Tage unter konstanter Belüftung und Rühren ablaufen. Es wurden in bestimmten Zeitabständen Proben entnommen, um das Wachstum, den pH-Wert und die biochemischen Änderungen zu messen.

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	Größe des Gefäßes	Stufe II	3O⁰C	Bestandteile (tradenames)	Stufe . III	Stufe IY
Tabelle I	Volumen des Mediums	113,6 1 (30 gal)	0,7 kg/cm (10 psi)	1892,5 1 (500 gal)	7570 1 (2000 gal)
	Volumen des Inokulums	37,85 1 (10 gal)	60 min	1135,5 1 (300 gal)	4542,0 1 (150 gal)
Fermentations-Bedingungen	Rühren	4 Schrägen	40 h	37,85 1 ( 10 gal)	567,75 1 (150 gal)
	Anzahl der Flügelräder	nein	ARM 1547	84 UpM	125 UpM
Anzahl der Flügel/Rad	keines	Swifts 51*	2	2
Belüftung CFM	-	Tabelle II	6	3-5
6,25	Medium Arm 1547	45	120
Geschwindigkeit der ober flächlichen Luft 2,8	2,8	2,8
Temperatur	30⁰C	37⁰C
Innerer Druck	0,7 kg/cm (10 psi)	0,7 kg/cm (10 psi)
Sterilisations-Zeit 250⁰F (121⁰C)	30 min	30 min
Fermentations-Zeit	24 h	120 h
Medium	ARM 1547	ARM 1547
Antischaum-Mittel	Swifts 51*	Swifts 51*


	$(Gewicht)

Glucose-monohydrat (Corn Products Cerelose)

Sojabohnenmehl, mit Lösungsmittel extrahiert, 44 y>

NaCl

Swifts Nr.51 Antischaummittel (Swift and Co., Chicago, 111.)

2,0

2,0 0,5 0,25

0,04

pH auf 7,5 eingestellt mit NaOH vor der Sterilisation

* Ein Antischaummittel,enthaltend tierische Fette, Glycerinester und leichte Mineralöle

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cn

co 00

	Stufe II	pH	Sediment	I'abelle	pH	Sediment	Stufe	pH	Sediment	Stufe IV	pH	Sediment
	6.85	6.77.	$ III	6.9	7.47.		6.6	7.47.	6.6	7.4Z
	-	_	. Untersuchungen, in jeder	6.7	8.77.	Stufe- IV	6.55	13.37.	6.4	17.3*
h.	7.05	6.77.		.	-	-	-	-
0	-	_		6.55	15.37.	6.25	17.3	5.9	17.3
8	6.20	12.77.	Stufeiii	6.4	19.37.	6.35	20.0	6.4	19.3
12	6.65	21.37.	-	-	6.4	20	6.45	20.0
16	6.60	23 7.		-	6.35	23.3	6.35	23.3
24					6.45	23.3	6.45	24
32					6.45	23.3	6.45	24
40					6.35	26.6	6.45	26.6
48					6.4	26.6	6.45	26
56					6.4	29.3	6.45	26.6
64					6.35	28	6.4	28.6
72					6.4	28.6	6.3	28
80					6.4	23.3	6.4	30.6 .
88					6.55	28.6	6.45	30.6
96					6.4	30	6.5	31.3
104
¹ 113
120

co

¹T

σ", ro

VJ]

