DE2517596C2 - (R)-3-(2-Deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo [4,5-d] [1,3]diazepin-8-ol und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents
(R)-3-(2-Deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo [4,5-d] [1,3]diazepin-8-ol und Verfahren zu dessen HerstellungInfo
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Description
Beschreibung
Die Erfindung betrifft (R)-3-(2-Deoxy-/^D-erythro-pentci-furanosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-dI13]diazepin-8-ol
der Formel
OH
HN \ N
1S /O
HOCH
,said ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung. Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, enthaltend die
erfindungsgemäße Verbindung zusammen mit 9-(/J-D-Arabinofuranosyl)adenin. Dieses Mittel ist geeignet zur
Behandlung von Herpes-Infektionen.
Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Verbindung in den Kulturbrühen, die beim Züchten von
Streptomyces antibioticus NRRL 3238 erhalten werden (vgl. z. B. US-PS 36 16 208), neben 9-(0-D-Arabinofuranosyljadenin
in kleinen Mengen enthalten ist
Die erfindungsgemäße Verbindung I wird daher hergestellt durch Züchtung des genannten Stammes in einem
üblichen Nährmedium, bis eine erhebliche Menge (R)-3-(2-Deoxy-/J-D-erythro-pento-furanosyl)-3,6,7-8-tetrahydroimidazo[4,5-dI13]diazepin-8-ol
gebildet worden ist, Entfernung von 9-(/?-D-Arabinofuranosyl)-adenin und
Abtrennung der erfindungsgemäßen Verbindung.
Die Züchtung des genannten Stammes von Streptomyces antibioticus kann, wie in der zitierten US-PS
beschrieben, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann der Organismus unter aeroben Bedingungen auf der
Oberfläche des Mediums gezüchtet werden oder er kann unterhalb der Oberfläche des Mediums gezüchtet
werden, das heißt submers, vorausgesetzt, daß eine entsprechende Sauerstoffmenge zur Verfügung gestellt wird.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von (R)-3-{2-Deoxy-/3-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][l,3]diazepin-8-ol
in großem Maßstab ist die Züchtung in einer submersen oder tiefen Kultur. Nach dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein steriles wäßriges NShrmedium mit
der ausgewählten Kultur beimpft und unter Rühren und Belüftung unter aseptischen Bedingungen inkubiert bei
einer Temperatur von ungefähr 20 bis 45°C, vorzugsweise b?i 33 bis 400Q bis sich eine wesentliche Menge von
(R)-3-(2-Deoxy-/J-Derythro-pentofuranosyl·)- 3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-dIl,3]diazepin-8-ol in der Kulturflüssigkeil
findet. Die Zeit, die erforderlich ist, um eine maximale Ausbeute zu erhalten, variiert mit der Größe und
Art der angewandten Apparatur, der Rühr- und Belüftungsgeschwindigkeit, der speziellen Organismuskultur
und anderen Faktoren. Bei technischen Fermentationen im großen Maßstab, die in kesselartigen Fermentationsbehältern
durchgeführt werden, wird die maximale Bildung üblicherweise in ungefähr 3 bis 7 Tagen erreicht.
Kürzere Fermentationszeiten können auch angewandt werden, aber führen im allgemeinen zu geringeren
Ausbeuten. Wenn die Fermentation in Schüttelkolben durchgeführt wird, kann die Zeit, die zur maximalen
Bildung erforderlich ist, etwas länger sein als wenn große Fermentationstanks angewandt werden.
Unter submersen Kulturbedingungen entwickelt sich der Organismus in Form von verhältnismäßig einzelnen
Teilchen, die in dem gesamten Nährmedium verteilt sind, im Gegensatz zu dem verhältnismäßig kontinuierlichen
zusammenhängenden Häutchen oder Belag, der sich auf der Oberfläche des Medium bildet bei der Oberflächenkultur.
