DE2931792C2

DE2931792C2 -

Info

Publication number: DE2931792C2
Application number: DE2931792A
Authority: DE
Inventors: Hisayoshi Kyoto Jp Okazaki; Tsuneo Kanamaru; Kazuhiko Osaka Jp Ohta
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1978-08-07
Filing date: 1979-08-04
Publication date: 1987-11-12
Also published as: GB2028132A; GB2028132B; FR2433026A1; FR2433026B1; JPS5522650A; DE2954566C2; DE2931792A1; JPS6111206B2; US4260599A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Substanz mit der Bezeichnung P-1894B, die eine Hemmwirkung auf die Protokollagenprolinhydroxylase und die Kollagenbiosynthese sowie andere Eigenschaften aufweist.

Omura et al, The Journal of Antibiotics, Vol. 30, No. 11, S. 908-916 (977) beschreiben die Substanz OS-4742 A₁ (Vineomycin A₁). Diese Substanz ist identisch mit der erfindungsgemäß hergestellten Substanz P-1894B. Die Autoren aus "The Journal of Antibiotics" beschreiben im wesentlichen die morphologischen und physiologischen Eigenschaften der Substanz OS-4742 A₁. Weiterhin werden die Eignung der Substanz OS-4742 als Antibiotikum sowie deren antimikrobiologische Aktivitäten untersucht.

Omura et al geben jedoch keinerlei Hinweis auf eine antifibrotische Wirkung der beschriebenen Substanz. Die Anmelderin fand auch einen neuen Weg zur Herstellung dieser Substanz.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung der Substanz P-1894B=OS-4742 A₁ der Strukturformel

durch Züchten eines Stammes der Gattung Streptomyces in einem Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine verwertbare Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Bedingungen und Isolieren der Substanz aus dem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stamm der Gattung Sreptomyces entweder Streptomyces albogriseolus subsp. IFO 13 881 oder Streptomyces albogriseolus IFO 13 882 züchtet.

Die obige Strukturformel (1) wurde nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Erfindung durch Röntgenstrukturanalyse ermittelt (vgl. Journal of The Chemical Society, Chemical Communications S. 154-155, 4, 1981).

Die Merkmale der beiden erfindungsgemäß eingesetzten Stämme von Mikroorganismen, die nach ähnlichen Methoden untersucht wurden, wie sie in International Journal of Systematic Bacteriology 16, 3 (1966) 313-340 untersucht wurden, sind nachstehend genannt. Falls nicht anders angegeben, handelt es sich um die Kulturmerkmale, die bei der Kultivierung jedes Stammes bei 28°C für 14 Tage beobachtet wurden.

1) Streptomyces albogriseolus subsp. Nr. 1894 IFO 13 881 I) Morphologische Eigenschaften

Die sporentragenden Hyphen sind vom vegetativen Mycel einfach verzweigt. Sporen treten in Ketten von mehr als 10 auf. Die Form der sporentragenden Lufthyphen ist spiralförmig. Sie weisen offene Schleifen, Flexibilis und gelegentlich Haken auf. Windungen wurden nicht beobachtet. Die Sporen sind ellipsoid bis zylindrisch, 0,4 bis 0,6×0,7 bis 1,2 µm. Die Oberfläche der Sporen ist warzig (Saccharose-Nitratagar, Nährboden aus Stärke-anorganisches Salz (ISP-4)), zuweilen mit kurzen Stacheln (Tyrosin-agar (ISP-7), Hefe- Malzagar (ISP 2)) und/oder glatt (Glycerin-Asparagin- Agar (ISP-5)).

II) Kulturmerkmale

Der Wachstumsgrad, die Farben des Luftmycels, der Rückseite, die Farben von löslichen Pigmenten, falls gebildet, und andere Kulturmerkmale auf verschiedenen Medien sind in Tabelle 1 genannt. Der Standard-Farbcode, der bei jeder Angabe der Farbe in Klammern genannt ist, wurde aus dem Color Harmony Manual of Container Corporation of America entnommen.

Tabelle 1

Kulturmerkmale von Streptomyces albogriseolus subsp. Nr. 1894 auf verschiedenen Nährmedien

III) Physiologische Merkmale

a) Temperaturbereich für das Wachstum:
Wachstum auf Maltose-Hefeextrakt-Agar (1% Maltose, 0,4% Hefeextrakt und 2% Agar, pH 7,0) wurde während einer Zeit von 2 Wochen beobachtet. Wie Tabelle 2 zeigt, war der optimale Temperaturbereich für das Wachstum dieses Stammes 28 bis 40°C.