cn

CD

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Die gewonnene Fermentationsbrühe (9745,6 1, 2515 gallons) wurde mit 45,4 kg (100 lbs) Diatomeenerde wie Gelite 545 bebandelt und durch eine 91,44 cm (36 inch) große Presse mit Platte und Rahmen filtriert. Der pH-Wert wurde von 6,7 auf 9,2 gebracht, die Brühe im Vakuum auf 968,8 1 (250 gallons) ■ eingeengt und das Konzentrat 3 Tage auf? 4 bis 5⁰O gekühlt* Dann wurden 18,1 kg (40 lbs) Celite 545 zu dem gekühlten Gemisch zugegeben und die Aufschlämmung durch eine 45,72 cm große Presse mit Platte und Rahmen filtriert. Das Piltrat wurde wieder mit Wasser auf 9687,5 1 (2500 gallons) verdünnt und die verdünnte Lösung auf einen pH-Wert von 8,3 eingestellt mit 3 % Gew./Vol.(ungefähr 272 kg, 600 lbs) Aktivkohle (Darco G-OO_x Aktivkohle aus Braunkohle und Holzkohle der Atlas Chemical Industries, Wilmington, Delaware) und 90,7 kg (200 lbs) Celite 545 behandelt. Die Aufschlämmung wurde ungefähr 1 h bei Raumtemperatur gemischt und dann durch eine 76,20 cm (30 inch) Filterpresse mit Platte und Rahmen filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 2906,3 1 (750 gallons) Wasser gewaschen und viermal mit je 1937,5 1 (500 gallons) einer 25$igen wässrigen Acetonlösung eluiert. Die ersten vier Anteile von 1937,5 1 wurden zusammengegeben (pH 7,4) und im Vakuum auf 32 1 eingeengt (pH 8). Das zuletzt genannte Konzentrat wurde mit 124 1 (32 gallons) Methanol verdünnt, so daß man eine 80$ige wässrige Methanollösung erhielt« Der beim 2 Stunden langen Stehen auftretende Niederschlag wurde abfiltriert und verworfen. Das Filtrat wurde dann im Vakuum auf 24 1 eingeengt. Gesamtfeststoffgehalt der Lösung ungefähr 13,9 kg.

A. Reinigung im Labor

700 ml der oben angegebenen 24 1 wurden mit 960 ml Wasser und 87,5 ml Aceton verdünnt, wobei man eine 5$ige wässrige Acetonlösung erhielt. Die Lösung wurde auf eine 15,24 x 122 cm (6 inch χ 4 ft) große mit Aktivkohle gefüllte Säule aufgegeben, die folgendermaßen hergestellt worden war. 3500 g Aktivkohle wie Darco G-60 und 3500 g Diatomeenerde wie Celite 545 wurden in einer 5$igen wässrigen Acetonlösung aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde mit verdünntem Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und in die 15,24 x 183 cm (6 inchx6ft

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Glassäule gegeben-«,- Die Packung der Säule war ungefähr 122 cm (48 inch) hoch» Nachdem die aufgebrachte Menge (1945 ml) durch die Säule gelaufen war, wurden 19 1 von 5$iges wässriges Aceton und 19 1 von ίObiges wässriges Aceton nacheinander zum Waschen der Säule verwendet. Der gewünschte Deaminaseinhibitor wurde mit 40 1 25%igem wässrigen Aceton eluiert. Nach Durchgang der ersten 9 1 25%igem Acetoneluat wurden Fraktionen von 1500 bis 1800 ml gesammelt. Diese !Fraktionen wurden auf den Gehalt an Desaminaseinhibitor untersucht und die Fraktionen, die den größten Teil des gewünschten Produktes enthielten, wurden zusammengegeben (4 Fraktionen 6200 ml). Diese Gesamtmenge wurde im Vakuum eingeengt, wobei der pH-Wert auf 8,2 bis 8,5 gehalten wurde_f und dann lyophilisiert, wobei man 14,7 g eines Feststoffes erhielt. Der Rückstand wurde in 100 ml Wasser gelöst, der pH-Wert der Lösung von 7,9 auf 8,5 gebracht und die lösung auf eine Säule mit polymerisiertem Dextran geringer Porengröße wie Sephadex G-10 in Wasser zubereitet, (5,1 χ 115 cm₍(äußeres Volumen ) 800 ml,(inneres Volumen) 1200 ml). Nachdem die aufgebrachte Menge durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 320 ml/h durchgelaufen war, wurde die Säule mit Wasser entwickelt. Die Fraktionen(des inneren Volumens) wurden in 100 ml Fraktionen gesammelt. Entsprechend der DeaminasebeStimmung wurde die gewünschte Substanz in den Fraktionen am Ende des (inneren Volumens) und danach erhalten. Diese Fraktionen wurden lyophilisiert. Eine lyophilisierte Fraktion,enthaltend 1,40 g Feststoffe, wurde in 5,5 ml kaltem Methanol gelöst und die Lösung über Nacht auf 5⁰C abgekühlt. Die entstehenden Kristalle wurden abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und aus 10 ml Methanol und 0,6 ml Wasser umkristallisiert. Ausbeute an Kristallen 215 mg,Fp 220-225⁰C nicht korrigiert.

Enzymatische Bestimmung von (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo £"4,5-ä_7Z~¹ ,3_7diazepin-

8-0I durch Berechnung der Deaminasehemmung. wäßrige

Verfahren: 1 ml 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin-Lösung mit 300/Ug/ml wurde mit 8 ml 0,05 m Phosphatpuffer pH 7,5 verdünnt.