Aufgrund dieser Verteilung des Organismus in dem gesamten Medium können große Volumina des
beimpften Nährmediums zur Züchtung des Organismus in den Kesseln und Bottichen angewandt werden, die
üblicherweise in der Fermentationsindustrie verwendet werden. Ortsfeste Fermentationsbottiche, die mit Rühr-
und Belüftungsvorrichtungen versehen sind, sind besonders geeignet zur Produktion im großen Maßstab,
obwohl auch andere Fermentationsvorrichtungen angewandt werden können. Zur Erzeugung kleinerer Mengen
des Produktes oder zur Herstellung der Organismuskulturen, die als Inokulum für Fermentationen im großen
Maßstab angewandt werden, kann die submerse Kultur in kleinen Kolben oder Gefäßen durchgeführt werden,
die entweder geschüttelt oder mil Hilfe geeigneter mechanischer Vorrichtungen gerührt werden.
Bei der submersen Kultur kann das Rühren bzw. die Bewegung des Kulturmediums und die BelüiFtung des
Kulturgemisches auf verschiedene Weise erreicht werden. Die Bewegung kann erreicht werden mit Hilfe von
Turbinen, Paddeln, Propellern oder anderen mechanischen Rührvorrichtungen, durch Rotieren oder Schwenken
oder Schütteln des Fermentationsgefäßes selbst, durch verschiedene Pumpvorrichtungen oder durch !Durchleiten
von Luft oder Sauerstoff durch das Medium. Die Belüftung kann erreicht werden durch Einblasen von Luft
oder Sauerstoff in das Fermentationsgemisch durch offene Rohre, gelochte Rohre oder Rohre, die einen porösen
Diffusionsbereich besitzen, oder durch Versprühen, Verspritzen oder Umgießen des Mediums in oder durch e»ie
sauerstoffhaltige Atmosphäre.
Eine Alternative zu der bevorzugten submersen Kultur ist die Oberflächenstruktur zur Bildung von
(R)-3-(2-Deoxy-)9-D-erythropentofuranosyl)-316,7,8-tetrahydroimidazo[4^-dI13]-diazepin-8-oI, bei der eine
flache Schicht üblicherweise von weniger als 2 cm eines sterilen wäßrigen Nährmediums mit dem genannten
Stamm von Streptomyces antibioticus beimpft wird und da<i beimpfte Gemisch unter aeroben Bedingungen bei
einer Temperatur von ungefähr 20 bis 45° C inkubiert wird. Das Produkt wird dann auf ähnliche Weise erhalten
wie für die submerse Kultur beschrieben.
Nach Abschluß der Fermentationsphase des Verfahrens kann das gewünschte Produkt auf folgende Weise
erhalten werden. Das Mycel wird durch Verfahren wie Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt Der Filterkuchen
wird gut mit Wasser gewaschen, die Waschflüssigkeiten mit der abfiltrierten Fermentationsbrühe zusam··
rnengegeben,<iir pH-Wert mit Hilfe einer wäßrigen Lösung einer Base wie Natriumhydroxid, Triäthylamin oder
Ämnioniüirihydröxiu auf ungefähr 9,2 eingestellt und die vereinigten Flüssigkeiten unter vermindertem DrucS;
auf ungefähr 1Ao des ursprünglichen Volumens eingeengt Die konzentrierte Lösung wird eine längere Zeit (von
einigen Stunden bis zu einigen Tagen, je nach dem Volumen) auf ungefähr 5°C abgekühlt und der sich abscheidende
Feststoff, der 9-(^-Arab;nofuranosyl)adenin ist, wie in der US-PS 36 16 208 angegeben, mit Hilfe von
Diatomeenerde abfiltriert.
