DK151396B - Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af cholesterin - Google Patents

Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af cholesterin Download PDF

Info

Publication number
DK151396B
DK151396B DK172374AA DK172374A DK151396B DK 151396 B DK151396 B DK 151396B DK 172374A A DK172374A A DK 172374AA DK 172374 A DK172374 A DK 172374A DK 151396 B DK151396 B DK 151396B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
cholesterol
esterase
determination
cholesterin
bound
Prior art date
Application number
DK172374AA
Other languages
English (en)
Other versions
DK151396C (da
Inventor
Klaus Beaucamp
Hans Mollering
Gunter Lang
Wolfgang Gruber
Peter Roeschlau
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of DK151396B publication Critical patent/DK151396B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK151396C publication Critical patent/DK151396C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/827—Actinoplanes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces
    • Y10S435/893—Streptomyces chartreusis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/913—Aspergillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/921—Candida
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/921—Candida
    • Y10S435/922—Candida albicans
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/933—Penicillium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

151596 i
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af cholesterin og specielt af det samlede cholesterin-indhold eller af det bundne cholesterinindhold.
_ Cholesterin foreligger i biologisk materiale, som f.eks. serum og 5 lignende, delvis i fri form, delvis i bundet form som ester. Til bestemmelse af det bundne cholesterin eller den samlede cholesterin-mængde er det nødvendigt først at frigøre det i bundet form foreliggende cholesterin. Dette skete hidtil ved forsæbning under alkaliske 1Q betingelser, f.eks. med alkoholisk kalilud. Efter forsæbningen kan det frigjorte cholesterin derpå blive bestemt efter en af de kendte metoder, enten kemisk eller enzymatisk. Den kemiske bestemmelse kan f.eks. ske ifølge Liebermann-Burchard-metoden, den enzymatiske bestemmelse kan ske ved hjælp af cholesterinoxydase, cholesterindehy= drogenase eller cholesterindehydrase. Da som bekendt de enkelte cholesterinestere og også det frie cholesterin ved de kemiske bestemmelsesmetoder har forskellige ekstinktionskoefficienter,er det nødvendigt ved hjælp af alkalisk hydrolyse at omdanne chole-sterinesteren til frit cholesterin.
20 I hvert tilfælde er imidlertid den alkaliske forsæbning af det bundne cholesterin et forstyrrende og tidsrøvende fremgangsmådetrin. Hertil kommer, at de anvendte forholdsvis aggressive reagenser kan føre til en nedbrydning af cholesterinet. kor at forhindre en sådan nedbrydning og dermed en forfalskning af analyseresultaterne skal 2 5 der hydrolyseres under forholdsvis milde betingelser, hvilket igen uønsket forøger den tid, der er nødvendig til bestemmelsen.
Særlig uheldig er den alkaliske frigørelse af cholesterinet, når bestemmelsen af cholesterin derefter skal ske ifølge de foretrukne 30 enzymatiske metoder. Da enzymerne som bekendt bliver inaktiveret i stærkt alkalisk medium, skal hydrolysatet bringes på en pH-værdi på 5-8 ved tilsætning af syre, før den enzymatiske bestemmelse kan påbegyndes. Alt dette fører til, at bestemmelsen af den samlede cho= lesterinmængde eller den bundne cholesterinmængde stadig tager uøn-35 sket lang tid, og er for arbejdskrævende.
Eormålet med opfindelsen er derfor at angive en fremgangsmåde til bestemmelse af det samlede cholesterinindhold eller indholdet af bundet cholesterin, som fjerner de ovennævnte ulemper.
___ 151396 2
Dette lykkes ifølge opfindelsen ved en fremgangsmåde til bestemmelse af det samlede cholesterinindhold eller det bundne cholesterinindhold ved frigørelse af det bundne cholesterin-5 indhold og efterfølgende bestemmelse af det frigjorte cholesterinindhold ifølge kendte metoder, hvilken udmærker sig derved, at det bundne cholesterin bliver frigjort med en chole-sterinesterase af mikroorganismer.