Tabelle 2

b) Verflüssigung von Gelatine (Glucose-Pepton-Gelatine, 28°C, 3 Wochen): positiv, jedoch sehr schwach.
c) Hydrolyse von Stärke (Nährboden aus Stärke und anorganischem Salz, 28°C): positiv.
d) Koagulierung und Peptonisierung von Magermilch (Magermilch, 37°C): Koagulierung positiv, Peptonisierung positiv, jedoch schwach.
e) Reduktion von Nitraten (Peptonwasser mit 1% Kaliumnitrat, 28°C, 3 Wochen). negativ.
f) Bildung von melanoiden Pigmenten: auf Tyrosinagar, Pepton-Hefeextrat-Eisen-Agar (ISP 6) und Tyrosin- Hefebrühe (ISP 1) keine Bildung von melanoiden Pigmenten.

IV) Assimilierung von Kohlenstoffquellen (Pridham-Gotlieb-Agar (ISP 9), 28°C):

Das Kohlenhydrat- Assimilationsspektrum dieses Stammes ist in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

2) Streptomyces albogriseolus Nr. 1953=IFO 13 882 I) Morphologische Merkmale

Die sporentragenden Hyphen waren vom vegetativen Mycel einfach verzweigt. Sporen traten in Ketten von mehr als 10 auf. Die Form der sporentragenden Lufthyphen war spiralig, offene Schleifen, zuweilen Flexibilis und Haken. Windungen wurden nicht beobachtet. Die Sporen waren ellipsoid bis zylindrisch, 0,5 bis 0,8×1,0 bis 1,7 µm. Die Oberfläche der Sporen war warzig oder dornig (Saccharose-Nitrat-Agar, Stärke-anorganisches Salz (ISP-4), Tyrosin-Agar (ISP 7)) und gelegentlich glatt (Glycerin-Asparagin-Agar (ISP 5)).

II) Kulturmerkmale

Die Kulturmerkmale dieses Stammes sind in Tabelle 4 genannt. Die gleichen Farbcodes, die vorstehend genannt wurden, werden verwendet.

Tabelle 4

Kulturmerkmale von Streptomyces albogriseolus Nr. 1953 auf verschiedenen Nährmedien

III) Physiologische Merkmale

a) Temperaturbereich für das Wachstum:
Das Wachstum des Stammes wurde in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben, beobachtet. Wie Tabelle 5 zeigt, ist der optimale Temperaturbereich für das Wachstum 28 bis 40°C.

Tabelle 5

b) Verflüssigung von Gelatine (Glucose-Pepton-Gelatine, 28°C): positiv.
c) Hydrolyse von Stärke (Nährboden aus Stärke und anorganischem Salz, 28°C): positiv.
d) Koagulierung und Peptonisierung von Magermilch (Magermilch, 37°C): Koagulierung positiv, jedoch schwache Koagulierung, Peptonisierung positiv.
e) Reduktion von Nitraten (Peptonwasser mit 1% Kaliumnitrat, 28°C, 3 Wochen): negativ.
f) Bildung von melanoiden Pigmenten:
Tyrosin-Agar: blaßbraunes Pigment;
Pepton-Hefeextrat-Eisen-Agar: negativ
Trypton-Hefebrühe: negativ.

IV) Assimilierung von Kohlenstoffquellen (Pridham-Gotlieb-Agar)

Das Kohlenhydrat-Assimilationsspektrum dieses Stammes ist in Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6

Der P-1894B-Bildner kann unter Verwendung eines flüssigen oder festen Mediums kultiviert werden, jedoch ist es normalerweise zweckmäßig, die Kultivierung in einem flüssigen Medium als Schüttelkultur oder aerob unter Rühren durchzuführen.

Beliebige Nährmedien können verwendet werden, vorausgesetzt lediglich, daß sie sich für das Wachstum von Streptomyces gut eignen und die extrazelluläre Bildung von P-1894B ermöglichen. Beispielsweise kann das Medium als Kohlenstoffquellen Glucose, Lactose, Glycerin, Stärke, Saccharose, Dextrin, Melasse und organische Säuren (z. B. Essigsäure oder Weinsäure) enthalten.