Dann wird das entstehende Fihrat mit Wasser auf ungefähr das ursprüngliche Volumen vor dem Einengen
verdünnt Der pH-Wert wird mit Hilfe einer wäßrigen Säure, wie Salzsäure oderiiehwefelsäure auf ungefähr 8,3
eingestellt und mit Aktivkohle oder einem anderen Adsorptionsmittel behandelt Die Adsorption kann entwedeir
ansatzweise oder durch kontinuierlichen Fluß durch eine Adsorptionssäule durchgeführt werden. Bei dem
bevorzugten ansatzweisen Arbeiten werden 0,5 bis 10%, vorzugsweise ungefähr 3% (Gewicht/Volumen) deii
bevorzugten A '-tivkohle-Adsorptionsmittels zu der filtrierten Fermentationsbrühe zugegeben und das entstehende
Gemisch 1 bis 3 h gerührt Das Gemisch wird filtriert, der feste Bestandteil mit Wasser gewaschen und
anschließend mit wäßrigem Aceton (ungefähr gleiche Teile Wasser und Aceton) eluiert Das Eluat wird auf
ungefähr V300 des Volumens der ursprünglichen Brühe eingeengt Zu dem Konzentrat wird Methanol zugegeben,
um eine 80%ige wäßrige Meuianollösung zu erhalten. Der entstehende Niederschlag wird abfiltriert. Das
Fütrat wird eingeengt, um das Methanol zu entfernen und dann auf das ungefähr 2'/3fache seines ursprünglichen
Volumens verdünnt durch Zugabe einer wäßrigen Acetonlösung (ungefähr 5% Aceton in Wasser) und" durch
s eine Säule mit Aktivkohle geleitet, deren Länge und Weite mit den angewandten Volumina variiert. Die
* Aktivkohle-Säule wird mit Acetonlösung, enthaltend ungefähr 95% Wasser und 5% Aceton, -^ev/aschen und
anschließend mit einer Lösung, enthaltend ungefähr 90% Wasser und 10% Aceton. Die Säule wird anschließend
mit einer Acetonlösung, enthaltend ungefähr 75% Wasser und 25% Aceton, eluiert. Das Eluat wird im Vakuum
eingeengt und gefriergetrocknet. Der getrocknete Feststoff wird in einer möglichst geringen Menge Wasser
gelöst und dann durch eine Säule perkoliert, die mit im Wasser zubereitetem vernetztem Dextzan gefüllt ist. Die
Säule wird mit Wasser gewaschen und die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, getrocknet und
aus wäßrigem Methanol umkristallisiert. «5
Das im wesentlichen reine (R)-3-(2-Deoxy-/?-D-erythro-pento-furanosyl)-3,6,7.8-tetrahydroimidazo[4,5-dIl,3]diazepin-8-ol
besitzt die folgenden Eigenschaften:
1. Schmelzpunkt220-225°C(nichtkorrigiert)
bi &Lgr; 282 £|298
| 2. Ultraviolett-Absorption | &Lgr; 282 | &Egr;\ | 298 |
| pH 2 | &lgr; 273 | E) | 282 |
| pH 2 nach 6.5 h | &Lgr; 267 | &Egr;\ | 117 |
| pH 11 | &lgr; 283 | E) | 297 |
| 3. [a] 2S + 76,4° 1% in Wasser | |||
| 4. Dünnschicht-Chromatographie | |||
| Brinkmann-Silicagel F2« | |||
a) 50% Methanol - 50% Chloroform Rr 0.42
b) 80% Methanol - 20% Chloroform Ri 0,54
•a 5. pKa 5,2 in Wasser; Molekulargewicht etwa 300.
6. Infrarotspektrum (KBrTabletten).
Breite intensive Bande im Bereich von 3400 bis 2500 cm-' mit Maxima bei 3400,3330,3120.2940 und 2890 cm-1;
der Rest des Spektrums zeigt scharfe Maxima, wobei die hervorstechendsten bei 1649, 1578, 1544,1505. 1470,
1460,1414, 1396, 1370,1356, 1325, 1301, 1281, 1245, 1214, 1178, 1162, 1135, 1115,1095,1060. 1035. 1020,990,95;!, 1,5
868,842,822,765,745,702,668,580,540,510,475 cm~' liegen.
7. Kernmagnetisches Resonanzspektrum in D2O mit Tetramethylsilan (TMS) als äußerem Standard.
M ultiplett bei 2,65,2,81,2,87,2,98,3,10 ppm, scharfe Banden bei 3,79,3,82,3.89,4,13,4,19 ppm.
Quadruple« bei 4,43,4,49.4,56,4,62 ppm.