Det har nu vist sig, at der med cholesterinesterase kan gen- 10 nemføres en hurtig og kvantitativ frigørelse af det bundne cholesterin. Denne fremgangsmåde er ganske særlig fordelagtig, når også den tilsluttende bestemmelse af det frigjorte cholesterin sker enzymatisk, f.eks. med cholesterinoxydase eller med cholesterindehydrase. I dette tilfælde muliggør fremgangs-15 måden ifølge opfindelsen den fuldstændige enzymatiske bestemmelse af cho1 ester i net og dermed en afgørende forbedring af den medicinske rutinediagnostik samt en let tilpasning af fremgangsmåden til gennemførelsen i analyseautomater. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Det var ganske vist allerede kendt, at der i Pankreas, lever 2 og i Nocardia restrictus forekommer en cholesterinesteraseak- 3 tivitet. Heraf kunne det dog ikke sluttes, at sådanne enzymer 4 skulle egne sig til en hurtig fu1dstænd i g spaltning af cho 1 - 5 esterinestere indenfor rammerne af en kvantitativ analyseme- 6 tode, thi de konstaterede spaltningsgrader var ikke kvantita 7 tive, men opnåede kun maksimalt 80% (Biochimica et Biophysica 8
Acta, 270 (1972) 156-166). Yderligere foreligger bundet chole 9 sterin i biologisk materiale, i form af estere af meget fors 10 kellige syrer. Til en anvendelighed indenfor rammerne af en 11 analysemetode er det en forudsætning, at alle forekommende 12 estere med omtrent samme hastighed og med samme pålidelighed 13 bliver spaltet kvantitativt. På grund af disse enzymers kendte 14 egenskaber er det overraskende, at cholesterinesteraserne er i 15 stand til kvantitativt at spalte samtlige forekommende chol- 16 esterinestere i løbet af meget kort tid. Dette er også særlig overraskende, fordi det var kendt, at der ved de kendte chol-esterinesteraser eksisterede betydelige forskelle med hensyn til aktiviteten overfor forskellige cholesterinestere.
3 151396
Det har vist sig, at cholesterinesteraser fra mikroorganismer er særligt egnede til fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Med hensyn til spaltningshastighed og aktivitet overfor forskel-g lige cho1 ester i nestere viste de sig at være overlegne i forhold til cholesterinesteraser fra andre oprindelser og foretrækkes derfor i forbindelse med den foreliggende opfindelse.
Det har yderligere vist sig, at forskellige mikroorganismer indeholder særligt aktive cholesterinesteraser, og derfor indenfor rammerne af den foreliggende fremgangsmåde ifølge opfindelsen kan anvendes direkte uden separering og rensning af cholesterinesteraserne. Dette har foruden den særlig simple tilgængelighed også den fordel, at ved undladelsen af enhver separering og berigelse af cholesterinesterasen undgår man den 15 fare,at meget vanskeliggøre en kvantitativ bestemmelse af alt bundet cholesterin, ved at man undgår at separere den i praksis foreliggende blanding af cholesterinesteraser, der er specifikke overfor forskellige cho1 ester i nestere. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Hertil kommer yderligere, at rensningen af størstedelen i lipoid- 2 membraner bundne cholesterinesteraser er omstændelig, og derfor 3 fører til et præparat, som på grund af sin pris er mindre velegnet 4 til en rutinediagnostik end et uden enhver enzymrensning anvendeligt 5 mikroorganismepræparat.
6 7 Særligt fordelagtige resultater opnås ved fremgangsmåden ifølge op 8 findelsen under anvendelsen af en cholesterinesterase af Candida 9
rugosa (også betegnet som Cylindracea) AICC 14830 henholdsvis WS
10 90031 og af Aspergillus spec. WS 90030. Disse to mikroorganismer 11 , , 12 kan indenfor den foreliggende opfindelses rammer anvendes direkte 13 som sådanne eller i oplukket form, f.eks. som acetontørpulver, ligeså er imidlertid naturligvis også anvendelsen af et beriget cho= 14 lesterinesterasepræparat af disse mikroorganismer mulig, hvorhos 15 en særlig fordel består i, at en vis berigelse her kan opnås meget 16 simpelt. Den nævnte Candida rugosa udgør en i stor teknisk målestok produceret mikroorganisme, som er i handelen. Den sædvanlige handelsform er et med lactose stabiliseret acetontørpulver, som har vist sig særlig fordelagtigt til opfindelsen.