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Zu dieser Lösung wurde 1 ml der zu untersuchenden Lösung, enthaltend unterschiedliche Mengen an (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythropentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo £~4,5-d_7/~1» 3_7~ diazepin-8-ol zugegeben, 3 ml der oben angegebenen Lösung wurden in eine UV-Zelle aus Quarz gegeben und die Dichte bei 265 gemessen. 0,1 ml Adenosin-deaminase-enzym-Lösung mit 1 «g/ml (Typ iraus Darmschleimhaut,, der Sigma Chemical Company, St,Louis, Missouri)/urde mit in die Zelle gegeben, die Lösung gemischt und die UV-Dichte bei 265 am 5 min später bestimmt.

/Ug kristalliner Desaminase-Inhibitor	Optische Dichte bei λ 265 O min	nm 5 min	Abnahme der optischen Dichte
Yergleich	1,433	1,046	0,387
0,1	1,432	1,365	0,067
0,075	1,432	1,355	0,077
0,05	1,441	1,355	0/086
0,04	1,439	1,347	.. 0,092
0,03	1,429	1,315	0,114
0,02	1,438	1,291	0,148
0,01	1,435	1,225	0,210

in der
Bei der Bestimmung derYzu untersuchenden Lösung vorhandenen Menge (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetra hydroimidazo /.""4,5~d_7Z~1,3_/diazepin-8-ol entspricht eine Abnahme der optischen Dichte bei 265 nm um 0,10 ungefähr 0,035 /U (R)-3-(2-De oxy-ß-D-erythro-pentofura nosy1)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /."~4,5-d_7/""1,3_7diazepin-8-ol.

B. Reinigung im halbtechnischen Maßstab

Die restlichen 23,7 1 des nach der ansatzweisen Adsorption an Kohle erhaltenen Konzentrats (A),das oben erwähnt ist, wurden mit 31,6 1 Wasser und 2,9 1 Aceton verdünnt, um eine 5$ige wässrige Acetonlösung (58,2 1) zu erhalten und die entstehende Lösung wurde auf einer Säule mit Aktivkohle wie Darco G-60 mit einer Größe von 45,72 χ 365,8 cm (18 inches x 12 fts) aufgebracht. Die Säule war folgendermaßen hergestellt worden,

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81,6 kg (180 lbs) Darco G-60 und 81,6 kg (180 lbs) Diatomeenerde wie Celite 545 wurden in 581,3 1 (150 gallons) 5#igem wässrigen Aceton aufgeschlämmt, wobei der pH-Wert des Gemisches mit 480 ml 10 η Katriumhydroxidlösung auf 9 eingestellt wurde. Die Aufschlämmung wurde in die 45,7 cm Säule gegeben und die Flüssigkeit aus der Säule abgezogen, bis der Flüssigkeitsspiegel ungefähr dem oberen Ende der Packung entsprach. Die 58,2 1 der wässrigen Acetonlösung wurden auf die Säule aufgebracht und die Säule mit 5%igem wässrigen Aceton entwickelt. Dabei wurde auf die Säule ein Druck von 0,7 kg/cm (10 psi) ausgeübt. Durchflußgeschwindigkeit 450 ml/min. Die Säule wurde mit 445,6 1 (115 gallons) 5%igem wässrigen Aceton perkuliert und 232,5 1 (60 gallons) 1Obigem wässrigen Aceton. Der Desaminaseinhibitor wurde mit 25$igem wässrigen Aceton eluiert und Fraktionen von 18 1 gesammelt und auf die Aktivität an Desaminase-Inhibitor untersucht. Es wurde auch der Feststoffgehalt jeder Fraktion durch Lyophilisieren von 25 ml Anteilen bestimmt. 9 .Fraktionen, umfassend insgesamt ungefähr 162 1, enthaltend den Desaminase-Inhibitor, wurden zusammen gegeben und im Vakuum bei weniger als 35⁰C auf ein Endvolumen von 2,7 1 eingeengt, wobei der pH-Wert auf 9,0 gehalten wurde. Die erhaltene Gesamtmenge an Feststoffen in dem Konzentrat betrug ungefähr 467 g·