Multiple« bei 437,4,93,436,4,98,5,02,5,09 ppm.
HDO bei 5.16 ppm; Quadruple« bei 5,51,5,54,5,57,5,60 ppm;
Triplett bei 6,55.6,67 und 6,79 ppm:Singuletts bei 7,62 und 8,11 ppm.
Die erfindungsgemäße Verbindung ist ein wirksamer Deaminaseinhibitor (Beispiel 1, Teil A). Außerdem
verstärkt sie die Wirksamkeit von 9-fjS-D-Arabinofuranosyl)adenin, einem Antivirenmittel (US-PS 36 16 208),
das geeignet ist zur Behandlung von Infektionen, die durch DNS-Viren verursacht sind, besonders Herpes umd
Impfvirus-Infektionen bei Säugetieren. Besonders ergibt die erfindungsgemäße Verbindung, wenn sie zusammen
mit S (^-D-Arabionofuransosyl)adenin in einem Verhältnis von ungefähr 0.005 bis 0,2 Teilen der erfindungsgemäßen
Verbindung auf ein Teil 9-(/?-D-Arabinofuranosyl)adenin verabreicht wird, pharmazeutische Mittel, die
wirksamer sind als Mittel, enthaltend nur 9-(/?-D-Arabinofuranosyl)adenin als Antivirenmittel gegen DNS-Viren.
Die bevorzugte Menge beträgt 0,01 bis 0,05 Teile der erfindungsgemäßen Verbindung auf einen Teil 9-{&bgr;-&Oacgr;-&Agr;&tgr;&zgr;-bino-furanosyl)adenin.
Das Mitte! kann als nicht geformte Masse, enthaltend 0,005 bis 0,2 Teile der erfindungsgemäßen Verbindung
auf ungefähr ein Teil 9-(/?-D-Arabinoftiranosyl)-adenin vorliegen, die bei der Anwendung durch Zugabe eines
Lösungsmittels, das für injizierbare Zubereitungen geeignet ist, in Lösung gebracht wird. Wahlweise kann das
pharmazeutische Mittel eine wäßrige Lösung sein.
Außerdem kann die oben angegebene Kombination für ophthalmische mittel, wie Salben und Lösungen, zur
M' Behandlung von Herpes keratitis angewandt werden.
Ferner kann die oben erwähnte Kombination auch angewandt werden für topisch anwendbare Salben und
Cremes.
Die Erfindung wird durch das folgend» Beispiel näher erläutert:
Die Erfindung wird durch das folgend» Beispiel näher erläutert:
Es wurde ein lnokulum für die Fermentation hergestellt durch Suspendieren einer lyophilisierten Ausgangsmasse
der Kultur NRRL 3238 in sterilem destilliertem Wasser und Ausstreichen dieser Kultur auf der Oberfläche
von Schrägen eines geeigneten Agar-Mediums. Die entstehenden Schrägen wurden bei einer Temperatur
jo von ungefähr 25 bis 32° C (maximal 50° C) inkubiert. Der Organismus wuchs und bildete Luftsporen in ungefähr 3
bis 10 Tagen. Die Kulturen, die Sporen gebildet hatten, wurden unmittelbar als lnokulum angewandt oder einige
Monate vor der Verwendung bei 3 bis 10° C gelagert.
Die Bildung von (R)-3-(2-Deoxy-/^D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-dIl3]-diazepin-8-ol
durch Fermentation wurde in einem Fermentationsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 75701 durchgeführt.
Das Verfahren entsprach einersubmersen Standardfermentation eines aeroben Actinomycetus.