4 151396
Som allerede nævnt består en særlig vigtig fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen deri, at der muliggøres en fuldstændig enzymatisk bestemmelse af det samlede cholesterinindhold. Herved er det af betydning, at der med de foretrukne cholesterinestera-5 sepræparater af mikroorganismer er mulighed for en hurtig og kvantitativ frigørelse af cholesterinet af dets estere. Specielt med de ovennævnte foretrukne mikroorganismer er det muligt ved direkte tilsætning heraf i en meget ringe mængde og under bibeholdelse af pH-værdi- og temperaturbetingelserne, som de ønskes ved den efter-10 følgende enzymatiske cholesterinbestemmelse,i løbet af nogle få minutter at opnå en kvantitativ frigørelse af cholesterinet. Derved blev det konstateret, at de sædvanlige stabiliseringsmidler på carbchydratbasis, som bliver anvendt til sådanne mikroorganismer, ikke indenfor rammerne af den fuldt enzymatiske fremgangsmåde 15 forstyrrer cholesterinbestemmelsen.
Som nævnt kan der til fremgangsmåden ifølge opfindelsen også anvendes en separeret og beriget cholesterinesterase. En egnet berigelse kan opnås ved, at man går ud fra et acetontørpul ver af en mikroorganisme og underkaster dette en dialyse, en behandling med svag-basisk anionbytter og en ammoniumsulfatfrak-tionering. På denne måde lykkes let en 20 til 30 gange berigelse af cholester i nesterasen. Som svagt basisk anionbytter viser det sig, at et med diethylaminoethanolgrupper modifice-25 e ret præparat pa carbchydratbasis er særlig egnet. Ved ammoni-umsu1fatfrakt ioner i ngen udvindes fortrinsvis fraktionen mellem 1,3 og 2,4 mol ammoniumsulfat. Den således opnåede enzymfraktion bliver derpå fortrinsvis kromatograferet på det nævnte byttermateriale.
30 Særligt gode resultater opnås indenfor opfindelsens rammer med mikroorganismer, som blev dyrket på et cholesterinesterholdigt næringsmedium. Herved kan cholesteri nesteren eller en cholester i nesterbl andi ng anvendes som eneste carbonkilde under 35 dyrkningen, eller der kan samtidig anvendes en anden carbonkilde. Særligt foretrækkes anvendelsen af mikrooranismer, som blev fremstillet ved en flertrins dyrkningsmetode, hvor mi-kroorgan i smerne i det første trin blev dyrket på et egnet car- 5 151396 bonleverende stof som glycerol, og i det andet trin på en cholesterinester. En egnet dyrkningsmetode er f.eks. beskrevet i de offentliggjorte tyske beskrivelser nr. 2.224.133 og 2.307.518 .
5
Den ifølge opfindelsen foretrukne anvendte cholesterinesterase af Candida rugosa AICC 14830 udviser en meget god stabilitet i det svagt sure område mellem pH-værdi 3 og 6,5. Enzymets pH-optimum ligger ved 7,5. Enzymet er ejendommeligt derved, at der sker et sær-ligt godt forløb af den katalytiske reaktion ved relativt højt saltindhold i reaktionsmediet. Der arbejdes derfor fortrinsvis i en 0,5-0,8 M, fortrinsvis 0,4-0,6 M pufferopløsning. pH-værdien kan ligge i intervallet fra 4,5 til 7,5, fortrinsvis i det ovennævnte interval fra pH 5 til 6,5. Cholesterinesterasens virkning bliver fortrinsvis forøget ved tilsætning af overfladeaktive stofier. En tilsætning af hydroxypolyethoxydodeean foretrækkes specielt.
Som allerede nævnt foretrækkes det specielt at gennemføre fremgangs·»· måden ifølge opfindelsen fuldstændigt enzymatisk, d.v.s. den til-20 sluttende cholesterinbestemmelse sker ligeledes enzymatisk, fortrinsvis under anvendelse af cholesterinoxydase. Der kan dog også anvendes cholesterindehydrase eller cholesterindehydrogenase.
Bestemmelsen med cholesterinoxydase er f.eks. beskrevet i den of-25 fentliggjorte tyske beskrivelse nr. 2.224.132. Den der beskrevne fremgangsmåde kan fordelagtigt kombineres med fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Principielt kan der herved måles oxygenforbruget, H202-dannelsen eller cholestenondannelsen. 1 2 3 4 5 6