Beispiele von Stickstoffquellen, die im Medium vorhanden sein können, sind Pepton, Casaminosäure, N-Z- Amin A und andere Proteinhydrolysate, Hefeextrakt, Malzextrakt, Sojabohnenkuchen, Maisquellwasser, Aminosäuren (z. B. Asparaginsäure und Glutaminsäure) und verschiedene Ammoniumsalze (z. B. Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid).

Als Anorganische Salze können verschiedene Phosphate (z. B. Mononatriumphosphat und Dikaliumphosphat), Metallsalze, z. B. Magensiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)- sulfat und Schwermetallsalze (z. B. Mangansulfat und Zinksulfat) dem Medium zugesetzt werden. Zur Förderung des Wachstums können ferner Vitamine (z. B. Vitamin B₁ und Calciumpantothenat), mit Nucleinsäure verwandte Verbindungen (z. B. Adenin und Uracil) usw. zugesetzt werden.

In Abhängigkeit vom Kultivierungsverfahren und von den Kultivierungsbedingungen kann es in gewissen Fällen vorteilhaft sein, ein Antischaummittel, z. B. ein Siliconöl, Polypropylenglykolderivate (z. B. Actocol®), Sojabohnenöl usw. zuzusetzen, die sämtlich zu gesteigerter Bildung von P-1894B führen.

Die Kultivierungstemperatur und -zeit, der pH-Wert des Meidums und andere Kultivierungsbedingungen hängen vom jeweiligen Stamm, von der Zusammensetzung des Mediums und anderen Faktoren ab. Die Kultivierungsbedingungen werden zweckmäßig so gewählt, daß die Ausbeute an P-1894B maximal ist. Beispielsweise ist es in vielen Fällen vorteilhaft, den Stamm bei etwa 20 bis 40°C unter aeroben Bedingungen 1 bis 10 Tage zu bebrüten, wobei der pH-Wert des Mediums bei etwa 4 bis 9 gehalten wird.

Zur Isolierung der antifibrotischen Substanz P-1894B aus dem hierbei erhaltenen Kulturmedium können verschiedene Methoden in geeigneter Kombination angewendet werden. Zu diesen Methoden gehören die Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel unter neutralen oder schwach sauren Bedingungen, wobei als Lösungsmittel beispielsweise Äthylacetat, Butylacetat, Chloroform, Butanol, Benzol, Toluol, Diäthyläther, Methylenchlorid oder Methylisobutylketon in Frage kommen, die Adsorptionschromatographie mit Aktivkohle, Kieselgel, Aluminiumoxyd od. dgl., die Gelfiltration an einer Säule des Harzes "Sephadex" und die Ionenaustauschchromatographie an einem Ionenaustauschharz. Mit Hilfe einer geeigneten Kombination dieser Methoden ist es möglich, die gewünschte antifibrotische Substanz P-1894B in Form von Kristallen oder eines kristallinen Pulvers aus dem Kulturmedium zu isolieren.

Die in dieser Weise erhaltene antifibrotische Substanz P-1894B hat die foglenden Eigenschaften:

1) Physikalische und chemische Eigenschaften

a) Schmelzpunkt 165-172°C
b) Elementaranalyse: 62,62±1,0% C, 6,28±0,5% H, 30,06±1,0% O.
P-1894B besteht aus C, H und O. N ist nicht nachgewiesen worden (bestimmt mit dem Perkin-Elmer-Gerät Modell 240).
c) Molekulargewicht etwa 1000 (durch Dampfdruckosmometrie mit Äthylacetat als Lösungsmittel)
d) Spezifische Drehung: = +155°±15° (c=0,419, Methnaol)
e) Farbreaktionen:
- I) Naphthoresorcin-Schwefelsäure:
  positive Reaktion (grünlich-schwarz)
- II) Alkoholisches Magnesiumacetat:
  positive Reaktion (bläulich-violett)
- III) Ninhydrin: negative Reaktion
- IV) Barton′ Reagens: negative Reaktion
f) Löslichkeit: Leicht löslich oder löslich in Chloroform, Dioxan, Äthylacetat, Dimethylsulfoxid, Aceton, Methyläthylketon, Pyridin, Methanol, Äthanol, Benzol, Toluol, Diäthyläther und 0,1n-NaOH, schwerlöslich oder unlöslich in Petroläther, n-Hexan und Cyclohexan.
g) Absorption im UV-Bereich und sichtbaren Bereich des Spektrums: Fig. 1 zeigt die Absorptionen der antifibrotischen Substanz P-1894B im UV-Bereich und sichtbaren Bereich des Spektrums.
Im Diagramm stellt die ausgezogene Kurve das in 90%igem wäßrigem Methanol aufgenommene Spektrum, die gestrichelte Kurve das in 0,1n-HCl-90% wäßrigem Methanol aufgenommene Spektrum und die strichpunktierte Linie das in 0,1n-NaOH-90% wäßrigem Methanol aufgenommene Spektrum dar. Die Wellenlängen (nm) und die E-Werte, die Absorptionsmaxima unmittelbar nach der Auflösung in verschiedenen Lösungsmitteln ergeben, sind nachstehend genannt. LösungsmitelWellenlänge (E) 90%iges wäßriges Methanol218±2 (432±40), 318±2 (59±6), 440±2 (71±7) 0,1n-HCl-90%iges wäßriges Methanol218±2 (427±40), 318±2 (62±6), 435±2 (70±7) 0,1n-NaOH-90%iges wäßriges Methanol228±2 (297±30), 282±2 (144±14), 530±2 (77±8)
h) Infrarot-Absorptionsspektrum: Fig. 2 zeigt die Absorptionen von P-1894B im Infrarotbereich des Spektrums (KBr). Die folgenden Hauptwellenzahlen ergeben Absorptionsmaxima:
3430, 2980, 2950, 1740, 1705, 1645, 1570, 1440, 1380, 1290, 1120, 1100, 1080, 1040, 1010, 970 cm^-1
i) Allgemeine Eigenschaften und Aussehen:
Schwach sauer; Kristalle orangegelb bis orangerot
j) pKa: 10,15 (durch Titrimetrie, in 66,7%igem wäßrigem DMF)
k) NMR: Das in Deutero-Chloroform bei 90 MHz aufgenommene NMR-Spektrum ist in Fig. 3 dargestellt.
l) Dünnschichtchromatographie, Rf-Werte: Die Rf-Werte auf Kieselgelplatte (Merck, Produkt Nr. 5715) sind nachstehend genannt.

LösungsmittelRf

Wasser0 Chloroform0,01 Chloroform-Aceton (10 : 1)0,21 Chloroform-Äthylacetat (2 : 3)0,50 Chloroform-Äthylacetat (1 : 1)0,32 Mit Wasser gesättigtes Butylacetat0,40 Aceton-n-Hexan (1 : 1)0,70 Benzol-Methanol (10 : 1)0,56 n-Butanol-Essigsäure-H₂O (3 : 1 : 1)0,80 Äthylacetat0,83 Chloroform-Methanol (10 : 1)0,96 Aceton0,97

Ein Vergleich von P-1894B mit den vorstehend genannten physikalischen und chemischen Eigenschaften mit den bekannten beschriebenen Substanzen ergbit, daß P-1894B dem Aquayamycin, Ayamycin A₂, TA-435A und Julymycin B-II ähnlich ist. P-1894B unterscheidet sich jedoch von Aquayamycin im Schmelzpunkt, Molekulargewicht und Verhalten in der Dünnschichtchromatographie (Rf) (J. Antibiotics 21, Nr. 2 (1968) 91-97). Es unterscheidet sich von Ayamycin A₂ im Schmelzpunkt, und in der spezifischen Drehung (J. Antibiotics, Ser. A, 13, Nr. 5 (1960) 321-326), von TA-435A im Verhalten bei der Dünnschichtchromatographie (Rf) (J. Antibiotics 21, Nr. 2 (1968) 91-97) und von Julymycin B-II im Molekulargewicht, in der spezifischen Drehung, im UV-Spektrum und Verhalten bei der Dünnschichtchromatographie (RF) (J. Antibiotics, Ser. A, 17, Nr. 4 (1964) 156-160 und J. Antibiotics 21, Nr. 2 (1968) 91-97).