Die Schrägen-Kulturen, die Sporen gebildet hatten (Stufe 1), wurden angewandt um das Impfmedium, das bei
diesem Verfahren mit dem Produktionsmedium identisch ist, zu beimpfen. Der Organismus wurde in 37,851 eines
belüfteten nicht gerührten Mediums 40 h wachsen gelassen (Stufe II). Diese wachsende Impfbrühe wurde dann
angewandt, um ein gerührtes und belüftetes Impffermentationsgefäß mit einem Volumen von 113551 (Stufe III)
zu beimpfen. Das Zwischenimpfmedium (Stufe III) wurde ungefähr 24 h gezüchtet und dann angewandt, um den
75701 Produklionsbottich (Stufe IV), enthaltend 4542 1 Medium zu beimpfen.
Man ließ die Fermentation ungefähr 5 Tage unter konstanter Belüftung und Rühren ablaufen. Es wurden in
bestimmten Zeitabständen Proben entnommen, um das Wachstum, den pH-Wert und die biochemischen Änderungen
zu messen.
Tabelle 1
Fermentations-Bedingungen
Fermentations-Bedingungen
Stufe II
Stufe III
Stufe IV
Größe des Gefäßes Volumen des Mediums Volumen des Inokulums Rühren
"Anzahl der Flügelräder Anzahl der Fügel/Rad Belüftung CFM
Geschwindigkeit der oberflächlichen Luft Temperatur
Innerer Druck
Sterilisations-Zeit 121°C Fermentations-Zeit
Medium
| 113,61 | 1892,5 I | 75701 |
| 37,85 1 | 1135,5 1 | 4542,0 1 |
| 4 Schrägen | 37,85 1 | 567,75 1 |
| nein | 84UpM | 125 UpM |
| keines | 2 | 2 |
| - | 6 | 3-5 |
| 6,25 | 45 | 120 |
| 2,8 | 2,8 | 2,8 |
| 3O0C | 300C | 37°C |
| 0,7 kg/cm2 | 0,7 kg/cm2 | 0,7 kg/cmi |
| 60 min | 30 min | 30 min |
| 40 h | 24 h | 120 h |
| ARM 1547 | ARM 1547 | ARM 1547 |
| Tabelle II | ||
| Medium Arm 1547 |
Bestandteile % (Gewicht)
| Glucose·· rnonohydrat | 2,0 |
| Sojabohnenmehl, mit Lösungsmittel | 2.0 |
| extrahiert, 44% | |
| NaCl | 0.5 |
| CaCO3 | 0,25 |
| Antischaummittel*) | 0,04 |
| pH auf 73 eingestellt mit NaOH | |
| vor der Sterilisation |
*) Enthaltend tierische Fette, Glycerinester und leichte Mineralöle
Tabelle Uli
Untersuchungen in jeder Stufe
Untersuchungen in jeder Stufe
| h | 0 | Sture 11 | Sediment | Stuie III | Sediment | Sture IV | Sediment | Sture IV | Sediment |
| 8 | pH | 6,7% | pH | 7,4% | pH | 7,4% | pH | 7,4% | |
| 12 | 6,85 | - | 6,9 | 8,7% | 6,6 | 13,3% | 6,6 | 17,3% | |
| 16 | - | 6,7% | 6,7 | - | 6,55 | - | 6,4 | - | |
| 24 | 7,05 | - | 15,3% | 17,3 | - | 17,3 | |||
| 32 | - | 12,7% | 6,55 | 19,3% | 6,25 | 20,0 | 5,9 | 19,3 | |
| 40 | 6,20 | 21,3% | 6,4 | - | 6,35 | 20 | 6,4 | 20,0 | |
| 48 | 6,65 | 23% | - | 6,4 | 23,3 | 6,45 | 23,3 | ||
| 56 | 6,60 | - | 6,35 | 23,3 | 6,35 | 24 | |||
| 64 | 6,45 | 23,3 | 6,45 | 24 | |||||
| 72 | 6,45 | 26,6 | 6,45 | 26,6 | |||||
| 80 | 6.35 | 26,6 | 6,45 | 26 | |||||
| 88 | 6,4 | 29,3 | 6,45 | 26,6 | |||||
| 96 | 6,4 | 28 | 6,45 | 28,6 | |||||
| 104 | 6,35 | 28,6 | 6,4 | 28 | |||||
| 113 | 6,4 | 23,3 | 6,3 | 30,6 | |||||
| 120 | 6,4 | 28,6 | 6,4 | 30,6 | |||||
| 6,55 | 30 | 6,45 | 31,3 | ||||||
| 6,4 | 6,5 | ||||||||