Bestemmelsen af oxygenforbruget kan f.eks. ske gaskromatografisk, 2 polarometrisk eller ifølge polarisationsmetoden. Disse bestemmel 3 sesmetoder er i og for sig kendte metoder. Dannet hydrogenperoxid 4 kan bestemmes titremetrisk, potentiometrisk, polarografisk og 5 colorimetrisk samt enzymatisk. Den enzymatiske bestemmelse under 6 anvendelse af katalase eller peroxydase, specielt bestemmelsen ved hjælp af katalase i nærværelse af β-diketoner, som acetylaceton, lavere alkoholer og ammoniumionholdig puffer eller bestemmelsen ved hjælp af peroxydase i nærværelse af en chromogen som 2,2,-amino= benzthiazolinsulfonsvre, foretrækkes. Cholestenon bestemmes ved 6 151396 hjælp af ketoreagenser, f.eks. 2,4-dinitrophenylhydrazin eller photometrisk ved 240 nm.
5 Såfremt den fuldstændig enzymatiske bestemmelse af den samlede eller bundne cholesterinmængde sker med cholesterinoxydase anvendes der fortrinsvis en sådan af Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica AHCC 14811 eller Proacti= nomyces erythropolis NCIB 9158.
10
Den foreliggende opfindelse angår yderligere et reagens til bestemmelse af cholesterin, bestående af cholesterinesterase af mikrobiologisk oprindelse, og et system til bestemmelse af frit cholesterin. Et reagens af denne art består fortrinsvis 15 af en cholesterinesterase af mikrobiologisk oprindelse, cholesterinoxydase, et system til bestemmelse af H2O2 eller et system til bestemmelse af cholestenon. Herved foretrækkes ganske særligt et reagens, ved hvilket der som cholesterinesterase bliver anvendt en cholesterinesterase fremstillet af en af de 20 yderligere ovennævnte mikroorganismer, specielt i form af et acetontørpulver eller en deraf opnået proteinfraktion med cholester i nes ter aseakt i vi tet .
De ovennævnte foretrukne reagenskombinationer kan foruden de an-25 førte obligate bestanddele yderligere indeholde sædvanlige opløsningsmidler, stabilisatorer eller/og overfladeaktive stoffer. Alle disse tilsætningsstoffer kendes af fagfolk og er sædvanlige ved systemer til påvisning af hydrogenperoxid henholdsvis cholestenon.
Med fremgangsmåden og reagenset ifølge opfindelsen kan der 30 gennemføres en overordentlig hurtig og fuldsæntig spaltning af bundet cholesterin. F.eks. bliver under betingelserne til cholester i nbestemme 1 se med cholesterinoxydase ifølge opfindelsen opnået en kvantitativ spaltning af bundet cholesterin i løbet af 1 til 3 minutter ved en tilsætning af Candida rugosa ATCC 14830 eller Aspergillus sp. WS 90030 acetontørpulver i en mængde mellem 0,1 og 0,3 mg.
De følgende eksempler belyser opfindelsen yderligere.
7 151396
Eksempel 1.
Under anvendelse af den i eksempel 1 i den offentliggjorte tyske beskrivelse nr. 2.224.132 beskrevne fremgangsmåde bestemmes det frie cholesterinindhold i serum til 63 mg% (63 mg i 100 ml). Til
bestemmelse af bundet cholesterin blev en sammenligningsprøve af 5 O
serummet behandlet i 30 minutter med alkoholisk kalilud ved 70 C.
Efter neutralisation og fornyet måling af det for hånden værende cholesterin blev der konstateret et samlet indhold på 181 mg$ cholesterin. Heraf fremgår det, at der forelå 118 mg cholesterin/ 100 ml i bundet form.
Fremgangsmåden blev gentaget med ubehandlet serum, dog blev der ved bestemmelsens påbegyndelse tilsat 0,3 mg (beregnet på proteinet) Candida rugosa ATCC 14830-acetontørpulver i form af et sædvanligt handelsprodukt. Efter 3 minutters forløb viste den polaro- 15 grafiske bestemmelse et samlet cholesterinindhold på 183 mg$. Eksempel 2.
2o Til berigelse af cholesterinesteraseaktiviteten blev et handelsprodukt af acetontørpulver af Candida rugosa ATCC 14830 opløst i kaliumphosphatpuffer pH-værdi 6,0 og dialyseret mod den samme puffer. Efter fjernelsen af det som stabiliseringsmiddel indgående lactose var der en specifik cholesterinesteraseaktivitet på 0,3 U/ 25 mg protein i den dialyserede opløsning.
Den således opnåede opløsning blev rørt sammen med en med diethyl= aminoethanolgrupper modificeret ionbytter på dextranbasis, ionbytteren blev separeret fra og der blev elueret med 0,2 M phosphatpuf-30 fer, pH-værdi 6,0. Eluatet udviste en specifik cholesterinesteraseaktivitet på 1,2 U/mg.