Das oben angegebene Konzentrat (2,7 1) wurde dann über eine Säule mit polymerisiertem Dextran mit kleiner Porengröße, wie Sephadex G-10 (Pharmacia Co., Piscataway, Ii.J.)_y fraktioniert. Das Sephadex (6 kg), das ein vernetztes Dextran ist, war 2 Tage in Wasser gequollen in eine 10,16 cm dicke Glassäule gegeben und dann mit Wasser gewaschen worden bis der Kohlenhydrattest (Phenol und Schwefelsäure) negativ war. Die gepackte Säule besaß die folgenden Eigenschaften: Größe der gepackten Säule 10,16 χ 187,96 cm (4 x 74 inches); äußeres Volumen $21; Fließgeschwindigkeit 2,1 l/h, Zugabe auf die Säule ungefänr 600 ml der 2,7 1 des Konzentrats aus der Kohlensäule. Nachdem die aufgegebene Menge durch die Sephadex G-10 Säule hindurchgelaufen war, wurde die Säule mit Wasser entwickelt. Das (innere Volumen) wurde in 400 ml Fraktionen gesammelt und die Fraktionen, die den

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Hauptteil des (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuraaosyl)-3,6,7,8-tetrahydro imidazo Z"~4 > 5-d__7Z"~1 ,3_7diazepia~8-ol enthielten, wurden zusammen gegeben, im Vakuum eingeengt und lyophilisiert. Die oben angegebene Sephadex-Säule wurde weitere dreimal verwendet, um den Rest des Konzentrats aus der Kohlensäule zu fraktionieren. Die vereinigten Fraktionen,enthaltend das.(R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /""4,5—d_7"/7"1, 3_J7-diazepin-8-ol aus jeder der vier Fraktionierungen, wurden zusammengegeben und aus 90$igem wässrigen Methanol umkristallisiert. Die Kristalle wurden dreimal umkristallisiert. Man erhielt 8,5 g kristallines (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /,""4,5-d__7Z""i» 3_>_7diazepin-8-ol·

Beispiel 2
Pharmazeutische Mittel

1. Parenterales Mittel

Bestandteil ^;Gehalt

(mg/ml)

9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin-hydrat ' 200 (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo Z~"4»5-d__7Z~¹ »3_/-diazepin-8-ol 10

Phemerol-chlorid 0,1

4,8

HaH₂PO₄ · 1,11

a) Das Phemerol-chlorid und das ein- und zweibasische Natriumphosphat wurden in einer entsprechenden Menge Wasser zur Injektion gelöst.

b) Die unter a) hergestellte Lösung wurde sterilisiert durch Durchleiten durch ein 0,22 >um Membranfilter.

c) Das sterile 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin-hydrat und das (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo £~4-, 5-ά_7Ζ~"1,3_7diazepin-8-ol wurden in die unter b) er-

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haltene sterile Lösung gegeben. Das Gemisch wurde mit sterilem Wasser zur Injektion auf das entsprechende Volumen gebracht und vermischt bis .eine homogene Suspension entstand«,

d) In jede Flasche wurde das entsprechende Volumen der Suspension aus Stufe c gegeben, um den entsprechenden Gehalt der angegebenen Bestandteile zu erreichen.

e) Die gefüllten Flaschen nach Stufe d wurden gefroren, indem sie auf -40 C oder eine niedrigere Temperatur mindestens 12 h gebracht wurden.

f) Die gefrorenen Zubereitungen wurden folgendermaßen lyophilisiert:

1. Die Trockenschalen wurden auf -45⁰C vorgekühlt;

2. Das gefrorene Produkt wurde in die Schalen gegeben;

3. Es wurde ein Vakuum von 100yum oder darunter in der Trockenkammer erzeugt.

4. Die Schalen wurden erwärmt, daß sie am Ende von 48-h eine maximale Temperatur von +40 C erreichten.

5. Das Vakuum wurde mit Hilfe von sterilem filtriertem trockenem Stickstoff aufgehoben.

6. Die trockenen Flaschen wurden mit entsprechenden Vorrichtungen verschlossen.

g) Die entsprechende Flüssigkeit zur intravenösen Verabreichung wird vor der Anwendung zu dem lyophilisierten sterilen Feststoff zugegeben.

2«, Ophthalmisches Mittel

a) Ophtba!mische Salbe(Augensalbe)

Bestandteil ' Gehalt

Steriles, feinteiliges** 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin-hydrat 30 mg

Steriles, feinteiliges**

(B.)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /"4,5-d_JZ""¹»^J" diazepin-8-ol 1,5 mg

Sterile Salbengrundlage auf 1000 g

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- 24 ~ 1A-4-O

1. Das sterile, feinteilige 9(ß-D-Arabinofuranosyl)adeninhydrat und-das sterile, feinteilige (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythropentof uranosyl)-3, 6,7,8-tetrahydroimidazo /~4,5-d__7Z.""¹» 3_7-diazepin-8-ol wurden unter Verreiben in eine kleine Menge der sterilen Salbengrundlage unter Bildung einer glatten Paste eingearbeitet.