Die gewonnene Fermentationsbrühe (9745,61) wurde mit 45,4 kg Diatomeenerde behandelt und durch eine
91,44 cm große Presse mit Platte und Rahmen filtriert. Der pH-Wert wurde von 6,7 auf 9,2 gebracht, die Brühe im
Vakuum auf 968,81 eingeengt und das Konzentrat 3 Tage auf 4 bis 50C gekühlt. Dann wurden 18,1 kg Diatomeenerde
zu dem gekühlten Gemisch zugegeben und die Aufschlämmung durch eine 45,72 cm große Presse mit
Platte und Rahmen filtriert. Das Filtrat wurde wieder mit Wasser auf 9687,51 verdünnt und die verdünnte
Lösung auf einen pH-Wert von 83 eingestellt mit 3% Gew7Vol. (ungefähr 272 kg) Aktivkohle (aus Braunkohle
&kgr; und Holzkohle) und 90,7 kg Diatomeenerde behandelt. Die Aufschlämmung wurde ungefähr 1 h bei Raumtemperatur
gemischt und dann durch eine 76,20-cm-Filterpresse mit Platte und Rahmen filtriert Der Filterkuchen
wurde mit 29063! Wasser gewaschen und viermal mit je 1937,51 einer 25%igen wäßrigen Acetonlösung eluiert.
Die ersten vier Anteile von~1937,51 wurden zusammengegeben (pH 7,4) und im Vakuum auf 321 eingeengt (pH
8). Das zuletzt genannte Konzentrat wurde mit 1241 Methanol verdünnt, so daß man eine 80%ige wäßrige
«o Methanollösung erhielt. Der beim 2 Stunden langen Stehen auftretende Niederschlag wurde abfiltriert und
verworfen. Das Filirat wurde dann im Vakuum auf 241 eingeengt. Gesamtfeststoffgehalt der Lösung ungefähi
13.9 kg.
A. Reinigung im Labor
700 ml der oben angegebenen 241 wurden mit 960 ml Wasser und 873 ml Aceton verdünnt, wobei man eine
5%ige wäßrige Acetonlösung erhielt Die Lösung wurde auf eine 15,24 · 122 cm große mit Aktivkohle gefüllte
Säule aufgegeben, die folgendermaßen hergestellt worden war. 3500 g Aktivkohle und 3500 g Diatomeenerde
wurden in einer 5%igen wäßrigen Acetonlösung aufgeschlämmt Die Aufschlämmung wurde mit verdünntem
so . Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und in die 15,24 · 183-cm-Glassäule gegeben. Die
Packung der Säule war ungefähr 122 cm hoch. Nachdem die aufgebrachte Menge (1945 ml) durch die Säule
' gelaufen war, wurden 19 1 5%iges wäßriges Aceton und 191 10%iges wäßriges Aceton nacheinander zum
Waschen der Säule verwendet. Der gewünschte Deaminaiseinhibitor wurde mit 40125%igem wäßrigen Aceton
eluiert Nach Durchgang der ersten 9125%igem Acetoneluat wurden Fraktionen von 1500 bis 1800 ml gesam-
melt Diese Fraktionen wurden auf den Gehalt an Deamiinaseinhibitor untersucht und die Fraktionen, die den
größten Teil des gewünschten Produktes enthielten, wurden zusammengegeben (4 Fraktionen, 6200 ml). Diese
Gesamtmenge wurde im Vakuum eingeengt, wobei der pH-Wert auf 8,2 bis 8,5 gehalten wurde, und dann
lyophilisiert wobei man 14,7 g eines Feststoffes erhielt Der Rückstand wurde in 100 ml Wasser gelöst, der
pH-Wert der Lösung von 73 auf 8,5 gebracht und die Lösung auf eine Säule mit polymerisiertem Dextran
bo geringer Porengröße in Wasser zubereitet (5,1 -115 cm, äußeres Volumen 800 ml, inneres Volumen 1200 ml).