Den således opnåede opløsning blev underkastet en ammoniumsulfat-fraktionering. Den mellem 1,8 og 2,4 M ammoniumsulfatudfældende 35 proteinfraktion blev skilt fra. Den udviser en specifik cholesterin= esteraseaktivitet på 2,5 U/mg.
Det resulterende produkt blev påny opløst i phosphatpuffer, pH-vær-di 6,0, dialyseret mod den samme puffer indtil saltfrihed, og derpå 151396 δ pH-værdi 6,0. I fraktionen med cholesterinesteraseaktivitet viste der sig en specifik aktivitet på 7 U/mg protein.
Det således opnåede berigede cholesterinesterasepræparat blev som beskrevet i eksempel 1 anvendt ved cholesterinbestemmelsen. Den an-5 vendte mængde udgjorde dog kun dog 0,001 mg, beregnet på proteinet. Resultatet svarede til eksempel 1.
Cholesterinesterasen af Candida rugosa kan blive renset yderligere ifølge de sædvanlige metoder til finrensning af enzymer. I stedet for de ovennævnte berigelsestrin kan der også anvendes andre sædvanlige biokemiske rensningstrin, som f.eks. fældning eller fraktionering med polyethylenimin, organiske opløsningsmidler eller salte, kromatografi over molekylsimaterialer eller svage anionbyttere med andre funktionelle grupper end diethylaminoethanolgrupper, protamin= 15 sulfatfældning og lignende.
Eksempel 3.
Til 0,5 ml serum henholdsvis cholesterin-standard blev der tilsat 20 1,0 ml 0,5 M kaliumphosphatpuffer, pH-værdi 7,5, som indeholdt 0,4$ hydro^polyethoxydodecan, og 2,5 U cholesterinesterase ifølge eksempel 2. Denne reaktionsblanding blev inkuberet i 40 minutter ved 37°C. Derpå blev 0,25 ml af denne opløsning tilsat til 3 25 ml cholesterinreagens, som indeholdt 2 dele eddikesyre, 3 dele eddikesyreanhydrid og 1 del svovlsyre (Iiebermann-Burchardt-rea-gens).
Under anvendelse af en standard som referencestørrelse blev der 30 for en typisk prøve fundet en samlet cholesterinmængde på 170 mg$. Sammenligningsbestemmelsen ved forsæbning af cholesterinesteren med alkoholisk kalilud gav 165 mg$.
Eksempel 4.
35 0,02 ml serum behandles med 10 ml 0,5 M kaliumphosphatpuffer, som indeholder 0,4$ hydroxypolyethoxydodecan, og 0,2 U cholesterines= terase ifølge eksempel 2. Reaktionsopløsningen inkuberes i 60 minutter ved 37°C. Derpå aflæses ekstinktionen (E^) ved 240 nm i et 9 151396 t hydrase af Brevibacterium sterolicum. Efter 15 minutters forløb aflæses ekstinktionen (E^) på ny. Koncentrationen af det dannede Δ^-cholesteron og dermed cholesterinet fås ud fra differencen mel-5 lem den første og den anden aflæsning under hensyntagen til de molære ekstinktionskoefficienter for Δ^-cholestenon ved 240 nm. Målingen af en typisk prøve gav en samlet cholesterinmængde på 183 mg $.
10 Sammenligningsbestemmelsen med en cholesterinoxydase (af Nocardia erythropolis) i stedet for sterindehydrasen gav en samlet chole= sterinmængde på 181 mg$.
Eksempel 5.
15 10 g diammoniumhydrogenphosphat opløses i 100 ml vand og pH-værdien indstilles på 7,0 med 85$ phosphorsyre. Derpå tilsættes 10^ n kata-lase. Med den således opnåede opløsning bliver en blanding af 0,2 ml acetylaceton, 10 ml methanol og 0,1 g hydroxypolyethoxydodecan 20 opfyldt til 100 ml. Til denne opløsning tilsættes 2,5 U cholesterin= esterase af Rhizopus spec. (WS 90027).
5,0 ml af den således opnåede opløsning blandes med 0,02 ml serum, 25 henholdsvis 0,02 ml af en cholesterin-standard-opløsning med et indhold af 200 mg$ cholesterin. Portioner af den serumholdige samt den cholesterinstandardholdige prøve behandles hver med 0,1 U cho= lesterinoxydase og inkuberes i 60 minutter ved 37°C. Derpå måles det dannede farvestof ved 405 nm photometrisk under hensyntagen 3 0 til prøvens blindværdi.
Cholesterinindholdet i den serumholdige prøve udgjorde under anvendelse af en standard som referencestørrelse 154 mg$ samlet cholesterinmængde. Kontrolbestemmelsen med cholesterinesterase af 35 Candida rugosa ATCC 14830 i stedet for Cholesterinesterase af Rhizopus spec. (WS 90027) gav den samme værdi.