2) Biologische Eigenschaften I) Hemmwirkung auf die Protokollagenprolinhydroxylase

Die Bestimmung der Hemmwirkung wurde nach der Methode von R. E. Rhoads und Mitarbeitern (Methods in Enzymology XVIIB (1979) 306) unter Verwendung eines teilweise gereinigten Enzympräparats, das aus Hühnerembryos nach der Methode von K. I. Kivirriko und Mitarbeitern und J. Halme und Mitarbeitern (J. Biol. Chem. 242 (1967) 4007 und Biochim. Biophys. Acta 198 (1967) 460) erhalten worden war, und von (Pro-Pro-Gly)₅ · 4 H₂O als Substrat durchgeführt. Die Bestimmung ergab, daß die Konzentration von P-1894B, die für eine 50%ige Hemmung von 100 µg (als Protein) des teilweise gereinigten Enzyms erforderlich war, etwa 7 µg/ ml betrug.

II) Hemmwirkung auf die Biosynthese von Kollagen

Grundlegend nach der von R. A. Salvador und Mitarbeitern beschriebenen Methode (Arch. Biochem. Biophys. 174 (1976) 382) wurden 0,3 mg/kg Sprague-Dawley-Ratten (weiblich, 3 Wochen alt) intraperitoneal einmal täglich für eine Dauer von 6 Tagen verabreicht. Die Mengen von Kollagen und nicht-kollagenen Proteinen in den Uteri wurden mit den Zahlen für Kontrolltiere verglichen. Wie die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen, hemmte P-1894B die Biosynthese von Kollagen spezifisch und stark.

Tabelle 7

III) Wirkung von P-1894B auf die Biosynthese von Kollagen bei mit Tetrachlorkohlenstoff ausgelöster Leberzirrhose

Weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von etwa 110 g wurden in 4 Gruppen eingeteilt. Die Gruppe I (Kontrolle) erhielt Kochsalzlösung (1 ml/Ratte), während die Gruppen II, III und IV ein Gemsich von 10% CCl₄ und Olivenöl (1 ml/Ratte) zweimal wöchentlich in insgesamt 8 Dosen intraperitoneal erhielten. Die Gruppen III und IV erhielten 4 Wochen P-1894B oral mit dem Futter. Die durchschnittliche Dosis von P-1894B betrug bei der Gruppe III 3,25 und bei der Gruppe IV 6,16 mg/kg pro Tag. Die Ratten wurden einen Tag nach der letzten Injektion getötet. Die Leber wurde für die Bestimmungen unmittelbar entnommen.

Bestimmung der Protokollagenprolinhydroxylase-Aktivität

Ein 10%iges Homogenat der Leber wurde in 20 mMol Tris- HCl-Puffer, pH 7,5, der 0,2 Mol NaCl, 0,1 Mol Glycin, 5×10^-5 Mol 1,4-Dithiothreitol und 0,1% Polyäthylenglykol- p-Isooctylphenyläther (Triton®X-100) enthielt, unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators hergestellt. Das Homogenat wurde 20 Minuten bie 15 000 g zentrifugiert. Am klaren Überstand wurde die Prolinhydroxylaseaktivität nach der Methode von Hutton und Mitarbeitern (Anal. Biochem. 16 (1966) 384-394) bestimmt. Der Proteingehalt des Homogenats wurde nach der Methode von Lowry und Mitarbeitern (J. Biol. Chem. 193 (1951) 265-275) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard ermittelt.

Bestimmung des Hydroxyprolingehalts

Der Hydroxyprolingehalt der Leber wurde in einem 6n-HCl- Hydrolysat (110°C, 22 Stunden) nach der Methode von Blumenkrantz und Mitarbeitern (Anal. Biochem. 63 (1975) 331-340) bestimmt.

Die Ergebnisse in Tabelle 8 zeigen, daß nach der Behandlung mit P-1894B (6,16 mg/kg pro Tag, p.o.) die spezifische Aktivität der Protokollagenprolinhydroxylase und der Hydroxyprolingehalt in der Leber im Vergleich zu der Leber von mit CCl₄ fibrotisch gemachten Ratten, die kein P-1894B erhalten hatten, stark reduziert waren.

Tabelle 8

Einfluß von P-1894B auf die Protokollagenprolinhydroxylase-Aktivität und den Hydroxyprolingehalt der Leber

IV) Akute Toxizität: LD₅₀, 50∼100 mg/kg (Maus, intraperitoneal)

Wie bereits erwähnt, ist P-1894B eine Substanz mit Hemmwirkung auf die Protokollagenprolinhydroxylase und selektiver Hemmwirkung auf die Biosynthese von Kollagen und daher wertvoll beispielsweise als biochemisches Reagenz oder Inhibitor der Gewebefibrose bei Warmblütern.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen bevorzgute Ausführungsformen der Erfindung.