Nachdem die aufgebrachte Menge durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 320 ml/h durchgelaufen war,
wurde die Säule mit Wasser entwickelt. Die Fraktionen des inneren Volumens wurden in 100 ml Fraktionen
gesammelt Entsprechend der Deaminasebestimmung wurde die gewünschte Substanz in den Fraktionen am
Ende des inneren Volumens und danach erhalten. Diese Fraktionen wurden lyophilisiert Eine lyophilisierte
&mgr; Fraktion, enthaltend 140 g Feststoffe, wurde in 5,5 ml kaltem Methanol gelöst und die Lösung über Nacht auf
5 C abgekühlt Die entstehenden Kristalle wurden abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und aus 10 m:
Methanol und 0,6 mi Wasser umkristallisiert Ausbeute an Kristallen 215 mg, Fp 220—225° C. nicht korrigiert
Enzymatische Bestimmung von
(R)-3-(2-Deoxy-^-D-erythro-pento-furanosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo{1,5-dI1,3]cliazepin-8-ol durch
Berechnung der Deaminasehemmung.
Verfahren
1 ml wäßrige 9-(/3-D-Arabinofuranosyl)aderiin-Lösung mit 300 &mgr;g/mI wurde mit 8 ml 0,05 M Phosphatpuffer.
pH 7,5 verdünnt.
Zu dieser Losung wurde 1 ml der zu untersuchenden Lösung, enthaltend unterschiedliche Mengen an
(R)-3-(2-Deoxy-/?-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-dIl,3]-diazepin-8-ol zugegeben.
3 ml der oben angegebenen Lösung wurden in eine UV-Zelle aus Quarz gegeben und die Dichte bei 265 nm
gemessen. 0,1 ml Adenosindeaminase-Lösung mit 1 &mgr;g/ml (Typ 1: aus Darmschleimhaut) wurde mit in die Zelle
gegeben, die Lösung gemischt und die optische Dichte bei 265 nm 5 min. später bestimmt.
| ag kristalliner | Optische Dichte | bei &Lgr; 265 nm | Abnahme der |
| Deaminase-Inhibitor | optischen Dichte | ||
| 0 min | 5 min | ||
| Vergleich | 1,433 | i,Ö46 | Ü,387 |
| 0,1 | 1,432 | 1,365 | 0,067 |
| 0,075 | 1,432 | 1,355 | 0,077 |
| 0,05 | 1,441 | 1,355 | 0,086 |
| 0,04 | 1,439 | 1,347 | 0,092 |
| 0,03 | 1,429 | 1,315 | 0,114 |
| 0,02 | 1,438 | 1,291 | 0,148 |
| 0,01 | 1,435 | 1,225 | 0,210 |
i i
Bei der Bestimmung der in der zu untersuchenden Lösung vorhandenen Menge (R)-3-(2-Deoxy-/J-D»erythropentofuranosy!)-3,6,7,8-tetra-hydroimidazo[4,5-dIl,3]diazepin-8-ol
entspricht eine Abnahme der optischen Dichte bei 265 nm um 0,10 ungefähr 0,035 &mgr;g (R)-3-(2-Deoxy-j3-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-dIl,3]diazepin-8-ol.
B. Reinigung im halbtechnischen Maßstab
Die restlichen 23,7 1 des nach der ansatzweisen Adsorption an Kohle erhaltenden Konzentrats (A)1 das oben
. erwähnt ist, wurden mit 31,61 Wasser und 2,9 1 Aceton verdünnt, um eine 5%ige wäßrige Acetonlösung (58,2 1) zu
erhalten und die entstehende Lösung wurde auf einer Säule mit Aktivkohle mit einer Größe von 45,72 · 365,8 cm
aufgebracht. Die Säule war folgendermaßen hergestellt worden.