Claims (9)

10 151396
1. Fremgangsmåde til bestemmelse af det samlede cholesterinindhold eller det bundne cholesterinindhold ved frigørelse af det bundne cho-lesterindinhold og efterfølgende bestemmelse af det frigjorte cholesterinindhold ifølge kendte metoder, kendetegnet ved, at det bundne cholesterin bliver frigjort med en cholesterinesterase af 10 mikroorganismer.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes en cholesterinesterase af Candida rugosa ATCC 14830, Rhi-zopus spec. WS 90027 eller Aspergillus Spec. WA 90030. 15
3. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-2, kendetegne ved, at bestemmelsen bliver gennemført fuldstændig enzymatisk ved kombination med en enzymatisk bestemmelse for frit cholesterin.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der samtidig bliver tilsat cholesterinesterase og et enzym til bestemmelse af frit cholesterin.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, kendetegnet ved, 25 at det frigjorte cholesterin bestemmes med cholesterinoxidase.
6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at der anvendes en cholesterinesterase af en mikroorganisme, som dyrkes på et cholesterinesterholdigt næringsmedium. 30
7. Reagens til udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det består af cholesterinesterase af mikrobiologisk oprindelse og et system til bestemmelse af frit cholesterin. 3 5
8. Reagens ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det består af en cholesterinesterase af mikrobiologisk oprindelse, cholesterinoxidase, et system til bestemmelse af eller et system til be stemmelse af cholestenon.
9. Reagens ifølge ethvert af kravene 7 og 8, kendetegnet
DK172374A 1973-03-28 1974-03-28 Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af cholesterin DK151396C (da)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2315501 1973-03-28
DE2315501A DE2315501C3 (de) 1973-03-28 1973-03-28 Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin
DE2316637 1973-04-03
DE2316637A DE2316637A1 (de) 1973-03-28 1973-04-03 Verfahren zur bestimmung von cholesterin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DK151396B true DK151396B (da) 1987-11-30
DK151396C DK151396C (da) 1988-07-04