Beispiel 1

Streptomyces albogriseolus subsp. Nr. 1894 (IFO 13 881) wurde zum Beimpfen von zwei 2-Liter Sakaguchikolben verwendet, die je 500 ml eines flüssigen Nährmediums (pH 7,0) der folgenden Zusammensetzung enthielten: 2,0% Clucose, 1,0% Glycerin, 0,5% rohes Sojabohnenmehl, 0,5% Maisquellwasser, 0,3% Polypepton, 0,3% Natriumchlorid und 0,5% Calciumcarbonat. Die beimpften Kolben wurden auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung 3 Tage bei 28°C bebrütet, wobei etwa 1 l Kultur erhatlen wurde. Diese Kultur wurde in einen 50-l-Fermenter überführt, der 30 l des Nährmediums der gleichen Zusammensetzung enthielt, worauf 3 Tage bei 28°C unter Belüftung und Rühren bebrütet wurde. Die erhaltene Kultur in einer Menge von 15 l wurde weiter in einen 200-l-Fermenter überführt, der 100 l eines flüssigen Nährmediums (pH 7,0) der folgenden Zusammensetzung enthielt: 5% Dextrin, 3% rohes Sojabohnenmehl, 0,7% Polypepton, 0,05% Eisen(II)-sulfat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,05% Mangansulfat, 0,05% Dikaliumphosphat und 0,5% Calciumcarbonat. Das Medium wurde unter Belüftung und Rühren 2 Tage bei 28°C bebrütet. Zu etwa 80 l des erhaltenen Kulturmediums wurden 2 kg Topco-Perlite® Nr. 34 gegeben. Das Gemisch wurde mit einer Filterpresse, die mit 6 kg des Filterhilfsmittels Hyflo Super-Cel® beschichtet war, filtriert, wobei etwa 70 l Filtrat erhalten wurden. Das Filtrat wurde mit Schwefelsäure auf pH 3,0 eingestellt und zweimal mit 25 l Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und zweimal mit 15 l Wasser gewaschen. Der gewaschene Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei etwa 150 ml Konzentrat erhalten wurden. Das Konzentrat wurde mit etwa 50 ml Chloroform verdünnt und durch eine Kieselsäuresäule (Merck) (4×32 cm) geleitet. Die Elution wurde mit 2 l Chloroform vorgenommen. Die P-1894B-Fraktionen wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck eingeengt. Anschließend wurden 500 ml n-Hexan zu etwa 50 ml Konzentrat gegeben, wobei die aktive Substanz als Öl ausgefällt wurde. Die ölige Fraktion wurde in einer geringen Menge Äthylacetat gelöst und durch eine mit n-Hexan behandelte Säule (4×40 cm) einer Kieselsäure geleitet. Die mit 2 l n-Hexan-Chloroform (1 : 1) austretende Fraktion wurde verworfen. Die P-1894B-Fraktion wurde mit Chloroform-Äthylacetat (1 : 1) eluiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das trockene Konzentrat wurde in einer geringen Menge Chloroform gelöst und durch eine Säule (3,5×31 cm) einer mit Chloroform vorbehandelten Kieselsäure geleitet. Die mit 1,2 l Chloroform austretende Fraktion wurde verworfen. Die mit Chloroform-Äthylacetat (1 : 1) eluierten P-1894B- Fraktionen wurden zusammengegossen (etwa 600 ml) und unter vermindertem Druck eingeengt. zu 50 ml Konzentrat wurden 300 ml n-Hexan gegeben, wobei 1,15 g P-1894B als rohes Pulver ausgefällt wurden. Dieses rohe Pulver wurde in Chloroform-Toluol (1 : 1) gelöst. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck eingeengt und gekühlt. Hierbei wurden etwa 920 mg gelb-orangefarbene rohe Kristalle erhalten. Die rohen Kristalle wurden aus Diäthylätherlösung umkristallisiert, wobei etwa 660 mg P-1894B als orange-gelbe Kristalle gewonnen wurden.