81,6 kg Aktivkohle und 81,6 kg Diatomeenerde wurden in 581,3 1 5%igem wäßrigen Aceton aufgeschlämmt,
wobei der pH-Wert der Gemisches mit 480 ml 10 &eegr; Natriumhydroxidlösung auf 9 eingestellt wurde. Die Aufschlämmung
wurde in die 45,7-cm-Säule gegeben und die Flüssigkeit aus der Säule abgezogen, bis der Flüssigkeitsspiegel
ungefähr dem oberen Ende der Packung entsprach. Die 58,21 der wäßrigen Acetonlösung: wurden
auf die Säule aufgebracht und die Säule mit 5%igem wäßrigen Aceton entwickelt. Dabei wurde auf die Säule ein
Druck von 0,7 kg/cm2 ausgeübt. Durchflußgeschwindigkeit 450 ml/min. Die Säule wurde mit 445,61 5%igem
wäßrigen Aceton perkuliert und 232,51 10%igem wäßrigen Aceton. Der Deaminaseinhibitor wurde mit
25°/oigem wäßrigen Aceton eluiert und Fraktionen von 181 gesammelt und auf die Aktivität an Deaminase-Inhibitor
untersucht Es wurde auch der Feststoffgehalt jeder Fraktion durch Lyophilisieren von 25 ml Anteilen
bestimmt.9 Fraktionen, umfassen insgesamt ungefähr 1621, enthaltend den Deaminase-Inhibitor, wurden zusammengegeben
und im Vakuum bei weniger als 35°C auf ein Endvolumen von 2,7 1 eingeengt, wobei der pH-Wert
auf 9,0 gehalten wurde. Die erhaltene Gesamtmenge an Feststoffen in dem Konzentrat betrug ungefähr 467 g.
Das oben angegebene Konzentrat (2,7 1) wurde dann über eine Säule mit polymerisiertem Dextran mit kleiner
Porengröße fraktioniert Das vernetzte Dextran (6 kg) war 2 Tage in Wasser gequollen in eine 10,16 cm dicke
Glassäule gegeben und dann mit Wasser gewaschen worden bis der Kohlenhydrattest (Phenol und Schwefelsäure)
negativ war. Die gepackte Säule besaß die folgenden Eigenschaften: Größe der gepackten Säule
10,16 - 187,96 cm: äußeres Volumen 5,21; Fließgeschwindigkeit 2,1 l/h, Zugabe auf die Säule ungefähr 6(X) ml der
2,7 1 des Konzentrats aus der Kohlensäule. Nachdem die aufgegebene Menge durch die Säule hindurchgelaufen
war, wurde die Säule mit Wasser entwickelt. Das innere Volumen wurde in 400-ml-Fraktionen gesammelt, und
die Fraktionen, die den Hauptteil des (R)-3-(2-Deoxy-0-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6.7,8-tetrahydroimidazo[4,5-dI13]diazepin-8-ol
enthielten, wurden zusammengegeben, im Vakuum eingeengt und iyophilisiert. Die
oben angegebene Dextran-Säule wurde weitere dreimal verwendet, um den Rest des Konzentrats aus der
Kohlensäure zu fraktionieren. Die vereinigten Fraktionen, enthaltend das (R)-3-(2-Deoxy-/?-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-dIl,3]diazepin-8-ol
aus jeder der vier Fraktionierungen, wurden zusammengegeben und aus 90°/oigem wäßrigen Methanol umkri-tallisiert. Die Kristalle wurden dreimal umikristallisiert
Man erhielt 8,5 g kristallines (R)-3-(2-Deoxy-/^D-erythro-pentofuranosyI)-3,6,7,8-teirahydroimida-
-dll ,3]diazepin-8-ol.
60
Claims (3)
- Patentansprüche(J^y^ypO
- 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anpntich 1, dadurch gekennzeichnet,daß man den Mikroorganismus Streptomyces antibioticus NRRL 3238 auf bekannte Weise in einem üblichen Nährmedium züchtet und aus der Fermentationsbrühe, nach Abtrennung des 9-{0-D-Arabino-furanosyl)adenins. die gewünschte Verbindung isoliert.
- 3. Arzneimittel, enthaltend die Verbindung nach Anspruch 1, zusammen mit 9-(/?-D-Arabinofuranosyl)adenin.
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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| DE2517596C2 true DE2517596C2 (de) | 1987-05-14 |
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