2. Die sterile konzentrierte Paste nach Stufe 1 wurde aseptisch in den Rest der sterilen Salbengrundlage mit Hilfe eines geeigneten sterilen Mischers eingearbeitet.

3e Das gesamte Gemisch aus Stufe 2 wurde durch eine geeignete sterile Salbenmühle geführt, um sicherzustellen, daß das Mittel homogen war.

** mittlere Teilchengröße etwa 2,4 /im.

b) Ophthalmische Tropfen (Augentropfen)

Bestandteil Gehalt
Steriles, feinteiliges** 9-(ß-D-Arabino-

furanosyl)adenin-hydrat 30 mg
(R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro—pentofuranosyl)—
3,6,7,8-t e trahy dr ο imida ζ ο /~4,5 -d__7/7"i, 3_7-

diazepin-8-ol 1,5 mg

Natriumchlorid 9,0 mg

Polyvinylpyrollidon 30,0 mg

Phemerol-chlorid (Benzethonium-chlorid) 0,1 mg Wasser zur Injektion auf 1,0 ml

1. Das Natriumchlorid, Polyvinylpyrollidon und das Phemerolchlorid wurden in einer Menge des Wassers zur Injektion gelöst. Die Lösung wurde durch Eiltration durch ein 0,22 yum Millipor-Membran sterilisiert.

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2. Das sterile, feinteilige** 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin-

daa , .

hydrat und sterile feinteilige ** (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythropentofuranosyl)-3,6,7»8-tetrahydroimidazo /"~4,5-d_7Z"~1, 3J-diazepin-8-ol wurden aseptisch in den nach Stufe b erhaltenen Träger eingebracht.

3. Es wurde ausreichend steriles Wasser¹ zur Injektion zu dem Gemisch der Stufe 2 zugegeben, um das gewünschte Volumen zu erhalten. Es wurde gründlich vermischt, um eine homogene Suspension zu erhalten.

** mittlere Teilchengröße nahe 2,4 Aim.

3. Mittel zur topischen Anwendung

Bestandteil Gehalt

(Gewicht/g Creme)

9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin-hydrat** 30 mg (R)-3-(2-Deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-

3,6,7,8-tetrahydroimidazo Z"~4,5-d_J7/~1 »3_7- "

diazepin-8—öl 1,5 mg

Stearyl-alkohol 25Q₁O mg

Petrolatum (weiß) 200,0 mg

Myrj 52 50,0 mg

Propylen-glykol ' 120,0 mg

Destilliertes Wasser 349,0mg

Destilliertes Wasser auf 1000,0 mg

a) Das destillierte Wasser und Propylenglykol wurden vermischt und auf 75⁰C erwärmt. ■ ,

b) Der Stearylalkohol, Petrolatum (weiß) und Myrj 52 (ein oberflächenaktives Mittel der Polyoxyathylen-stearat-Gruppe) wurden vermischt und durch Erhitzen auf 75⁰C geschmolzen.

c) Die wässrige Phase der Stufe a wurde langsam zu der öligen Phase der Stufe b unter schnellem Rühren zugegeben.

d) Nach Abkühlen des Mittels auf 50 bis 55⁰C wurden 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin-bydrat**· und das (R)-3-(2-Peoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl)-3_t6,7,8-tetrahydroimidazo £~4,5-ä~7~ £"\, 3^7"diazepin-8-ol** zugegeben. Das Gemisch wurde weiter gerührt bis es abgekühlt und koaguliert war.

** mittlere Teilchengröße nahe 2,4 /Jm. Patentansprüche

S09844/1014

Claims

Patentansprüche

(R)-3-(2-Deoxy-ß-D-er;/thro-pentofuränosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo /~"4,5-d_7/"~1, 3_7äiasepin-8-ol.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Streptomyces antibioticus IiERL 3238 in einem geeigneten Nährmedium züchtet und die gewünschte Verbindung aus der Fermentationsbrühe isoliert.

3· Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1, gegebenenfalls zusammen mit 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin zur Herstellung von Arzneimitteln.

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