Beispiel 2

Streptomyces albogriseolus subsp. Nr. 1894 (IFO 13 881) wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise kultiviert. Etwa 80 l des erhaltenen Kulturmediums wurden in einer Sharples-Zentrifuge zentrifugiert, um die Zellen und andere Feststoffe zu entfernen. Etwa 70 l (pH 8,3) des erhaltenen Überstandes wurden zweimal mit je 25 l Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden zusammengegossen und zweimal mit 10 l wäßriger Salzsäure (pH 3,0) und zweimal mit 15 l Wasser extrahiert. Der gewaschene Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Zu 80 ml Konzentrat wurden 500 ml n-Hexan gegeben, wobei die aktive Substanz als Öl ausgefällt wurde. Die Fällung wurde isoliert, in einer geringen Menge Chloroform gelöst und durch eine Säule (3,5×31 cm) einer mit Chloroform vorbehandelten Kieselsäure geleitet. Die mit 1 l Chloroform austretende Fraktion wrude verworfen und die Säule mit Chloroform- Äthylacetat (1 : 1) weiter eluiert. Die P-1894B-Fraktionen wurden zusammengegossen (500 ml), unter vermindertem Druck eingeengt und in der vorstehend beschriebenen Weise erneut chromatographiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegeben, wobei 300 mg trockenes Pulver erhalten wurden. Das Pulver wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise umkristallisiert, wobei 80 mg P-1894B in Form von orange-gelben Kristallen erhalten wurden.

Beispiel 3

Streptomyces albogriseolus Nr. 1953 wurde zur Beimpfung von zwei 2-l-Sakaguchikolben verwendet, die 300 ml eines flüssigen Nährmediums (pH 7,0) der folgenden Zusammensetzung enthielten: 2% Glucose, 1% Glycerin, 0,5% rohes Sojabohnenmehl, 0,5% Maisquellwasser, 0,3% Polypepton, 0,3% Natriumchlorid und 0,5% Calciumcarbonat. Jeder beimpfte Kolben wurde auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung 3 Tage bei 28°C bebrütet, wobei 1 l Kulturmedium erhalten wurde. Diese Kultur wurde in einen 50-l-Fermenter überführt, der 30 l eines flüssigen Mediums (pH 7,2) der foglenden Zusammensetzung enthielt: 5% Dextrin, 3% rohes Sojabohnenmehl, 0,5% Polypepton, 0,001% Eisen(II)-sulfat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,001% Mangansulfat, 0,05% Dikaliumphosphat und 0,5% Calciumcarboant. Die Kultivierung wurde 3 Tage bei 28°C unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Etwa 26 l des erhaltenen Kulturmediums wurden mit einer Filterpresse filtriert. Das Filtrat wurde mit Salzsäure auf pH 3,0 eingestellt und zweimal mit je 10 l Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und mit 10 l Wasser gewaschen. Der gewaschene Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt, und 50 ml des Konzentrats wurden durch eine Säule (3×43 cm) von 130 g Kieselsäure geleitet.

Die Elution wurde mit Äthylacetat durchgeführt. Das aktive Eluat in einer Menge von 750 ml wurde unter vermindertem Druck eingeengt. 30 ml Konzentrat wurden durch eine Säule (3×36 cm) von 110 g Kieselsäure geleitet. Die mit 400 ml Chloroform austretende, die Verunreinigungen enthaltende Fraktion wurde verworfen. Die aktive Verbindung wurde dann mit Chloroform-Äthylacetat (4 : 1) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen und zur Trockene eingedampft. Das Konzentrat wurde in einer geringen Menge Chloroform gelöst und in der gleichen Weise wie bei der zweiten Chromatographie erneut chromatographiert. Die hierbei erhaltenen aktiven Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt und mit n-Hexan verdünnt, wobei etwa 210 mg eines rohen Pulvers ausgefällt wurden. Das Pulver wurde aus Toluol umkristallisiert. Hierbei wurden 100 mg P-1894B in Form von orangeroten Kristallen erhalten.

Claims

Verfahren zur Herstellung der Substanz P-1894B=OS-4742A₁ der Strukturformel durch Züchten eines Stammes der Gattung Streptomyces in einem Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine verwertbare Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Bedingungen und Isolieren der Substanz aus dem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stamm der Gattung Streptomyces entweder Streptomyces albogriseolus subsp. IFO 13 881 oder Streptomyces albogriseolus IFO 13 882 züchtet.