Family

ID=25764885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK172374A DK151396C (da) 1973-03-28 1974-03-28 Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af cholesterin

Country Status (20)

Country Link
US (1) US3925164A (da)
AR (1) AR200596A1 (da)
BE (1) BE812858A (da)
CA (1) CA1067804A (da)
CH (1) CH594887A5 (da)
DD (1) DD110356A5 (da)
DE (2) DE2315501C3 (da)
DK (1) DK151396C (da)
FI (1) FI57783C (da)
FR (1) FR2223696B1 (da)
GB (1) GB1429526A (da)
HK (1) HK46679A (da)
HU (1) HU174541B (da)
IL (1) IL44480A (da)
IT (1) IT1024524B (da)
KE (1) KE2968A (da)
MY (1) MY8000101A (da)
NL (1) NL157111B (da)
SE (1) SE460057B (da)
YU (1) YU86074A (da)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3898130A (en) * 1974-03-18 1975-08-05 American Hospital Supply Corp Rapid enzymatic hydrolysis of triglycerides
US3884764A (en) * 1974-03-25 1975-05-20 Eastman Kodak Co Method and composition for blood serum cholesterol analysis
GB1515195A (en) * 1975-08-05 1978-06-21 Hycel Inc Triglyceride assay
US4184921A (en) * 1976-03-25 1980-01-22 Boehringer Mannheim Gmbh Process and reagent for determining cholesterol
CA1100023A (en) * 1976-08-19 1981-04-28 Charles T. Goodhue Process and composition for the quantification of glycerol and triglycerides
DE2737286C2 (de) * 1976-08-19 1985-05-02 Eastman Kodak Co., Rochester, N.Y. Mehrschichtige analytische Elemente für die Bestimmung von Triglyceriden und Glycerin in Flüssigkeiten
US4042461A (en) 1976-09-10 1977-08-16 Eastman Kodak Company Method for purifying cholesterol esterase
CA1104041A (en) * 1977-02-03 1981-06-30 Charles T. Goodhue Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters
US4275152A (en) * 1977-02-03 1981-06-23 Eastman Kodak Company Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters
US4275151A (en) * 1977-02-03 1981-06-23 Eastman Kodak Company Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters
US4259440A (en) * 1979-05-21 1981-03-31 Miles Laboratories, Inc. Hydrolysis and assay of triglycerides
DE2933648A1 (de) * 1979-08-20 1981-03-26 Boehringer Mannheim Gmbh, 68305 Mannheim Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase
DE2933646A1 (de) * 1979-08-20 1981-03-26 Boehringer Mannheim Gmbh, 68305 Mannheim Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase
EP0024578B1 (en) * 1979-08-23 1983-12-07 Ivan Endre Modrovich Method of stabilizing an enzyme solution for use in total cholesterol determination, stabilized solution and test kit therefor
US4378429A (en) * 1979-08-23 1983-03-29 Modrovich Ivan Endre Enzymatic method and stabilized solutions for determining total cholesterol in human serum
IT1132230B (it) * 1980-07-24 1986-06-25 Anic Spa Procedimento per la produzione dell'enzima colesterolo-esterasi e per idrolisi degli esteri con acidi grassi del colesterolo mediante l'impiego dell'enzima stesso
US5387431A (en) * 1991-10-25 1995-02-07 Fuisz Technologies Ltd. Saccharide-based matrix
US5456932A (en) * 1987-04-20 1995-10-10 Fuisz Technologies Ltd. Method of converting a feedstock to a shearform product and product thereof
WO1989002925A1 (en) * 1987-09-22 1989-04-06 Abbott Laboratories Simultaneous assay for cholesterol and triglycerides
US5171688A (en) * 1988-08-30 1992-12-15 Cholestech Corporation Self-corrected assay device
US5156954A (en) * 1989-03-08 1992-10-20 Cholestech Corporation Assay device and method using a signal-modulating compound
JP2514087B2 (ja) * 1989-01-06 1996-07-10 富士写真フイルム株式会社 総コレステロ―ル分析要素
US5114350A (en) * 1989-03-08 1992-05-19 Cholestech Corporation Controlled-volume assay apparatus
US5340539A (en) * 1989-03-16 1994-08-23 Chemtrak, Inc. Non-instrumented cholesterol assay
US5110724A (en) * 1990-04-02 1992-05-05 Cholestech Corporation Multi-analyte assay device
DE69232721T2 (de) * 1991-05-17 2002-12-05 Biovail Tech Ltd Enzymsysteme
US5576042A (en) * 1991-10-25 1996-11-19 Fuisz Technologies Ltd. High intensity particulate polysaccharide based liquids
CA2129117C (en) * 1992-01-31 1999-01-05 Mark D. White Inhibition of catalase activity in biological fluids
US5346377A (en) * 1993-10-07 1994-09-13 Fuisz Technologies Ltd. Apparatus for flash flow processing having feed rate control
US5445769A (en) * 1994-06-27 1995-08-29 Fuisz Technologies Ltd. Spinner head for flash flow processing
US5582855A (en) * 1994-07-01 1996-12-10 Fuisz Technologies Ltd. Flash flow formed solloid delivery systems
US5556652A (en) * 1994-08-05 1996-09-17 Fuisz Technologies Ltd. Comestibles containing stabilized highly odorous flavor component delivery systems
US5587198A (en) * 1995-05-31 1996-12-24 Fuisz Technologies Ltd. Positive hydration method of preparing confectionery and product therefrom
DE60207196T2 (de) 2002-04-09 2006-07-20 Cholestech Corp., Hayward Verfahren und Vorrichtung zur Quantifizierung von Lipoprotein-Cholesterol hoher Dichte
US20050074828A1 (en) * 2003-07-16 2005-04-07 Dimagno Theodore John Uae of lipase for high-density lipoprotein cholesterol detection
JP4643212B2 (ja) * 2003-11-28 2011-03-02 シスメックス株式会社 コレステロール脱水素酵素の安定化方法、コレステロール脱水素酵素含有組成物及びコレステロール測定試薬
ATE483165T1 (de) 2007-01-09 2010-10-15 Cholestech Corp Vorrichtung und verfahren zur messung des ldl- assoziierten cholesterols
US20080299543A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Uti Limited Partnership Method for Assessing Trace Element Related Disorders in Blood Plasma
US9828624B2 (en) 2013-07-24 2017-11-28 Boston Heart Diagnostics Corporation Driving patient compliance with therapy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK145234B (da) * 1972-05-17 1982-10-11 Boehringer Mannheim Gmbh Fremgangsmaade og reagens til kvantitativ bestemmelse af cholesterol
DK131784A (da) * 1983-05-11 1984-11-12 Interholz Technik Gmbh Fremgangsmaade og apparat til at rette langstrakte traeelementer op

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3607093A (en) * 1968-02-15 1971-09-21 Schering Corp Devices for testing biological liquids
FR2047147A5 (da) * 1969-05-06 1971-03-12 Kyowa Hakko Kogyo Kk

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK145234B (da) * 1972-05-17 1982-10-11 Boehringer Mannheim Gmbh Fremgangsmaade og reagens til kvantitativ bestemmelse af cholesterol
DK131784A (da) * 1983-05-11 1984-11-12 Interholz Technik Gmbh Fremgangsmaade og apparat til at rette langstrakte traeelementer op

Also Published As

Publication number Publication date
DE2315501B2 (de) 1979-04-26
IT1024524B (it) 1978-07-20
NL7403978A (da) 1974-10-01
FR2223696A1 (da) 1974-10-25
YU86074A (en) 1984-04-30
NL157111B (nl) 1978-06-15
AU6730074A (en) 1975-10-02
FI57783C (fi) 1980-10-10
KE2968A (en) 1979-07-20
AR200596A1 (es) 1974-11-22
FI57783B (fi) 1980-06-30
US3925164A (en) 1975-12-09
DE2315501A1 (de) 1974-10-17
HK46679A (en) 1979-07-20
BE812858A (fr) 1974-09-26
DE2316637A1 (de) 1974-10-17
GB1429526A (en) 1976-03-24
CH594887A5 (da) 1978-01-31
HU174541B (hu) 1980-02-28
DK151396C (da) 1988-07-04
SE460057B (sv) 1989-09-04
IL44480A (en) 1976-12-31
DD110356A5 (da) 1974-12-12
FR2223696B1 (da) 1976-10-08
CA1067804A (en) 1979-12-11
IL44480A0 (en) 1974-06-30
DE2315501C3 (de) 1980-02-21
MY8000101A (en) 1980-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK151396B (da) Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af cholesterin
Shapiro Purification and properties of a lysolecithinase from pancreas
Shimizu et al. Enzymatic microdetermination of serum free fatty acids
Taguchi et al. Phosphatidyl inositol-specific phospholipase C from Clostridium novyi type A
Henderson A study of the lipase produced by Anaerovibrio lipolytica, a rumen bacterium
US4242446A (en) Method for determining a substance in a biological fluid and reagent combination for use in the method
US3862009A (en) Determination of triglycerides
Ameyama et al. Method of enzymatic determination of pyrroloquinoline quinone
SU664536A3 (ru) Реактив дл определени холестерина
US4259440A (en) Hydrolysis and assay of triglycerides
EP0010296B1 (en) Test composition for the determination of triglycerides and its use
US4338395A (en) Method for the analysis of triglycerides
Baich The biosynthesis of proline in Escherichia coli phosphate-dependent glutamate γ-semialdehyde dehydrogenase (NADP), the second enzyme in the pathway
US4999289A (en) Lipase, its production and use for assay of triglycerides
Malavolti et al. Determination of cholesterol with a microporous membrane chemiluminescence cell with cholesterol oxidase in solution
Thiel et al. Determination of hydrolytic enzyme activities in anaerobic digesting sludge
JPS6134800B2 (da)
Bigelis et al. Yeast alpha-isopropylmalate isomerase. Factors affecting stability and enzyme activity.
Patel et al. Characterization of Leptospiral lipase
Goldiger et al. The pyruvate metabolism of sea urchin eggs during the process of cell division
JP2647684B2 (ja) トリグリセリドの分析用試薬および分析方法
SU1168103A3 (ru) Способ определени общего холестерина в сыворотке крови
JPH0474000B2 (da)
JP2017158441A (ja) カタラーゼ
JPH0452119B2 (da)

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired